Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение и применение моноклонального ПАП-набора

На правах рукописи

МАРТЫНОВА Тамара Геннадьевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНОГО

ПАП-НАБОРА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Москва

19 9 7

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РБА А.Ю.Барышников. доктор биологических наук, старший научный сотрудник В.В.Новиков;

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Н. Н. Тупицын

доктор биологических наук, профессор Р. В. Ленская

Ведущая организация - Институт онкологии им. П. А. Герцена МЗ РФ

Зашита состоится "_"__1997 г. в_час. на

заседании Диссертационного Совета К 084.18.02 при Московском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского

Автореферат разослан " О/" 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Л. И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммуноферментный анализ (ИФА) все шире применяется для определения микроколичеств самых различных соединений в диагностических и научно-исследовательских целях. Разработаны разнообразные варианты ИФА, каждый из которых имеет свои преимущества и особенности, используемые при решении конкретных диагностических или исследовательских задач.

Особое место среди вариантов ИФА занимает метод немеченных антител, основанный на использовании комплекса, состоящего из фермента и антител к нему. Одним из часто используемых вариантов метода немеченных антител является ПАП-метод, в котором взамен антител, химически сшитых с пероксидазой хрена (ПХ), используют ПАП-комплекс, состоящий из ПХ и антител к ПХ. Если первые антитела имеют ту же видовую принадлежность, что и антитела, входящие в состав ПАП-комплекса, то они могут быть легко связаны мостиком из антител, направленных против иммуноглобулинов того вида животных, к которому относятся первые антитела.

Наряду с ИФА широкое распространение находят моноклональные антитела (МКА), направленные против самых различных антигенов. Одна из областей, где получение достоверной диагностически значимой информации возможно только с помощью МКА, - это иммунофенотипирование клеток по наличию поверхностных антигенных маркеров [Барышников А.Ю. и др., 1989]. Использование в этих целях ИФА позволяет в сравнении с иммунофлуорес-ценцией получать более обширную информацию, поскольку дает возможность исследовать одновременно иммунофенотип и морфологию клеток. Преимущества ПАП-метода в сравнении с другими методами иммунофер-ментного анализа ярче всего проявились в иммуногистохимических исследованиях, поскольку для ПАП-метода характерны низкие фоновые реакции. В связи с этим использование ПАП-метода в иммуногистохимии получило

довольно широкое распространение. [Рустамова Р.З. и др., 1983, Erber W.N. et. al. 1983, Feller А.С. et. al. 1983, Morich F.-J. et. al. 1983, Poletti A. et. al. 1987]. ПАП-метод может быть успешно использован также и для выявления с помощью МКА различных растворимых антигенов, имеющих диагностическую значимость.

Цель работы. Целью диссертационной работы явилось конструирование моноклонального ПАП-набора (пероксидаза-антипероксидаза), предназначенного для проявления взаимодействия МКА с различными антигенами, и оценка возможностей его применения.

Задачи исследования:

1. На основе МКА против пероксидазы хрена сконструировать набор для проведения иммуноферментных реакций методом ПАП.

2. Изучить стабильность компонентов ПАП-набора и входящих в его состав МКА против ПХ в сравнении с другими МКА.

3. Показать возможности применения ПАП-набора для выявления с помощью МКА различных растворимых и клеточных антигенов, а также мышиных поликлональных антител.

4. С помощью ПАП-метода провести характеристику специфичности МКА против различных цепей иммуноглобулинов человека.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан моноклональный ПАП-набор, предназначенный для проведения иммуноферментных реакций с использованием МКА.

2. Максимальная интенсивность ПАП-реакции регистрируется в ограниченном интервале концентраций ПХ в составе ПАП-комплекса, зависит от RZ ПХ и концентрации связующих антител.

3. Стафилококковый реагент, содержащий белок А, применим для очистки мышиных иммуноглобулинов и МКА.

4. С помощью ПАП-метода охарактеризована группа моноклонапьных антител, выявляющих различные цепи иммуноглобулинов.

