Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Дифференцировочные антигены и субпопуляционная организация лимфоцитов человека

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ФИЛАТОВ Александр Васильевич

ДО®ЕРЕНШРОВОЧНЪ!Е АНТИГЕНЫ И СУ БПОБУ ЛЯЦШШ/> Я ОРГАНИЗАЦИЯ ЛШШЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Работа ышолнена в Институте кммунолс-ии Минздрава Российской Федерации

Научный консультант: член-корреспондент Российской АМ профессор Р. М. ХАИТОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: И. М. ДОЭЮРОВ, доктор биологических наук, профессор 3. Г. КАДАГИДЗЕ, дсютор медицинских наук, профессор Е. В. СИДОРОВА, доктор биологических наук

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИВДШШ УНИВЕРСИТЕТ

Защита состоится "... "........ 1992 г. в-... час. на

дании специализированного Совета Д074.08. 01 по защите дис< ций на соискание ученой степени доктора/наук при Институте нологии Минздрава Российской Фэдерации (115478, Москва, К кое шоссе, дом 24, корп. 2),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инс иммунологии Минздрава Российской Федерации.

Диссертация разослана .,."....... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор Оиологичрпких язук

а. а кол

Стр.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цель и задачи исследования. Научная новизна. Научно-практическое значение. Основные положения, выносимые на защиту. Апробация диссертации. Публикации................. 1

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение гибридом. Выделение ШАТ. Определение поверхностных маркеров. Определение молекулярных масс антигенов. Функциональные тесты............................... 6

РЕЗУЛЬТАТЫ .-ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Методы.кластеризации ыоноклональных антител к диф$еренцировочнъ!м антигенам лимфоцитов человека. ........................... 6

2.2. Характеристика кластеризованных ЖАТ ............ 9

2.3. Характеристика некластеризованных МНАТ......... 14

2. 4. Изучение влияния ШАТ на функциональную

активность шнонутгеаров....................... 23

. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЩКЖНОЙ СТРУКТУРЫ ЛИМФЖИТОВ................................ 28

ИССЛЕДОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРКТУРЫ ЛИМОНИТОВ ... 30 4.1. Исследование экспрессии

пан-В клеточных антигенов ...................... 33

4. 2. Исследование экспрессии

пан-Т клеточных антигенов ...................... 35

4. 3. Исследование экспрессии

субпопуляционных маркеров ...................... 39

ВЫВОДЫ ............................................. 45

СПИСОК ОСНОВНЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАШ . .......................

\

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОКРАЩЕНИЯ

АУТ Ц - антителовависимая цитотоксичность А-Т - атаксия-телеангиэктазия (В) 1ТГ - (врожденная) гипогашагдобулинемия ДОН 11ААГ - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецидсульфата натрия ИДС - ишунодефицитное состояние Кои А - кошсанадалин А МКАТ - миншсланальюе антитело HCT - нитросиний. тегразолиёвый ОВГ - общая вариабельная гипогашаглоОудинемия СВО - синдром Вискотта-Олдрйча (Т)К№ - (тяжелая) комбинированная иммунная недосгат ность

ТМ - туникамиции

ФЙТЦ - иэогшшанаг флуоресцеина

SÖ - фико;фигр>ш

ХГБ - хроническая гранулематорная болезнь ХКСК - хронический кожно-слизиетый кандвдоз ЭБ - эритроциты Оарана

DWEM . - минимальная среда Игла,

модифицированная Дульбекко FcR - рецептор Fe-фрагмента иммуноглобулина HLA - главный комплекс гиетосовместимости челове» Ig - иммуноглооулии

Prot А - Белок Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАГС>ТН

AicrychThtiocri проблемы.. Одной из уникзльних особенностей им иной системы является ее бысокпя гетерогенность по своему кле иному составу. Клетки ее слагающие отличаются между собой гаг своему антигенному портрету, так и фунгацгоналыго. Рэ<".пити<" мунологии последних лет во многом определялось открытием П"" вых популяций клеток и разделением их на все более и более у г» е оубпопуляции, отличающиеся по функциональным или антигенные ойствам (Петров Р. а . 1987). В ходе этой работы постоянно воз кал вопрос о том, ш разделение лимфоцитов по Функциональным ойствам соответствует их разграничению по антигенным (Cant or , Boyse Е. А. , 1977). У исследователей всегда существовало елаение в том, что в конечном итоге удастся создать такую iinp ну строения иммунной ситемы, когда кздяая функциональная с; б пуляция будет характеризоваться только eft присушим антигенным .бором. Это нвлялялоеь одним из основных побудительных мотивов я поиска все новых антигенов, маркирующих определенные популя м лимфоцитов. В результате разработок в этом направлении сформовалось новая область исследования - изучение дифференциро-|чных антигонов лейкоцитов человека, к которым относят 'Верхностные маркеры лейкоцитов, появляющиеся и исчезающие m [ределенных стадиях развития клеток (Ыанъко B.W. , 1987; Варш! псов А. П., Кадагидзе 3. Г. и др., 1989; Глузмаи Л. Ф, 1990: Сидо ¡икс С. П. и др. , 1990; Milstsin С. , 1989).

Основным инструментом выявления и идентификации поверхност к антигенов лейкоцитов явились МКАТ. Зачастую открытие не из устного ранее маркера являлось следствием получения нового CAT. С помощью МКАТ к настоящему времени охарактеризовано около ) дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека, и эту рэбо ' можно считать далеко не. законченной (Knapp V. , et al. 1989) ¡а сомнения, в ближайшие годы списс.; открытых антигенов будет гщественно расширен, что позволит углубить наши представления п •роении иммунной системы и свойствах ее составляющих лейкош?-

)В.

МКАТ к поверхностным антигенам используются тага»? (сак высоко .;цифические зонды, реагирующие с определенными субпопуляцлчми 1еток и заданными антигенами. Поскольку многие» поверхности»« ггигены являются рецепторами различного рода фпкторрр. то г ii'v

мощью МШ стало вовможным моделирование влияния на клетки ; монов и димфокинов, воздействующих опосредованно через те иные антигены (Royer Н. D. et. al. , 1985). Определенные Фун! лимфоцитов во8шжнр как активировать, так, и угнетать с пом ЫКАТ.

.Обладая высокой специфичностью к антигенам, представле на субклассах лимфоцитов, ЫКАТ предоставляют значительные шлшости в лечении заболеваний иммунной системы или состояни развитии которых вовлечены эти клетки. При этом ЫКАТ могут Пользоваться в качестве терапевтического средства как сами себе, та« и в комплексах с различными физиологически актив ваадсгваыи. В частности. ШАГ наши свое применение в тер при пересадках ночек (Norman D. J., 1985) и костного w (McMlchasl A. J. et al., 1987).

Наваменимы ЖАТ для изучения субпопуляционной органиа лимфоцитов в норме и при патологии. С их помощью возможно только контроль за отклонением иммунной системы от нормаль ■состояния, но и поиск тех специфических дефектов, которые я «гея причиной возникновения определенных иымунопатол (Schlossman S. F;, Roinherz Е. L., 1Q84-, Moretta L. et. al., 1 Хаитов P. k , Османов С. К, 1991).

В свете вышесказанного представляется перспективным пoi нив новых МКАТ. как к известным, так ещэ неописанным антит целью дальнейшего изучения клеточных антигенов, механизмов 4 ционирования лимфоцитов, путей и форм их дифференцировки, а же для диагностики и лечения различных заболеваний.

Цель к задачи исследования. Перед настоящей работой сч лась задача 'создания панели ШАТ к маркерам основных попу, лейкоцитов человека с целью ивучения субпопудяционной ctpyi лимфоцитов в норме и при патологии. В качестве основной < патологии были выбраны первичные НДС у детей. В задачи исс. вания входило определение нарушений субпопуляционной струк специфических для определенных форм первичных ИДО. Вредно, лось также, что б процессе работы будут получены МКАТ к ! неизвестным ранее антигенам и будут' изучены их свойства.

Научная новизна. Получены и охарактеризованы МКАТ, ра нагадив неизвестные ранее антигены. Впервые найден антиген, ¡ошийся общим маркером В- и NK-клеток и не обнаруживаемый на г их типах клеток. Показано, что действие МКАТ на функциона

тивность мононуклеаров может определяться не только специфи-ским взаимодействием антиген-антитело, но и уникальным угяе-дным составом Fc-фрагмента МКАТ. Продемонстрировано, что "пан-клеточные антигены CD5 и CD7 могут использоваться для изуча-я тонкой субпопуляционно-" структуры Т-лимфоцитов. Впервые об-ружен бимодальный характер экспрессии антигенов CD5 и CD7 на мфоцитах при некоторых формах первичных ИДС. Изучено распреде-ние клеток с высокой и низкой степенью экспрессии антигенов 5 и CD7 по субпопуляциям CD4+- и CD8*-лимфоцитов. Впервые исс цован характер разделения CD4+ и CD8+ субпопуляций по зкспрес-¡1 антигена CD27. Детализированы на уровне тонкой субпопуляци-юй структуры нарушения, наблюдаемые при первичных ИДС.

В ходе работы разработан ряд новых методических приемов, из горых, в первую очередь следует отметить следующие: показша шошость использования неизотопного мечен га (биотинилирова-:) в реакции иммунопреципитации для определения молекулярных :с поверхностных антигенов лимфоцитов, продемонстрирована воз-тость усиления реакции иммуиофлуоресценции с использованием гоэритрин-антификозритриновой системы, предложен метод соеди-ждей в себе процедуры скрининга и отбора клонов гибридом, сек-■ирующих цитотоксические МКАТ, использован метод коррекции тих определения субпопуляций путем нормализации к числу С04Ь+-!Ток, разработана математическая модель, позволяющая по данным тс цветной иммунофлуорэсценцки расчитывать субпопуляционную 'уктуру с учетом одновременной экспрессии до о антигенов.

Научно-практическое значение. Полученные МКАТ были переданы испытание в более, чем 100 научных учреждений СССР и получили ожительные отзывы. МКАТ внедрены в производство, и в настоя-время доступны коммерчески. Полученные МКАГ используются при нке иммунного статуса больших конг нгентов людей, в том числе , пострадавших при аварии на ЧАЭС. Данные МКАТ нашли примеие-при фэнотипировании лимфок и лейкозов, а такие для выделения популяций лимфоцитов. МКАТ внедрены в практику иммунологичее-исследований в лаборатории клинической иммунологии Института унологии Минздрава Российской Федерации, НИИ проблем онколо-им. P.E. Кавецкого АН Украины, Научном центре радиационной эдпш (г. Киев), Онкологическом научном центре РАМН, НИИ ге-элогии и переливания крови МЗ Беларусь, Львовском филиале Киото НИИ гематологии и переливания крови, НИИ трасплантологии

H иокуотьвннщ органов, Институте олкол^гии С г. С-Петербург) Пр. учреждениях. Полученные MliA'J заявлены для участия в V Шщ народном рабочем ооьынании но дифференцировочйым антигенам ле коцитов человека.

Оеюьпие полошит, выносимые на защиту.

1. Сое дана иьнель ЫКАТ к дифферещировочным антигена« дй ('»оцитоа человека. Проведено в соответствии с международной кл иификащий отнесение основной части полученных UKAT к определи ним кластерам дкффаренцировки.

2. Ьшйланы МКАТ, которые по специфичности не соответств известным кластерам диффвренцировки и, по-видимому, распозн неизвестные ранее антигены лиьфцитов человека.:

3. Установлено, что FcR-опосредованные функции - моновд могут блокироваться МКАТ T5G11, реагирующим с антигеном с мс куляриой массой 110 «Да. Показано, что эффекторной частью мс кулы T5QH является ее Fc-фрагмент, и важную роль в проц< блокирования играют углеводные остатки Fo-фрагмента T5G11,

4. Обнаружен новый антиген, являющийся обидам для ' ХК-диьфцитов, который состоит иа двух цепей с молекудяр: массами 87 и 71 кДа и, который находится на поверхности клет виде олигомарних комплексов.

6. Разработаны обшие принципы анализа субпопуляцио 4 структуры лимфоцитов, возводящие детализировать иммунные н шания на сублоиуляционном уровне.

An роб aim Aivoe ртции. Результаты исследований были щ тавлены ка I Всесоюзном биофизическом съезде (йосква, 1982) Всесоюзном совещание'по генетике соматических клеток в куж (Москва, 1983), Всесоюзной конференции "Профилактика, диаг» ка и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммунодв! тов. (Новосибирск, 1985), V Всесоюзном биохимическом съезде ев, 1986), Симпозиуме с международным участием "Иммунодефии аллергия" (Москва, 1986), 1-ой и 2-ой Всесоюзных конфере "'Современные направления создания медицинских диагностик (Москва, 198В; Москва, 1890), III Республиканской конфер "Автоматизация цитологических исследований" (Киев, 1990), i 10-ой межинстнтутекой конференции "Факторы клеточного и рального иммунитета при различных физиологических и патоло! ких состояниях" (Чеяяпинск, 19ЙЭ; Челябинск, 1990), Бсес<

- Б -

ференхщи "Генная и клеточная инженерия в решении фундамен-, ьных проблем биотехнологии" (Тарту. 1989), I Всесоюзном имму-огическом съезде (Сочи, 1986), IV Международной конференции дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (Вена, 9), VII Международной "онференции по маркерам опухолей чело-а (Киев, 1990), IV Всесоюзном совещании "Люминесцентный ана-в биологии и медицине и его аппаратурное обеспечение" (Моск-1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 рабо-получены 4 авторских свидетельства

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение гибридом. В качестве иммуногена в различных олу-с использовали мононуклеары периферической крови человека, 5ЦМТЫ, лимфоциты небных миндалин, лимфоциты, активированные эгенами, а также клетки опухолевых линий. Мышей BALB/c мно->атно внутрибршинно иммунизировали 5-20 млк .леток с интер >м 2-3 недели. Последнюю иммунизацию осуществляли внутривен-Клетки селезенки иммунных мышей гибридизовали с клетками юмы ЖЗ. 653 или Sp2/0 с помощью 50% полизтиленгликоля йог G. , Milstein С. , 1975). Шсле гибридизации клетки в сре-ШМ о 10Х эмбриональной телячьей сыворотки, 1СГ4 М гипоксан-I, 4»10 М аминоптерина и 1,6« 10"^ М тимидина (селективная [а ГАТ) помещали в 96-луночные планшеты, предварительно засе-ie перитонеальными макрофагами (10^ на лунку). Через .10-14 i наличие MRAT в культуралыюй жидкости оценивали непрямы».: шфлуоресцектным методом с регистрацией флуоресценции на очном цитометре. Положительные культуры 2-3 раза клонирова-методом конечных разведений, тиражировались и криоконсерви-лись.

