Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моноклональные антитела к поверхностным антигенам моноцитов человека и изучение их биологических свойств

121 G 9 9 2

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЗДЕЕШЩ

КИРЮХИН Алексей Юрьевич

МОНСШЮШЬНЫЕ АНТИГЕНА К ДОВЕРШОСШИ АНЕИГШАМ МОНОЦИТОВ ЧЕДОВШ. И ИЗУЧШИЕ ИХ ШСЙ01ЖЖЖИХ свойств

14.00.36 - Аллергология в иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой отедени

кандидата медицинских наук i . Москва

1992

ИШТИГУТ ШИУН010ГИИ

т

На правах рукописи

Работа выполнена в Институте иммунология Минздрава РФ Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор 3вьюков В.М. кандидат биологических наук, Филатов А.В;

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, дрофеооор Динегнн Б.В. доктор медицинских наук, профеооор Литвинов В.И.

Ведущая организация - Роооийокий Государственный Медицинский Университет

Защита двооергации оостоитоя " " 1992 г.

в часов на заседании специализированного совета Д 074,09.01 Института ищунологии но адресу: 1X5478, Москва, Каширское шооое, д. 24, корп. 2 С диссертацией деохно ознакомится в библиотеке Института;

Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А. В. Колобов

1С.-- ¿АЛ БИБЛИОТЕКА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблеммы.

Иэноциты периферической крови являются важным звеном в иммунной системе человека. Благодаря своим свойствам фагоцитировать чужеродный материал, опосредовать антителозависимую цитотоксичность (АЗЦТ), вырабатывать ряд факторов, они принимают активнейшее участие в защите организма, фундаментальная роль в процессировании и представлении антигенов обеспечивает" ключевую функцию этих клеток в индукции иммунного ответа, а регуляция клеточной пролиферации, регенерации, различных типов метаболизма и т.д. - их существенное значение в поддержании клеточного гомеостаза и других процессах. В патогенезе многих заболеваний иммунной системы лежат дефекты функционирования моноцитов. Поэтому изучение рецепторного аппарата и функционирования этих клеток может расширить знания об иммунной системе человека, поможет рещить некоторые практические проблемы клинической иммунологии.

Удобным инструментом в исследованиях такого рода могут стать моноклональные антитела (МКАТ). С их помощью можно не только маркировать поверхностные структуры клеток, определяя их принадлежность к той или иной популяции, но и изучать тонкие механизмы функционирования клеток. В институте Иммунологии ЫЗ СССР уме несколько лет ведутся работы по получению и использованию МКАТ к поверхностным маркерам лимфоцитов человека Так, получена панель МКАТ к дифференцировочным антигенам Т-лимфоцитов. В-лимфоцитов, которые нашли свое применение в клинике. Излучение ШАТ к поверхностным рецепторам моноцитов позволило бы расширить спектр антител, применяемых в клинической иммунологии, и помогло бы в изучении некоторых особенностей функционирования этих клеток в норме и патологии.

- г -Цель работа

Получение моноклональных антител к поверхностным антигенам моноцитов человека, характеристика их, исследование функциональной активности, изучение возможности применения для иммунодиагностики.

Задачи исследования.

1. Получение гибридом к поверхностным антигенам моноцитов' человека

2. Серологическая и иммунохимическая характеристика полученных антител.

3. Характеристика поверхностных структур моноцитов, распознаваемых полученными антителами.

4. Исследование функциональной роли структур, выявляемых полученными антителами.

5. Изучение возможности использования подученных ЫКАТ для фенотипкрования моноцитарного звена иммунной системы в норме и при некоторых формах лимфопролиферативных заболеваний.

Научная новизна.

- Получены 5 гибридом, секретируюцие моноклональные антитела против поверхностных антигенов моноцитов чс тавека.

- Проведен корреляционный анализ экспрессии дифференциро-вочных антигенов, выявляемых коммерческими ЫКАТ известной специфичности и полученными ЫКАТ.

- Излучены два ЫКАТ, Т5611 и ЛШОО, выявляющие два эпитопа одного антигена, обладающего характеристиками, отличными от характеристик известных антигенов.

- Обнаружено, что )ТАТ Т5И1 ингибирует Рей-опосредованные функции моноцитов, благодаря необычному углеводному составу Гс фрагмента ЫКАТ.

- Получено шит Т5(д11 с измененным углеводным составом Рс-

фрагмента, обладающее особыми функциональными характеристиками.

- Найдено, что полученные ЫКАТ модно применять в качестве реагентов для иммунофенотипирования больных с некоторыми формами лимфолейкозов.