-------Научная новизна. Показано, что моноклональный ПАП-набор применим

для определения с помощью МКА антигенов поверхности клеток на криостатных срезах и в суспензии клеток, для выявления растворимых антигенов, для иммуноблоттинга и определения специфических поликлональных антител. Разработаны экспресс-варианты применения ПАП-набора для выявления различных антигенов с помощью МКА. С помощью ПАП-набора определено, что МКА ИКО-ЗО направлены против ц-цепей иммуноглобулинов человека, МКА ИКО-97 взаимодействуют с Р(аЬ')г-участком иммуноглобулинов Э человека, а МКА ИКО-Ю6 и ИКО-Ю7 выявляют соответственно Х- и -/-Цепи иммуноглобулинов человека. Впервые в стандартизованных условиях изучена устойчивость МКА различных изотипов к обработке протеолитическими ферментами. Продемонстрирована связь стабильности МКА с их изотипом. Выявлено, что наиболее устойчивыми являются МКА 2а-изотипа класса С.

Практическая значимость.

На основе МКА против ПХ разработан диагностический моноклональный ПАП-набор для иммунопероксидазного проявления реакции МКА с антигенами поверхности клеток и растворимыми антигенами. Отработаны методы применения ПАП-набора, которые позволяют усовершенствовать методический уровень проведения иммунодиагностических реакций с помощью МКА при выявлении растворимых и клеточных антигенов. Охарактеризованные в работе МКА против различных цепей иммуноглобулинов применимы для иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга при миеломатозе и лимфолейкозах, а также для определения количественного содержания иммуноглобулинов в биологических жидкостях.

Апробация работы. Полученные результаты доложены на Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагности-кумов" (Москва, 1988г.), на I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989 г.), на Юбилейной конференции, посвященной 100-летию Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского,

на VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997г.).

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторной научной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии с участием членов Ученого Совета ННИИЭМ 23 апреля 1997 г..

Объем и структура диссертации. Работа в объеме 139 листов машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов, обсуждения, выводов и указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 123 источника литературы (74 отечественных и 49 иностранных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Моноклонапьные антитела (МКА), использованные в работе, представлены в табл.1.

Для получения очищенных МКА использовали асцитическую жидкость мышей-носителей гибридом. Очистку МКА проводили с помощью каприлат-ного метода [Steinbuch М. et. al., 1989], бепок-А-сефарозы [Новиков В.В. и др., 1985] и стафилококкового реагента, содержащего белок А. Очищенные поликлональные мышиные иммуноглобулины получали с помощью стафилококкового реагента, содержащего белок А, в соответствии с разработанным методом.

Электрофорез белков в тонком слое 10%-ного полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия в редуцирующих и нередуцирующих условиях проводили согласно методу Лэммли [Laemmly Н.К., 1970].

Очищенные фракции IgG и IgM человека получали из человеческого гаммаглобулина, обогащенного IgM, путем гельфильтрации на сефадексе G-200 с последующей доочисткой на белок А-сефарозе.

----------------------------------------------------------------------------------------------Таблица 1

МКА, использованные в работе

Наименование МКА Специфичность

ИКО-1 мономорфная детерминанта HI_A-Dr антигенов

ИКО-2

ИКО-ГМ-1 CD11b антиген

ИКО-86 CD4 антиген

ИКО-31 CD8 антиген

ЛТ-8 -"-

ИКО-90 CD3 антиген

ИКО-Г-2 CD15 антиген

ИКО-12 CD22 антиген

AP-FC-2B4 пероксидаза корня хрена

ИКО-97 у-цепь IgG человека

ИКО-ЗО ц-цепь IgM человека

ИКО-106 >.-цепь иммуноглобулинов человека

И КО-107 Х-цепь иммуноглобулинов человека

1 И КО-20 CD38 антиген

ИКО-166 CD45RA антиген I

Взаимодействие МКА с цепями иммуноглобулинов человека в имму-ноблоттингв определяли после переноса белковых электрофоретических фракций из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу с последующим проявлением реакции ПАП-методом в присутствии 0,5% диаминобензидина и 0,3% перекиси водорода.

Обработку МКА пепсином, трипсином и лапаином проводили общепринятыми методами [Иммунологические методы под ред. Г.Фримеля, 1987]. Специфическую активность МКА, выявляющих клеточные антигены, определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием в качестве вторых антител Р(аЬ')г-фрагменты козьих ФИТЦ-меченных антител против иммуноглобулинов мыши.

