Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:"Лейкоцитарные" антигены на эпителиальных и лимфоидных клетках опухолей желудка

2 11] 9 С

Шщт щцицинских иш ссср

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕШР

I----

На правах рукописи уда 616.3 - 006.04 - 097

МАКИШЕВ АБАЙ КАЙРГОЖИНОВИЧ

' ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ" АНТИГЕНЫ НА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ И ЛИЮООДШХ КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕЙ ЖЕЛУДКА

<14.00.14 - ОНКОЛОГИЯ )

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЦДОфЫашл НАУК

МОСКВА - 1990

>

I ..о-ш ышышена в отделении абдоминальной онкологии (рук. -н .ктор медицинских наук, профессор А. А. Клименко в} лаборатории ыишико-радиоинмунологической -(рук. доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидэе), Всесоюзного Онкологического Научного Центра АМН СССР ( Директор - академик АМН СССР Н.Н.Трапезников

Научные руководители:

доктор медицинских наук А.Б.Итин кандидат медицинских наук Н.Н.Тупицын

инициальные оппоненты:

диктор медицинских наук, профессор А.И.Агеенко доктор медицинских наук Д.В.Комов

1кн1УЩов учреждение - Научв» ~ исоле«оват«ль6кий имотгуг •«каногцц Министерства здравоохранения УССР

Защита диссертации состоится 1990г.

»а заседании специализированного ученого совета Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР

(г.Москва, 115478, Каширское шоссе, д.24)

и диссертацией ш»но ознакомиться в библиотеке ВШЦ АМН ССС1' «ато|«4'й(»аг' рааоодан " "_______„_______1990 г.

Уч^шй секретить Специализированного Сонета, ^члор дадицннии'ил на^к, профессор В.СЛ'уруиои.

ОНДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования: СССР относится к етрянпм с наивысшими показателями заболеваемости раком келудко ( 36,9 im 100 ООО населения) (Напалков Н.П., Мирабишвили В.М., i960). Однако, начиная с 60-х годов, повсеместно отмечается малообъпг нимое ее снижение. М.К.Стуконис (1964) приводит данные о тгм, что в 18 странах Заболеваемость раком желудка уменьшалась у мужчин и среднем на 2,5$, а у женщин - на 3$. В Японии, где на долю рака желудка приходится 37,7$ опухолей, последний подъем заболеваемости отмечен в 1968 году.

Пока что мало удовлетворительными остаются результаты рургического лечения - основного вида лечения при рпке желуде :> 5-летняя выживаемость после хирургического лечения опстяпляет, как правило, 10-28$ (Березов D.E., 1976 j Клименков A.A., JIp тягин В.П., Тихомиров Г.К. и др., 1977).

Неудовлетворительные результаты хирургического лечении ¡; будили многих исследователей к поиску причин данного факта- Тяч било выявлено влияние различных клинико-морфологических признаков на 5- летнюю выживаемость.

Влияние микроскопической формы роста опухоли показали Нп-. хин H.H. (1965), Серов В.В. <1970), Елохина Н.Г. (1976). Гивтологического строения - Серов B.B. (1970), Петерсон В,Ь (1972). Локализаций - Холдин С.А. (1953),Ekfr ei EfsKind (i960). Размеров опухоли -3a-towei&ß(I965). Степени атипизм--, опухоли и глубины прорастания стенки желудка - Серов В.В. (1970) ,K<*j¿^Лni (1965), Метастатического поражения регион;^; "их лимфатических, узлов -K«j ciomi.,ZcxcKo ei аl. (1963)-

Б ■ пьятютве этик йрнянзков окйзвввет сущестпс(п1гс влп» •чю на летнюю вйкиваеиссть после хирургического лечении.

В настоящее время изучению иммунологической реактивности ишшлигичвоких больных придается большое значение, поскольку нимунная система оказывает непосредственное влияние на возникновение и последующий рост опухоли. Результаты исследовали! взаимодействии организма и опухоли показывает, что росту опу-лшш организм противопоставляет прежде всего иммунную защиту ( Трапезников H.H., 1979 } ЕЬковская С.Н., Грунттенко Е.В., IStiZ,Thaier tl ut^97?tU9rrj/ U at. 1979, Vad^ ei of 1973, Ka-дагидзе З.Г. иди)., 1968).

Открытие гибридомной технологии tin, 1975)

предоставило новые широкие возможности развитию исследований н области иммунодиагностики злокачественных новообразований. Развитие иммунодиагностики опухолей в настоящее время полностью определяете« широким использованием моноклональных антител как в поисках новых маркеров, так и в практическом исполь аивашш (Г.И.АбсЛив, 1982).. Моноклональные антитела обладают стандартностью чистейших химических реактивов, выявляют минимальные антигенные различия между клетками в одну детерминанту и делают зти различия предметом количественных измерений, в том числе между опухолевыми и нормальными клетками, а также злокачественными клетками, различающими» по происхождению, что значительно расширило и усовершенствовало методы дшйиренциальной диагностики злокачественных новообразований с использованием моноклональных антител. Ионоклональные антитела используют для определения иммунологического фенотипа инухилевых клеток, присутствующих в крови и костном мозге, в иымуногистохимии, где они дают возможность выявить органную принадлежность мйтастадов опухоли, определить подиари-uiitu ь пределах ыо^филогически одну{ЦДН1;>. ц.'.^.г.-кдуй' ¿ши^пд

ения опухолево-ассоциированных. антигенов в сыворотке ::рови Кадагедзе З.Г., в соавт. 1968).

К настоящему времени в нлинико-радноиыыунологической ла-эратории ВОНЦ АМН ОССР получены ыоноклональные антитела к оп-эделенным этапам дифференцировки Т, В-лимфоцит'ов и миело-мсно-1тарных клеток. С помощью панели моноклональных антител полу-зны принципиально новые сведения о природе бластных клеток у )льных ХМЛ, выявлены различные подварианты бластного криза ХМЛ Зарышников A.D., в соавт. 1965). Вместе с тем, возможность введения иммунодиагностики рака желудка на основе применения (ноклональных антител еще недостаточно изучена.

