Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Нейрофизиологические механизмыфармакологических эффектовпотенцированных («гомеопатизированных») антителк мозгоспецифическому белку S-100

На правах рукописи

0д

Эпштейн Олег Ильич

Нейрофизиологические механизмы фармакологических эффектов потенцированных («гомеопатизированных») антител к мозгоспецифическому белку Э-100

14.00.25 - фармакология 14.00.45 - наркология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1999г.

Работа выполнена в НИИ медицинской и биологической кибернетики СО РАМН (Новосибирск) и в Украинском НИИ клинической и экспериментальной неврологии и психиатрии (г. Харьков).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор,

академик РАМН М.Б.Штарк

(Новосибирск)

доктор биологических наук, профессор

Т.М.Воробьева (Украина, Харьков)

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Н.И.Суслов

доктор медицинских наук, профессор

Е.С.Смолянинов

Ведущая организация: Новосибирский государственный университет

Защита состоится « ^ о » октября 1999г. в_час. на

заседании Диссертационного совета К 001.33.01 при Научно-исследовательском институте фармакологии ТНЦ СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.Н.Амосова

рб С Г. 0X1 - о

Введение

1. Состояние проблемы

Галопирующий рост алкоголизма и наркоманий во всем мире, отличающихся резистентностью к терапевтическим воздействиям, актуализирует проблему поиска новых эффективных средств и методов лечения больных, страдающих аддиктивными расстройствами. Существующие и используемые при лечении аддикций психофармакологические средства обладают рядом серьезных недостатков: наркогенностью, аллергенностью, высокой стоимостью, малозначимым или кратковременным действием при вторичной профилактике, тенденцией оказывать заместительный эффект с последующим формированием устойчивой зависимости. В связи с этим постоянно ощущается острейшая необходимость в создании средств, воздействующих на патогенетические механизмы адциктивных состояний, стимулирующих адаптивные возможности психической деятельности.

Изначально привлекательно в этом аспекте выглядят потенцированные средства, приготовленные по принятой в гомеопатии технологии, использующиеся в исчезающе малых дозах, не вызывающие привыкания и пристрастия, обладающие рядом особых позитивных свойств; перспективных в экологическом и экономическом отношениях.

2. Актуальность темы

Принципы гомеопатической терапии сформулированы в 1796г. немецким исследователем С. Ганеманом. Им предложена технология приготовления потенцированных средств и методология их применения, базирующаяся преимущественно на двух постулатах: принципе подобия и максимальной индивидуализации лечения. Несмотря на несомненную терапевтическую эффективность и наличие рациональных клинико-феноменологических принципов лечения, сближающих гомеопатию с «канонической» клинической фармакологией, несмотря на широчайшее распространение ее влияния на все без исключения нозологические формы, это направление как бы отторгнуто от современных

представлений о тонких механизмах действия лекарственных средств. Количество фундаментальных работ молекулярно-клеточного и системного уровня, посвященных изучению механизмов эффектов потенцированных средств, крайне мало; современный анализ механизма действия гомеопатических препаратов отсутствует.

Для заполнения этого ощутимого пробела знаний о гомеопатии проведено настоящее исследование, посвященное

нейрофармакологическому анализу антител к мозгоспецифическому антигену S-100 и разработке на основе полученных результатов нового лекарственного средства для клинической наркологии.

3. Обоснование выбора фармакологического препарата

Выбор моноспецифической антисцворотки (AS-100) к мозгоспецифическому белку S-100 (S-100) в качестве предмета исследований и потенциального лекарственного средства обусловлен рядом предпосылок.