Практическое1 значение работа Получены гибридомы, которые могут быть использованы для наработки МКАТ в больших количествах. ЫКАТ, продуцируемые этими гибридомами распознают поверхностные структуры, характерные, в основном, для моноцитов периферической крови человека. Эти лтитела могут использоваться в фундаментальных исследованиях для изучения субпопуляционной структуры лимфоцитов. Полученное антитело Т5611, ингибируюдее ГсИ-оп^с-редозанные функции моноцитов, может быть использовано для изучения некоторых аспектов функционирования моноцитов, а в прикладных исследованиях - для оценки иммунного статуса в норме и при патологии, фенотипирования некоторых форм лимфо-пролиферативных заболеваний. Полученные ЫКАТ нашли применение в гематологическом отделении больницы им. Боткина и в ВНГЦ Ю СССР для иммунофенотипирования больных, стр?-ающих острыми и хроническими формами моноцитарных, миеломоноцитарных и миело-монобластных лейкозов.

Публикация результатов исследования и апробация материалов работа По теме диссертации опубликовано 4 работа Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конкурсе молодых ученых (февраль, 1989) и на межлабораторной конференции Института имыунологмм МЗ СССР (май, 1991).

- 4 -

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, включая материалы и методы исследования, обсуждения, выводов. Содержит 4 таблицы и 13 рисунков. Список литературы включает 155 работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Для получения моноклональных антител против поверхностных антигенов моноцитов, клетки мышиной миеломы Х53.653 гибриди-зовали с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных мононуклеарами периферической крови человека. Культу-ральную жидкость гибридом исследовали на наличие антител методом иммунофдуоресценции на проточном цитометре EPICS С Coultronics (Франция). В качестве клеток-мишеней использовали суммарную популяцию мононуклеарных клеток, полиморфнонуклеар-ные клетки, моноциты тромбоциты, эритроциты, перитонеальныэ макрофаги (М$) и Щ> грудного молока, а так же к.г?тки некоторых опухолевых линий человека. Отобранные гибридомы дважды клонировали, а МКАТ накапливали в виде культуральных или ас-цитных жидкостей. МКАТ выделяли высаливанием сульфатом аммония с последующей очисткой ионообменной или аффинной хроматографией на белок А-сефарозе. Чистота выделенных антител контролировалась с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Некоторые- антитела коныогировали с биотипам или с изотиоцианатом фяуоресцеина (ФИТЦ). Изотипы МКАТ определяли иммуноферментным методом с помощью набора изотип-специфичес-ких реагентов (Calblochem). Специфичность полученных МКАТ ус-

танавливали на основании данных по сравнительной реактивности антител с антителами известной специфичности серии Leu, а также на основании данных определения молекулярных масс антигенов и данных по распределению реактивности полученных МКАТ с клетками различных популяций и опухолевых линий.

Возможность применения порученных ЫКАТ в качестве маркеров моноцитарного звена иммунной системы исследовалась у здоровых доноров и у больных, госпитализированных в г¿матологичнском отделении больницы им. Боткина и в ВГНЦ МЗ СССР с диагнозами острый и хронический моноцитарный лейкоз, миеломоноцитарный и ыиелобластьый лейкозы.

Исследовали влияние полученных ЫКАТ на такие функции моноцитов, как адгезия, фагоцитоз, АЗЦТ, генерация кислородьых радикалов. В реакциях фагоцитоза и АЗЦТ в качестве мишеней использовали эритроциты барана (ЭБ), опсонизированные специфическим кроличьим IgG. Генерацию кислородных радикалов изучали по восстановлению нитросинего тетразолиевого( HCT), мишенями в этом случае служили или ЭБ, опсонизированные IgG, или зимозан. Анализировали связывание моноцитов с ЭБ, опосредованное рецепторами к третьему компоненту компонента (CR3). В этом случае, ЭБ обрабатывали последовательно специфическим кроличьим IgM и сывороткой человека

В ряде случаев выделяли фрагменты МКАТ, которые получали при расщеплении иммуноглобулинов протеолитическими ферментами - трипсином и пап айном.

Лектин-связывающие характеристики МКАТ исследовали иммуно-ферментным методом. Негликозилированные ЫКАТ получали при культивировании гибридомных клеток в среде с туникамицином (ТЫ).

- 6 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение МКАТ и их характеристика.