При проведении ПАП-реакции (пероксидаза-антипероксидаза) планшеты сенсибилизировали раствором антигена в 0,1 М бикарбонатном буферном растворе рН 9,6, неспецифическое связывание блокировали 1 %-ным раствором БСА, планшеты обрабатывали моноклональными антителами или поликлональной мышиной антисывороткой, а затем козьими связующими антителами против иммуноглобулинов мыши и раствором ПАП-комплекса. Реакцию проявляли в присутствии 0,3% НгО и 0,5% ортофенилендиамина. В модельных опытах взамен растворов антигена и МКА использовали мышиные 1дЭ. В опытах по блокаде связывания МКА с иммуноглобулинами человека после сенсибилизации и обработки 1 %-ным БСА планшеты обрабатывали очищенными 40%-ным сульфатом аммония моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов человека, а затем планшеты инкубировали с МКА и проявляли ПАП-методом.

При выявлении клеточных антигенов использовали прикрепленные к стеклу криостатные срезы тканей или клетки крови, фиксированные в ацетоне (5-30 сек при 4°С) и обработанные смесью метанола и 3%-ной перекиси водорода (10:1. 10-20 минут). ПАП-реакиию проявляли раствором 0,5°< ного диаминобензидина в присутствии 0,3%-ной перекиси водорода Перед просмотром препараты помещали на 1 мин в раствор гематоксилина и промывали дистиллированной водой.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ПАП-метод является одним из многих вариантов иммуноферментного анализа, однако имеет отличительные особенности, которые выделяют его среди других методов. Взамен химически слитых конъюгатов антител с пероксидазой хрена в этом непрямом варианте ИФА используется ПАП-комплекс (ПХ-антитела к ПХ), который связывается с антителами против

выявляемого антигена с помощью мостика их "антивидовых" антител. В применении к моноклональному ПАП-набору таким мостиком могут служить поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши.

В целом, ПАП-комплекс вместе со связующими антителами является аналогом "антивидовых" конъюгатов, однако, как показывает опыт ряда исследователей [Рустамова Р.З. и др. 1983, Erber W.N. et. al. 1983, Morich F.-l. et. al. 1983, Van der Weij J.P. et. al. 1983], использование ПАП-метода в иммуногистохимии характеризуется низкими фоновыми реакциями в сравнении с применением "антивидовых" конъюгатов. Широкое внедрение мышиных МКА против клеточных антигенов в диагностическую практику, а также в научные исследования и послужили толчком к выполнению настоящей работы.

В соответствии с поставленными задачами на первом этапе работы был сконструирован моноклональный ПАП-набор, основанный на МКА AP-FC-2B4 против ПХ В состав набора вошли: преформированный ПАП-комплекс, состоящий из пероксидазы хрена (ПХ) и МКА к ПХ; поликлональные козьи антитела к иммуноглобулинам мыши, используемые как связующие антитела, и нормальные сывороточные иммуноглобулины мыши, применяемые в качестве отрицательного контроля взамен первых моноклональных антител.

Связующие антитела получали многократной иммунизацией козы очищенными иммуноглобулинами мыши. Иммуноглобулины очищали из нормальной сыворотки мышей. С этой целью был разработан метод очистки мышиных иммуноглобулинов с помощью стафилококкового реагента, содержащего белок А, выпускаемого предприятием Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера.

В предварительных экспериментах было выявлено, что при рН 8,0 стафилококковый реагент способен связывать мышиные иммуноглобулины, о чем свидетельствовал электрофоретический анализ сывороточных

белков, проведенный до и после инкубации со стафилококковым реагентом (Рис.1).

........ ..............¡мим.....м^м.....

6 5 4 3 2 1

Рис.1. Электрофореграммы белков.

1 - белки сыворотки крови мыши;

2 - то же после обработки сыворотки стафилококковым реагентом рН 8,0;

3 - очищенные иммуноглобулины мыши;

4 - белки асцитической жидкости, содержащей МКА ИКО-1;

5 - то же после обработки стафилококковым реагентом рН 8,0;

6 - очищенные МКА ИКО-1

Известно, что на поверхности фиксированных клеток золотистого стаф'.тг'т1'1"» ■"ре низких рН '.'сжст "-'есто »""-поцифичес'-'ое