3.1. Белок S-100 выделен специалистами Института цитологии и генетики СО РАМН, Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН по стандартной технологии из ткани головного мозга быка. Молекулярная масса очищенного белка составил 21000Д, его электрофоретические характеристики, аминокислотный и субъединичный состав оказались практически идентичными описанным в литературе данным Мура (Moore, 1971), Дэнниэлса и Левина (Danniels, Levine, 1971). Моноспецифическая антисыворотка к белку S-100 получена путем иммунизации кроликов S-100 в комплексе с метилированным бычьим сыво-роточным альбумином в качестве носителя. Полученная антисыворотка имела титр 1:500-1:1000, её специфичность была подтверждена микрометодом иммунодиффузии по Ухтерлони, а моноспецифичность - методом перекрестного иммуноэлеюгрофореза по Лореллу (Laurell,1965).

3.2. В отличие от нейропептидов, группа мозгоспецифических белков в терапевтических целях практически не используется, хотя нейробиологические особенности МСБ и антител к ним достаточно известны. Наиболее изученным к сегодняшнему дню является как раз

антиген S-100, не имеющий видовой специфичности, присутствующий у животных различных таксономических групп, принимающий участие в реализации фундаментальных, базовых функций нейронных систем, таких как генерация и проведение нервного импульса, синаптическая передача (Старостина, Свиридов, 1977; Шгарк 1985; Полетаев, Шерстнев, 1987; Березин, Белик, 1990), а на системном уровне S-100 и антитела к нему модифицируют интегративную деятельность ЦНС (Рылов, Шерстнев, 1984; Сайдахметова и др. 1986).

3.3. Базовый характер функций, определенный для S-100 исследованиями последних 20 лет (Старостина, Свиридов., 1977; Штарк, 1978, 1985; Березин, Белик., 1990 и др.) позволяет отнести его к классу протеинов, непосредственно включенных в локальную синаптическую деятельность нейронной сети гиппокампа, роль которого и в формировании алкогольной аддикции, и в генезе абстинентного синдрома хорошо известна.

Имеются сведения об участии S-100 в патогенезе алкоголизма: повышение уровня S-100 коррелирует со злокачественным течением алкогольной энцефалопатии (Moor, 1967). Практически у 100% больных алкоголизмом обнаружена гиперчувствительность немедленного и замедленного типа к S-100. (Jankovic et а!, 1982; Jankovic, 1985). Постоянное же присутствие антител к антигену S-100 в крови и спинномозговой жидкости рассматривается в качестве диагностического благоприятного критерия при алкогольной аддикции (Морозов, 1986; Анохина, 1987; Волошин и др., 1992), в особенности при нарастании титра антител и дальнейшем быстром его снижении при абстинентном синдроме (Jankovic et al, 1982,1985).

3.4. Принципиальным для выбора антител к S-100 в качестве потенциального лекарственного средства является принадлежность этого мозгоспецифического белка (антигена) к классу Са-связывающих и, в свою очередь, участие Са2+ в патогенезе основных центральных патологических феноменов. Известно, что все эффекты Са2+ реализуются через Са-связывающие белки. Поэтому «идеальным лекарственным средством при многих патологиях», в том числе церебральных, были бы ингибиторы Са-связывающих белков (Костюк,

Чазов, 1988). Избирательными ингибиторами в этом случае являются антитела к Са-связывающим протеинам.

Кроме того, применительно к аддиктивным состояниям показано, что хроническая алкоголизация активирует потенциал-чувствительные кальциевые каналы нейронов (на модели клеточной культуры), а дигидроперидин, блокирующий их, уменьшает выраженность проявлений острой отмены этанола у животных (Dolin et al., 1986; 1987).