Выделение ЖАТ. МКАТ. секретируегче позитивными гибридомами, пливали в виде асцитных жидкостей при пассировании in vivo ышах BALB/c, предварительно обработанных пристаном. МКАТ выли с помощью ионообменной хроматографии на Toyopearl. HV-65 HMi../ноаффинно на Prot А-сефарозе (Surolia А., et al. , 1981). лассовую принадлежность МКАТ определяли иммуноферментным Mehl. В некоторых случаях МКАТ метили ФШ1 или биотином. Фраг-а МКАТ получали при расщеплении Ig протеолитическими фермен - трипсином или папаином (Parham Р., 1986). Негликозилиро je МКАТ получали при культивировании гибридомных клеток ь

среде с туникашщином (Peppard J. V., et al.. 1989).

Определение поверхностных маркеров. Связывание МКАТ с кле' ками-мишеняыи оценивали иммунофлуоресцентным методом, проявл реакцию F( ab') ¿-фрагментами овечьих антител к Ig шш, меченн ФИТЦ и адсорбированных на Ig человека, или коньпгагом сгрептав дина с фикоэритрином, регистрируя флуоресценцию на проточном ц тометре EPICS С или FACScan.

Определение молекулярных масс антигенов. Антигены выделя методом иммунопреципитации (Clark Е. А. , Einfeld D. , 1986). Д этого клетки метили шш по поверхности с помощью дактоп

то ф

роксидазы или биосинтетически 1JC- или аминокислотами. Кяе ки лизировапи IX раствором Тритона Х-100, и антиген преципитир вали МКАТ и стафилококковым реагентом, предварительно обработа ш кроличьими антителами к lg шш. Антиген элюировали ммш нием в присутствии 2% додецилсульфата натрия с добавлением \ без добавления 5Х 2-мвркаптоэтанола Электрофорез проводили в или ?,БХ-ном полиакриламидноы геле в присутствии додецидсульфг натрия. Гель высушивали и радиоавтографировали при -70 С.

Функциональные тести Про лифе ративную активность кле-оценивали по включение меченного 3Н-тимидина Ери транеформа) лимфоцитов под действием вируса Эпштейна-Барр в качестве иск ника вируса использовали надосадочную жидкость культуры В95 Секрецию Ig определяли иммуноферменгным твердофазным сеадвич i тодом, применяя специфические антитела к IgG и IgM человека, : чениые пероксидазой. Активность NK-клеток измеряли по высвоб дению ^Сг из клеток линии К-562. В реакциях фагоцитоза и АЗТ качестве мишеней использовали ЭВ, опсонизироваиные специфичес кроличьим IgG или IgM, в последнем случаи ЭВ дополнительно об батывали человеческой сывороткой. .Генерацию кислородных ради лов изучали по восстановлению HCT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОВСУВДЕШБ

1. Методы кластеризация моноклональнш антител к дифферы ровопным антигенам лимфоцитов человека

К настоящему времени получено несколько тысяч индивидуал! МКАТ к дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека Cpaj иие результатов, полученных с использованием различных МКАТ, до бы трудно осуществимо, если бы международной общественно* планомерно не проводилась работа по систематизации получв!

,Т. Основная часть этой работы осуществляется в рамкам ставше-традиционным Совев^ния по дифференцировочным антигенам дейко-ов человека (Париж 1*082, Бостон 1984, Оксфорд 1986, Вена 9), основной целью которого является сравнение антител и вы-ение их в группы, лол„чивших название кластеров дифферент»-ки (cluster of differentiation) или сокращенно CD. Кластер ител - это группа ШАГ, имеодих близкий спектр реактивности с тками различных тканей, опухолей, линий и распознающих один и те антиген. К настоящему времени видело 78 кластеров, неко-ые из которых содержат по несколько подкласторов.

В ходе данной работы было получено более .50 индивидуальных Г. При соотнесений полученных МКАТ с извествыми кластерами ^еренцировки были использованы следующие подходы.

В первую очередь, для каждого МКАТ определялся спегар реск-гости. В качестве клеток-мишеней использовались лимфоциты, )циты, нейтрофллы, тромбоциты и эритроциты крови, а тага® [юидные клетки из некоторых органов: тимуса, селезенки, лим-1ческих, небных 1«стдалин и костного мозга Дополнительными ши мишеней являлись лимфоциты, активированные митогенами или «ешанной культуре лимфоцитов. Далее определяли связывание ' с клетками линий различного происхождения: Jurkat, СЕМ, -4, Н9, HUT 78 (Г-клеточные); CESS, Nanalva. Daudl, IM -9, is, Raji, UC-729, РШ1 8866 (В-клеточные); К-562 (эритроб-ная); HL-60 и U937 (моноцитарные), а такяз B-клеточными ли-м, полученными трансформацией с помощью вируса Зпштей-lapp. Объектами изучения служили тагаяе злокачественно сформированные клетки больных лимфопролиферативныыи заболе-ями.

Незаменимую информацию о специфичности МКАТ получали из алиментов по ишунопреципитацш с последующим определением молярной массы антигена, выявляемо о данным ЖАТ. Для выясне-субтединичной структуры антигенов проводили электрофорез как останавливающих условиях, вызывающих разрыв -S-S- связей,

и невоестанавливаквдх условиях, при которых субъединичная ктура антигена остается интактной. В некоторых случаях грофоретическая подвижность антигена в нередуцирующих усло-

была выше, чем в редуцирующих, что свидетельствовало о су-вовании внутримолекулярных -S-S- связей. Большинство изучен-ЖАГ преципитировали антигены, состоящие из одной полипеп-зй цепи, в то же время некоторые МКАТ взаимодействовали ~

антигенами состоявшими из двух или более цепей (рис. 1).

Продуктивным подходов, позволя шям существенно сократ процесс кластеризации ШАТ, является метод двухцветной иммун луорерценции. С помощью этого метода сравнивались распределе антигенов, выявляемых исследуемым ШАТ и МКАТ сравнения. Но выделить несколько типов двухцветных цитограмм (рис. 2). Пер тип - сравниваемые МКАТ окрашивают неперекрывающиеся попудя клеток (например ЛГ8 и 0КТ4). Второй тип - МКАТ окрашивает пе секащиеся, но не идентичные популяции клеток (например J3T2 ЛТ4). Третий тип - МКАТ окрашивают полностью совпадающие попу ции клеток, но экспрессии выявляемых антигенов не коррелир (например ЛГ1 и ОКТЗ). Четвертый тип - МКАТ окрашвахл идент вые популяции клеток и экспрессии детерминант, выявляемых ср ниваемыми МКАТ, хорошо коррелируют (например IM5 и 2Н4). Поел иий тип свидетельствует о принадлежности рассматриваемых 1Ш одному кластеру.

Если изучаемый антиген в результате взаимодействия с 1 способен слущваться с поверхности клеток, то прямые данные идентичности сравниваемых антигенов получали в эксперимент аз комодуляции (рис. 3).

Наиболее полные сведения о соответствии структур, распог ваешх сравниваемыми МКАТ, получали из экспериментов по взаю му блокированию МКАТ. С этой целью были использованы МКАТ, кс вгированные с ФИТЦ, фикозритрином или биотином. Данные о ваг ном блокировании связывания МКАТ приведены в таблице 1.

В некоторых случаях для подтверждения специфичности пс ченных ШАТ использовались данные по влиянию МКАТ на Ф/hki нальную активность лимфоцитов. В частности, было обнаружено, МКАТ JTI2 ингибировало бласттрансформацию лимфоцитов под деве ем митогенов и подавляло активность натуральных киллеров (| 4), что соответствует отнесению данного антитела к' кластеру i

С учетом описанных выше подходов была проанализировала активность полученных МКАТ и обнаружено, что среди них име представители по крайней мере 17 кластеров. Часть кластеров аались представленными двумя или более МКАТ. Список получе МКАТ представлен в таблице 2. Рассмотрим полученные МКАТ б подробно, обращая внимание на их индивидуальные особенности.

Таблица 1. Перекрестное блокирование связывания ЖАТ

.......... ................. —--------------------------- | Ингибиройание связывания МКАТ в X | i i

г »локируемое | Блокирующее МКАГ

1 i ОКТ8 Leu2a ЛТ8 ЛТ8С JIT8e OT8s |

1 1КГ&-ШЦ | 1Тв-®ИТЦ | 100 100 25 100 70 100 76 100 0 0 | 75 0 |

1 ( Le ni ЛИ ЛГ1е ЛИж |

1 eul-ЮЭ | Tl-биотин | i 100 100 100 100 н. 0. 0 Н. о. | 0 I

1 1 i 0КТ4 Lsu3a JTT4 |

1 КТ4-ФИТЦ | Г4-6иотин | 100 18 28 56 34 | 100 |

1 1 Leu5b ЛТ2

1 эи5Ь-ЖЭ | Г2-ФИТЦ | 100 100 100 100 i

2. Характеристика кластеризован«- тс МКАГ. CD2. МКАТ ЛГ2 перекрестно полностью блокировалось МКАТ 5Ь и 0КТ11, принадлежащими к данному кластеру. JIX2 также бло-)вало розеткообразование Т-лимфоцитов с эритроцитами барана, йировало бласттрансформацию лимфоцитов под действием митоге-и активность натуральных-киллеров. CD3. МКАТ ЛТЗ не блокирует ни МКАТ Leu4, ни МКАТ ОКТЗ. CD4. Получено по-крайней мере два МКАТ, принадлежащих к iy кластеру: ЛТ4 и ЛТ4а. Данные антитела частично блокируют 1 друга, а тага® МКАТ Leu3a, но не блокируют МКАТ 0КТ4. МКАТ и ЛТ4а не взаимодействовали с синтетическими пептидами (лю-

М.Н., кДа

bu;

94 — 67 —

43 —

30 — 20 —

— 116

— M

— 67

i i 3 A 5 6 7

Наектрофореграмма антигенов, преципигированных МКАГ (1), J1T2 (2). ЛГ7 (3). ЛТ8 (4), MP (б), ЛГ6 (6), I (7). Электрофорез проводили в восстанавливающих услоа в юг-ной (а) или 7,52-ном (б) ДСН пааг. Антигены пре питироьшш иа лимфоцитов крови (1-6, 6), лимфоцитов и них миндалин (6), клеток линии Raji (7).

fcr ...... [а а

% ч •■■■■а.

ia

П

<Щ

" ф ! i .. г

V i д» 'Ж-|.

i i , *

'л

an

лтm

Рис. 2. Типы коэкспрессии антигенов по данным двухцветной ш нофлуоресце нции.

Лимфоц-иы крови окрашены МШ: а - ЛГ8 и ОКГ4; С - Л ЛГ27; в - ОКГЗ и ЛГ1; г - 1Кб и 2Н4. МКАТ ЛТ4, ЛТ8, < и ЛГ45ИА мечены ФИТЦ, а ОКТ4, JTT27, ЛИ и 2Н4 - фи» ритрииом. Ш оси абсцисс - log зеленой флуоресценции; оси ординат - log красной флуоресценции.

1 б

3. Ко модуляция антигенов лимфоцитов крови под действием МКАТ ЛИ (а) и ЛТ8 (б).

Лимфоциты инкубировали 18 ч в присутствии 100 мкг МКАТ ЛИ (2а-4а) или ЛТ8 (26-46) или без МКАТ (1а, 16) и окрашивались МКАТ ЛИ (1а, 2а, 46), Ьеи1 (За), Ьеи2а (4а, ЗС) или ЛТ8 (16, 26).

К ЛТ2 1д6 К Ш 1д6 I ЛТ2 1д6

4. МКАТ ЛТ2 ингибирует бласттрансформацию лимфоцитов и активность натуральных киллеров.

Лимфоциты активировали Кон А или ФГА. Клетки обрабатывали 10 мкг/мл ШАТ ЛГ2 или 10 мкг/мл нормального [ев мыши или использовали без обработки (К).

608НО предоставлении С. М. Андреевым), соответствующими фрагмент первого домена антигена CD4 (последовательности 47-67 и 76-99 и связывание этих ШАТ с лимфоцитами данными пептидами не инг бировалось.

CD5. Получено 4 антитела, принадлежащих к данному кластер Наиболее наученное МШ ЛИ перекрестно полностью блокировало МКАТ Leul. ЫКАТ JITle и JTTlg выявляли 2 других независимых зпит па антигена CD5.

CD6. ШАТ ЛГ5 на основании подученных характеристик отнес но к кластеру СВб, однако эксперименты по перекрестному блоки; вашто не проводились из-за отсутствия антител сравнения.

CD7. МКАТ JTT7 и Ж7а принадлежат к этому кластеру. Ш7а, по-видиыо, является менее аффинным, и поэтому дает более сла( окрашивание клеток по сравнению с ЛТ7.

CD8. Получено по крайней мере 4 МКАТ, относящихся к клас: ру CD8. Реакция ШАТ JTT8 и ЛГ8с полнее блокировалась антите. Leu3a, чем 0КТ8. Эпитопы, распознаваемые МКАТ ЛТ8е и ЛТ8з, бо. отдалены от мест связывания ЛТВ и ЛТ8с, по сравнению с зпито: ми, вшвляемыми ШАТ ЛГ8, Leu3a и ОКГ8.

СЮ. МКАТ ЛШ реагирует с моноцитами и тромбоцитами, предварительным данным оно отнесено к кластеру CD9.

CDllb. МКАТ ЛШ1 не блокирует МКАТ Leul5, принадлежала данному кластеру, однако в отличии от Leul5 МКАТ ЛШ.1 хор прецилитирует антиген, состоящий из двух цепей с молекулярн шесаш 155 и 95 кДа.

CD14. ЛМ14 не ингибирует связывание Leu МЗ.

CD16. Подучено 5 МКАТ, отнесенных к кластеру CD16. 4 t очень схожи меаду собой, и, вероятно, выявляют один и toi эпитоп антигена1 CD16, непере крываюамйся с зпитопами, вьтвляе ü Leullb и Leullc. МКАТ ЛНК16У резко отличается от остальных ai ■ тел данного кластера, оно дает менее интенсивное окрашив; лимфоцитов, ш преципигирует антиген из клеточного лизата j блокирует другие МКАТ, принадлежащие к данному кластеру.