имг/> >!»/ГЛс.С/;...пчГ/.: и т^.'лсс-Оим.и; ^слотам»: [ипйтагк И. е1 а1., 1982]. Такое взаимодействие может быть причиной неполной элюции иммуноглобулинов и устраняется при добавлении в элюирующий раствор хлористого магния. На примере МКА ИКО-1, относящихся к 1дС мыши, было показано, что введение хлористого магния в буфер для элюции антител привело к резкому увеличению их выхода. Изменение объемного соотношения стафилококкового реагента и асцитической жидкости (АЖ), содержащей МКА, показало, что увеличение количества реагента в смеси приводит к увеличению выхода антител (Табл.2). Применяя избыток мышиных иммуноглобулинов и МКА, было определено, какое их количество может быть выделено из мышиной сыворотки и асцитической жидкости при использовании 1 мл 10%-ной суспензии реагента. Метод обеспечивал получение чистой фракции сывороточных иммуноглобулинов. Емкость реагента

составила 0,19 мг мышиных иммуноглобулинов на 1 мл реагента. При этом при очистке различных МКА емкость реагента колебалась от 0,16 мг/мл до 0,26 мг/мл. Нужно заметить, что стафилококковый реагент, содержащий белок А, был использован для очистки МКА впервые и показал себя как сорбент, который с успехом может заменить белок-А-сефарозу (агарозу).

Таблица 2

Выход очищенных моноклональных антител ИКО-1 приразличныхсоотношениях реагент/асцит

¡ Объемное соотношение реагент/асцит Выход по специфической активности, % Выход по содержанию белка (мг на 1 мл АЖ)

1:1 25,0 + 2,9 0,18 ± 0,03

2:1 37,9 ± 3,7 0,30 ± 0,04

4:1 74,7 + 5,4 0,70 ± 0,09

8:1 75,0 ± 9,0 0,73 + 0,10 J

ПАП-метод включает несколько различных стадий. Нарушения в соотносительном содержании и активности компонентов, участвующих в реакции, значительно изменяют интенсивность и специфичность реакции. Для исследования количественных соотношений компонентов реакции был проведен ряд экспериментов в модельной системе, не требующих наличия специфических антигенов. Планшеты сенсибилизировали очищенными мышиными иммуноглобулинами, рассматривая их как комплекс "антиген-антитело", определяли зависимость интенсивности ПАП-реакции от условий ее проведения. Была изучена зависимость интенсивности реакции от количественного соотношения в составе ПАП-комплекса ПХ и МКА ПХ. Изменение содержания ПХ в составе ПАП-комплекса показало, что наибольшая интенсивность реакции регистрировалась в ограниченном интервале концентраций ПХ. При этом выявлено, что чем более высоким значением ИТ характеризовалась ПХ, тем более высокая интенсивность реакции обнаруживалась. Границы, в которых

обнаруживалась максимальная интенсивность реакции, были одинаковы для всех использованных в работе ПХ.

Изменение процентного соотношения МКА к ПХ и ПХ также не меняло границы интервала концентраций ПХ, в которых регистрировалась максимальная интенсивность реакции (Рис.2). Проведенное исследование обнаружило сложную картину соотношений между ПХ, МКА и связующими

г>!-г- ? интенсивности роатии от содержания пероксидазы

в сопавг- ПЛП-комплекса при разных разведениях АЖ. содержащей

4 _ 1-50ГЮ 5 - 1:7500, 6 - "МППОП кг пероксияачы 2.00

антителами и выявило ряд особенностей, которые были учтены при конструировании ПАП-набора. Полученные результаты легли в основу нормативно-технической документации на производство моноклонального ПАП-набора, утвержденного в качестве медицинского диагностического препарата.

Одной из обязательных характеристик иммунобиологического препарата является его стабильность при хранении. В связи с этим была исследована стабильность ПАП-набора и его отдельных компонентов при хранении в условиях разных температур. Изучение стабильности компонентов ПАП-набора продемонстрировало, что активность ПАП-комплекса при его продолжительном хранении падает в течение года до 40%, в то время как козьи

антитела к иммуноглобулинам мыши лишь незначительно теряют свою стабильность. Сходным образом изменяли свои антигенные свойства иммуноглобулины мыши (Рис.3). Активность всего ПАП-набора изменялась при хранении аналогично изменению активности ПАП-комплекса. Был сделан вывод, что самым лабильным компонентом ПАП-набора, определяющим сроки его хранения, является ПАП-комплекс.