В результате серии гибридизаций получены 5 гкоридом, сек-ретирувдие МКАТ, которые условно обозначили Т5611, ЛЫ100, ЛШ4, SMS и 307. Связывание этих ЫКАТ с различными клетками лимфоидного происхождения и клетками опухолевых линий представлено в табл. 1.

Таблица 1. Распредеоение специфической активности полученных МКАТ, оцениваемое по связыванию с клетками различ ных популяций и клеточными линиями (X реагирующих

клеток и интенсивность флуорнсценции).

T5G11 шоо Ш14. SMS 307

Лимфоциты 20+5 25+5 10+7 15+5 30+5

ЬЬноциты 70+10 70+10 95+5 95+5 70+10

Гранулоциты 10+5 70+10 0 60 5 25+10

Эритроциты - - +- +- -

Тромбоциты ++ ++ - +- +-

Перитонеальные Щ +- +- - -

Щ| грудного молока - - - - +-

Клеточные линии

HL-60 ++ ++ + ++ +

К-562 j + +- + ++

MDLT-4 +- +- +- - +

Raji - - - +

Ramos - - - - +-

Экспрессию АГ оценивали по средней интенсивности флуоресценции (ИФ, в относ, ед.) и обозначали: (++) - ИФ>50; ( +) - 50>ИФ>30; (+-) - ИфсЗО.

Как видно, полученные МКАТ связываются в основном с моноцитами, окрашивая с более слабой интенсивностью и гранулоциты и тромбоциты. Исключение составляет МКАТ ЛШ.4, которое реагировало практически только с моноцитами. Лучшо всего данными МКАТ окрашивались клетки промиелоцитарной линии HL-60, менее интенсивно ими окрашивались клетки эритробластной линии К-562. МКА" практически не реагировали с перитонеальными Ыф и Ыф грудного молока. Более того, при культивировании моноцитов in vitro (в результате чего наблюдается дифференцировка моноцитов в Щ) на вторые сутки снижалась экспрессия АГ, выявляемых полученными МКАТ,. а на 7 день культуры доля клеток, связывающих данные антитела, ухе не превышала нескольких X. -

Эксперименты с использованием двухцветной иммунофлуорес-ценции с использованием МКАТ известной специфичности, показали, что полученные МКАТ связываются в основном с той же популяцией мононуклеарных клеток, что и МКАТ Leu "3, Leu М5 и Leu 15, хотя степень корреляции выявляемых АГ была различной. Так, наилучшая корреляция получена с АГ, выявляемыми МКАТ ЛШ.4 и Leu МЗ. С учетом данных по распределению этих антител по популяциям и клеточным линиям это свидетельствует о принадлежности антител ЛШ4 и Leu МЗ к одному кластеру дифферен-цировки (CD14). Характер распределения АГ, выявляемых МКАТ T5G11, ЛШОО, SM2 и 3D7 не позволяет отнести их к кластерам дифференцировки антител Leu МЗ, Leu КБ и Leu 15 (CD14, CDllb и CDllc соответственно).

Были проведены эксперименты по определение молекулярных масс АГ, выявляемых подученными МКАТ. Для этого использовали две методики: классическую, по которой клетки метили по поверхности ltSI с помощью лактопероксидазы и методику с использованием биотинилирования клеток с последующим выявлением преципитатов в блоттинге с помощью иммуноферментной реакции. Оказалось, что МКАТ T5G11 и ЛМ100 стабильно преципитировали АГ состоящий из двух цепей с мол. массами!.00 и 110 кД. Причем идентичные результаты были получены при преципитации как из лизатов мононуклеарных клеток, так и из лизатов тромбоцитов. В опытах по взаимной блокировке оказалось, что МКАТ T5G11 и ЛШОО взаимно друг друга не блокируют. Исходя из этих, а также из данных о сходном распределении МКАТ по клеточным популяциям и опухолевым линиям, можно думать, что МКАТ T5G11 и ЛШОО метят различные эпитопы одного и того же антигена. К сожалению, многократные попытки определения мол. массы АГ, выявляемых другими МКАТ, оказались безрезультатными.

2. Клинические исследования.