Иммунологические маркер«, если они доступны, должны вне-'И свой вклад в понимание характерных особенностей рака же-дка. Поэтому изучение иммунологического фенотипа опухолевых :еток рака желудка.ö.помощью МКАТ является одним из актуальных просов онкологии. Особый интерес представляет отбор монокло-льных антител, специфически реагирующих с клетками рака же-дка. •

ль работы: Оценка значения идентификации ряда маркеров опу-левых и.иммунокомпетентных клеток в срезах рака желудка с мощью моноклональных антител.

я достижения зтой цели поставлены следующие задачи : Провести комплексную характеристику опухолевых клеток рака желудка с помощью моноклональных антител, реагирующих как с эпителиальными, так и с некоторыми "лейкоцитарными" антигенами.

Оценить в срезах рака желудка субпопуляции клеток, экспрес-сирующих Т-клеточные, миело-моноцйтарные и нелинейные антигены.

3. Проанализировать связь иммунологических параметров опухоли

с ее гистологический типом и клиническими проявлениями. Научная новизна:Впервые в СССР проведена комплексная характеристика клеток рака желудка по экспрессии ряда эпителиальных маркеров: Едо 34 (МКА НЕА 125); раково-аыбриональный антиген, детерминанта, отсутсуруицая на.лейкоцитах (МКА НЕА 19); антиген мембран Кировых ^\побул HMPî-I (МКА ИКО 25); молекул НАА-I и II класса (антрг.ела W 6/32,. ИКО 53, BEA 23/9, ИКО I, BEA 30/2, BEA FB 6); антигенов, присутствующих на опухолевых клетках и субпопуляциях лейкоцитов (Х-гагтена, МКА ИКО Г2 и BEA 4FI; ССЗЬ!-рецептор, МКА ИКО Ш; RFB-I антиген, МКА ИК0-40); а также антигенов, выявляемых моноклональными антителами ИКО 84 и BEA I0Ç. Охарактеризованы состав и количество в опухолевьо гистологических срезах иммунокомпетентных клеток, вкспрессирую-щих Т-клеаочные, миело-моноцитарные и нелинейные маркеры. Установлена взаимосвязи экспрессии ряда молекул (H&A-I и II класса, HUPCp-Z, EFB-I, Х-гаптена) на опухолевых клетках. Показано существование связи между гистологическим типом опухоли и Набором антигенов, экспрессируемых на мембране раковых клеток, а также степенью выраженности инфильтрации опухоли СД 5*' Т -лимфоцитами. Выявлено важное клиническое значение оценки экспрессии НАА-антигенов, EFB-I и Х-гаптена, как имеющих достоверно значимую связь с характером распостраненности опухолевого процесса (размером опухоли, наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы, клинической стадией).

Практическая значимость: -

1. Выявлен набор маркеров информативных с точки зрения связи с клиническим течением заболевания.

2. Показана возможность изучения этих антигенов с помощью

отечественных моноклональннх антител ИКО 53, ИКО I, ИКО 25, ИКО 40, ИКО 80, ИКО ГШ, ИКО Г2.

3. Комплекс этих антител внедрен в практику исследований у больных раком желудка в клинико-радиоиммунологической лаборатории ВОНЦ АМН СССР.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных данных, обсуждения и списка литературы. Материалы диссертации излодены на 124 страницах машинописного текста. Работа содержит 22 таблицы, I рисунок. Библиография включает.148 названий, из них отечественных авторов 21, зарубежных - 127.

Апробация работы; •

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отделения абдоминальной онкологии, клинико-радио-шмунологической лабораторий, диагностического отделения, отделения опухолей печени и поджелудочной железы, торакаль-юго отделения, отделения опухолей молочных желез, лаборатории отологической анатомии опухолей человека с прозектурой 3 июля [990 года.

Основные положения диссертации были доложены на итоговой шучной конференции ВОНЦ АМН СССР "Диагностика злокачественна новообразований", ноябрь 1989 года.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 3 на-■чных работы.

Материалы- и методы: i. Характеристика исследованного биопсиГлого материала опу-:олевых- срёзой.

Характеристика исследованного биопсийного материала 'опухоли

Исследование на крадетатных срезах проведено у 69 больных рако» желудка.

Распределение больных по гнсяологической классификации В(

Аденонарциноыа 41

Перстна-видноклеточный рак.-. 14

Ниакодифференцированный рак ' 4

Всего: 59

Клиническая стрдня: II - 25

III - 34

Размеры первичной опухоли: Т 2 - 14

ТЗ - 25

Т4 - 20

Наличие метастазов в регионарные «о - 42

лимфатические узлы Н1 - 17

П. Среды, реактивы, сыворотки, антитела

Для отмывания гистологических срезов от антител использовали синтетическую среду 199 на растворе Хенкса для культур тканей, приготовленную НИИ полиоыиеллита и вирусных энцефалитов АНН СССР г.Москвы и НИИ вирусных инфекций ИЗ РСФСР, г.Све! дловск.

Азид натрия. Готовили 2,5$ раствор азида натрия на физиологическом растворе. В сыворотки" добавляли азид натрия до конечно} концентрации 0,25$.

Диаминобензидин. Для проявления иммунопероксидаэной реакцм использовали диаминобензидин производства "Р(цкл"» раствор диамино бензидина готовили "ех4:9трвГае" (0,5 мг/мл с добав-

лениеы 2 ыкл 3% Н2О2).

Специфичность использованных моноклональных антител представлена в таблице I. 1

II. Реакция определения активности МНАТ'и иммунорёактивности антител с опухолевыми клетками.

1. Непрямая реакция поверхностной иммунофлюоресценции (РШ) на криостатных срезах.