CD21. Получено 2 МКАТ ЛБ21 и ЛБ21а, отнесенных к "клас CD21. ЛБ21 и ЛБ21а не блокируют друг друга, из них только JI блокируется MKA'f GKS7, и только ЛБ21а тормозит трансформ лимфоцитов под действием вируса Эпштейна-Барр. Напротив., то JIB21 ингибирует образование комплементарных розеток. Видимо топ, распознаваемый МКАТ ЛБ21 находится ближе к месту пос третьего компонента комплемента (C3d), а эпитоп, выясля

яйца 2. Характеристика полученных ШАТ к антигенам лейкоцитов человека

гитело Иэотип T-------- — -r |M. m. антигена 1 (кда) г Антиген | ...........- —■ 1 Тип клеток- | мишеней |

Т1 IgGl I 67 1 CD5 | Т-,(В-)клетки |

Т2 IgG2b 1 БО CD2 | Т-, NK-клетки |

тз IgM 1 н. О. СЮ . | Т-клетки |

Т4 IgGl 1 и.о. CD4 | Т-хелперы |

Т6 IgGl | 120 CD6 | Т-клетки |

!Т7 IgG2a | 40 CD7 | T-, NK-клетки |

ГГ8 . lgGl 1 32 CD8 | Т-киллеры/ , | супрессоры |

мэ IgG2b | H. 0. CD9? I моноциты, | тромбоциты |

Ш1 IgGl . | 155/95 CDllb | моноциты, | гранулоциты, | часть Т-клеток |

DÜ4 IgG2b I H. 0. CD14 | моноциты |

1Ш6 IgGl | 55 CD16 | 1 NK-клетки, | гранулоциты |

Е521 IgGl | 140 CD21 | В-клетки |

П27 IgG2a | 55 CD27 | 1 90% С04+-клеток, | 777. СОа+-клеток |

ГГ4Б IgG2a | 200 CD45 | лейкоциты |

IT45RA IgG2b I 220 CD45RA | В-, NK-клетки, | часть Т-клеток |

JH1 IgM I Н. 0. CDw52? | лимфоциты |

ÜSD8 lgGZa | 45/14 HLA-A.B.CI лимфоциты |

ИР ígG3 | 34/29 HU-DR | 1 1 1 В-клетки, | моноциты. I активированные | Т-клетки |

5Б7 IgG3 | 45/14 ^¿-микро t глобулин I лимфоциты |

iSGll • IgG2b I 110' ? 1 1 моноциты, | тромбоциты |

3F3 lgGZb I 45 ? 1 В-клетки j

Rs4 IgGl I 87/71 ? 1 В-, МК-клетки |

Rs22 IgGl I 87 ■ i ? 1 1 клетки линии | Ramos |

ЛБ21а, - к участку связывания вируса Эпштейна-Барр.

CD27. Подучено только одно ШТ ЛТ27, принадлежащее к это кластеру.

CD45. ШАТ ЛГ45 реагировало со 100% мононуклеаров и прей цитировало антиген, состоящий из 4 цепей с молекулярными масса 220, 205, 190 и 180 кДа.

CD46R. Получено 3 МШ, которые отнесены к данному подкла repy. МКАТ JTT45RA прецилитирует иэофорыу антигена CD46, иыега молекулярную массу 220 кДа, и блокирует ШАТ 2Н4, вследствие i го МКАГ JIT45RA отнесено к субкластеру CD45RA. Дня ШТ HS хс и ае удалось определить молекулярную кассу выявляемого антиге{ тем не менее данные двухцветной иммунофлуоресцонют достаток определенно указывает на пряиадлешость этого ШАТ к тому сускластеру. МКАГ 1В4 имеет сходный тип реагирования, однако двухцветных гистограммах оно слабее коррелирует с МКАТ 2Н4, сравнению с ЫКАТ. Возможно МКАТ 1В4 относится к другое субкл) теру, например CD45RB.

CDwSS. ШАТ CHI реагирует со всеми лимфоцитами и моноци' ми, но не нейгрофилаш. Отнесение CHI к кластеру CD52w являв' предварительным.

Получено гакде несколько МКАТ, которые реагирует с пове ностными антигенами лейкоцитов человека, однако в ноыенклат кластеров дифференцировки они не включается. Это МКАТ к * классов 1 и II, а такте к бета-2 микроглобулину.

3. Характеристика некластеризованных ЫКАТ

Наряду с четко кластеризовавшимися МКАТ были также полу 5 ШАТ, которые по своим характеристикам отличались ог извеет МКАТ. Возможно,* что эти ШАТ являются' прообразаш новых клас ров дифференцировки. Рассмотрим данные, полученные для s ЫКАТ, Солее подробно.

3F3. МКАТ 3F3 окрашивает около 7+3Z лимфоцитов перифери» кой крови и не реагирует с Т- и NK-клетками, моноцитами, грг лоцитами, тромбоцитами и эритроцитами, клетками тимуса и фиб] ластами костного мозга.

Как было показано ранее (Clark А.Е. et al., 1S86), В-ли циты лимфатических узлов разделяются на 2 популяции. Клетки ной популяции слабо окрашиваются МКАТ CD20 и являются покоящ ся, lgM-позитивными В-лимфоцитами, происходящими в основно мантийной зоны лимфатического узла. Клетки другой популяции

задаются ЖАТ CD20 ярко, и она представлена IgKf-негативными лфоцитами, вступившими в процесс активации, и локалиауодшися ¡ародышевых центрах. МКАТ 3F3 давало более сильную реакцию с >тками. слабо окрашенными ИКАТ CD20 (рис. 56). Таким образом соящиеся В-клетки экспедируют более высокий уровень антигена 5, чем активированные В-клетки.

Экспрессия антигена 3F3 значительно снижалась при активаций • фцитов под действием таких В-клеточных штогенов, как вирус' . ггейна-Барр и митогека лаконосз. Экспрессия антигена 3F3 не юнялась под действием насыщгвдэй концентрации МКАТ 3F3.

3F3 птеципитировало из лизатов клеток линий Raji, меченных ; или С, антигенный материал, мигрировавший при электрофоре-в редуцирующих условиях в виде одной полосы, соответствукей ку с молекулярной массой 45+5 кДа. Ацтигея 3F3 не 'удалось ципитировать из лизатов клеток, меченых По-видимому,

ный антиген, как и некоторые другие описанные в литературе игены, недоступен для мочения лактопероксидазой (Sayro Р. Н. al., 1985).

Антиген 3F3 обнаруживается на одних В-клеточных линиях ji, Rar.ios, Daudi, Namalwa), но отсутствует на других (IM-9, S, UC-729, RPMI 8856; линии, полученные трансформацией виру-Эпитейка-Барр (п-7)). Ш антигену 3F3 тага» негативны Т-кле-ные линии (Jurkat, СЕМ, t.DLT 4) и линии миелоидного и зрит-ластного проксхоздения (U939, HL60, К-562). При обследовании ьных с лимфопролифэративянми заболеваниям! было найдено, что иген 3F3 обнаруживается на лимфоцитах крови при хроническом В мфолейкозе (п-11) и волосаговлеточном лейкозе ' (n-З). Единенный обследованный случай плазмоцитомы был негативным по ая-'. ену 3F3. Таким образом, антиген 3F3 является маркером зрелых имфоцитов, который появляется примерно на стадии экспрессии эрхностного IgM и исчезает с мембряы клеток при их актива-

Антиген 3F3 по стадиям дифференцировки, на которых он экс-зсируется, соответствует антигенам CD21 и CD22, но отличается iva по молекулярной массе. Молекулярная масса антигена 3F3 • зка к таковой антигена CD37, однако в отличие от антигена 7, антиген 3F3 является чисто В-клеточным. Таким образом, Г 3F3 отличается по своей реактивности и молекулярной массе 1ляемого антигена от JSKAT, кластеризованных к настоящему вре-i, и, по-видимому, выявляет неизвестный ранее антиген.

T5G11. Из двух независимых гибридизаций были получеш UKAT T6G11 и ЛШ.00, которые имели сходные типы реактивное T5G11 и ЛШ.00 слабо реагируют с лимфоцитами крови, не Beai действуют с эритроцитами, ярко окрашивают моноциты и тромба и менее интесивно реагируют с гранулоцитами. T5Q11 и ЛИ00 п) ттест не реагировали с леритонеальньш макрофагами и макр< гаки грудного молока Более того, при культивировании ыонощ Ш vitro (в процессе которого наблюдается дифференцировка м цитов в макрофаги) экспрессия антигеиов T5G11 и ЛШОО постеп снижалась и на 7 день культивирования они полностью исчезал поверхности клеток.

Двухцветная имыунофлуоресцаиция с использованием ИКАГ весгной специфичности показала, дао ЫКАТ T5G11 и ЛШОО свяэ ится, в основном, с той же популяцией шнонуклеаров, что и CD14, CDilb, CDllo и CD36, однако полной корреляции в акспре сравниваемых антигенов не наблюдалось, и, следовательно, сре ваеыыа ЫКАТ принадлежат к различным кластерам.

При использовании различных опухолевых линий человека г вано.что T5Q11 и ЛЫ100 в наибольшей степени реагировали с t jсами промиелоцитарной линии HL-60, более слабо - с клез зритробластной линии К-562, и не связывались с Т-клеточнсй j IÜLT-4 и В-клеточными линиями Ranos и Raj ь

Шла изучена реактивность (ЖАТ T5G11 с моцонуклеараш i ферической крови больных некоторыми формами лейкозов миело] природы: острый и хронический ыоноцитарные лейкоаы (01 ХМонЛ), острый миеломоноцитарный лейкоз (ОНМЛ), а также г» цитоз X (ГХ) С Табл. 3). В качестве контроля использовались j нуклеары здо]ювых доноров. В группе моноцитарных лейкозов (' и ХМэнЛ), при * которых повышалась доля клеток фенотипа С увеличивалось также количество T5G11+-клеток. В то же время ОШЛ, когда в кровь погадают более ранние предшественники цитов, число клеток, связывающихся с ЫКАТ T5G11 повьшалос столь значительно. Поскольку известно, что антиген CD14 явл маркером зрелых лимфоцитов, а антигены CDllb и COI1с появл на более ранних стадиях дифференцировки клеток миедоидного можно предполол„;ть, что ЫКАТ T5G11 метит в основном зрелые циты, а их более ранние предшественники слабее экспресс этот антиген.

МКАТ T5G11 и ЛШОО преципитировали антигены с совпад{ молекулярными массами равными 110 кДа (рис. б). В некторн)

аОлнца 3. Связывание различных IfiíAT с клетками Сольных некоторыми формами миелоидных лейкозов (X антигенполо-лительных клеток).

i i | Тип клеток |

ШАТ |--1

| Контроль ГХ ХИЛ ОМЛ 01Ж |

iu-МЗ | 12+5 13+5 35+11 38+17 20+6 | iu-M5 | 17+4 15+6 42+12 60+22 52+17 | ¡u-15 1 22+7 24+6 48+9 74+30 64+22 | iGll | 29+8 31+10 41+10 42+18 21+7 | -1__i

[ на электрофореграммах рядом с основной полосой наблюдалась ;е выраженная дополнительная полоса, соответствующая меньшей жулярной массе. Антиген, выявляем ШАГ T5Gli и ЛМ100, име-5ел)совую природу, так как он чувствителен к действию трипсина фоназы. В тесте иммунофлуоресценции холодное ЫКАТ ЛЖОО не даровало меченое МКАТ T5Q11. С учетом данных по иммунопреци-адии это свидетельствует о том, что ШАТ T5G11 и ЛМ100 выяв-е различные эпитопы одного и того же антигена.

Антиген Т5611 имеет некоторые обще свойства с антигеном 3: антигены имеют практически совпадающие молекулярные массы :ы и оба антигена представлены на макрофагальньк клетках. Оду антиген CD68 в отличии от T5G11 зкспрессируется только на пых тканевых макрофагах и отсутствует на моноцитах. Таким об-эм, ЫКАТ T5G11 отличается по свойствам от известных кластери-анных антител.

Rs4. МКАТ Rs4 и Rs22 были полученг из одной гибридизации, надлежат к одному и тому же иаотипу (IgGl), но существенно личаются по реактивности. Rs4 реагирует как с ¡слетками линии os, которые служили иммуногеном, так и с нормальными лимфоци-и. Напротив, Rs22 взаимодействует только с клетками Ranos, но ? кагал®-либо другими мишенями.

МКАТ Rs4 окрашивает среди лимфоцитов периферической крови ло 18+5% клеток, не реагирует с Т-лимфэцитами, моноцитами, нулоцитами, тромбоцитами, эритроцитами и тимоцитами. На гис-рамме флуоресценции лимфоцитов периферической крови, окрашен-

—да—

ow

5 ь

0

Rs4

с г г

(§

m

Рис. 6. Двухцветная иымуиофлуореоценцяя лимфоцитов небных миид дин. Клетки окрашены IffiAT CD20, меченным фнкозритрино и ШАТ, «гченнши ©ИТЦ; а - CD19; 0 - 3F3; в - Rs4; г CD76. Ш оси абсцисс - log- зеленой флуоресценции; по о ординат - log краской флуоресценции.

Н.Н., Ф т'

о

65— <3— 29—

1 2

Рис. 6. ШТ Т5Ш1 преципитирует антиген с молекулярной шс 110 кДа. Электрофорез проводили в восстанавливающих жовиях в в градиенте плотности ДСН ПААГ от 7,6 до 16Х .1 - контрольный образец с преципитацией нормальным мьим; Z - преципитат ТбШ.

: Rs4, обычно модно выделить клетки с ярким и более слабым ¡чением. Методом двухцетной иммунофлуоресценции показано, что :иген Rs4 представлен на большей части В- и NK-лимфоцитов пе-Еерической крови, причем к ГЖ-клет.'сам принадлежат, в основном, lee слабо флуоресцирующие Rs4+-лимфоциты, в то время как среди слеток обнаруживаются лимфоциты как ярко, так и слабо окрашэн-} МКАТ Rs4 (рис. 7). Число Кз4+-клеток примерно соответствует те количеств CD20*- и CD16+-лимфоцитов, что является дополни-яьным подтверждением того, что антиген Rs4 является общим мар-ром В- и NK-клеток.

Для выяснения вопроса о распределении антигена Rs4 по суб-пуляциям В-лимфоцитов, отллчаиэдшся по степени активации, узу-ны двухцветные цнтограммы флуоресценции при окрапивании клеток бных миндалин МКАТ Rs4 в паре с МКАТ CD20. Обнаружено, что ан-ген Rs4 в большей степени представлен на клетках слабо окраши-ящихся МКАТ CD20 й являющихся покоящимися, IgM-позитивными лимфоцитами, происходящими в основном из мантийной зоны лимфа-ческого узла, по сравнению с ярко светящимися С020+-клеткаки, торые относятся к IgM-негативными лимфоцитам, вступивши в оцесс активации и локализующимся в зародышевых центрах (рис. 0.