В работе исследовали возможность применение полученных МКАТ в качестве маркеров моноцитарного звена иммунной системы. Для этого, МКАТ, наряду с коммерческими МКАТ серии Leu, использовали для иммунофенотипирования клеток периферической крови больных с такими формами лимфолейкозов, как острый и хронический моноцитарные лейкозы (ОМЛ, ХМЛ), острый миеломо-нобластный лейкоз (ОММЛ), а также гистиоцитоз X (ГХ) (Табл. 2). Наиболее резко выделялись группы моноцитарных леРчюзов, когда с помощью МКАТ Leu МЗ детектировалось резкое повышение - до 50% и более СИ 4+ клеток в периферической крови. Суадэст-

венно, что количество Leu МЗ клеток соответствовало количеству JM4+ клеток. При этих заболеваниях наблюдалось и резкое повышение процента T5G11+, SM2+ и 3D7+.клеток. В то же время, при OMMJI, когда в кровь попадают более ранние предшественники моноцитов, число клеток, связывающихся с МКАТ T5G11, JM4, SMS, но не 3D7, повышалось не столь значительно, а содержание Leu М5+ и Leu 15+ клеток оказалось повышенным как и при моно-цитарных лейкозах. Поскольку известно, чю CD14 является маркером зрелых лимфоцитов, а антигены CDllb и CDllc появляются на более ранних стадиях дифференцировки клеток миелоид-ного ряда .ложно предположить, что МКАТ T5G11, ЛШ4, SM2 (но не 3D7) метят в основном зрелые моноциты, а их более ранние предшественники слабее зкспрессируют эти маркера

Таблица 2. Связывание различных МКАТ с клетками больных некоторыми формами лимфолейкозов (% реагирующих клеток).

МКАТ К ГХ ХМЛ 0Ш1 ОЫМЛ

Leu МЗ 12+5 13+5 35+11 38+17 20+6

Leu Ш 17+4 15+6 42+12 60+22 52+17

Leu 15 22+7 24+6 48+9 74+30 64+22

T5G11 29+8 31+10 41+10 42+18 21+7

ЛМ14 13+4 14+6 34+12 34+15 19+8

SMг 17+6 18+5 48+16 45+18 30+15

3D7 25+5 23+5 47+12 55+21 59+23

- 10 -

3. Изучение влияния полученных МКАТ на зффекторные функции моноцитов.

Исследовали влияние МКАТ на АЗЦТ. Гс1?-опосредованный фагоцитоз ЭБ, СИЗ-опосредоваиное связывание ЭБ, восстановление НСТ и адгезию. Оказалось, что при обработке клеток антителами в насыпающих концетрациях ни одно из подученных МКАТ не оказывало влияния на указанные функции моноцитов.

Известно, что некоторые МКАТ проявляют свою функциональную активность только в случае их иммобилизации на твердой фазе. Исходя из этого, были проведены эксперименты по изучению влияния МКАТ на функции моноцитов в приближенной схеме. Для этого МКАТ наносили на полистиролоьую поверхность 96-луночных плоскодонных планшетов и после стандартных процедур инкубации, отмывок и забивки свободных мест сорбции раствором желатина, в этих лунках формировали монослои моноцитов и изучали их зффекторные функции. Оказалось, что при иммобилизации МКАТ Т5611 на полистироловую поверхность проявляется ингибирующэе влияние этого антитела на РсЕ?-опосредованые функции моноцитов. Наиболее выраженным было ингибирующее влияние на эритро-фагоц;:гоз - от 60 до 90% (Рис. 1). Кроме того, в тех же

условиях ингибировало и АЗЦТ и восстановление НСТ, если мишенями служив ЭБ, опсонизированные кроличьим 1ей При проведении НСТ-теста с зимозаном, Т5011 не сказывало ингибирующэго влияния. Это антитело не оказывало влияния и на СЯЗ-опосредованное связывание ЭБ.

Шскольку для проявления ингибируюцего влияния данного 11КАТ критичным оказалось связывание его с твердой фазо;;, была сделана попытка изменить характер посадки МКАТ ТКЗИ на полистирол. Для этого, лунки плоскодонного планшета вначале

- и -

предобрабатывали белком А, кроличьими анти-мышиными или авидином. Затем, после стандартных процедур отмывок и забивки свободных мест сорбции, в эти лунки вносили раствор этелатина, МКАТ Т5в11 или ЛМ100. В лунки, предобработанные авидином вносили биотиншшрованные МКАТ. После чего формировали монослой моноцитов и проводили РсЯ-опосредованный фагоцитоз. Как оказалось, при иммобилизации МКАТ ТБвИ на белок А или анти-мышином оно не оказывало ингибирувдего действия на фагоцитоз, который оставался на уровне контроля (Рис. 2). При посадке на полистирол биотинилированного антитела Т5И.1 через авидин, ик^ибиция сохранялась, хотя ее уровень был на 207. ниже, чем при посадке 15611 непосредственно на полнстироловую поверхность. Следует отметить, что само по себе биоткнилирэ-вакие не изменяло функциональной активности антител, что проверяли по влиянию сорбированных на полистироле биотинилиро-ванных МКАТ на фагоцитоз. В случае МКАТ Т5БП, биотиншшрованные АТ блокировали фагоцитоз в той же степени, что и небиотинилированные. МКАТ ЛШ.00 ни в каком варианте опыта ингибирующего действия не оказывало.