Замороженные срезы (толщина 4-6 мзш) помещали по три среза на поверхность обезжиренных предметных стекол. Срезы фиксировали при комнатной температуре в течение 4 секунд. Перед окраской антителами срезы фиксировали в течение 10 минут в ацетоне при 4°С. Последующие' этапы реакции проводили при комнатной температуре во влажной камере. Инкубировали срезы 10 минут в среде 199 рН 7,2-7,4. ЖАТ наносили наЗО минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Наносили ЙИЩ - меченые Р(ав)<з -фрагменты антисыворотки против глобулинов белой мыши на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Срезы покрывали покровным стеклом и характеризовали антигенположительные клетки и структуры. Специфические реакции учитывали на микроскопе ЯеМгОг^ор^ап , (ФРГ). '

2. Прямая реакция-иммунофлюоресценции на криостатных срезах.

Срезы опухоли фиксировали в ацетоне, как описано выше. Отмывали в среде 199 10 минут. " Затем наносили ФИГЦ - меченые антисыворотки или моноклональные антитела и инкубировали 30 «мнут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервирован! 50$ глицерином на физрастворе и учитывали специфическое свечение на люминисцентнги шкроскопе.

■Таблица JP i

Специфичность отечественных й зарубежных моноклональдах антител, использованных в работе

* Кластер дифференцировки Название МКАТ

Дифференцировочные адаигены

Т - клеуок

I. ОД 5

Антигена Wik - I класса ИКО 80

m - I ыб/зг™

HiA - I ИКО 53

Ш - I BEA 23/9

Антрдедо Щ(к - П класса

la - подобный антигед ИКО I

Ш - П (Дй) BRA 30/2

Ш - II (ДР) ■ BEA FB6

НМ - U «Rf ДР) BRA I3/I

Мяе^одоороцитарные антигены

ОД Ив ИКО ПП

ОД 15 ИКО Г2

ОД 15 BRA 4 Pj

ОД 44 BEA IOQ

Дополнительные маркеры

ОД 10 ИКО 35

ОД 38 ИКО 20

ОД 45 ИКО 46, ИКО 59,BEA 5

2FB - I антиген ИКО 40

УНА - 4 антиген - f - церь К-20х; НКО 84

Раково-эмбриональный антиген НЕА - 19х*

Общеэпителиальный антиген НЕА - 125 хх

HMFU - I антиген ИК0-25

Примечание: Все МКА серии ИКО получены д.м.н. A.D.Барышниковым, МКАс отметкой хх - предоставлены (¿.ßoumseft )

отметкой хх - предоставлены (г.мольденхауером), ФРГ В ходе совместного сотрудничества в рамках 4 международного совещания -по кластерам дифференцировки человеческих антигенов (Вена,3969). МКА серии BRA предоставлены В.Хорват (Братислава) в ходе совместного сотрудничества. ,,

93. Иымуноферментный метод (Ш!)

ИммуноферментныЙ метод на криостатных срезах проводили сле-цующим образом. Срезы опухоли фиксировали в ацетоне как описано выше. Ингибировали активность эндогенной пероксидазы клеток с помощью 3% раствора перекиси водорода, 20 минут при комнатной температуре. Инкубировали срезы в среде 199 10 минут. Наносили первые антитела на 30 минут. Отмывали от антител в среде 199 10 минут. Наносили антисыворотку меченую пероксидазой против иммуноглобулинов мыши (производства ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР). Инкубировали 30 минут. Отмывали в среде 10 минут 199. Проявляли реакцию с помощью раствора диаминобензидина. Ядра клеток докрашивали гемотаксилином №ейера. Затем срезы заключали в 10$ раствор желатина, закрывали покровными стеклами и оценивали результаты реакции с помощью светового микроскопа.

При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакции учитывали полуколичественным методом. Ввделяли 3 типа взаимодействия антител с опухолью:, \

I) Отсутствие реакции ; 2) Мозаичная реакция (антигены присутствуют на части опухолевых клеток) ; 3) Мономорфная экспрессия антигена на опухолевых клетках.

При иммунофенотипировании имм^унокомпетентных клеток' в опухоли также вьделяли 3 типа иммунной реакции: I) Полное'отсутствие реакции (антигеноположительные клетки не определяются) ; 2) Слабый (умеренный) тип реакции (в опухолевом срезе

определяются единичные антигеноположительные клетки, располо-

>

женные разрозненно или мелкими группами) j 3) Выраженный тип иммунной реакции (множество антигенположительных клеток в срезе, могут встречаться крупные группы и инфнльтршиз этих клеток). -

Статистическая обработка результатов проводилась по методу Стьюденга.

Результаты.исследования и обсуждение Маркеры клеток рака желудка

Исследование ярухоле^ых клеток проведено на криостатных срезах рака желудка у 59 больных с использованием набора мо-ноклональных антител к эпителиальным и лейкоцитарным антигенам Вццеляли 3 типа реакции: полное отсутствие антигена на опухоли мозаичный тип экспрессии и мономорфный тип экспрессии. Частота встречаемости"каждого типа реакции-представлена в таблице 2.

Табл. 2 Частота выявления различных антигенов на клетках рака желудка

Антитела ! Тип реанции/кол-во набл. (%) /

! Отрицательный ! Мозаичный Шономорфный

НЕА-125 0/58 (0%) 3/58 (5,1%) 55/58 (94,9%)

НЕА-19 " 4/59 (6,6%) 13/59 (22%) 42/59 (71,4%)

ИКО-1 3/59 (5,1%) 10/59 (16,9%) 46/59 (78%)

\А/ 6/32 6/59 (10,1%) 5/59 (8,4%) 48/59 (81,5%)

ИКО-25 19/59 (32,2%) 20/59 (33,9%) 20/59 (33,9%)

ИКО-84 5/59 (8,4%) 19/59 (32,2%) 35/59 (59,4%)

ИКО-Ш 45/59 (76,2%) 11/59 (18,7%) 3/59 (5,1%)

ИК0-Г2 49/59 (83%) 7/59 (11,9%) 3/59 (5,1%)

ША 23/9 29/55 (52,7%) 17/55 (30,9%) 9/55 (16,4%)