Из лизата клеток линии Ramos МКАТ Rs4 приципитировало анти-'H, который в редуцирующих условиях мигрировал в виде двух по-)С, соответствующих молекулярным массам 87 и 71 кДа, а ШАТ ;22 преципитировало антиген, молекулярная масса второго точно »ответствовала таковой тяжелой цепи антигена Rs4 (рис. 8). Три-гальное совпадение по электрофоретической подвижности антигена ;22 и альфа-цепи антигена Rs4 представляется маловерояньш. Для таснения взаимосвязи антигенов Rs4 и Rs22 была изучена копреци-гтация с помощью МКАТ к этим антигенам. Если перед прёципитаци-J из лизата клеток линии Ramos а помощью МКАТ Rs4 полностью далить материал, реагирующий с данным МКАТ, то это приводило не элько к отсутствию преципитата в пробе с МКАТ Rs4, но и в пробе МКАТ Rs22. Если, напротив, клеточный лизат предварительно ис-ощигь ш антигену, распознаваемому МКАТ Rs22, то это есгествен-о вызывало исчезновение преципитата в пробе с МКАТ Rs22, а в реципитате, полученном с помощью МКАТ Rs4, удалялась только тя-елая цепь, но не затрагивалась легкая цепь данного антигена, ледовательно МКАТ Rs4 и Rs22 реагируют с одним и тем же антиге-ом, но отличаются по связыванию с различными цепями данного ан-

----- ........... 20 - --------------

1 б

&

с Щ 6

ы

8 г

ЧА

1

СС76

Рис. 7. Сравнение экспрессии антигенов, выявляемых ШШ

и С076, на лимфоцитах периферической крови человека. Клетки окрашены ЖАТ: а - ^4 и С020; б - 1?з4 и СО! б В - СБ76 и С020; г - С076 И СШ6.

М.м., кДа

203—

да

— 20Й

116— 97 —

I

ее—

■

• 9?

< -43—

— «3

29 —

1 2 14 5 4 7 6 9 (ОН«!

■39

Рис. 8. Копре ципитация антигенов, выявляемых ШАТ ^4 и 1?з22. В преципитации использовался штатный лизат клеток пин Калюг (1,2,7,8) или лизат, осветвленный ИКАТ 1^4 4.9,10) или МКАТ 1й>22 (5,6,11,12).' Электрофорез провс ли в градиенте плотности ДСН ПААГ от 7,5 до 152 в вс танавливавдих (1-6) или невосстанавливаадих (7-12) ус

виях.

ена

В нередуцирующих условиях антиген Rs4 мигрировал в виде х полос в области 200-250 кДа, а антиген Rs22 в виде двух по-в той же области. Также как и в случае редуцирующих условий осы, соответствующие антигену Rs22, совпадали по здектрофоре-еской подвижности с наиболее тяжелыми формами антигена Rs4. В ичественном отношении наиболее выраженной была самая легкая ма антигена Rs4 и самая тяделая - антигена Rs22. Предвари-ьное осветление лгаата с помощью МКАТ Rs4 приводило к полному ления как антигена Rs4, так и антигена Rs22. Напротив, пред-ительное истощение антигена Rs22 вызывало исчезновение толы«) х тяяэдых форм антигена Rs4, но не его более низкомелекуляр-формы.

Из опытов по ^преципитации с помощью МКАТ Rs4 и Rs22 мояно лать выьод о том, что они реагируют с различны!.® формами од-э и того же антигена, который мокно назвать антигеном -Rs22. Данный антиген имеет в своем составе 2 типа цепей, ванных дисудьфидными связями. Нативная форма антигена предс-лена 3 видами олигомеров, составленных из 4-5 цепей (рис. 9). наиболее тяжелых вида олигомеров имеют в своем составе толь-эльфа-цэпь и отличаются между собой по ira кратности. Наиболее сая форма антигена Rs4-Rs22 состоит только из бета-цепей. Г Rs4 реагирует со всеми 3 формами антигена Rs4-Rs22, а МКАТ 22 только с теми формами, в состав которых входит альфа-цепь, гы с биотинилированными антителами показали, что МКАТ Rs4 и Í не блокируют друг друга, и, следовательно, распознают непе-энваюшиеся зпитопы. Следует отметить, что структура антигена -Rs22 в определенной мере сходна со строением антигена CD8, пе существующем в нативном состоянии в форме олигомеров и роящего из 2 типов цепей (Martin P.J. , et al. , 1984; Moeblus 19B9).

МКАТ Rs4 реагирует о В-кдеточными линиями Ramos, CESS и не-)рыми линиями, подученными трансформацией с помощью вируса ;ейяа-Барр (2 литии из 9 обследованных). Антиген Rs4 отсутс-ít гп. Б-клеточных линиях Raj i, IM-9, UC-729 и RPMI 8866, а se Т-клеточной линии Н-9. МКАТ Rs22 не связывалось ни с каки-(в том числе позитивными по антигену Rs4) тестированными "ками-мишенями, за исключением клеток линии Ramos. Возможно,

МКАТ Rs22 выявляет опухоль-специфическую детерминанту анти» Rs4-Rs22, присутствующую только на (слетках линии Ranos, не

R»4. Ra22 : R»4, RsZS

Рис. 0. Схема строения антигена йз4-йз22.

Отмечены антигенные детерминанты, распознаваемые Ц й£4 (ф и Кз22 ф).

юа

5J :

В

\7

J4.S. "V" о о

*

-JL.

/№11СЭ TSW« Л#11«

я?з

Si3

Рис. 10. Ингкбирование зригрофагоцитоза под до йене и ШАТ T5G По оси абсцисс - вид МКАТ, которые; обрабатывалась пл тикозая поверхность; по оси ординат - индекс зритра годатоза (в X) по отношению к фагоцитозу моноцитов, тезированных на пластиковой поверхности, обработан нормальны),! IgG мыаи.

сличено таюв. что столь узкая специфичность МКАТ Rs22 связана ?ем, что Rs22 распознает некую аллотилическую детерминанту 1ного антигена В любом случае это наблюдение является еще од-t уникальной особенностью антигенного комплекса Rs4-Rs22.

При сравнении МКАТ R4 с известными УКАТ можно обнаружить, ) оно обладает некоторыми свойствами, характерны),« для класте-CD76, В частности, МКАТ CD76, тагапэ как и Rsl, реагируют пре-тцоственно с В-лимфоцитами, антиген CD76 также состоит из двух left, а их молекулярные массы (85 и 67) очень близки к таковым I Rs4. Однако имеются и некоторые отличия. Например Rs4 спо-5но к связыванию с NK-клетками, а МКАТ CD76 слабо взаимодейс-пот с Т-клетками. МКАТ HD66 и СР. IS-4, принадлежащие к CD76, in любезно предоставлены G. Moldenhauer и R. Vilella. Прямое шение реактивности Rs4 с НКАТ HD66 и CRIS-4 показало, что № CD76 дают более интенсивное окрашивание клеток-мишеней, чем I (рис. 7). Показано тага®, что количество Rs4+-клеток всегда шее, чем 0075*-лимфоцитов. Rs4 реагирует с клетками линий ios и CESS, а МКАТ CD76 с ними не взаимодействуют. Связывание « не блокировалось МКАТ CD76.

Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что МКАТ . выявляет новый, неизвестный ранее уникальный антиген. Анти; Rs4 является общим маркером для В- и NK-клеток, что является ¡кальным свойством, поскольку никаких других антигенов специ-тых только для этих двух групп лимфоцитов до настоящего вре-:и не известно. Существование о 0 се г о маркера может свидетелъ-овать о наличии каких-то общих стадий дифференцировки или :кций В- и NK-клеточных популяций. Есть все основания пола-ь, что МКАТ Rs4 является антителом-прототипом нового класте-

ЙЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МКАТ НА ФУШЩИО"АаЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОНУКЛЕАРОВ

В начальный период изучения дифференцировочных антигенов они смаривались лишь как маркеры определенных стадий созревания ■эдцигов или маркеры субпопуляций лимфоцитов с различной физи-т-ической активностью. Однако постепенно стали накапливаться ные о том, что ЫКАТ к некоторым дифференцировочным антигенам ут блокировать или активировать определенные функции клеток.

привело к пониманию того, что если не все, то значительная ть дифференцировочных антигенов является не просто пассивными

маркерами, но они также принимают активное участие в функщю ровании клеток, выполняя роль рецепторов межклеточных вэаи действий и факторов роста, структур, ответственных за перед сигналов о поверхности клетки в ее цитоплазму.

Нами было исследовано влияние подученных МКАТ на различ функции лимфоцитов. При этом было обнаружено, что некоторые них модулировали функциональную активность мононуклеарных f ток. Б частности, ЫКАТ ЛТ2 ингибировало блаттрансформацию действием митогенов, а также подавляло активность натурам килеров (рис. 4). Причем некоторые МКАТ, относясь к одному и ну ке кластеру, могли отличаться друг от друга по степени вi иия на функциональную активность лимфоцитов. Так, в частнос МКАТ ЛЕ21 и ЛБ21а реагируют с одним и тем же антигеном CD21. этом ЛВ21а мнгибирует трансформацию В-лимфоцитов под дейст! вируса Эпштейна-Барр, а ЛБ21 - нет. С другой стороны, ЛЕ21 С кируег образование комплементарных розеток, а ЛБ21а такой с собностыо не обладает.

Влияние МИД на функциональную активность лимфоцитов «с быть усилено за счет связывания с МКАТ различных биологии« активных веществ. Одной из разновидностей таких комплексов я; ются ишуяотоксины (Press О. V. et al., 1986), с помощью коп возможна полная элиминация популяции клеток, несущих опреде. ный антиген. Одним из наиболее перспективных видов иммуното! нов является комплекс МКАТ с токсином растительного происхо: ния - рицином.

В работе был получен коньюгат А-цепи рицина с МКАТ ЛИ, торый в концентрации 10~® М полностью подавлял пролиферацию : ток линий Н-9 и Jurkat, позитивных по антигену CD5, при сохр нии заметной пролиферации в культурах клеток линий Raji и К-1 негативных по этому антигену. Полученный иммунотоксин также фективно тормозил пролиферацию лимфоцитов крови, стимулирова фитогемагглотинином. Изолированная А-цепь рицина, использу для получении иммунотоксинов, не оказывала заметного цитото ческого действия на лимфоциты крови вплоть до концетрации М. Полученная панель МКАТ является хорошей базой для созд разнообразных иммунотоксинов, которые могут найти применение трасплантации аллогенного костного мозга, а также при леч некоторых видов лейкозов.

Наибольший интерес представляют данные по влиянию на $ ционалъиую активность МКАТ, выявляющих новые неописанные ain

ны. Одно из таких антител ШАТ 3F3, реагирующее исключительно с Б-клетками, не влияло выраженным образом ни на пролиферацию В-лимфоцитов, ни на секревдо Ig. Jipyroe исследованное антитело ЫКАТ Т5611 обладало сильным ингибирующим действием на некоторые функции моноцитов, и было изучено более детально.

МКАТ T5G11 блокировало фагоцитоз, АЗЦТ и образование кислородных радикалов, если мишенями для фагоцитов служили ЭБ, опсо-низирозанние специфическим кроличьим 1га Ингибирующее влияние T5S11 проявлялось только в том случае, если оно било иммобилизовано на пластиковой поверхности, на которой затем формировался монослой моноцитов и проводился фагоцитоз. При обработке моноцитов в суспензии T5G11 не влияло на указанные функции. Иммобилизованное T5G11 подавляло фагоцитоз на 60-902 по сравнению с уровнем фагоцитоза, регистрируемым при обработке пластиковой поверхности нормальным IgG мьш (рис. 10). В то же время T5G11 не подавляло функции, осуществляемые с участием рецептора для компонента комлемента iC3b, в частности, образование активных форм кислорода в ответ на действие эимозаяа или ЭБ, опсониэированных комплементом. Таким образом, блокирующее действие T5G11 ограничено опосредованными через FcR функциями моноцитов. МКАТ ЛМ100, распознающее тот ш шгаиген, что и T5G11, заметного действия на функции моноцитов но оказывало.

Постольку для проявления блокирующего действия T5G11 критичным оказалось связывание его с твердой фазой, было изучено влияние способа иммобилизации T5S11 на проявление его ингибирую-щих свойств. При иммобилизации T5G11 на пластиковой поверхности чер^з Prot А или антитела 'к IgG мыши фагоцитоз оставался на уровне контроля. При посадке на полистирол биотинилированного rpGll через авидин, ингибиция сохранялась, хотя ее уровень был «а 20% ниже, чем при иммобилизации T5G11 непосредственно на пластиковую поверхность. Следует отметить, что само по себе био-гинилирование не изменяло функциональной активности антител.

Исходя из результатов этих опытов, можно предположить, что а осуществлении ингибирующих свойств T5G11 важную роль играет iro Fc-фрагмент, который экранируется при связывании T5G11 с =rot А и, вероятно, с антителами к Ig мыши. Этот вывод подтвердился экспериментами с Fab-фрагментом T5G11, который, в отличие >т целой молекулы, не обладал блокирующим действием на фагоцитоз опосредованный FcR. Это может свидетельствовать о том, что ИКАТ '5G11 по строению Fc-фрагмента существенно отличается от других

ШТ того же класса, которые не обладают подобной функциональной активностью, и в первую очередь от МКАТ ЛШОО.

Одним из возможных отличий в строении Fc-фрагмента T5S11 мокет являться характер его гликозилирования. Для этого были изучены лектин-связывающие характеристики T5S11 в сравнении с другими МКАТ. Оказалось, что МКАТ T5G11 связывалось с лектинами намного лучше, чем другие 1ÍKAT класса IgG, и даже превосходило МКАТ класса IgM (Рис. 11). Так, с лектином проростков шпениць ( VGA) и лектином садового гороха (PSL), связывалось до 100% все? МКАТ T5G11, внесенных в лунку планшета; с Кон А - 75%, а с аглю-тинииом арахиса ( PNA) - до 65%. В то же время связывание Fat -фрагментов T5G11 с Кон А составляло в среднем 30Z от связывали с кроличьим антителами к Ig мыши. В отличие от МКАТ класса IgM, связывание которых с Кон А полностью блокировалось 0,5 M метил-! -малнопиранозада, взаимодействие T5G11 с Кон А подавлялось дан ным сахаром лишь на 25%. С целью модификации углеводного компо нента T5G11 обрабатывали 10-20 мМ периодата, что как известн приводит к окислению углеводов. Периодированио вызывало подавле ние связывания T5G11 с Кон А и PSL. При этом образцы T5G11, об работакные наибольией концентрацией периодата (50 - 100 Ш) пол ностьп топ«»^ способность ингибировать фагоцитоз. Обработк аериодатом в концентрации до 100 мМ не отменяла связывания T5G1 с Prot А и антителами к Ig мши.