Исходя из результатов этих опытов, можно предположить, что экранирование Рс-участков МКАТ Т5611 при связывании его с белком А (возможно то же самое происходит и в случае связывания антитела с анти-мышиными приводит к отмене ингибирувдего влияния данного антитела на РсЯ-опосредованные функции моноцитов, и, следовательно, для проявления этого ингибирующего влияния необходимо взаимодействие Рс рецепторов моноцитов с Рс-фрагментом МКАТ, а не взаимодействие МКАТ со специфическим АГ на клетках. Для выяснения вопроса об участии в зффекторных функциях отдельных частей молекулы Т5СИ, были

Рис. I. Влияние различных МКАТ, адсорбированных па пластике на

эритрофагоцитоз моноцитов. За 100$ взят уровень фагоцитоза на адсорбированном нормальном IgG мшяи.

Рис. 2. Вшшша различной иммобилизации /.КАТ Жюо и Т5011 на эрит-ро$атоцатоз моноцитов. За 100$ взят уровень фагоцитоза на яелатине. Желатин, 0,25% (I), ЛМчоо (2) и Т5011(3) наносили на сорбированный Рго* а, кроличий анти-ыышиный 1й<5, авидан или на голый пластик.

еятк-юяышЯ д£с ашдая

проведены опыты по получению и изучению влияния на фагоцитоз РаЬ-фрагментов МКАТ Т5Б11.

3. Получение фрагментов МКАТ ТбвИ и изучение их влияния на фагоцитоз.

При получении фрагментов Антител использовали протеолити-ческие ферменты трипсин и папайи. Подбирая оптимальные условия для расщепления ими молекул наилучшие результаты были получены с пепсином, который использовали в соотношении с 1:100. После ферментативного расщепления антител материал подвергали аффинной хроматографии на колонке с белок А-сефаро-зой, а образцы исследовали на связывание склеточными АГ в им-мунофдуоресцентиом тесте и в ПААГ электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия.

При расцеплении МКАТ Т5в11 выявили, что в образцах, не связавшихся с белок А-сефарозой, в электрофорезе в нередуцирующих условиях детектировалась полоса, соответствующая мол. массе 50 кД и минорная полоса, соответствующая 100-110 кД. В материале, элюированном с белок А-сефарозы детектировались в основном полосы, соответствующие белкам с мол. массами 110 и 150 кД. Как показал иммунофлуоресцентный тест, фрагменты МКАТ Т5И1, не связавшиеся с белок А-сефарозой, связывались с моно-нуклеарными клетками с той же интенсивностью, что и целые молекулы ТбвИ, тогда как фрагменты антител, элюированные с колонки связывались с клетками с гораздо меньшей интенсивностью. Более того, обработка клеток не связывающимися с белком А фрагментами антител приводила к практически полной отмене последующего связывания с клетками целых молекул МКАТ ТбвН, меченных ФИТЦ. Это свидетельствует о том, что дан-

ный материал является в основном Fab-фрагментами МКАТ T5G11. В свою очередь, фрагменты, злшрованные с колонки, по-видимому, являются целыми, не расщепленными молекулами и их Fab/c-фраг ментами.

Исследование влияния на фагоцитоз полученных фрагментов МКАТ T5G11 позволило выявить, что фрагменты этих антител, злшрованные с белок А-сефарозы обладали примерно той же активностью, что и целые молекулы антитела, в то время как выделенный препарат Fab-фрагментов не оказывал ингиОирушзго влияния на фагоцитоз (Рис. За). Таким образом, эти данные подтверждают предположение, что ингибирующее влияние МКАТ T5G11, на опосредованный Fc-рецепторами фагоцитоз обусловлено скорее всего не взаимодействием типа антиген-антитело на мембране клетки (или не только им), а является результатом взаимодействия Fc-фрагмента данного МКАТ с Fc-рецептором на клетках, либо с Fc-рецептором и соответствующим антигеном одновременно (так называемый эффект Курляндера). Однако в связи с этим предположением, МКАТ T5G11 (именно его Fc-фрагмент) должно существенно отличаться от других антител того же изо-тгага, которые не обладают подобной функциональной активностью, и в первую очередь от МКАТ ЛШОО.