Ш РВ6 32/54 (59,2%) 15/54 (27,7%) 7/54 (13,1%) ■

Ш 13/1 4/55 (7,3%) 12/55 (21,8%) 39/55 (70,9%)

ВКА 30/2 2/55 (3,7%) И/55 (20%) 42/55 (76,3%)

ША 10(5 ! 25/32 (78,1%) 3/32 (9,3%) 4/32 (12,6%)

ВЕА 4Р1 • 36/52 (69,2%) 11/52 (21,1%) 5/52 (9.7%) ■

ИКО-53 5/49 (10,2%) .. 2/49 14,3%) 42/49 (85,5%)

Данные представленные в таблице 2 свидетельствует о том, что наиболее часто (100% случаев) на клетках рака желудка выявлялся антиген Еур 34 (ЯКА НЕА-125), далее по мере убывания следовали раково-эмбриональный антиген (МКА НЕА-19) -93,2%:

jj-цепь Ш-4' (1Ш-20), МКА КК0-84, HMP3-I. В редких случаях обнаруживались антигены, выявляемые МКА ИКО-П1-1, ИК0-Г2, BRA IOC, BRA 4FI. ' _ .

Сравнение трех типов антител к мономорфной детерминанте молекул HIA-I класса (ЗПГ 6/32, ИКО-53, BRA 23/9) показало высокую частоту реакции (89,655) и полную идентичность реакции ЫНА W 6/32 и ИКО-53. МКА BRA 23/9 значительно реже (46,956) выявляли антиген на клетках рака желудка (в особенности моно-мод^иый тип экспрессии).

Сопоставление 4 типов МКА к антигенам H1A-II класса показало высокую частоту реакции (80$), полную идентичность в реакции с клетками опухоли различных антител к мономорфным детерминантам молекул ША-М (ИКО-I, BRA 30/2). Аналогичным образом были распределены и мономорфные детерминанты Н1А-ДЕ{ ♦ ДР - молекул (МКА BRA 13/1). Вместе с тем, молекулы HIA-Jp (ЫКА BRA ГВ6) выявлялись значительно реже (40,6$ случаев), причем преобладали случаи с незначительным количеством анти-генополокительншс опухолевых клеток.

Взаимозависимость экспрессии 5 маркеров на опухолевых клетках и гистологического типа опухоли представлена в т&б-лице 3. .

Типы лейкоцитарной инфильтрации опухолей желудка

Использовали ыоноклональныё антитела, позволяющие оценить всю совокупность лейкоцитов S.опухолевых срезах и не дающие перекрестной реакции с опухолью, BRA 55 (СД 45). МКА к мономорфным детерминантам НЬА-I класса (W 6/32, ИКО-53) также вьивляют все лейкоциты в срезах рака желудка, неудобством в их использовании при оценке иммуно.компетентных клеток является высокая частота перекрестной реактивности с собственно опухочетш -зчемонтами. Субпопуляци» Т-.к ш v. i; .ь

Иммунофенотип опухолевых клеток при раке желудка

и» Больной. ** в И О и а р к е ры

морф. НЕА125 НЕА19 У/6/32 Ш-л ИКО-2

I 2 3 ' 4 5 6 7 8

1-Г-я. Ж + + : + + _

2. С-в АК + + + + +

3, Р-в* АК + + + - ,

4. К-в АК + . + + + -

5. М-в /К . + + - +

б. 8-в АК + + + ± ±

7. &-а АК + - ■ + -

8. У-в АК + + + +

9. 3-в АК + + + - ' +

10. Л-н 6и + ' + + + -

И. А-в АК + + + + +

12. Р-в АК + + ' + + +

13. Р-в АК + + + + +

14. Р-в АК + + + +

15. Ф—а АК + • + + + +

16. Х-в АК . + - + + + +

17. С-н АК + + + ±

18. И-о АК + + + + +

19. Г-в АК + . + + + +

20. Т-н АК + + + + +

21. В-ч АК + + + +

22. В-в АК + + + + +

23. С-ч АК + + + + +

24. в-в АК + + + + -

25.,Ш-н АК + + + - -

26. Д-и АК + + + ♦

27. М-а АК + + + - +

28. М-е АК + + + + -

29. К-о АК + + + + -

30. Р-в АК + + ±

31. С-в АК + + + + -

.ijji^Hi.-ji'iM-lHI'

Таблицы №3

I 2 3 *L 5. ' 6 7, 8

32. Н-в . АК t + + + -

33. К-в АК + + + +

34. Л-н АК + + + - +

35. Ш-а АК + + + + +

36. Ч-в АК. + + + + -

37. С-н АК + - + + - -

38. Ж-а АК + + + +

39. Е-а АК + + + + -

40. Ч-а АК > - - + ±

41. П-а АК + + - + -

42. М-в ПР + + - + -

43. 0-и ПР + + + - • +

44. М-й ПР + + + + +■

45. М-а ПР + + + + +

46. С-а ПР + + + + +

47. С-в ПР + + + + +

48. Н-в ПР + + + + -

49. М-а ПР + + + + +

50. Л-в ПР + + . + - +

51. К-в ПР + + + - +

52. Д-я , ПР + + + + +

53. Ч-в ПР + . - + + +

54. Э-в ПР + - + , + +

55. Б-н ПР + + + +

56. П-а HP + + + + +

57. Г-в HP + ± + + -

58. Б-а HP + t ' a. + +

59. Л-н HP + + - + +

срезах оценивали по маркеру СД5 (ЫКА ИК0-80). Клетки миело-

моноцитарного ряда изучали с помощью МКА ИК0-ГЫ1, ИК0-П2, ВЕЛ

4Р1. В качестве нелинейных и антивационных маркеров были испо;

зованы антигены Т-10, ¡^ и некоторые другие. Частота различию

типов выраженности гадвунной реакции представлена в таблице 4,

, ,'. Таблица М

Выраженность иммунных реакций в срезах келудка, выявляемых с помощью моноклональных антител