Для более детального выяснения состава углеводной части >.:с лекулы T5G11 изучали связывание этого МКАТ с лектинами в npi сутствии водорастворимых коньюгатов моносахаридов с полиакрилг мидом (так называемые псевдополисахариды): Мап-«-РАА; Man-6-P--РАА; Gal-jB-PAA; GlcNAc-^-PAA; GalNAc-oi-PAA и Fuc-cí-PAA. Обкар: йена, что Fuc-o( не влияла на связывание антитела с дектшаи тогда как в присутствии Man-* связывание T5G11 с PSL и PMA npai тически полностью отменялось; Gai~ß на 80% ингибировада связыв; ние антитела с Кон A, PSL и РИА, а ¡Лзп-6-Р-с< на 50% отмена связывание с W3A. Нэсиотря на то, что Кон А, как известно, иш специфическое сродство к связыванию с маннозой, а РИА - с гала тозой, в наших условиях связывание T5G11 с Кон А существенн ингибировада Gal-J3, а с PNA - напротив, Kían-e!. Еозюжно, что и лекула T5G11 содержит довольно сложную по строению и соста олигосахаридную цепь, и этим объясняется связывание T5G11 с с wm разнообразными лектинаш за счет взаимодействия по разл! нш участкам этой цепи. Ее исключено тага®, что множественное

aassmssasBssss

err

SS

и

CJ и о

§

s

о £

S

реакции T5G11 обгоняется тем, что лектины обладают лишь преимущественной, а не абсолютной специфичностью к тем или иным саха-рам. Во всяком случае данные опыты могут свидетельствовать, что именно благодаря особому углеводному строению ШТ T5G11 обладает повышенной лектин связывающей способностью, и этим отличается от других ШАТ.

Известно, что туникамицин (ТМ) в концентрациях (1-10 мкг/мл) подавляет гликозшшрование в клетках бактерий и млекопитающих. При выращивании гибридом в среде с ГМ, примерно 50% клеток сек-ретируюг иммуноглобулины, на 90Z дефицитные по олигосах^рядныы цепям Fe-фрагмента (агликозилированные AT). T6G11 полученное из культуры гибридош, выращенной в присутствии TU (T5G11-TM), сохраняло способность связывать Prot А и специфический антиген. В то же время степень связывания T5G11-TM с Кон А, PSL и РИА; уменьшалась в среднем на 40% по сравнению с нативным T5G11 (Рис. 12). Одновременно T5G11-TM при сорбции его на полистирол характеризовалось сникеннием примерно в 2 раза своей способности к ингибированию фагоцитоза по гранению с контрольным T5G11. I

Полученные данные показывают, что блокирующее действие ШАГ1 T5G11 связано с особенностями строения его Fc-фрагмента, а именно, с необычным составом его углеводных остатков. Таким образом продемонстрировано, что характер гликозилирования антитела может играть валиую роль в его взаимодействии с Fc-рецептором фагоцитов.

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СУБГОПУЖШОННОЯ СТРУКТУРЫ ЛЮЙОЩГГОВ

В качестве основного метода при изучении субпопуляционной структуры лимфоцитов использовался метод проточной цктометрии, который помимо своих основных преимуществ, обладает также тек достоинством, что его результаты легко представляются в цифровое виде удобном для последующей математической обработки.

Выли разработаны методы математического разложения гистограмм флуоресценции и распределения лимфоцитов по величине малоуглового рассеяния. Предложенные подходы позволили отслеживав и детально аналигировать процесс бластгрансформацш лимфоцитов, а такке кинетику фагоцитоза макрофагами.

Наиболее плодотворным оказалось использование математического моделирования для расчета субпопуляциоккой структура гхифз

цитов. Параметрами субпопуляционной структуры являются размеры и степени перекрывания популяций клеток, несущих определенные антигены. При учете экспрессии 3-4 или более антигенов для прямого решения данной задачи необходимо использование трех- или четырех -цветного окрашивания, что практически выполнить довольно трудно. Однако поставленная задача может быть решена доступным методом двухцветного окрашивания с применением иатематичеоюго моделирования.

Рассмотрим случай, в котором учитывается экспрессия п антигенов. Наличие или отсутствие антигена на популяции клеток можно кодировать знаками "+" или "-" соответственно, тогда фенотип популяции может быть представлен в виде последовательности, состояла из "+" и а теоретически возможное количество типов клеток будет равно 2п. Их действительное количество можвт быть, конечно, меньше ввиду известных особенностей зспрессии некоторых антигенов: например, в норме на лимфоцитах крови антигены CD4 и CD8 практически не зкспрессируются одновременно, тага» не коэкс-прессируктся антигены CD3 и CD19. Известно также, что антиген CD4 может Сыть только на Т-клетках, другими словами комбинация 2D3~CD4+ является "запрещенной". Исходными данными для моделирования служат результаты двухцветного окрашивания лимфоцитов по-7арньши сочетаниями ШАТ к рассматриваемым антигенам. Задача моделирования состоит в определении доли каждого типа клеток в юпуляции по экспериментальным оценкам относительного содержания слеток, характеризующихся определенной феногипической комбинаци-(й пары антигенов. Количество линейно независимых уравнений в iTo\iслучае будет равно зСп, т.е. произведению числа различаются бипараметрических цитограмм на количество независимых дан->ix, получаемых из одной цитограммы. В общем виде задача имеет ешение до п-4, однако с учетом запрета на определенные сочета-ия антигенов решение может быть найдено и для большего коли-ества антигенов.

Предложенная математическая модель была использована для зсчета субпопуляционной структуры лимфоцитов нормальных доноров пациентов, страдающих различными формами первичных НДС. При ^строении субпопуляционной структуры, как правило, получались оеокие значения множественного коэффициента корреляции (> 0,9), 'О свидетельствовало о правомерности предлагаемого подхода, (счетные карты субпопуляционной структуры характеризуются оби-!см деталей и их можно уподобить своеобразным "отпечаткам чал!.

цев" суСполуляционной структуры исследуемых пациентов (рис. 19). Можно надеятся, что со временем они смогут служить тонкими диагностическими показателями иммунного статуса испытуемых.

ИССЛЕДОВАНИЕ СУБПОПУ ЛЭДШННОЙ СТРУКТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ

В рамках традиционного подхода при оценке имукного статуса измеряется количество клеток, составляющих основные популяции лимфоцитов. Однако размеры популяций могут значительно варьировать как в норме, так и при патологии, что снижает разрешающую способность данного метода, поэтому последние годы были отмечены поисками Солее эффективных способов оценки нормы и иммунопатологических состояний. Возможным усилением рассматриваемого метода является использование по возможности большего набора измеряемых параметров с последующим многомерным кластерным анализом. Однако более привлекательным представляется поиск величин, обладающих более высокими дискримзшативными свойствами. Возможно, что такими переменными могут стать параметры, характеризуюадле тонкуж субпопуляционную структуру.

Под суОпопуляционной структурой мы понимаем совокупносп данных о возможных типах клеток, отличающихся набором поверхностных антигенов, а также о количественной доли этих типов ; общей популяции лимфоцитов. Знание субпопуляциояной структур дает информацию не только о размерах субпопудяций, несущих опре деленные антигены, но также и данные о степени перекрывания эти субпопуляций между собой.

Приступая к изучению субпопуляциояной организации, мы заде лись вопросом, как она меняется при переходе от нормы к патолс г ии-, путем плавных сдвигов в структуре, характерной для норм или сопровождается разрывными деформациями, приводящими к поя: лению клеточных типов, отсутствующих в норме. •

В качестве объекта исследования были выбраны первичные И у детей. К первичным ИДС относят врожденные заболевания, харэ теризуюциеся недостаточной функцией иммунной системы. В завис мости от того, какое звено имунитета страдает в первую очере первичные ВДС можно подразделить на следующие группы заболе! ний: коьйшшрованную иммунную кедостг точность (КИН), при кото] нарушены функции как Т-, так и В-клеток; синдромы недостаточн! ти антител, при которых ведущим является поражение В-звена ш •итртя- ИДС, связанные с нарушениями функции макрофагальн

;тка. В свою очередь среди КИН можно выделить тяжелую комбини-занную иммунную недостаточность (ТКЙН), КИН с атаксией-телеан-зкстаэией (А-Т) и синдром Вискотта-Олдрича (СВО), а среди ИДС, 1занных с недостаточностью антител - врожденную гипогаммагло-аинемию без В-клеток (ВГГГ), гилогаммаглобулинемию с гипер-1&М ;Т-1гМ), общую вариабельную гипогаммаглобулинемию (ОВГ), а и® селективную недостаточность 1дА (сел-1вА). К первичным ИДС ^имущественным нарушением функции Т-клеток относят хроничес-4 кожно-слизистый кандидоа (ЖСК). Хроническая гранулематорная везнь (ХГВ) является 1слассичес1сим примером первичного дефекта гоцитируадих клеток. Промежуточное полотенце меяду лимфоидными фагоцитарными расстройства!«! иммунитета занимает гипер- 1дЕ трон (гипер- 1вЕ). Данные заболевания встречаются с различной зтотой. Наиболее распространенным заболеванием .является сел-\ (1 пациент на 328-3000 обследованных в популяции). Значи-иьно реже встречаются прочие формы первичных ИДС (частота 1:

000 - 1:100 ООО).

Первичные ИДС были выбраны в качестве объекта исследования зилу того, что при этих заболеваниях ведущим компонентом явля-:я расстройсто иммунной системы. Первичные ИДС отличаются так-тем, что наблюдаете нарушения в иммунной системе являются ^нь грубили. Так например при нарушениях В-звена иммунитета эедки случаи не только существенного снижения в-лимфоцитов, но случаи их полного отсутствия. Только при первичных ИДС могут гретиться случаи практически полного отсутствия Т-лимфоцитов, юдя из этого следует ожидать, что если наруше'ния в субпопуля-энной структуре при переходе от нормы к патологии и просходят, ойи в первую очередь должны наблюдаться при первичных ИДС, и

1 ротив, если какие-либо соотношения между субпопуляциями сох-шются далз при этих заболеваниях, то эти соотношения носят гойчивый и обияй характер. Благоприятсвующим фактором для виза первичных ИДС в качестве объекта исследования являлось так-то обстоятельств, что случаи этих довольно редких заболеваний гечение долгого времени собирались со всего СССР и находились учете в детском отделении Института иммунологии. Таким обра-л мы могли располагать хорошей выборкой по некоторсым очень цким формам заболеваний.

Было обследовано 225 больных детей с первичным ИДС, госпи-яизированных в детском отделении Института иммунологии и м

контрольных пациентов. Среди обследованнных больных 46 детей страдали КИН с А-Т, 7 - СВО, 48 - ЕГГГ с дефицитом В-клеток, 16 - ГПМеМ, 18 - ОВГ, 18 - ШЖ, 44 - селективным дефицитом 1еА, 7 транзиторной младенческой гипогаммаглобулинемией, 13 - гипер

синдромом, 8 - ХРБ. Многие больные обследовались многократно с интервалом 1-0,5 года Некоторые пациенты наблюдались в течении 5 или более лет. Контрольная группа состояла из практически здоровых детей, а также группы патологического контроля, включавшей пациентов без какого-либо верифицированного первичного ИДС, но с повышенной частотой гнойно-воспалительных бактериальных инфекций (п-27) или инфекций верхних дыхательных путей (п -22). Наличие групп патологического контроля преследовало цель дифференцирования вторичных изменений иммунного статуса вследс-твии частых инфекций от собственно генетически обусловленных изменений.

Анализируя субпопуляционную структуру лимфоцитов при первичных НДС, прежде всего рассмотрим какие соотношения выполняются между основными типами лимфоцитов, каковыш являются Т-, В- и ПК -клетки. При первичных ИДС количество Т-лимфоцитов варьировало от 1 до 90%, В-лимфоцитов от О до 30%, а Ж-лимфоцитов ог 1 до 60%. Варьируя в таких широких пределах, данные популяции остаются неперекрывающимися, однако не совсем ясно, все ли многообразие лимфоцитов списывается данными 3 типами клеток, или возможно появление "нулевых" клеток, лишенных как маркеров Т- и В-лимфоцитов, так и НК -клеток. В качестве меры "нулевых" клеток может быть использована разница между числом С045*'-клеток (все лимфоциты) и суммарным содержанием С03+-, 0020*- и С01б+-клеток, относящихся соответственно к популяциям Т-, В- и Ж-лимфоцитов.

Для з*сех обследованных больных, за исключением самых грубых патологий, каковыш являются КИН, суша количеств С03+-, С020+- и СШ6+-клеток довольно близка к общему количеству лейкоцитов, маркируемых антигеном СЭ45. В этих случаях "нулевые" клетки есл* и существуют, то их доля не превышает 3,5+3,02. Иная картинг наблюдалась у больных КИН, у которых регистрировалось вползи ощутимое количество "нулевых" клеток (10+9£), достигавшее у отдельных пациентов РО и более X. Какова природа "нулевых" клето! остается пока невыясненным, возможьо ими являются какие-либ< формы незрелых лимфоцитов.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ПАН-В КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ Среди обследованных иммунопатология наиболее представлены заболевания, связанные с нарушения (да функции В-кдеточного звена иммунитета. Это ВИТ, ГПМвМ, ОВР и селективный дефицит 1вгА. На какой стадии развития В-лимфоцитов происходят нарушения, приводящие к данным заболеваниям до сих пор неизвестно. Не исключено, что эти нарушения связаны или сопровождаются дефектом экспрессии одного или нескольких В-клеточных дифференцировочных антигенов.

Для выяснения этого вопроса была изучена экспрессия 7 В-кле-точных дифференцировочных антигенов: СШ9, С020, С021, С022, С076, ЗРЗ и Еисокие коэффициенты корреляции (0,94-0,99)

между числом клеток, несущих данные антигены, показывают, что экспрессии исследованных В-клеточных антигенов тесно взаимосвязаны. На рис. 13а представлены данные регрессионного анализа чисел лимфоцитов, несущих антигены С021 и С022. Количества С021+- и С022+~клеток варьируют пропорционально друг другу в широком диапазоне изменения этих величин от 0,1 до 25Х.