4. Изучение связывания МКАТ с лекынами.

Ряд авторов, исследуя степень гликозилирования иммуноглобулинов нашли, что в зависимости от углеводного состава и строения Fc-фрагмента, молекулы IgG могут, во-первых, структурно отличаться друг от друга и, во-вторых, по-разному влиять на опосредованные FcR функции фагоцитов. В работах такого рода широко использовали лектины, связывающиеся с гликопроте-

Рис.За. Влияние целых молекул и фрагментов ГШ! T5GH » адсорбированных на пластике, на эритрофагоцитоз. 100$ - уровень фагоцитоза на адсорбированном нормальном ige мыши.

Рис.3<*. Связывание целых молекул и фрагментов MKAIT5G11 с con а . За 10056 взят уровень связывания образцов с кроличьим анти-мыпшшм ige.

200.

100

50 .

ñ

% 100.

50

25

X

сл

I

1

1

1 - целые молекулы; 2 - штвриал глщрованный о Prot А-сефарозы; 3 - материал не связавшийся о Prot Авсефарозой.

идами и сахарами. Пользуясь аналогичным приемом, изучали лек-тин-связывающие характеристики полученных моноклональных антител. Эксперименты выполняли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), который облегчался тем, что большинство лек-тинов имели хорошие, экспериментально определенные сорбцион-ные характеристики. В качестве положительного контроля использовали лунки, предобработанные белком А (при анализе связывания с лектинами ШАТ IgG2b субкласса) или кроличьими IgG против иммуноглобулинов мыши (при анализе фрагментов МКАТ или с МКАТ субкласса IgGl или IgM). Отрицательным контролем служили лунки планшета, предобработанные бычьим сывороточным альбумином.

Оказалось, что МКАТ T5G11 обладали самой высокой лек-тин- связывающей способностью по сравнению с другими полученными МКАТ (Рис. 4). Так, с лектином проростков пшеницы (W3A) и лектином садового гороха (PSL), связывалось до 100Z всех МКАТ T5G11, внесенных в лунку планшета; с конканавалином А (Con А) - 75Х, а с аглотинином арахиса (РИА) - до 65Z. Существенно, что степень связывания оказалась выше, чем у МКАТ IgM класса (способность этого класса антител инт-нсивно связываться с лектинами хорошо известна). Более того, если связывание МКАТ с Con А осуществляли в присутствии 0,5 М метил -D-маннопиранозида, связывание моноклональных антител CHI с этим лектином отменялось полностью, тогда как взаимодействие МКАТ T5G11 с ним подавлялось лишь на 252L Далее обрабатывали MKAT.T5G11 периодатом, который, как известно, является окислителем углеводов. Подобная обработка 1025 мЫ периодата МКАТ T5G11, вызывала подавление их связывания с Con А и PSL. Причем образцы T5G11, обработанные наибольшей концентрацией пе-

Peo. 4 . Степень связывания различных МКАТ а нормального ыкютого ige о локтинаии: 1 - Сов А; 2 - PSL; 3 - PN А; 4 - й'СД.

За 100$ взят уровень связывания данных МКАТ и т-лтаного IgC о кроличьим анти-ыышиным IgG.

IgG T5G11 ЛМ100 ЛМ14 SM2 СН1 (IgMJ

риодата (50 - 100 мМ) теряли способность ингибировать фагоцитоз (данные не показаны). Однако, иммунофлуоресцентный тест показал, что при таких концентрациях (начиная с 10 мЫ) наступает нарушение связывания МКАТ со специфический антигеном клеточной мембраны - возможно в этом случае периодирование затрагивает не только углеводные остатки, но и белковую часть молекулы T5G11.

Анализ лектин-связывающих характеристик различных фрагментов МКАТ T5G11, выявил, что связывание Fatrфрагментов ЫКАТ с Con А составляло в среднем 30% от связывания с кроличьими антимышиными IgG (Рис. 36). Связывание материала, элюированного с белок А-сефарозы, было сравним^ по величине со связыванием целых молекул T5G11 с Con А. На основании этого можно думать, что в связывании данного ЫКАТ с лектинами основную роль играет его Fe-фрагмент.