ЫКА I __

I Отсутствует ! Слабая I Выраженная

Тип реакции

БРА 65 УУ 6/32 ИКО-53 ВЕА 23/9 ИК0-80 ИКО-Ш ИКО Г2 ША 4Л ИКО-1 ВЕА 30/2 ВЕА РВ6 ВЕА 13/1 ИК0-20 ИК0-40 К-20

0/54 (0$) 2/59 (4,6$) 2/48 (4,1$) 17/55 (30,9$) 8/59 (13,5$) 25/59 (42,4$) 13/59 (22$) 9/52 (17,2$) 2/59 (3,4$) 2/55 (3,7$) 6/54 (29,7$) 1/55 (1,9$) 1/59 (1,8$) 10/59 (18,1$) 10/59 (18$)

7/54 (12,9$) 5/59 (8,3$) \ 3/48 (6,2$) 21/55 (38,2$) 17/59 (28,8$) 14/59 (23,7$) 24/59 (40,6$) 16/52 (30,7$) 6/59 (7,2$) 11/55 (20$) 21/54 ^¿8$) . 9/55 (16,3$) 20/59 (35,5$) 17/59 (28,8$) 16/59 (26,1$)

47/54 (87,1$) 52/59 (87,1$) 43/48 (89,7$) 17/55 (30,9$) 34/59 (57,7$) 20/59 (33,9$) 22/59 (37,4$) 27/52) (52,&) 51/59 (89,4$) 42/55 (76,3$) 17/54 (31,5$) 45/55 (81,8%) 38/59 (62,7$) 32/59 (54,1$) 33/59 (55,9$)

Анализ иммунологических данных

Анализ иммунологических данных проведен по двум аспектам; I. Оценка взаимосвязи экспрессии различных антигенов на клет-ках-опухоли; 2. Оценка взаимосвязи иммунного ответа ¿а ьС-Ьц. с иммунофенотипом опухоли.

Проведена маркерная характеристика опухолей, различающихся по экспрессии моноиорфных детерминант Н1А-1 класса (УУ 6/3< и ВЕА 23/9), детерминант НН-11 хласса-ДЕ (ИКО-1), ДР (ВЕА Ш НМРС-1- антигена (МКА ИКО 25), Х-гаптена (СД 15, ЫКА ИК0Р2),

—iD-

Il EFB-I антигена (МКА ИК0-40) Полное или частичное (мозаичная экспрессия) отсутствие HEA-I-' антигенов на клетках рака желудка в реакции со стандартными МКА к ыономорфной детерминанте HSA-I антигенов (W 6/32) наблюдали у II из 59 больных (18,6%). Мы провели сравнение частоты встречаемости различных иммунологических паркеров на клетках опухоли в этой группе и в группе с ыономорфной экспрессией H5A-I молекул. При наличии на клетках молекул HÎA-I класса (IV' 6/32) значительно чаще определялись ыолекула~Н2А-1, выявляемые другими МКА (ИКО-53 -92,3% и 44,4%, р<0,05, BEA 23/9- 20% и 0%, р<0,05), молекулы HIA-П класса (ИКО-I, BEA 30/2, BRA I3/I). Таким образом, при наличии на опухолевых клетках молекул HIA-I класса (W 6/32) в абсолютном большинстве случаев присутствуют другие детерминанты HIA-I, а также молекулы ДО и ДЕ + ДР - II класса НИ. Связь экспрессии молекул HIA-I класса с другими маркерами не ограничивалась анти-. генами HJA-I и II. Экспрессия CR ЗЫ - рецептора (СД Ив) наблюдалась только в группе HIA-I +(УУ 6/32), в пределах Ш 6/32" -опухолей мы не наблюдали CP3bi- положительных случаев. Однако в силу малого числа наблюдений эти различия'недостоверны (-¿-1,8, р>0,05). Все 20 случаев EFB-I4" - опухолей были сосредоточены в НИ-Г* группе, что достоверно отличает их от HIA-Г - фенотипов (Р<0,05). В числе других особенностей опухолей с ыономорфной экспрессией молекул HIA-I класса (IV 6/32) отмечается более высокая частота встречаемости детерминанты Хг-гаптена (Б8А 4FI) антигена, определенного МКА ERA I0C5 (по-видимому СД 44); а также ыономорфной экспрессии РЭА на опухолевых клетках. Все эти различия статистически значимы. •

Как мы уже отмечали распределение на клетках рака желудка антигенной детерминанты H2A-I.класса,, выявляемой МКА ESA 23/9,

-Не-

существенно отличается от распределения стандартной мономорф-Hot терминанты HIA-I, выявляемой МКА IV 6/32 и ИКО-53. Связ! эхсь^.ссии антигена BRA 23/9 с другими маркерами таковы, что отмечается более высокая частота экспрессии молекул BfA FB6 и Х-гаптена (ИК0-Г2) при наличии BRA 23/9, однако эти различия не достоверны.

Мономорфная экспрессия молекул НЬА-ДЕ (МКА ИКО-I)/отмечена в 13 из 59 случаев рака желудка (22%). Эти две группы существенно различались по иммунологическому фенотипу опухолевых клеток. 2йесь, как и в случае анализа W 6/32+ и ¥¥ 6/32" -опухолей, отмечена связь между антигенами HIA-I и II классов на злокачественных клетках. В Н1А-ДЕ- положительной группе (ИК0-1+) достоверно чаще наблюдались такие маркеры, как HIA-I (УУ 6/32, ИКО 53), а также мономорфные детерминанты Н1А-ДР+ДР (МКА BRA I3/I). Все перечисленные различия статистически значимы. Интересно отметить, что выраженная ассоциация экспрессии HIA-flR антигенов (ИКО-I) наблюдалась с HMFÇ-I (ИКО-25) и RFB-I - антигеном (МКА ИК0-40). Антиген СД 44 (МКА BEA I0Q) был представлен только на опухолях, экспрессирующих HIA-flR -антигены (ИКО-I), однако следует отметить, что число наблюдении в 1а" - группе было невелико.