3.5. В последние 15 лет накоплены данные, свидетельствующие, что в здоровом организме присутствуют б очень малых концентрациях разнообразные антитела к различным эндогенным регуляторам, изменяющие их активность. Антитела чаще подавляют функции регулятора, но в ряде случаев (гормон роста, инсулин, ангиотензин II) стабилизируют их. Показана ферментативная активность антител (Paul S., et al., 1985; Paul S. Et al., 1989) и даже наличие у антиидиотипических антител к холинэстеразе ацетилхолинэстеразной активности; сформулирована гипотеза об антителах как регуляторах физиологических функций (Ашмарин И.П., Фрейдлин И.С., 1989). Все это дает основание предполагать у антител к S-100 даже в гомеопатических дозах наличие регуляторных свойств. С учетом имеющихся данных и результатов собственных исследований потенцированных средств на моделях острой и хронической интоксикации психоактивными препаратами (Эпштейн, Воробьева, Берченко и др., 1997), представлялось перспективным изучить нейрофармакологические особенности потенцированных форм S-100 (далее nS-ЮО) и антител (далее nAS-ЮО) к нему для последующего их освоения в качестве лекарственных средств в клинической наркологии.

4. Цель исследования

Изучение нейрофизиологических механизмов фармакологических эффектов потенцированной антисыворотки к мозгоспецифическому белку S-100 как на экспериментальных моделях, позволяющих исследовать ее эффекты на различных уровнях организации деятельности центральной нервной системы, так и в клинических условиях (рис.1).

Рисунок 1

Блок-схема изучения эффектов потеицнрованпой формы Ав-ЮО па разлпчпых структурных уровнях организации иейропиых систем

А8-100

Системный уровень

Структурный уровень

Межклеточны й уровень

Клеточный уровень

Интегративная деятельность мозга уУРАИ \

у

I

РСС

уНейрональная активность лимбпческих структур

Гипоталамус

Гиппокамп

\интоксикацня алкоголем

интактные животные

интоксикация морфшюм

_'У

\ ДГГГП в срезах г

гипнокампа

I

7

Электрические характеристики \ иейрональных мембран

Клиническая ^ апробация

7

5. Задачи исследования:

5.1. Приготовить потенцированные формы (гомеопатические растворы) антигена Э-ЮО и антител к нему (далее пЭ-ЮО и пАЭ-ЮО) из исходных продуктов, полученных в Институте цитологии и генетики СО РАМН и Институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.

5.2. Исследовать влияние nS-100 и nAS-100 на условно-рефлекторные эмоциональные реакции активного избегания (УРАИ).

5.3. Оценить влияние nS-ЮО и nAS-ЮО на эмоциональное поведение животных путем анализа реакций самостимуляции латерального гипоталамуса (РСС).

5.4. Проанализировать характер влияния потенцированных форм AS-100 на нейрональную активность эмоциогенных лимбичесшх структур интактных животных и животных с морфинной и алкогольной зависимостью.*

5.5. Осуществить микроэлектродный анализ влияния nAS-ЮО на пассивные и активные характеристики изолированных нейронов in vitro.

5.6. Исследовать эффекты nAS-ЮО на модели длительной посттетанической потенциации (ДПТП) в' переживающих срезах гиплокампа.

5.7. Изучить неспецифические иммунные реакции к nS-ЮО и nAS-100 на модели экспериментального алкоголизма.

5.8. Провести клиническую апробацию nAS-100.**

6. Связь работы с научными программами, планами, темами

Диссертация выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ Украинского НИИ экспериментальной и клинической неврологии и психиатрии ("Изучение нейробиологических закономерностей новых нетрадиционных (гомеопатических) веществ и безмедикаментозных способов (аллотранслантация и дистантная ксеноимплантация мозгоспецифических тканей) купирования наркоманической зависимости в эксперименте и клинике") и Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН ("Изучение клеточных и молекулярных механизмов гомеопатической и бипатической фармакокинетики").

"Активность нейронов перифорникальной области гипоталамуса исследовалась в НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН.

**С разрешения Фармакологического комитета МЗ РФ клинические испытания nAS-100 (препарата «Пропротен-100») проводились в клиниках НИИ психиатрии МЗ РФ, РГМУ, РМАПО.

7. Научная новизна

7.1. Впервые, используя в качестве тест-систем простые нервные структуры - изолированные нейроны и переживающие срезы гиппокампа, на примере пАБ-100 описана феноменология мембранных и синаптических эффектов потенцированных форм.