При сравнении количества лимфоцитов, несущих В-клеточные дифференцировочные антигены, с показателями, характеризующими экспрессию антигенов ША-ОК и поверхностного была выявлена менее жесткая взаимосвязь. На рис. 136 представлено сравнение экспрессий антигенов БЯ и С021. Коэффициент корреляции в этом случае составил всего лишь 0,517. Аналогичная картина была получена при корреляционном анализе экспрессии В-клеточных маркеров и поверхностного Было отмечено, что клеток, несуиих я БЯ

Таблица 4. Коэффициенты корреляции между отеосительным

' содержанием клеток, несущих различные В-клеточные маркеры (п-44).

»........ " 1 ¡Маркер | СШ9 СС21 С022 ЗРЗ ни-оя 1 ■1в 1 1

1 1 I С019 | 1 0,958 0,942 .0,953 0,545 1 0,573 |

| С021 | 1 0,947 0,987" <3,517 0,626 1

| С022 | 1 0,972 ©,541 0,643 ?

I ЗРЗ | 1 0,517 0,616 Ч

I Н1.А-0!? | 1 0,382 1

! 18 1 1 1

л

8

1Шг

50

I

ИГ41Ш

ШИМ

Рис. 12. Влияние нативного ШАТ Г5611 и его агликозилированной формы (Т5011-ТМ) на аритрофзгоцитоз шдацитов. По оси ординат - индекс эритрофагощяоза (в Ж) по отношению к фагоцитозу ыоноцитов, адгезироеашшх на пластиковой поверхности, обработанной нормальным шеи.

гз £1

$ го ..•о"* Ор^о

N

а ю -

и „ о

0 " о.о'"

> • '

а 10 10 . £0

СЕкги^"

£3 &

о °о о °

Т о

й 15 _ 0

& •-Ч. О о

10 'аоао о

3 _|_ 1 1

л

ъз

10 13

С02

ео

Рис. 13. регрессионный анализ зависимости количества клеток, не сущих антиген СБ22 (а) или антиген НЬА-Ой (С), от кода чества клеток, зкспрессируидах антиген С021. По оси абсцисс - количество лимфоцитов (в X), несущ маркер С021; по оси ординат - количество лимфоцитов < X), несущих маркер С022 (а) или Ю-01? (б). Пунктирш линией обозначена регрессионная зависимость.

антигены, как правило, на несколько Z больше, чем клеток, положительных по ьаркерам CD19, CD21, CD22 и 3F3. Наиболее отчетливо это проявлялось у некоторых больных ВГГГ, у которых при полном отсутствии клеток, несущих В-клеточные диффэренцировочные антигены, наблюдалось заметное число lg+- и DI?*-клеток. Последующий анализ показал, что данное превышение объясняется не присутствием В-глоток с анамальиым фенотипом Ig+DRfCD19~, а является следствием экспрессии антигена HLA-DR на авизированных Т-клетках и пассивной сорбцией сывороточного Ig- на Г-лимфоцитах.

Таким образом при первичных ИДС, связанных с дефектами В-клеточного звена, отмечается жесткая корреляция между зкспрес-сияш! В-клеточных маркеров, фи этом наблюдается сокращение размеров всей популяции В-клеток, а не утрата отдельных В-клеточных MapicepoB. Полученные данные показывает, что при изученных иммунопатологии дефект развития В-клеток не связан с блоком какой-либо стадии дифференцировки В-лимфоцитов, поскольку это приводило бы к появлению В-клеток, ляиенных определенных маркеров, а скорее является регуляторной поломкой, не позволяющей В-ростку развиваться до нормальных размеров.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ПАН-Т КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ

Популяция Т-лимфоцитов в периферической крови в количественном отношении является самой значительной. Доля ее редко снижается ниже 502. Т-лимфоциты маркируются антигенами CD2, CD3, CD5, CDS и CD?, получившими наименование пан-Т клеточных, поскольку в норме они присутствуют на всех или почти всех Т-лимфоцитах.

/ Исследование показало, что при взятых наш первичных ИДС та-<ой тесной корреляции, какая наблюдалась между пан-В клеточными маркерами, для пан-Т клеточных маркеров не отмечается. В первую зчередь это объясняется тем, что антигены CD2 и CD? кроме Т-лим-[юцитов присутствуют также на NK-клетках. При некоторых заболе-iалиях, чаще всего при КИН с А-Т, значительно увеличивается доля Ж-клеток, вследствии этого различия меаду уровнем клеток, несу-Ш антигены CD3 и CD5, с одной стороны, и количеством клеток4 жспрессирующих антигены CD2 и CD7, с другой стороны, может дос-'игать 40 и более процентов. Однако сколь не велика была бы доля IK- клеток С определяемых по присутствию антигена CD16), темно (енее все СОК^-лимфотпы сохраняли экспрессию антигенов CD2 и ■и'г.

Дополнительный вклад в разсогласоваюш уровней экспрессии пан-Т клеточных маркеров вносит также то обстоятельство, что антиген CD7 не представлен на некоторой части CD4+ популяции. В норме количество клеток с фенотипом CD3+CD4+C07- невелико (4+27.), однако при патологии их доля может заметно увеличиваться. В частности, нами было отмечено, что при ОБГ количество CD7*-клеток уменьшается по сравнению с числом СЮ*"- и С05+-лимфоцитов. Дополнительное исследование с помощью двухцветной иммунофлуорес-ценции показало, что это связано с расширением пределов популяции с фенотипом CD3+CD44CD7~. В груше больных с ГГГ количество CD3+CD4+CD7r - лимфоцитов (6,5+5,1, р<0,05) достоверно выше, чем i контрольной группе. У одного из больных ОВГ число C03'fCD4+CD?r клеток достигало 22Z, что составляло более половины всех CD4-1 лимфоцитов (рис. 14). Таким образом, несмотря на то, что антиге) CD7 принято рассматривать как пак-Т клеточный маркер, он таи н< менее может использоваться для выявления некоторой субполуляци внутри множества CD4+-клеток, размеры которой могут увеличивать ся при ОВГ. t

Антиген CD5 также не является строго пан-Т клеточным, те как кроме Т-лимфоцитов он обнаруживается на части В-клеток, оi нако доля CD5+ В-лимфоцитов невелика, а интенсивность окрашив; ния их настолько слаба, что зарегистрировать их можно только помощью специальных приемов.

Таким образом, расхождение в экспрессии пан-Т клеточных а тигенов следует понимать не как изменения субпопуляционн структуры, связанные с появлением новых субпопуляций, несун необычные комбинации маркеров и не встречающиеся в нормаль* состоянии, а как следствие увеличения или уменьшение доли лим; цитов, присутствующих в норме.

Ш-видимомд под последнее определение не подпадает наб. давшийся нами случай с больным, страдавший' ТКИН и характер» вавшийоя очень грубым нарушением субпопуляционной структуры, имел следующий фенотилический профиль: CD454" - 70%; CD2+ - 2 CD3+ - 2 2; CD4+ - 0,4%; CD5+ - 5%; CD7+ - 60%; CD8+ - IS CD16+ - 502; CD19+ - 0%. Хотя абсолютная разница между урови CD3* и С05+_клеток невелика, тем не менее количество последю 2 раза больше, чем первых. Волыни разница между числом СЕК СОЗ^-лимфоцктов объясняется высоким уровнем СШ.6+-клеток, ода количество СВ21"-лимфоцитов не соответствует ни доле Т-клеток числу NK-лимфоцитов. Возможно Б этом случае мы имеем дел

- -

только с изменением пропорций между субпопуляциями, наблюдаемыми в норме, по и с проявлением антигенов в новых сочетаниях.

Помимо сложностей, связанных с многочисленностью маркеров, участвующих в формировании антигенного портрета, задача субпо-пуляционного анализа лимфоцитов еще более усложняется из-за воз-мзгшой гетерогенности антиген-положительных клеток, вследствии различий в уровне экспрессии антигенов. Разделение клеток на субпопуляции, различающиеся по степени экспрессии маркеров, отмечалось ранее для антигенов. CD8 (Martin P.J. et al., 1984) и CD56 (Lanier L. L. et al., 1986). Клетки различающиеся по степени экспрессии антигена могут отличаться не только фенотипически, но и функционально. Так например, CD8+-клетки с яркой флуоресценцией является типичными т-лимфоцитами, a CD8+-клетки со слабой флуоресценции принадлежат к НК-клеткам (Gebel Н. М. et al., 1987), С05б+-клетки с сильной и слабой флуоресценцией различают-гя по активности в нерестриктированной по главному комплексу ци-готсксичности. Две популяции тимоодтов разлмчаюидеся по экспрессии CD5 антигена были обнаружены, в тимусе: ярко флуоресцирующие Ж-1-- клетки, которые принадлежат к медулярным тимоцитам и слабо ¡шуоресцирующие CD5+-(слетки, которые относятся к кортикальным гимоцитам (Martin P.J. et al., 1981).

Было обнаружено, что при некоторых первичных ИДО лимфоциты срови могут сыть разделены на субпопуляции, отличающиеся по сте-!енр экспрессии антигенов CD5 и CD7. Бимодальные гистограммы 1аблюдались лишь при некоторых формах первичных ИДС, а именно: >ЕГ (у 10 из 24 обследованных) , ВГТГ (у 10 иэ 40), ПТ-JgrM (у 1 13 10), А-Т (у 4 из 36), СЕО (у 1 из 6). Подобные изменения от-уФствовали у остальных 162 больных с разнообразными генетически «условленными дефектами иммунитета и у всех 69 обследованных ациентов без первичного иммунодефицита

Для выяснения вопроса о взаимосвязи ярко и слабо флуоресци-ующих CD5+ и CD7+- клеток, с "традиционными" CD4+ и СВЗ^-суОпопу-яциями был использован метод двухцветной иммунофлуоресценции Рис. 15). У пациентов с бимодальным распределением антигенов D6 и CD7 CD8+-клетки обнаруживались как среди ярко и так и ускло флуоресцирующих CDS'"- и CD1^-лимфоцитов. Напротив, CD4+-имфоциты наблюдались лишь только среди ярко флуоресцирующих CDS* леток. Антиген CD4 хотя и присутствовал как на ярко, так и на ускло флуоресцирующих CD7+-клетках, тем не менее в основном Сил

£ т

(Ш ш

Рис. 14. Разделение СБ4+ популяции лимфоцитов крови по экспрессии антигена СБ7.

Цитограмш двухцветной иммунофяуоресценции нормального донора и пациента, страдающего-ОБГ. Цифрами указано количество клеток с фенотипом С04+СБ7+ и С04+С07-.

В ^

см

i

Щ!

(М

йй

см

ш

81

ж.

ш

В

dz

ез

•

8 ё Б

- с>

ом

ёЫ

Ж

см

в

см

CIS

I Л

в! ®

ё1 >- I

-1 ¿3' ! да

"fci Iе

а®

Рис. 16. Цитограммы двухцветной иммунофяуоресценции лшфоцитоз периферической крови с одномодальньм (А) и бимодальны) (Б, В) распределением антигенов CD5, CD7 (Б) и CDS (В). А - нормальный донор; Б - пациент, страдающий общей вариабельной гипогаммаглобулинемией; в - пациент с атак с ией- телеагиэкгаэдай.

осредоточен на ярко флуоресцирующих CD7+-лимфоцитах. Таким оО-ззом, антигены CDS и CD7 можно рассматривать но только как пан-Т яеточвЦе, во и как «аркеры, которые в некоторых случаях раздели! субпопудявдю С03+-лиифоцитов на более тонкие группы клеток, редчавддася по степени экспрессии данных антигенов.

Иэйвление бимодальной экспрессии антигенов CD5 и CD7 связано увеличением доли слабо флуоресцирующих CDS*- и CD7*-клеток, шсутствуюяих в небольших количествах и в нормальных случаях, юдуе.т отметить, что подобное возрастание доли слабо флуоресцн-тойзгх СБ5+-да!фощггов и появление бимодальных гистогралм фдуо-юценции отмечалось также и для HIV позитивных пациентов .onkei R. et al., 1989).

интересно отметить определенную аналогию в экспрессии чело-ческого антигена CD5 и гомологичного ему мышиного антигена tl. Антиген Lytl, присутствуя на большей части Т-лимфоцитов ай, подобно обнаруженной закономерности для человеческого ан-гена CD5, в наибольшей степени зкспрессируется на Т-хелперах, язанных с CD4+-лимфоцитами (Matosslan-Rogers A. et al. , 1982).

Представленных данных пока недостаточно для того, чтобы ут-эждать. что обнаруженная бимодальность является исключительной Ценностью рассматриваемых патологий. В тоже время приведенные нше позволяют проследить определенные ассоциации. Так бимо-шгоэ распределение антигенов CD5 и CD7 наблюдалось преиму-!т'венно при патологиях, характеризующихся тотальным дефицитом (у 21 из 26 случаев), и отмечалось также при комбинированных ¡уНо дефицит ах, но не встречалось при других заболеваниях, как ример, при селективном дефиците IeA.

/Бимодальность распределения антигена CD8 является более иа-тным явлением. Клетки слабо экспрессирухвде CD8 не являются ячиимй Т-клатками. (они лишены антигенов CD3 и CD5), а прилежат к NK-лимфоцитам (экспрессируют антигены CD7 и CD16). дичение числа слабо флуоресцирующих CDS4"- лимфоцитов при со-гтвующим возрастании доли СО/1'- и С016+-клеток наблюдалось у ьных с А-Т (Рис. 15с).

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ СУБШ1ШЩИОЩЩ МАРКЕРОВ Основными субпопуляциями Т-лимфоцитов являются CD4+- и CD8+-?ки, которые принято связывать с хелперами и киллерами/суп-юрами соответственно. Первоначально эта связь понималась ком прямолинейно (Schlossman S. F., Reinherz E.L. , 1984).

Позднее их взаимоотношения были уточнены, и в настоящее время антигены СБ4 и СШ рассматриваются в первую очередь как элементы, определяющие то, в контексте какого из классов НЬА Происходит распознавание рецептором Т-лиифоцита номинального антигена.' Как бы то ни было, соотношение С04+/СШ+ является чувствительным индикатором состояния иммунной системы, четко улавлийавдим отклонения от нормы в ее субпопуляционной структуре.

Отклонения от нормального уровня соотношения С04+/СШ+ встречались при первичных ИДС, связанных как с нарушениями Функций 7-клеток (КИН и ХКСК), так и при заболеваниях имеющих В-клеточную природу. Снижение соотношения С04+/СБ8+ при 1-дефицитах происходило в первую очередь за счет субйопуляции клеток, эсп-рессируюших антиген С04. В то яэ время сходное уменьшение соотношения С04+/С08+ у больных с ведущим гуморальным дефектом обычно возникало за счет повышения содержания С08+-субпспуляции. Представляется более вероятным, что экспансия £Г)3+ -субпопуляции при ВИТ связана не с супрессорныы генезом блока -развития В-клй-ток, а носит скорее приспособительный характер, отражая увеличение доли киллерных клеток у больных с глубоким гуюрелшда иммунодефицитом.