Другой маркер HIA-II класса (HIA-ДР), распознаваемый МКА BRA ÎB6 имел определенные отличия в распределении от детерминанты ИКО-I. Эти различия касались EFB-I антигена (не получено достоверных различий в частоте EFB-I+ в BKA FB6+ и BRA FB6" -группах; тип распределения однотипен таковому в ИК0-1+ и ИКО-1' ^трушрх") .-большая';чэсТ'ота 81^1 v-; случаев' при'наличии Н1А-ДР). й. ряда других .антигенов.'.MCA.BRÄ-.2.3/9 ■ (HIA-I) достоверно-'чаще рёегиговгли с опухолями,-клетки .котоГ-ùx окрошнвплись LÎKA FB6'.

-г#

Экспрессия ША РВ6 наблюдалась чаще в НМРО-Г случаях рака желудка, а СЕЗЫ- рецептор на опухолевых клетках присутствовал достоверно чаще в НМИ«-1+ - группе (р<0,05). По остальным маркерам различии не отмечено.

Экспрессия Х-гаптена (СД15) на опухолевых клетках отмечена в 10 из 59 (16,9^) случаев рака желудка. ОД 15+ и СД 15" опухоли имели определенные различия по фенотипу. Этн различия касались ЕРВ-1 антигена (ИК0-40), а также антигенов, присутствующих наряду с опухолевыми на клетках гранулоцитарного ряда. КЕВ-1 антиген присутствовал достоверно чаще в группе опухолей, экс-прессирующих Х-гаптен (ЫКА ИК0-Г2). Аналогичные данные получены для распределения антигенов, выявляемых ЫКА ИКО-Ш-1 и ИКО-84.

Экспрессия ЕРВ-1 антигена (МКА ИК0-40) отмечена в 41 из 59 (70^) случаев рака желудка. Этот антиген достоверно чаще встр( чается в группе опухолей, экспрессирующих Н1А-ДЕ-антигены (ИК0-1) Отличий в маркерном профиле по другим антигенам мы не наблюдали.

Связи в экспрессии антигенов НЬА-1 и II классов, НМРС*-1, ЕРВ-1 и антигенов, присутствующих на глетках миелоидного ряда (Х-гаптен, ЫКА ИКО-84, СЕЗЫ- рецептор) дают во многом объяснение взаимозависимости иммунологических параметров с гистологическим- типом опухоли и рядом клинических характеристик, представленных в следующем разделе.

Другим типом иммунологических сопоставлений явился анализ взаимосвязи выраженности иммунных клеточных реакций, определяемых в срезах с помощью моноклональных антител, и иммунного фенотипа клеток первичной опухоли. Анализировали субпопуляции Т-клеток (СД 5+), миело-ыоноцитарных клеток, а также клеток, экспрессирующих линией неограниченные антигены. Анализ проведен в трех различающихся по иммунсфенотипу группах рака желуд-. Чаркой связи между гираженностыо иммунных реакций Т, мне;!.)-

-А8-

мононитарных клеток и клеток, вкспрессирующих линией неограничен) антигены, с фенотипом первичной опухоли (маркеры ШЗ-1, НМПЗ-1 и Х-гаптен) не обнаружено- .

Клинико-иммунологические сопоставления

Клиническое значение выявленных маркерных особенностей • опухоли проводили по 2 критериям: I. Сопоставление с гистологической структурой опухоли; 2. Анализ связи со стадией заболевания,, размером первичной опухоли и вовлеченностью регионарных лимфатических узлов.

Суммарно данные по частоте встречаемости аденокарциномы, перстневидноклеточного рака и низкодифференцированного рака в антигенпозитивной и антигеннегативной группах представлены в таблице 5.

Достоверная связь с гистологическим типом опухоли отмечена для следующих антигенов: НМР(«-1, Х-гаптен, антигены НЬА-1 клас-' са. .,' .'.''"■'.

Тип и интенсивность иимуннрго ответа!«. также имели

определенную связь с гистологическим типом опухоли. Выраженная пролиферация Т-клеток (СД 5+, ИКО 80) отмечена значительно чаще при аденокарциноме (68,3$), чем при перстневидноклеточноы раке (28,6$).Достоверных различий в частоте встречаемости других типов иммунокомпетентных клеток не отмечено (Таблица 6).

Существование достоверных связей таких клинических параметров как размеры первичной опухоли, поражение регионарных лимфатических узлов и.клиническая стадия заболевания с иммуно-. фенотипом, опухолевых клеток наглядно показано в таблицах 7, 8, 9.'

Эти взаимосвязи характеризуют делецию молекул НЬА-1 и II класса по мере опухолевой прогрессии, связь ряда других марке-рон. (СТВ-!) с процессами опухолепого роста инг-там ''.чч'рж&нин,

Таблица 5.

Взаимосвязь иммунофенотипа и гистологического варианта опухолей желудка

Иммунологи-_Гистологический тип опухоли

ческие маркеры аденокарцинома Перстневиднокле-точный рака Низкодифференцир! ванный рак

W6/32+ W6/32" Т.Р 36/48« (75%) 5/II (45,5%) 4,7; <0,05 10/48 (20,8%) 3/II (27,3%) 0,45; >0,05 2/48 (4,2%) 2/II (18,2%) 4.8; <0.05

ИК0-1+ ико-г Т.Р 31/46 (67,4%) 10/13 (76,9%) 1,4; >0,05 10/46 (21,7%) 3/13 (23,1%) 0,1; >0,05 4/46 (8,7%) 0/13 (0,4%) 2.1; <0,05

BRA ЕВ6+ 16/22 (72,755) 4/22 (18,2%) 2/22 (9,1%)

ERA ЕВб" 22/32 (68,8%) 8/32 (25%) 2/32 (6,3%)

Т.Р 0.3; >0,05_0.62; >0.05 0.37; >0.05

ИК0-Г2+ 8/10 (80%) 2/10 (20%) 0/10 (0%)