7.2. Впервые установлено, что:

- потенцированная форма 8-100 оказывает стимулирующее влияние на условно-рефлекторную деятельность; потенцированная форма АБ-100 тормозит или подавляет её различные звенья

- потенцированная форма 3-100 оказывает активирующее влияние на мозговую систему позитивного эмоционального подкрепления, пАБ-100 снижает её активность.

7.3. Впервые показано, что:

- потенцированные формы Б-100 и АБ-100 изменяют активность нейронов гиппокампа и гипоталамуса, вызывая вначале их активацию, а затем торможение;

- потенцированные формы АБ-100 тормозят механизмы, формирующие патологическое влечение к этанолу, морфину и абстинентный синдром при отмене психоактивного вещества, что сопровождается тормозной направленностью поведенческих реакций, изменением характера пачечной активности нейронов гиппокампа, и гипоталамуса, а также подтверждено результатами клинических исследований.

7.4. Впервые достоверно показано, что исходное вещество и приготовленная из него по гомеопатической технологии потенцированная форма оказывают качественно идентичный, но в различной степени выраженный эффект, проявляющийся в однонаправленном воздействии нативной и потенцированной АБ-100 на нейрональную мембрану.

7.5. Впервые на переживающих срезах гиппокампа показано, что потенцированная форма АБ-100 самз по себе не оказывает влияние на синаптическую эффективность в модели ДПТП (длительной посттетанической потенциации), однако, двадцатиминутная преинкубация срезов в потенцированной АБ-100 приводит к отмене блокирующего влияния нативной антисыворотки на формирование

ДПТП. Это позволило сделать заключение о том, что потенцированная форма АБ-ЮО обладает свойством долговременно изменять чувствительность нейрональной мембраны к обычным дозам АБ-ЮО. Есть основания считать, что этим свойством обладают все потенцированные средства.

7.6. Впервые в клинических условиях показано, что потенцированная АБ-100 является эффективным средством для купирования психопатологических и вегетосоматических проявлений алкогольного абстинентного синдрома.

8. Практическая значимость полученных результатов

8.1. Предложена система отбора потенцированных лекарственных средств для наркологии из исходных (нативных) биологически активных веществ с учетом иерархической организации нейронных систем.

8.2. На основе результатов экспериментов создан препарат "Пропротен-100", прошедший стадию клинических испытаний и предложенный в фармакологический комитет Минздрава РФ в качестве эффективного средстза для монотерапии алкогольного абстинентного синдрома.

9.Положения, выносимые на защиту

9.1. Потенцированные формы Б-100 и АБ-100 обладают нейроспецифической активностью, проявляющейся в непременных ответах мозга на введение пБ-100 и пАБ-100 на всех уровнях нейронной организации: системном, структурном, межклеточном, клеточном.

9.2. Биологическая актизность потенцированных препаратов обусловлена присущими им специфическими молекулярно-клеточными эффектами.

9.3. Наиболее фундаментальное свойство потенцированных препартов - сенситизирующее влияние на клеточную мембрану - лежит в основе выявленных феноменов потенцированных средств:

изменении физиологической активности исходного вещества при его сочетанном воздействии с потенцированной формой («бипатический» феномен)

способности nAS-100 изменять толерантность организма к воздействию психоактивных веществ.

9.4. Как в экспериментальных условиях, так и в клинических исследованиях nAS-ЮО уменьшает выраженность патологического влечения к алкоголю и морфину; купирует синдром лишения при алкогольной и морфинной зависимости.

10. Личный вклад соискателя

Диссертантом самостоятельно предложена и реализована программа исследований, проведен анализ данных литературы и результатов собственных исследований. Инструментальные исследования, обработка данных и их интерпретация, внедрение в практику выполнены самостоятельно, а эксперименты in vitro проведены совместно с руководителем соискателя.