Для более детального выяснения состава углеводной части молекулы T5G11 изучали связывание этих АТ с лектинами в присутствии водорастворимых коныогатов моносахаридов с полиакри-ламвдом (так называемые псевдополисахариды): Шп-^-РАА; Ыап-б -Р-Х- РАА; Gal-/- РАА; GlcNAc-/-PAA; Gal N Ас-./- РАА и Fuc-«C -РАА. Обнаружено, что Fuc-^не влияла на связывание антитела с лектинами, тогда как в присутствии Мап*Гсвязывание T5G11 с PSL и PNA практически полностью отменялось; üal-^на 80Z инги-бировала связывание антитела с Con A, PSL и PNA, а Мал-6-Р-</ на 50Z отменяла связывание с УЗА. Бе смотря на то, что Con А, как известно, имеет специфическое сродство к связыванию с маннозой, a PNA с галактозой, в наших условиях связывание T5G11 с Con А существеннее ингибировала Gal-^f, а с PNA - напротив, Man-.¿ (Рис. 5). Возможное обьяснение этих результатов

Рис.5 . Степень связывания МКАТ T5G11 с лектинаш Con a, PS1, РИА, wga в присутствии моносахаридов, коньюгированных о поли-акриламидом ("псевдополисахарида"). 100$ - уровень связывания МКАТ T5G11 с лектинаш dea добавок.

1 - Uan-oí; 2 - Ыап-6-Р-«4 3 - Gal-/?; 4 - GlcHAc-^; 5 - GalHAc^; б - Puc-ei

\ 123456 123456

риа vga

- 20 -

может состоять в том, что с одной стороны, молекулы содержат довольно сложную по строению и составу олигосахарид-ную цепь и не исключено взаимодействие с различными лектинами по различным местам этой цепи; с другой стороны, и это может Сыть одной из причин, лектины обладают лишь преимущественной, а не абсолютной специфичностью к тем или иным сахарам. Во всяком случае эти опыты могут свидетельствовать, что именно благодаря особенному углеводному строению МКАТ ТбйИ обладает повышенной лектинсвязывающей способностью и этим отличается от других МКАТ.

Б. Получение негликозилированных антител Т5С311 и изучение их функциональной активности и лек-тин-связывахвдей способности.

Известно, что туникамицин в малых концентрациях (1-10 мкг/ мл) ингибирует гликозилирование в клетках бактерий и млекопитающих. Так, при выращивании гибридом в среде с ТМ, примерно БОХ клеток начинают секретировать иммуноглобулины, на 90Х дефицитные по олигосахаридным цепям Рс-фрагмента (агликозилиро-ванные АТ). В связи с этими данными использовали ТМ для получения негликозилированных антител 15611. При подборе оптимальных условий культивирования гибридомных клеток в среде с ТЫ, оказалось, что концентрация свыше 3 мкг/мл приводила к гибели всех клеток в течении часа. Поскольку было необходимо накопить достаточно большое количество АТ в надосадочной жидкости, применяли концентрацию 1 мкг/мл.

Результаты свидетельствуют,что полученные таким обрезом АТ (обозначены ТбвИ-ТЫ) сохраняли свою белок А- и антиген-свя-зываютую способность. При изучении лектин-связываххвдх харак-

теристик МКАТ Т5611 и T5G11-TM, оказалось, что степень связывания T5G11-TM с Con A, PSL и PNA, уменьшалась в среднем на 40Х по сравнению с контрольными МКАТ T5G11 (Рис. ба). В то л© время, антитела T5G11-TM при сорбции их на полистирол, инги-бировали фагоцитоз лишь на 3Ö-40Z (в контроле на 70-80X, Рис. 66). Как отмечалось выше, ¡ie все молекулы IgG, при культивировании гибридомы в присутствии туникамицина, секретируются в негликозилированном виде. По-видимому.этим и объясняется неполная утрата функциональной активности и сильного связывания с лектинами антитела T5611-TML

ВУВОЛЫ

1. Получены 5 гибридом, секретирующие моноклокальны--антитела к поверхностным антигенам моноцитов человека и получившие условные обозначения T5G11, ЛШОО, ЛШ4, SM3, и 3D7.

2. На основании данных о распределении специфического связывания МКАТ ЛШ4 с клетками периферической крови, опухолевых линий и лимфолейкозов, результатов анализа с помощью двухцветной флуоресценции сделан вывод, чтоо данное антитело принадлежит к кластеру дифференцировки CD14.

3. МКАТ T5G11 и JM00 связываются с одним и тем лв антигеном, зкспрессирующимся на моноцитах и тромбоцитах. Данный антиген состоит из двух цепей, имеющих мол. массы 100, 110 кД. МКАТ T5G11 и ЛШОО взаимно друг друга не блокируют и, по-видимому, распознают различные зпитопы одного антигена. МКАТ T5G11 и ЛШОО по реактивности не соответствуют ни одному из известных антител к кластерам дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека, и по-видимому, выявляют неописанный ранее антиген.