Рис.3. Стабильность пиофилизированных компонентов ПАП-набора при 37°С.

1 - козьи поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши;

2 - иммуноглобулины мыши; 3 - ПАП-комплекс.

- - ПАГ--тутг-'к-гп г%/-г~т составляющих его

ингредиента, была поставлена задача выяснить, каков вклад каждого из них в падение активности ПАП-комплекса. Для этого к термостатированному при 37°С ПАП-комплексу добавляли МКА к ПХ или ПХ в тех же количествах, в которых они уже находились в составе ПАП-комплекса. Сниженная вдвое интенсивность реакции не изменялась при добавлении МКА и возрастала до 70-80% при введении в состав ПАП-комплекса свежей ПХ. То есть снижение активности ПАП-комплекса обусловлено в основном инактивацией ПХ. Можно заключить, что наиболее стабильны в составе ПАП-набора иммуноглобулины и поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши. Самым лабильным компонентом является ПХ, МКА занимают промежуточное положение. Этот факт соответствует литературным данным о том, что МКА часто менее стабильны, чем поликлональные антитела [Бектимиров Т.А., 1987].

Однако, в какой степени они уступают по стабильности поликлонапьным антителам, все ли они обладают одинаковой стабильностью - этот вопрос у разных авторов влечет за собой противоречивые ответы. В связи с этим была изучена стабильность МКА к ПХ, относящихся к первому подклассу иммуноглобулинов в мыши в сравнении с МКА других подклассов 1д6. В эксперимент были включены МКА, относящиеся к четырем различным под1спассам 1дС. Стабильность этих антител изучалась при воздействии протеолитических ферментов (пепсина, трипсина и папаина). Протеолиз проводили в стандартных для каждого из ферментов условиях с последующим элекгрофоретическим анализом и оценкой специфической активности антител. Наиболее устойчивыми к действию протеолитических ферментов оказались МКА, относящиеся к 2а подклассу, затем следовали МКА 1-го подкласса, к которым принадлежат МКА к ПХ, использованные в работе, а затем МКА 2Ь и 3 подклассов (Рис.4). При этом результаты соответствовали данным, полученным ранее другими авторами при изучении сроков хранения МКА серии ИКО, относящихся к разным изотипам и находящихся в различных

Рис.4. Зависимость сохранения активности моноклонапьных антител различных изотипов от длительности воздействия папаина. рН 6,0. 37°С. Соотношение папаин:белок - 1:25. 1 - МКА ИКО-2, 2 - МКА ЛТ-8, 3 - МКА ИКО-Г-2, 4 - МКА ИКО-ГМ-1, 5 - МКА ИКО-31, 6 - МКА

условиях хранения [Новиков В.В. и др., 1989]. Использованные в работе МКА против ПХ обладают таким образом достаточно высокойсравнении с другими МКА стабильностью. Этим объясняется тот факт, что при хранении ПАП-комплекса, в состав которого входят ПХ и МКА, последние более длительное в сравнении с ПХ время сохраняли специфическую активность.

Во второй части работы была показана применимость полученного ПАП-набора для решения широкого спектра задач, связанных с выявлением и характеристикой с помощью МКА различных антигенов, а также с характеристикой специфичности моноклональных антител мышиного происхождения.

Разработанный моноклональный ПАП-набор был апробирован в первую очередь для определения с помощью МКА серии ИКО клеточных антигенов

на криостатных срезах тимуса в сравнении с результатами реакции непрямой иммунофлуоресценции и непрямого ИФА с применением конъюгата ПХ с козьими политональными антителами против иммуноглобулинов мыши. Использовали тимус больных не старше 30 лет, умерших от заболеваний,

-------^ „.-тоюц.П.,!. МКА ИКО 1 И^О-ПУМ И^П-Г о

окрашивания. Результаты соответствовали специфичности МКА и данным реакции иммунофлуоресценции. Применение непрямого ИФА обнаружило значительно большее количество окрашенных клеток и фоновое окрашивание, затрудняющее учет результатов. МКА ИКО-20 и ИКО-166 выявляли в ПАП-реакции 48,7 ± 9,3 % и 14,8 ± 5,7 % клеток соответственно. Различия между результатами ПАП-реакции и реакции непрямой иммунофлуоресценции были статистически недостоверными. ПАП-набор, таким образом, позволяет проявлять реакцию МКА с клеточными антигенами с той же достоверностью, что и ФИТЦ-меченные фрагменты антител к иммуноглобулинам мыши. Активность тканевой эндогенной пероксидазы при этом достаточно легко и полно подавлялась инкубацией срезов в смеси метанола и 0,3%-ной перекиси водорода.