Клинические испытания проведены в соответствии с действующим законодательством и разрешения Фармакологического комитета Минздрава РФ.

11. Апробация результатов диссертации

Результаты исследования были представлены на V и VI Росийском национальном Конгрессее "Человек и лекарство" (Москва, 1998 и 1999гг.), Первом национальном конгрессе неврологов, психиатров и наркологов Украины (Харьков, 1997г.), V Международней конференции "Актуальные вопросы клинической фармакологии" (Москва, 1998г.), Международной конференции "Нерешенные вопросы гомеопатии и метода Фолля" (Москва, 1997г.), рабочем совещании Минздрава РФ "Место гомеопатии в системе здравоохранения" (С-Петербург, 1998г.), научно-практической конференции Минздрава РФ 'Традиционные методы лечения" (Москва, 1998г.), Ученом совете НИИ психиатрии МЗ РФ (Москва, 1999г.), Московской городской конференции наркологов (1998г.), Ученом совете Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, 1999г.), межлабораторном семинаре Украинского НИИ неврологии и психиатрии и Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Харьков, 1999г).

12. Объем и структура работы

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, списка литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована рисунками и таблицами.

Библиографический указатель включает источников, из них - . отечественных и - иностранных.

13. Материалы и методы исследования

13.1. Исследования выполнены на белых нелинейных крысах -самцах весом 200-250гр.: У РАИ - на 28 животных; исследование иммунологического статуса - на 21 интактном и 21 алкоголизированном животном; РСС - на 21 животном с вживленными в гипоталамус электродами; исследования нейрональной активности гиппокампа - на 24 нейронах, гипоталамуса - на 28 нейронах; исследование ДПТП - на 600 срезах гиппокампа, исследование электрических характеристик мембраны - на 28 гигантских нейронах виноградной улитки.

Клиническое изучение динамики алкогольного абстинентного синдрома проведено у 180 больных тремя независимыми группами исследователей, двойным слепым методом.

13.2. Потенцированные формы S-100 и AS-100 приготавливались по принятой в гомеопатии технологии С.Ганемана - путем последовательного разведения исходной лиофилизированной порошкообразной массы в различных сосудах. Каждое разведение сопровождалось 10 кратным (10 - секундным) вертикальным встряхиванием раствора. Использовалась сотенная шкала разведений: из предыдущего разведения 1 капля вносилась в 99 капель растворителя. Растворителем служила дистилированная вода. Ряд промежуточных разведений консервировался 20% этиловым спиртом. Выходной контроль приготовленных гомеопатических растворов проводился сертифицированными специалистами научно-производственной фирмы "Материа Медика". В исследованиях УРАИ (условно-рефлекторные реакции избегания) и РСС (реакции самостимуляции) использовались разведения nS-ЮО и nAS-100,

подвергнутые последовательному пятидесятикратному разведению, имеющие порядок разведения ЮО'50 или концентрацию Ю~100 массовых долей*; в исследованиях на срезах гиппокампа и изолированных нейронах - 10'12 и Ю"400 массовых долей.

13.3. Стереотаксическая техника эксперимента включала вживление долгосрочных электродов в изучаемые структуры мозга по картам О.Фифковой и Д.Маршала. Электрическую активность структур мозга анализировали с использованием общепринятых методов моно- или биполярной регистрации на 8-канальном энцефалографе ЕЕ9-83 ("Медикор", Венгрия).

13.4. В качестве модели позитивного эмоционального поведения использовали метод самостимуляции латерального гипоталамуса по Олдсу и Милнеру. Длительность одного импульса составляла 0,5 сек, частота 50-100 Гц, сила 20-100 мкА, форма тока - прямоугольная. Анализировались количественные и качественные реакции самостимуляции (нажатия животным на педаль) в динамике (суммарная частота, распределение по минутным интервалам, наличие серий нажатий, периодов отдыха).