Рио.ба. Степень связывания МКАТ лмюо, T5G11 и

Т5С-11-ТМО лектинами. За 100% взят уровень связывания данных МКАТ о Prot А.

100

50

Г I - С cm А VA - PSL

rJ

ИГА

Рио.6^. Влияние МКАТ лмюо, T5G11 и

T5G11-TU ва вритрофагоцитоз моноцитов. За 100£ взят уровень фагоцитоза на нормальном igG мыши.

а

■ - ;

100

I ß

I

50

T5G11 T5G11-TM ЛЫ100 T5G11 T5G11-TM ЛШОО

Т5СИ-ТМ случали яри культивировании гибридошых клеток в оредэ о туникамицином, I мкг/мя.

%

- 23 -

4. МКАТ T5G11 ингибирует опосредованные FcR функции моноцитов (фагоцитоз, AT-зависимая цитотоксичность, образование кислородных радикалов). Уровень ингибиции фагоцитоза составлял 60-90Z, Ингибиругвдее влияние антитела проявлялось только в случае его иммобилизации на твердой фазе. МКАТ ЛМ100 ингиби-рупгдам свойством не обладает)

5. Fab-фрагменты T5G11, иммобилизованные на твердой фазе ингибирупцего влияния на фагоцитоз не оказывала. При иммобилизации T5G11 на твердой фаге с помощью белка А или кроличьих антител к IgG мыши, T5G11 ингибирупцего влияния на фагоцитоз не оказывал!. По-видимому, ингибирухщее действие данного антитела осуществляется при участии его Fc-фрагмента

6. T5G11, относясь к субклассу IgG2b, характеризуется необычайно высоким сродством к углевод-связывапцим лектинаы (Con A PNA, PSL, VGA). Иягибиторный анализ, выполненный с помощью псевдополисахаридов свидетельствует о его необычном углеводном составе. Поскольку Fab-фрагменты МКАТ T5G11 не обладают подобным сродством к лектинам, предполагается, что углеводные группы расположены на Fc-фрагменте антитела.

7. Исследованы свойства МКАТ T5G11, полученного при культивировании гибридомы в среде с антибиотиком туникашщином, подавляющим гликозилирование клеточных белков ^(T5G11-TM). T5G11-TM сохраняет антиген- и белок А-связывающие характеристики, но на 40Х слабее реагирует с лектинами и на 50Z снижается его ингибирующее действие на фагоцитоз, по сравнению с контрольными МКАТ T5G11. Предполагается, что МКАТ T5G11 ингибирует опосредованные FcR функции моноцитов благодаря необычному углеводному составу и/или строению Fc-части.

8. Полученные МКАТ были использованы для иммунофенотипиро-

вания клеток периферической крови больных некоторыми формами шми лимфолейкозов. Количественные изменения моноцитарного звена у больных с ОЫЛ, ХЦЛ и ОШЛ наилучшим образом прослеживаются по изменению количества клеток, выявляемых МКАТ ЛМ14.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Бачурин П. С., Маркова Е А., Сурнакова Е £., Киртаин А. С., Филатов А. Е Панель моноклональных антител против маркеров лимфоцитов человека и ее использование при оценке иммунного статуса. Материалы всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии. Тарту, 1988 г.

2. Филатов А. Е , Бачурин П. С., Маркова Е А., Кирихин А. Ю. , Щзрбухин Е Е Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов человека с помощью панели моноклональных антител. Гематология и трансфузиология, 1990, том 35, N4, с. 35-38.

3. Кирихин А. Ю., Фиатов А. Е , Бачурин П. С., Зеисков Е М. Моноклональные антитела к антигену моноцитов человека с молекулярной массой 110 килодальтон. Иммунология, 1991, N2, с. 39 -42.

4. Kiryukhin A. Yu., Bachurln P. S., Zemskov Y. M., Filatov A. V.., A panel of monoclonal antibodies against antigens or human monocytes. Mononuclear Phagocyte Sist«m in Normal and Pathological States. All Union Symposium with the participation of foreign scientists. Novosibirsk, 1990.

5. Khrawtsov A. V., Kiryukhin A-Yu., BIPA (Biottn Irounoprecipitation As^ay) - an alternative approach f->r the identification of tumor cell surface antigens. 7th International Conference on Human Tumor Markers. Kiev, 199C.