Заслуживает внимания также тог факт, что при ВГГГ у 70* больных уровень С03+-клеток более, чем на 10% превышал сумму С04+-и СОв4--лимфоцитов, в то время как в норме подобное превышение наблюдалось менее, чем у 20% обследованных. Это наблюдение является косвенным указанием на значительную экспансию у больных ВГГГ субпопуляции т.н. "двойных негативных" (ССЗ*СС4~С08~) клеток. Показано, -что "двойные негативные" Т-клетки зкспрессируют антигенрас дознающий рецептор, состоящий из гамма и дельта цепей, в отличие от рецепторов, обнаруживаемых на С03+С04+- или С03+С08+-лимфоцитах и образованных альфа- и бета-цепями (ТПеЬе1 Г., Негсепс! Т., 1989). Поскольку гамма/дельте?1-клетки обладают повышенной цитолитической активностью против широкого спектра опухолевых клеточных мишеней, не связанной с естественной киллерной активностью, увеличение их числа при некоторых ИДС можно рассматривать как ещэ один механизм компенсации недостаточности антител.

Доктором Мэге^а были любезно предоставлены ИШ ВВЗ I А13, которые реагирует с различными субпопуляциями гамма/дедьтг клеток. Однако, как показали наши исследования, уровни ВВЗ+ 1 А13+-клеток не коррелируют с количеством СОЗ*'СВ4~С1)8~-лимЗоци

•ов. Более того, BBSf*"- и А134" -клетки примерно в равной мере ютречались как среди CD4+/CD8+ клеток, так и С04"*СШ~-лимфоци-'ов. По-видимому, для более полного выяснения взаимосвязи между двойными негативными" и гамма/дельта+-кдетками требуются МИАТ олее узкой специфичности.

Субпопуляции CD4*- и CD8+-клеток не являются однородными и нутри них модно выделить более тонкие "суб-субпопуляции", кото-ые обнаруживаются с помощью таких антител, как СИ lb, CD27, D28, CD29 и CD45RA. Наиболее известными в этом отношении явля-тся антигены CD29 и CD45RA, которые распределены взаимоисключа-Фм образом и делят С04^-субпопуляцию на хелперы-индукторы и элперы супрессоров, a CDS4"- субпопуляцию на собственно супрессо-ы и предшественники киллеров (Sohen S. et al., 1990). Характер азграничвния субпопуляций CD4+ и CDô+-клеток с помощью антигена 327 остается пока мало исследовнныи (Van Lier R. A. W. et al., 387). Неизвестно, в частности, в каких соотношениях CD4+- и CD8+-зпуляции подразделяются антигеном CD27, в каких пределах эти ютношения могут изменяться, как меняется характер разбиения в шисимости от размеров CD4+- и СВ8+-субпопуляций. а также как •о рсшграничение соотносится с подразделением по другим антиге-LM, расщепляющим CD4+~ и CDS^-субпопуляции.

П))и обследовании контрольной группы пациентов (п-24) было юаружено, что антиген CD27 присутствует на большей части лимфоцитов, однако распределен по отдельным субпопуляциям лимфоцитов неравномерно (рис. 22). В наибольшей степени анти-н CD27 представлен на С04+-клетках,. 90+8Z которых коэспресси-ет антиген CD27, и несколько 'в меньшей степени на С08+-клет-х, у которых только 77+28% клеток несут антиген CD27. Среди бль негативных CD3"t"CD4~CD8""-лимфоцитов 79И 22 клеток обладали тигеном CD27.

Несколько иные пропорции разделения CD4+- и CD8+-субпопуля й по антигену CD27 были обнаружены при обследовании пациентов иммунной недостаточностью. На рис. 17 представлены данные мнения долей CD4"tCD274/CQ4'+ и CD8+CD27+/CD8't" для контрольной дты, пациентов страдающих ГГГ, а также больных КШ. Прежде зго при КИН и ГГГ наблюдалось снижение общего количества CD27*'-îtok до 36+14Z и 45+13%, соответственно. Величины долей l+CD27+/CD4+ и CD3+CD27'VCD8+ при КИН колебались в широки* ; делах, но их средние значения от контроля достоверно не отли

Т- I а

« {V 1L-, as

» ь

» t i—а Ще—sb—1

OS

ь- t ь ф '

1 Ф \ —ж " "дь1 & 1

CM

г

щ

©27

CD4

Рис. 16. Коэкспрессия антигена CD27 и антигенов CD3 (а), (С), CD8 (в) и CD20 (Г).

По оси абсцисс - log зеленой флуоресценции; по оси ординат - log красной Флуоресценции.

100

50

еоео 000 ваав 00 'аввввв~2~" ее« о

_ _оо„ ■ оо о

• о

ооо о о

оо о .

о

"и™

оо о о

о о

1

3

Рис. IV. Сравнение коэкспрессии антигенов CD4 и CD27, а такж CD8 и CD2? в норме и при некоторых иммунопатологиях. По оси абсцисс - группы обследованных; ш оси ординат ■ доли клеток коэкспрессирующих антигены (в X); темные • доля CD4+OD27+/CD4+; светлые ДОЛЯ CD8+CD27+/CD8+. 1 нормальные доноры; 2 - больные комбинированной иммунио недостаточностью; 3 - больные гипогаммаглобулинемией Средние значения долей CD4+CD27+/CD4 " и CD8+CD27+/CD8 для нормальных доноров отмечены сплошной и пунктирно -.инией соответственно.

о os

о

о

о

' V

ис. 38. Регрессионный анализ, аависрюеги количества кюаксдрес-сиругаих клеток от раз^ров CIP4+ и CD8+ популяций. Ito оси абсцисс - кодидест?.о CQ4+ (а) иди CD8+ (б) клэ-ток (в X); по оси ординат - количество CD4+C027+ (а) или CD8+CD27+ (б) клеток (в *). Регрессионные коэффициенты зависимости у-ахь ; а - log(a)«-0,90, b-1.23, R-0,97; б - log(a)-0,26, b-0,71, R-0,71.

I—_I-1-1-1-i--I-1-1_I_L.

0 29 Л to 80 0 22 « И £Q

Рис. 19. Распределение антигенов CD3, CD4, CD8, CD27, CD29 и CD45RA на лимфоцитах крови.

По оси абсцисс - количество лимфоцитов (в %). а, г -нормальный донор; б - больной, страдающий атаксией-те-леангиэктагией; в - больной гипогаммаглобулинемией.

чались. У больных с ГГГ наблюдалось ваметное снижение доли CD4+CD27+/CD4+ (р<0,01) и еще более выраженное падение CD8+CD27+ /CD8+ (р<0,001), которые составили 80+117. и 45+192 соответственно.

Для выяснения зависимости разделения CD4+- и CD8+-популяций по антигену CD27 от размеров и соотношения самих CD4+- и CD8+-субпопуляций был использован регрессионный анализ. При этом рассматривалась объединенная группа детей, включающая контрольную группу и пациентов с ГГГ и КЖ Наилучшая регрессия (с наибольшим коэффициентом корреляции) была получена при выравнивание данных с помощью степенной функции у-ах*(рнс. 18). Зависимост! количества CD4fCD27f'-клеток от числа CD4+-лимфоцитов была бдизкг к линейной (Ь=1,2), хотя и наблюдалось некоторое увеличение дол] CD4+CD37+/CD4+ при возрастании размеров CQ4+-популяции. Напротив, для CD8+-популяции показатель Ь регрессионной зависимост) количества 008*0027*"-клеток равнялся 0,7, и наблюдалась опреде ленная тенденция к уменьшению доли CD8+CD27+/CD8+ при увеличени общего числа CD8+- клеток. Можно отметить также хорошую корреля цию при сравнении количества CD4+CD?r/+-клеток с числом CD4 -лим фоцитог. (R-0,97, р<0,001) и более слабую корреляцию в случае ко экспрессии антигенов CD8 и CD27 (R-0.71, р<0,01).

На рис. 19 приведены диаграммы субпопуляционной'структур

- 4ii

вух пациентов, диаметрально отличающихся друг от друга по соот ошению CD4+/CD8+ клеток. Пациент В-к страдая А-Т и имел соотно гние CD4+/C©8'+ равное 6,3 (рис. 196), пациент И-н бил болен РГГ, и соотношение CD4+/CD8+ для него составляло 0,3 (рис. Зв). На рис. 19а приведена также диаграмма донора с нормальным

. А. ' 4- 4-

отношением CD4/CD8 , равным 2,1. Хорошо еидно, что доля CD4 -яеток, коэкспрессирущих антиген CD27, мало меняется при изме-энии соотношения CD4+"/CDSf, в то время как при уменьшении этого ^отношения доля СС>8+-клегок, одновременно несущих антиген CD27, шетно падает. На далвом примере видно также, что при высоких гачениях соотношения. CD447CD8+ увеличивается доля двойных нега-1вяых клеток (CD3+CD4~CD8"), зкспрессирующих антиген CD27.

Для того чтобы выяснить, как соотносятся субпопуляции, вы-¡ляеше по наличию антигена CD27, с субпопуляциями, оСнарудива-шш с помощью МКАТ CD45RA и CD29, были дополнительно исследо-шы двухцветные шйограммы флуоресценции. Лимфоциты каждого иа торов окрашивались следующими комбинациями МКАТ: CD27 и CD4, )27 и CD8, CD27 и CD45RA, CD29 и CD4, CD29 и CDS, CD29 и )45RA, CD45RA и CD4, CD45RA и CD8. На рис. 19в качестве примера «ведена расчитанная субпопуляционная структура, подученная для даого из доноров с учетом одновременной экспрессии всех изучае-« антигенов. Из диаграммы видно, что антигены CD29 и CD45RA >исутствуют на CD4+- и CD8+-клетках, как несущих антиген CD27, к и не зкспрессирующих его. Аналогичные результаты были полу-1ны и для других обследованных доноров. Таким образом, разделе-:э CD4+~ и С08+-субпопудяццй антигеном CD27 отличается от разе шичения по экспрессии антигенов CD29 и CD45RA.

выээда'

1. Получена и охарактеризована панель из 21 МКАТ к маркерам ех основных популяций моноиукдеаров человека (Т-, В- и НК-лим-циты, моноциты, T-хелперы, Т-киллеры/супрессоры). Основная сть МКАТ отнесена к установленным кластерам дифференцировки. AT Rs4, Rs22, T5Q11 и 3F3 не имеют известных аналогов, и рас-энают неописанные ранее антигены.

2. Выявлен новый уникальный антиген - Rs4 общий для В- и NK имфоцитов и не встречающийся на других типах клеток. Антиген 4 состоит из 2 цепей с молекулярными массами 87- и 71 кДа. В тивном состоянии антиген Rs4 существует в виде 3 видов гомоо-

«исомеров, составленных из 3-4 альфа- или бета-цепей, связанны} т. ¡ульфидными связями.

3. Опосредованные через FcR функции моноцитов (фагоцитоз, чШ'итело зависимая цитотоксичность и образование кислородных радикалов) блокируются ЫКАТ T5G11, иммобилизованным на пластиковое поверхности. ЫКАТ T5S11 реагирует с неизвестным ранее антигеном, имеющим молекулярную массу 110 кДа и зспрессированном на моноцитах и тромбоцитах. Ингибирукадэе действие ЫКАТ T5G11 определяете: аномальным характером гликозилирования его Fc-фрагмента.

4. Описан новый антиген В-лимфоцитов, выявляемый ЫКАТ SF3 и имеющий молекулярную массу 45 кДа. Антиген 3F3 является марке ром зрелых В-лимфоцитов, появляясь примерно на стадии экспресси поверхностного IgM и исчезая с мембраны клеток при их активации В лимфатических узлах антиген 3F3 экспрессирован более на покоя щихся, Igbf-позитивннх В-клетках из мантийной зоны, чем на акти вированних IgM-негативных В-клетках из терминальных центров.

5. Разработана математическая модель, позволяющая по сово купным данным двухцветной нк-лунофлуоресценции -восстанавливат субпопуляционнуто структуру лимфоцитов с учетом одновременной зк опрессии до 5 антигенов. Модель применена для изучения изыенени еубпопуляционной структуры при первичных ИДО.

6. Проведен сравнительный анализ экспрессии дифференциро вочных антигенов в норме и при первичных иммукодефицитных состо яниях. Выявлены характерные особенности эспрессии некоторых ан тигенов при определенных формах первичных НДС. Полученная карте на изменений еубпопуляционной структуры более сосдасуется с ыс делью перегруппировки и изменения пропорций между субпопуляция ш, присутствующими в норме, :чем возникновение новых субпопулг ций с аномальным антигенным портретом.

'ПИСОК ОСНОВНЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

, «млатов А. В., Серов А. А., Щербухин Е Е , Гуцин И. С. , Сенчен ков Е. П. Лазерная проточная цитометрия как метод оценки про-лиферативного ответа лимфоцитов человека яа митогены. // I Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов, Уэскьа -1982.-С. 137.

. Филатов А. Е , Червонский А. Е , Ерондэ Е Д. Изучение локализации дифференцировочных антигенов лимфоцитов мыши с помощью моноклональных антител. // II Всесоюзное совещание по генетике соматических клеток в культуре. Тезисы докладов, Москва-1983.-С. 41.

Серов А. А., «млатов А. В., Щербухин Е Е , Гущин И. С., Сенчен-ков Е. П. Оценка Одаспрас формации лимфоцитов человека методом проточной цитофлюориметрии. // Иммунология,-1984. -N 6. -С. 86-89.

Червонский А. Е , Филатов А. Е , Черепахи» В. Е , Брондз R Д. Использование моноклональных антител против легких цепей иммуноглобулинов крысы в радиоиммунноы анализе дифференцировочных антигенов лимфоцитов мыши. /У Бюл. • эксп. биол. мед. -1984. -Т. 48. -Н 9. -С. 322-324.

Brondz B.D., Abronina I. F., Zalcova M. B., Filatov A. V., Chervonsky A. V. Specific suppressor T-cells immune to antigens of the H-2 complex: receptors, clonal structure, genetic resrtiction and antigenic markers. // Ittwunol. Rev.-1984. Vol. 80.- P. 29-76.

Червонский A. E , Филатов A. E . Орлова E. A., Брондз В. Д. Спектр реактивности моноклональных антител против специфических Т-супрессоров. //Бюл. эксп. биол. мед. -1987. -Т. 53.-N 4.-С. 437-440.