ИК0-Г2" 33/49 (67,3%) 12/49 (24,5) 4/49.(8,2%)

Т.Р 0.88; >0,05 0.54; >0,05 2.1; <0.05

ИК0-40+ 28/41 (68,3%) 8/41 (19,5%) 3/41 (7,8%)

ИК0-40" 13/8 (72,2%) 6/18 (33,3%) I/I8 (5,6%)

Т.Р_0.3; >0,05__1,2; >0,05_0,4; >0,05

ИКО 25+ 25/40 (62,5%) ' 12/40 (30%) 3/40 (7,5%)

ИКО 25" 16/19 (84,2%) 2/19 (10,5%) I/I9 (5,2%)

Т.Р__1.9; >0.05 2.02; <0,05 0.4; >0.05 _

BRA 23/9+ 17/26 (65,4%) 8/26 (30,8%) . 1/26 (3,8%)

ERA 23/9" 21/29 (72,4%) 5/29 (17,2%) 3/29 (10,3%)

Т.Р • 0,58; >0,05 1,18; >0,05__0,97; >0,05

Примечание: В знаменателе - число антигенпозитивных (антигегаю-гативных) случаев рака желудка; в числителе - кол-ви . больных с определенным гистологическим типом в пределах антигенпозитивной (антигеннегативной) группы.

Частота встречаемости выраженной реакции■иммунокомпе-тентных клеток при различных'гистологических типах рака желудка

гистология ' ЫКА ' : Адено карцинома Перстневидноклеточный рак Низкодифференцированньгй рак

ИКО 80 28/41-60,3%* 4/14-28,6%* 2/4-50%

ИКО 20 26/41-63,4% 9/14-64,9% 3/4-75%

Б6А-55 32/37-^86,5% ХО/ХЗ-76,9% 4/4-100%

ИКО Ш 14/41-34,1% 5/14-35,7% 1/4-25%

ИК0-4О 22/41-57,7% 8/14-57,1% 2/4-50%

ВКА ГВ6 13/38^34¿2 2/12-16,7 2/4-50%

ИКО-1 37/41^90,2% - .И/14г7в,€% ; 3/4-75%

я) Частота встречаемости выраженной £ёа&цйй" СДЕТ* Т-лиыфоциуов достоверно вше .при аденокарциноме, чем при перстневидноклеточном раке, р<0,05.

Связь антигенного фенотипа «леток рака желудка и размера первичной опухоли (Т по ТА^ II)

Маркер Размер по Т#М

Т2 ■ ТЗ Т4

У/6/32+ \^6/32" Т,Р 9/48 (18,8$) З/И (27,3) 0.58; >0.05 24/48 (50$) 2/П (18,2$) 2,3; <0,05 15/48 (31,3$) 5/11 (45,5$) 0,86; >0,05

ИК01+ ИКОГ Т.Р 12/46 (26,1$) 1/13 (7,7$) 1.9:.>0,05 22/46 (47,8$) 4/13 (30,7$) 1.2 ; >0.05 12/46 (26,1$) 8/13 (61,5$) 2,4 ; <0,05

ВБА НВ6+ БЕА РВ6" Т,Р 6/22 (27,3$) 7/32 (21,9$) 0,45: >0,05 8/22 (36,4$) 17/32 (53,1$) 1,13; >0.05 7/22 (31,8$) 9/32 (28,1$) 0,21; >0,05

ИКО Г2+ ИКО Т2~ Т.Р 5/10 (50$) 8/49 (16,3$) 2.13; <0,05 4/Ю (40$) 22/49 (44,9$) 0,28; >0,05 1/10 (10$) 19/49 (38,8$) 2,46; <0,05

ИКО 40+ ИКО 40" Т.Р Н/41 (26,8$) 2/18 (11,1$) 1,15; >0.05 19/41 (46,3$) 7/18 (38,9$) 0,53;>0,05 11/41 (26,8$) 9/18 (50$) 0.97;>0,05

ИКО 25+ ИКО 25" Т.Р 10/40 (25$) 3/19 (15,8$) 0.79; >0.05 17/40 (42,5$) 9/19 (47,4$) 0.35; >0.05 13/40 (32,5$) 7/19 (36,8$) 0.31; >0,05

ША 23/9+ Ш 23/9" Т.Р 4/26 (15,4$) 9/29 (31$) 114; >0,05 15/26 (57,7$) 10/29 (34,5$) 1,8; >0,05 7/26 (26,9$) 10/29 (34,5$) 0.61; >0,05

Связь антигенного фенотипа клеток рака желудка с наличием метастазов в регионарные лимфоузлы (// по Т/УМ)

Маркер Индекс по Т/Г И

No ^

W6/32+ W6/32" Т.Р ' 34/48 (70,8%) 8/11(72,2%) 0,13; >0,05 14/48 (29,2%) 3/II (27,3%) 0,28; >0,05

ИКО 1+ ИКО I" 37/46 (80,4%) 7/13 (53,8%) 11/46 (23,9%) 6/13 (46,2%)

Т.Р 4,5; >0,05 1,5; >0,05

BEA FB6+ BRA ЕВ6" Т,Р 17/22 (77,3%) 23/32 (71,9%) 0,45; >0,05 5/22 (22,?%) 9/32 (28,1%) . 0,45; >0,05

ИКО Г2+ ИКО Г2~ Т.Р 6/10 (60%) 36/49 (73,5%) 0,8; >0,05 4/Ю (60%) 13/49^(26,5%) 0,95; >0.05

ИКО 40+ ИКО 40" Т,Р 33/41 (80,5%) 9/18 (50%) 2,29; <0,05 8/41 (19,5%) 9/18 (50%) 2,29; <0,05

ИКО 25+ ИКО 25". Т.Р ' 30/40 (75%) 15/19 (78,9%) 0,34; >0,05 10/40 (25%) 4/19 (21%) 0,34; >0,05

BRA 23/9+ BRA 23/9" Т.Р 21/26 (80,8%) 19/29 (65,5%) • 1,3;>0,05 6/26 (23,1%) 9/29 (31%) -0,67; >0.05

Таблица 9

Связь антигенного фенотипа клеток рака нелудка с клинической стадией заболевания

Маркер _Клиническая стадия__

_П стадия_Ш стадия

W6/32+ 21/48 (43,8%) 27/48 ( 56,3%)