На примере ряда МКА серии ИКО продемонстрирована применимость ПАП-набора для выявления клеточных антигенов на криостатных срезах лимфоузлов тканей доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы. С помощью предложенного метода постановки ПАП-реакции исследована экспрессия HLA-Dr-антипена, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD22 антигенов. Показано преобладание количества С08+-клеток над С04+-клетками в периферическом инфильтрате злокачественных опухолей. При доброкачественных опухолях наблюдалась обратная картина, характеризующаяся преобладанием в инфильтратах С04+-клеток, выявляемых с помощью МКА ИКО-86, над С08+-клетками, определяемых МКА ИКО-31.

ПАП-метод был применен также для иммунофенотипирования клеток периферической крови. При использовании МКА ИКО-1, ИКО-12, ИКО-31, ИКО-53, ИКО-90 полученные результаты статистически не отличались от результатов иммунофенотипирования клеток, полученных в параллельных опытах в реакции непрямой иммунофлуоресценции. Это свидетельствует о применимости разработанного ПАП-набора для оценки состояния клеточного иммунитета и для иммунодиагностики гемобластов с помощью МКА против антигенов поверхности клеток.

ПАП-набор был использован, кроме того, для выявления некоторых растворимых антигенов. При определении ПАП-методом HBs-антигена с помощью МКА ЖАК-22 чувствительность метода составила 1-2,5 нг/мл. При определении иммуноглобулинов М с помощью МКА ИКО-ЗО положительная реакция регистрировалась при концентрации IgM, равной 0,2 мкг/мл.

Нужно заметить, что ПАП-метод является многостадийным методом, что осложняет его использование в экспресс-вариантах ИФА. Чтобы сократить количество времени для постановки ПАП-реакции, исследована возможность совместного нанесения козьих антител к иммуноглобулинам мыши и ПАП-комплекса. Были подобраны условия, в которых чувствительность ускоренного варианта ПАП-метода не отличалась от обычного проведения реакции. Аналогичным образом была показана возможность еще большего

сокращения времени реакции путем одновременного добавления в реакционную смесь всех компонентов реакции. Таким способом определяли НВвАд с помощью МКА ЖАК-22 и 1дМ человека с помощью МКА ИКО-ЗО.

Для оценки возможности определения специфических поликлональных антител ПАП-набор в отдельной серии экспериментов был использован при тестировании иммуногенных свойств двух различных белковых зоотоксинов: нативного яда гюрзы и гемолимфы личинок колорадского жука. Результаты, полученные при оценке антигенных свойств одного из новых и практически неизученных зоотоксинов - гемолимфы личинок колорадского жука - дают возможность сделать вывод, что однократное введение беспородным лабораторным мышам данного зоотоксина позволяет с помощью ПАП-метода достоверно регистрировать наличие специфических антител, содержание которых резко возрастает после трехкратной иммунизации (Табл.3). Сходные данные были получены при оценке антителообразования у мышей после введения им яда гюрзы.

Таблица 3

Рр.т/пьтгт I исследования антигенных свойств гемолимфы

глинок колорадского жука методом игллуноферментного анализа

Разведение Величина оптической плотности Показатель

сыворотки Однократная Трехкратная достоверности

крови иммунизация иммунизация различий (Р)

1:100 0,44 ± 0,03 1,38 + 0,002 <0,001

1:500 0,29 ± 0,08 1,17 + 0,04 <0,001

1:1000 0,26 ± 0,03 0,93 ± 0,02 <0,01

1:5000 0,21 ± 0,01 0,51 ± 0,06 <0,02

1:10000 0,23 ± 0,03 0,41 + 0,005 <0,01

Была продемонстрирована также применимость ПАП-набора для характеристики специфичности группы вновь полученных МКА. С помощью

твердофазного варианта ПАП-метода выявлено, что МКА ИКО-ЗО взаимодействуют с сывороточными 1дМ человека, сорбированными на планшеты для иммуноферментного анализа, и не реагируют с 1дО человека (Рис.5). Моноспецифическая сыворотка против 1дМ человека подавляла такое взаимодействие в отличие от моноспецифической сыворотки против 1дЭ (Рис.6). В иммуноблоттинге МКА ИКО-ЗО реагировали с тяжелой цепью 1дМ человека, не давая реакции с легкими цепями 1дМ. Представленные результаты позволили сделать вывод о направленности МКА ИКО-ЗО против ц-цепей 1дМ человека.