«млатов А. Е , Червонский А. Е , Брондз ЕД. Получение моноклональных антител к антигену Lyt-з. 2. // Бюл. эксп. биол. мед. -1984. -Т. 47. -N 8. -С. . 223-226.

Эрайзер Т. Л , Хамзина Л С., Филатов А. В., Червонский А. Е Выявление методом локального гемолиза в геле и выделение ан-тителообразующих клонов. //Бюл. эксп. биол. мед.-1984.-Т. 48.-N 9.-С. 375-377.

Cherepakhin V. V.. Chervonsky А. V., Filatov А. V., Rokhlln 0. V. Monoclonal antibodies against cornron and Igk-la allotypic determinants of rat immunoglobulin kappa chain coastant domain. // Immunol. Lett.-1Ö85.-Vol. 10.- P. , 217-221.

' Скопцева С. В., Ярцев M. H., Филатов A. E , Хахшшн Л. E , Сте -паненко Р. Е Клетки периферической крови детей с иммунодефи-цитными состояниями чувствительные к В-активину. // Профилактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммунодефицитов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции, Новосибирск, 1985.- Т. 2.- С. 99-100. Манько Е М., Руднева Т. Б. , Фиатов А. Е , Компаниец IL Л. , Остова Е. Ю. Характеристика Т-лимфоцитов, взаимодействующих с кроветворными стволовыми клетками: экспрессия антигена Lyt -3. // Цитология.-1986. -Т. 28.-N4.-С. 461-464. Алексеев JL П. , Шерешков С. И., Василов Р. Г. , Филатов А. В , Бачурин IL С; , Полунин А. И. Экспрессия антигенов гистосовмёс тимости 1-го и 2-го классов на клетках фетальной печени, и перспектива ее использования для восстановления кроветворе-» ния. // V Всесоюзный биохимический съезд. Тесизы симпозиаль-них докладов. 1986.-Т. 1.-С. 186-187.

Филатов А. В , Ярцев M.IL , Бачурин П. С. Исследование субпоиу-ляционкого состава лимфоцитов при первичных иммунодефицитиых

пслояниях с помощью панели моноклональных антител. // Иммунодефицита и аллергия, Масквч. -1086. ■- С. 96-97.

1 Глрман Л. Ф. , Надгорная R А., Абраменко И. В., Бар1ЫПщико1 А. ¡0. . Жилатов A. R Иммунопе роке идазный метод определения антигенов поверхностных мембран нормальных и лейкозиых Kjieroi с использованием отечественных моноклональных антител. А Зксшфнм. онкология.-1086.-г. a-'N 6.-е. 46-49." Филатов A. R , Гтурин П. С., Щербухин В. Е , Ярцев M. Е, Гомв! Л.А. Исследование экспрессии пан- Т клеточных маркеров димфо иитоп человека при первичных иммунодефицитах. // Иммуноло ГИЯ.-1987. - N 5,- С. 81-84.

и . Филатов А. В., Бачурин ILC., Королев А. Г. , Ульянова Я И. Алексеев JI IL Получение и свойства мовоклональных антите против антигенов CD2 и С07 лимфоцитов человека. // Биотёхнс логия.-1987.-Т. 3.- Мб, - С. 756-762.

I " Щербухин В. В. , Храмцов А. В., Земсков В. М., «млатов А. В. Hj ассоновскг^ выравнивание многокомпонентных цитограмм. // ф тология.-1987. - Т. 29,- N 4.- С. 497-502.

18 Петров Р. В,, Филатов А. В. , Храмцов А. Е , Молодцов ЕЕ Сп< соб определения мононуклеарных клеток. Авторское свидетел] сто N 1349465, 1987.

т. Филатов А. Е , Хаитов Р. М. Штамм гибридных культивируем клеток мыши mus rousculus, используемый для получения моно локальных антител к антигену,Т-лимфоЦйтов, маркирующее 0КТ8+- клетки и часть ОКТ4+ клеток. Авторское свидетельсто N 1338389. 1987.

í'o. Филатов А. Е , Хаитов Р. М. Штамм гибридных культивируем клеток мыши шиз musculus, используемый для получения ионе лонапьных антител к медулярным тимоцитам, зрелым Т-лимфф там, моноцитам и нейтррфилам человека Авторское свидете; CTO N 1321059, 1987.

п. Филатов А. Е , Ярцев М.Е, Гомес Л. L, Хахалин Л.Е, Хаи Р. М. Способ определения Т-клеточяых иммунных дефектов. I торское свидетельсто N 1365917, 1987.

"í!. Мирошниченко И. В, Ярилин А А., Шарова Е И. , Акнаэарова Р. : Рябинина И. Д. , Филатов А. Е Активированные предшественник Т~лимфоцитов, несущих Thy-1-антиген. //Иммунология. -1Q87 N 2. - С. 29-32.

Мирошниченко И. Е , Сорокина Е И-. Шарова Н. И., Акназарова X , Филатов А. Е , Ярилин А. А. , Филиппович И. В. Характерно ка внутритимусных предшественников Т-лимфоцитов. //Иммунс ГИЯ.-1987. - N 6. - С. 26-29.

84, Абраменко И. Е , Глузман Д. Ф., Сидоренко С. Е , Ветрова Е. Барышников А. К)., «млатов А. Е , Бачурин П. С., Сверствк / Определение субпопуляций нормальных и злокачественно ti формированных лимфоцитов в мазках крови иммунофермектатш гистохимическим методом с использованием моноклональных тител. // Эксперим. онкология.-1988. - Т. 10.- M 2.-С. 43

25. Лазебник Ю. А., Филатов А. Е , Зенин В. В. Набор для одно менного определения Т4+ и Т8+ лимфоцитов -на основе конь тов моноклональных антител с флюоресцеинизотиоцианато R-фикоэритрином. // Современные направления создания м цинских диагностикумов. Тезисы докладов Всесоюзной конфе ции, Москва. 1988.- С. 22.

26. Филатов А. В. , Бачурин Е С. , Алексеев JL Е Биотекнологиче мр годы в оценке иммунного статуса человека. // Ж. Бсес. о-па им. Д. И. Менделеева.-1988.- Т. 33. - N 4. - С. 561-56f

27. Филатов А. Е , Бачурин Е С. , Маркова Е А. , Ярцев M. Е Щ HfiitH'.? проточной цитометрии с использованием моноклона, ачгигел в клинической иммунологии. // Автоматизация шг

гических исследований (Сборник научных трудов), Киев. Науко-ва думка 19SO. - С. 146-148.

¡8. ЩерОухин ЕВ., Филатов А.Е, Бачурин П. С. , Скуйбин Б.Г. математическая оценка еубпопуляционной структуры лимфоцитов человека по данным -проточной двухцветной иммунофлюоресцен-ции. // Автоматизация цитологических исследований (Сборник научных трудов), Киев. Наукэва думка 1990.- С. 155-160.

:9. Бачурин ПС.., Мартова Н;А. , Ярцев М.Е, Филатов A.B. Взаимосвязь маркеров■лимфоцитов человека при первичных иммунодефицит ах. /7 Тезис& докладов IX конференции "Факторы клеточного и гуморальног'0 иммунитета при различных Физиологических и патологических состояниях", Челябинск. 1988.- С. 11-12.

0. Цвейбах А. С., 'Каждая И. а , Филатов А. Е , Карягин И. Е., Афанасьев- Б. В., Аркадьева Г. Е. , Алексеев Н А. Влияние интерлей-кина-2 на пролиферативную активность бластов и экспрессию некоторых т-клеточных: маркеров у больных острым лимфобласт-ным лейкозом. // Тер. архив. -1988. - Т. 60. - N 5. - С. 24-29.

1. Филатов A.B.-,, Бачурин П.С., Маркова H.A. , Сурнакова Е Е. Панель моноклойальных антител против антигенов лимфоцитов человека. //Эксперим. онкол.-1989.-Т. 11.-N2.-С. 28-32.

2. Бачурин IL С. , Маркова Н. А. , Сурнакова К Е., Кирюхин А. К. Филатов ' A. R Панель моноклойальных антител против маркеров лимфоцитов человека, и ее использование при оценке иммунного статуса. // Генная-и клеточная инженерия в решении фунгтмен-тальных проблем биотехнологии. Тарту. 1989.- Т. 2.- С. 185.

3. Филатов А. В. , Цвейбах А. С. , Каздан И. Я , Бачурин IL С. , Клу-бовская Н.И. Характеристика некоторых гематологических заболеваний с помощью'моноклойальных антител ЛТ1, ЛТ2, ЛТ7. // Тёр.' архив.-1989. - Т. 61.- N 2.- С. 104-108.

1. Балашов К. Е. , Бачурин ЕС., Котова О. М. , Филатов А. В. , Пине-гин Б. Е Разработка тест-системы для оценки продукции Т-лим-фоцитами человека B-клеточных ростовых факторов на основе использования отечественных Т-специфических моноклойальных антител.. // Иммунология.-1989. - N 2.- С. 84-85.

i. Филатов A. R , Бачурин П. С., Ярцев M. H , Щербухин В. Е , Маркова R А. Исследование еубпопуляционной структуры лимфоцитов человека с помощью панели моноклойальных антител (МНАТ). // Первый Всесоюзный иммунологический съезд (Сочи, 15-17 ноября 1980 г.), Москва 1989. Тезисы докладов. Т. 1.- С. 178.

i. Гомес Л. А., Ярцев.. М.Н., Хахалин J1 Н., Бачурин ЕС., «млатов A. R , Троицкая Н. А<, Еремина О. Ь Клинико-иммунологическая характеристика некоторых иммунодефицитних синдромов с ведущей .Т-клеточкой недостаточностью // Вопросы охоаны материнства и детства.-1989. - N 2.- С. 13-16.

'. Ярцев M. Е , Гомес' JL А., Хахалин Л. R , Бачурин IL С., Филатов A. R ,. Еремина О. v. , Пинегин Б. R Клиника и диагностика синдромов недостаточности антител. // Вопросы охраны материнства и детства-1989.- N2.- С. 8-12.

. Ярцев IL R , Гомес JL А. , Еач?рин Е С., Филатов A. R , .я

JL Fu Мембранные маркеры Т- и В-лимфоцитов при первично им-мунодефицитных состояниях. // Педиатрия.-1989. - N9.- С. 1721.

. Filatov А. V., Bachurin P.S.. Schorbukhln V. V., Yartsev M N. , Gomes L. A. Expression of pan-T lymphocytes markers in primary immunodeficiencjv.// Tissus Antigens.-1989. - Vol. 33. - N. Z.- P. 103.

. ЩерОухин ER , Платов A. R , Бачурин ЕС. , Ярцев M. IL Оценка тонкой структуры популяции лимфоцитов человека по данным проточной двухцветной иммунофдуорееценции. // Цитодо гия.-198». - Т. 3).- N а - С. 9№-963.

41. Маркова Е А. , Ярцев М. Е , Филатов А. Е Диагностика лервичн! В-клеточных дефектов с помощью «цноклональных ан'хит&л к див ференцировочным антигена).! В-лимфоцитов. // Современные на) равления создания медицинских диапностикумов. шсква, 191 С. 31.

42. Маркова Е А. , Филатов A. R Исследование функциональной ро, антигенов В-лимфоцитов. // Тезисы докладов X конференц "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различи! физиологических и патологических состояниях"' Челябийс; 1990. - С. 92.

43. Филатов А.Е-, Маркова ЕА., Ярцев М.Е Исследование экспр© сии маркеров В-лимфоцитов человека при первичных иммунодеф цитах. // Иммунология.-1930.- N 4.- С. 57-60.

44. Филатов А. В. , Бачурин Е С. , Сидоренко С. Е , Абраменко И. В Глузман Д. Ф. Изучение экспрессии -антигена, взаимодействуют го с моноклинальным антителом,-1В4, на поверхностных, мембр пах лейкоцитов человека в норме и при лимфопролиферат'ивн заболеваниях. // Эксперям. онкол. -1990. -Т. IS. ЧК 5..-40-43.

45. Filatov А. V. , Bachurin P. S. , Markova N. A. Kbnoclon antibody (1Mb) to CD76 antigen reacting with Burkitt lymphoma cells but not with normal lymphocytes. // J. Tuir Marker Oncology. -1990. - Vol. 5.- N. 3.- P. 232.

46. Филатов A. R , Бачурин E С. , Маркова. E A. , Кирюхин A. iQ Ще бухин R В. Исследование субпопуляцибнного состава лимфоцит человека с помощью панеди моноклональных антител. // Гемат логия и трансфузиология.-1990.-Т. 35.-N 4.-С; 16-19.

47. Кирюхин А. Ю. , Филатов А. Е , Бачурин И, С., Земеков Е М. i ноклоиальные антитела к антигену -моноцитов человека- с мод кулярной массой 110 килодальтон. // Иммунология. -1991. - N - С. 39-41.

48. Филатов А. В., Маркова Е А., Задорокный С. И. Моноклональи антитело к антигену В-лимфоцитов'крови человека с молекуля ной массой 45 кДа // Эксперим. онкол.-1991. -Т. 13.-N 1.53-56.

49. Filatov А. V.. Scherbukhin V. V., Bachurin P.S. , Yartsev M. Two-colour flow cytometry study of lyphocyte subpopulatic in patients with primary immunodeficiencies. // Biomedic Science.-1991. - Vol. 2.-P. 88-96.

50. Тоневицкий А. Г. , Топтыгин А. Ю. , Маркс У., Филатов A. I Алексеев Л.П. Избирательная элиминация Т-лейкозных клеч человека с помощью конъюгата А-цепи рицина и моноклональнс антитела против СОбантигена Т-лимфоцитов. // ДАН СССР. -Ш -Т. 307. -N. 6.-С. 1507-1511.

51. Ярцев Eli , Филатов А.В. , Гомес Д А., Щербухин ЕЕ , Бачу] Е С. , Маркова Е А. Субпопуляции лимфоцитов периферичес! крови при первичной иммунной недоиаточности. // Вопросы ( раны материнства и детства. -1991. -N. 5.-С. 28-33.

52. Кирюхин А. КХ , Храмцов А. В., Филатов А. Е , Бовин ЕЕ, ( ловьев М. Е. , Бачурин Е С. , Земеков В. М. Ингибирование фа) цитоза моноцитов, связанное с особенностями гликозилироваг Fc-фрагмента моноклональных антител. //Иммунология. -1992. 1

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ техники ВОНЦ АМН ссср

ПОДП. к tSEW'I К 2-У 1 л - ЗАКАЗ 7^3" ТИРАЖ ¡СО г.