W6/32" 4/И (36,4%) 7/II (63,6%)

Т,Р___0,46; >0,05 0,45; >0,05

ИКО I* 24/46 (52,2%) 22/46 (47,8%)

ИКО Г I/I3 (7,7%) 12/13 (92,3%)

Т.Р___4,3; <0,05__4,3; <0,05

BRA FB6+ 10/22 (45,5%) 12/22 (54,5%)

BRA FB6" 15/32 (46,9%) 17/32 (53,1%)

Т.Р____ O.I; >0,05 _0,007 >0,05 _

ИКО Г2+ ■ 5/10 (50%) 5/10 (5(Ю

ИКО Г2~ 20/49 (40,8%) 29/49 (59,2%)

Т,Р___0,53; >0,05__0,53; >0А05

ИКО 40+ 21/41 (51,2%) 20/41 (48,8%)

ИКО 40" 4/18 (22,2%) 14/18 (77,8%)

_Т,Р___ 2,23; <0,05_ 2,32; <0,05

ИКО 25+ . 18/40 - (45%) 22/40 (55%)

ИКО 25" 7/19 (36,8%)f 12/19(63,2%)

Т,Р___0,59; >0,05 , 0,62; >0,05

ВКА 23/9+ , 13/26 (50%) - " 13/26 (50%) BRA 23/9" 12/29 (41,4%) 17/29 (58,6$) Т.Р_0,72; >0.05_0,64; >0.05

Выраженность иммунных реакций не была связана с этими к, вескими парамеЦзамя^вЛухоли.

Существующая взаииозабисигоеть в экспрессии иммунологических маркеров на опухолевых клетках, бе связь с гистологическим типом опухоли, проявлениями местного Т-клеточного иммунитета и клинической картиной заболевания отражает комплексность развития опухоли. Биология самой опухолевой клетки, возможно, являются одним из определяющих факторов, влияющих на распространение процесса в организме. В этом контексте маркерные особенности раковых клеток в группах больных раком желудка, различающихся по клиническому течению, нуждаются в дальнейшем анализе и заслуживают пристального изучения.

ВЫВОДЫ

I. Отечественные моноклональные антитела ИКО-53 к моно-морфной детерминанте HIA-I антигенов идентичны международному стандарту W 6/32 в исследованиях клеток рака желудка и отличаются по типу.выявляемой экспрессии антигена от антител BEA 23/9.

2. Отсутствие НЬА-I антигенов (W 6/32) наблюдается на опухолевых клетках в 18,656 случаев рака желудка, сопровождается снижением других молекул HIA-I, II классов, ÏFB-I, РЭА, антигенов, выявляемых ЫКА BEA I0G и BEA 4FI.

3. МКА к антигенам HIA-II класса (ИКО-1, BEA 30/2, BEA I3/I) выявляет сходный тип распределения на клетках рака желудка и отличаются от Ш BEA РВ6.

4. Антигенное упрощение клеток рака желудка по экспрессии молекул Ш-ДВ (МКА ИКО-1) наблюдается в 20% случаев, как правило, при отсутствии НЬА-Г антигенов и сопровождается снижением HMFG-I, EFB-I и других антигенов,

5. Иммунокомпетентные клетки, выявляемые с помощью монокло-нальных антител в гистологических срезах рака желудка экспрес-сируют широкий набор активационных, Т-клеточных и миеломоно-цитаршх антигенов. Суммарную выраженность инфильтрации опухоли иммунокомпетентными клетками позволяют оценить ЫКА BKA 55 к общелейкоцитарному антигену Т200.

6. Выраженность реакции иымунокомпетентных клеток, обнаруживаемых с.помощью ЫКА в среаах опухолей желудка, не связана с маркерными составом этих опухолей.

7. Гистологическая форма опухоли и ее антигенный состав взаимосвязаны: аденокарцинома достоверно чаще обнаруживается при HIA-I + фенотипе, а перстневидноклеточный рака - при наличии на опухоли HUFGr-I антигена.

8. Степень инфильтрации опухоли Т-клетками зависит от гистологического типа опухоли: выраженная реакция СД5+ Т-лиыфо-цитов достоверно чаще наблюдается при аденокарциноме, чем при перстне видно клеточном ране.

9. Утрата экспрессии молекул HIA-I и П классов клетками опухоли связана с увеличением частоты обнаружения опухолей большое размеров (Т4), более частым поражением регионарных лимфатических узлов и наблюдается, главным, образом, при III клинической стадии заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.Н.Тупицын, З.Г.Кадагидзе, Г.И.Губима, В.И.Роттенберг, А.К.Ыаиишев. Доминирующая субпопуляция лимфоцитов в слизистой желудка при раке. /Общесоюзная конференция "Актуальные вопроси

I биохимической и иммунологической диагностике злокачественных гавообразований" ВОНЦ-АМН СССР, Москва, 1989г, c.77-?t.

2. А.К.Макишев. Исследование опухшшй желудка н гистологи-

ческих срезах с помощьв ыоноклональных антител /ВНИИМИ Мини-стерс i здравоохранения СССР, Москва, 1990, JHI,?'-

3. Тупицын H.H., А.А.Клименков, З.Г.Кадагидзе, А.К.Макишев, В.И.Роттенберг, Г.И.Г^бина. Клиничгеокое значение оценки экспрессии мономорфных детерминант молекул НЬА-I и II классов на клетках рака желудка. /"Вестник онкологии" ВОНЦ АМН СССР, Москва, J? 3.

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ВОНЦ АМН СССР подп. К ПЕЧ АТИ 20.e.Q0n--3AK.49il ТИРАЖ lot)