1дО, (мкг/мл) 1дМ, {мкг/мл)

Рис.5. Взаимодействие МКА с иммуноглобулинами человека в ПАП-реакции: 1 - МКА ИКО-ЗО (1:5000); 2 - МКА ИКО-97 (1:1000); 3 - МКА ИКО-Ю6 (1:1000); 4 - МКА ИКО-Ю7 (1:1000).

Проведена характеристика специфичности МКА ИКО-97. С помощью ПАП-метода было показано, что МКА ИКО-97 реагировали с сорбированными на твердой фазе 1дв человека и не реагировали с 1дМ (Рис.5). Наблюдалось подавление взаимодействия МКА ИКО-97 с 1дС человека при использовании моноспецифической сыворотки против 1дС человека. В то же время моноспецифическая сыворотка против 1дМ человека не блокировала взаимодействие МКА ИКО-97 с 1дЭ человека (Рис.6). Анализ специфичности МКА ИКО-97 с помощью иммуноблоттинга, проявляемого ПАП-методом, показал направленность данных антител против тяжелых цепей 1д6. Реакция с тяжелыми цепями 1дМ человека и с легкими цепями не регистрировалась.

и у п цуп л г ц г п И и п

Рис.6. Блокада связывания МКА ИКО-ЗО (а), ИКО-97 (б), ИКО-Ю7 (в), ИКО-Ю7 (г) с иммуноглобулинами человека, предобработанными моноспецифическими антителами к различным цепям (р, у, X, %) иммуноглобулинов человека; п - предобработка иммуноглобулинов человека нормальной бараньей

сывороткой. Разведение МКА, моноспецифических антител и нормальной бараньей сыворотки 1:1000. Реакция проявлялась ПАП-методом.

Более детальное изучение специфичности МКА ИКО-97 с использованием фрагментированного пепсином 1дС и твердофазного ПАП-метода показало, что антитела взаимодействуют с Р(аЬ')г-фрагментом, но не реагируют с Яс-фрагментом. Полученные данные были подтверждены результатами иммуноблоттинга с использованием фрагментированного иммуноглобулина в человека. Было показано, что МКА ИКО-97 в иммуно-блоттинге также обнаруживают Р(аЬ')г-фрагмент 1дЗ, не давая реакции с Рс-фрагментом.

Следующими двумя антителами, взаимодействующими с иммуноглобулинами человека, явились МКА ИКО-Ю6 и ИКО-Ю7. В твердофазном ПАП-методе эти МКА реагировали как с 1дМ, так и с 1дС (Рис.5). При использовании ряда моноспецифических сывороток к различным цепям 1д человека было обнаружено, что взаимодействие МКА ИКО-Ю6 с иммуноглобулинами человека блокировалось сывороткой к Х-цепям. Реакция МКА ИКО-Ю7 с иммуноглобулинами человека в свою очередь наиболее выраженно подавлялась моноспецифической сывороткой к х-Цепям. В иммуноблоттинге с

применением в качестве антигена 1дЭ человека МКА ИКО-Ю6 и ИКО-Ю7 взаимодействовали с полипептидом, соответствующим по своей молекулярной массе легким цепям иммуноглобулинов человека и не проявляли полосу, соответствующую тяжелым цепям 1дС.

Таким образом, была охарактеризована группа МКА, направленных против различных цепей 1д человека. Показано, что МКА ИКО-ЗО взаимодействуют с ц-цепью 1дМ, ИКО-97 с у-цепью в области Р(аЬ')г-фраг-мента, МКА ИКО-Ю6 с Х-цепью, а МКА ИКО-Ю7 взаимодействуют с х-цепью иммуноглобулинов человека.

Первая Европейская группа по иммунологической классификации лейкозов в своих последних предложениях включила МКА против мембранных и цитоплазматических 1дМ человека, х~ и Х-цепей в перечень антител для характеристики острых лейкозов [Бене М.К. и др., 1996]. Данные антитела, наряду с МКА к другим клеточным антигенам, предназначены для определения В-клеточных подвариантов острого лимфолейкоза. Иммуно-фенотипирование бластных клеток является основой для рациональной терапии гематологических больных.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что ПАП-набор может быть успешно применен для характеристики специфичности моноклональных антител, определения с их помощью различных антигенов, в иммуногистохимии, а также для тестирования мышиных поликлональных антител.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирован моноклональный ПАП-набор (пероксидаза-анти-пероксидаза), включающий антитела против мышиных иммуноглобулинов, нормальные иммуноглобулины мыши и преформированный ПАП-комплекс, состоящий из антипероксидазных моноклональных антител и пероксидазы хрена. Продемонстрировано, что наибольшая интенсивность ПАП-реакции

_ регистрируется в узком диапазоне соотносительных концентраций пероксидазы и моноклональных антител к пероксидазе хрена.

2. Разработан метод очистки иммуноглобулинов мыши и моноклональных антител с помощью стафилококкового реагента, содержащего белок А

3. Установлено, что антипероксидазные моноклональные антитела, находящиеся в составе ПАП-комплекса и относящиеся к изотипу I, более стабильны, чем пероксидаза хрена. Обнаружено, что моноклональные антитела первого подкласса стабильнее антител 2Ь и 3 подклассов и лабильнее моноклональных антител 2а-подкласса.

4. Показана применимость ПАП-набора для тестирования поликлональ-ных мышиных антител и для выявления с помощью моноклональных антител дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток и растворимых антигенов. Разработаны модификации ПАП-метода, позволяющие сократить время проведения реакции.

5. С помощью различных вариантов ПАП-метода выявлено, что моноклональные антитела ИКО-ЗО направлены против ц-цепей IgM человека, а моиоклонагьные антитепа ИКО-Ю6 и ИЮЭ-107 направлены соответственно против к- и ¿-Цепей иммуноглобулинов человека.

6. Определена специфичность вновь полученных моноклональных антител ИКО-97. С применением твердофазного варианта ПАП-метода, блокады связывания антител и иммуноблоттинга показано, что моноклональные антитела ИКО-97 направлены против F(ab')2 участка иммуноглобулинов G.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Новиков В.В., Андреев A.B., Трофимова М.Н., Мартынова Т.Г., Бирюкова Л.З. Разработка и возможности применения ПАП-набора на основе моноклональных антител к пероксидазе хрена// В кн. "Современные направления создания медицинских диагностикумов.-М.-1988.-С. 83-84.

2. Новиков В.В., Сандова О.М., Комарова О.Б., Мартынова Т.Г. Исследование стабильности моноклональных антител// Тезисы докладов I Всесоюзного иммунологического съезда.-М.-1989.-Т.1.-С.163.

3. Новиков В.В., Мартынова Т.Г. Свойства и направленная регуляция изотипов моноклональных антител// В сб. "Регуляция биологических систем".-Н.Новгород.-1990.-С.45-49.

4. Мартынова Т.Г., Зубов C.B., Фаерман А.И., Червонский A.B., Новиков В. В. Оптимизация условий проведения ПАП-реакции с применением моноклонапьныхантител//Биотехнология.-1994.-№-10.-С.53-56.

5. Мартынова Т.Г., Королева В.В., Починко A.A., Новиков В.В. Устойчивость к протеолизу моноклональных антител различных изотипов// Биотехнология.-1995.-Ш-4.-С.41-45.

6. Мартынова Т.Г., Романова Е.Б., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Возможности применения моноклонального ПАП-набора в иммуно-биотехнологических исследованиях// Биотехнология.-1995.-Ы9-10.-С.52-54.

7. Мартынова Т.Г., Фролова ЕЛ., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Получение и характеристика моноклональных антител против иммуноглобулинов человека// В сб. "Проблемы медицинской биотехнологии и иммунологии инфекционных болезней.-М.-1996.-Т.2.-С.182-186.

8. Мартынова Т.Г., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам человека// Материалы VII Съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.-М.-1997.-Т. 1 -С.465.