13.5. Условные рефлексы избегания вырабатывали по общепринятой методике. Прочность выработки рефлекса оценивали при достижении пяти реализаций из шести предъявленных условных сигналов. Регистрировались латентные периоды рефлексов и число условно-рефлекторных ответов.

13.6. Регистрация импульсной активности нейронов гиппокампа и перифорникальной области задне-латерального гипоталамуса осуществлялась вольфрамовыми электродами при помощи усилителей биопотенциалов в частотном диапазоне от 200 до 2000 Гц; биопотенциалы оцифровывались и в виде цифрового кода вводились в компьютер. Далее проводилась фильтрация и выделение активности отдельных нейронов.

'Массовые доли (масс, доли) - весовое отношение вещества краствору, его содержащему. Согласно закона Авогадро в разведениях, превышающих масс, долей, растворы не содержат молекул исходного вещества. Используемые в исследовании концентрации 10'12, 10" , Ю400 масс, долей являются общепринятыми в гомеопатической практике.

13.7. Исследование электрических характеристик мембран гигантских нейронов виноградной улитки проводилось с использованием внутриклеточной техники и метода фиксации напряжения. Измерялись и вычислялись следующие характеристики: потенциал действия, его производная по времени, максимальная скорость нарастания потенциала действия, частота генерации спайков, а также вольтамперные и инактивационные характеристики ионных каналов входящего и выходящего токов.

13.8. Исследование ДПТП проводилось на переживающих срезах гиппокампа с размещением стимулирующего электрода в области мшистых волокон, а регистрирующего - в СА3 (зоне начальных сегментов апикальных дендритов). Тестирование проводили при помощи одиночных прямоугольных стимулов длительностью 200 мксек, наносимых не реже, чем через 5 мин. Амплитуда тестирующих стимулов находилась в диапазоне 10-30В. Вызванные потенциалы регистрировали при помощи 12 разрядного АЦП.

13.9. Содержание ЦИК определяли методом селективной преципитации с использованием ПЭГ М-6000 на СФ-46 при длине волны - 450 нм; лейкоцитарную формулу - путем подсчета форменных элементов в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза.

13.10. Клинические методы исследования включали изучение психического и соматовегетативного статуса больных с алкогольным абстинентным синдромом в течение 5 дней. Стандартизация исследования обеспечивалась использованием протокола, включающего рубрики с количественной оценкой выраженности симптомов в баллах, согласно рекомендациям ВОЗ.

13.11. Математический анализ результатов экспериментальных массивов проводился с использованием пакета программ Digitata (Ахоп, Instruments, Inc.) и Microcal Origin. Статистическая обработка данных базировалась на непараметрическом критерии Вилкоксона и Т-критерии Стьюдента.

14. Результаты исследований.

14.1. Анализ результатов исследований показал, что введение nS-100 и nAS-ЮО животным сопровождается непременным ответом мозга, заключающимся в воздействии на следовые процессы. nS-ЮО облегчает формирование условно-рефлекторных реакций, их фиксацию и прочность (качество); на следующий день наблюдается снижение латентных периодов УРАН. На качество прочно выработанных УРАИ nS-100 влияния не оказывал.

Введение nAS-ЮО вызывало противоположный эффект -торможение УРАИ, вплоть до амнезии, носящей обратимый характер, и, в подавляющем большинстве случаев, увеличение латентных периодов реакций избегания на следующий день после введения препарата.(рис.2, табл.1).

14.2. Изучение на модели реакций самостимуляции заднего латерального гипоталамуса изменений эмоционального поведения животных при введении nS-ЮО и nAS-ЮО показало разнонаправленный характер их влияния.

После первого введения животным nS-ЮО достоверно увеличилась частота реакций самостимуляции с 86,09+ 24,5 до 119,96+14,0 нажатий на педаль в минуту. При дальнейшем введении nS-ЮО происходила стабилизация частоты РСС, т.е., наблюдался активационный мнестический эффект на положительные эмоции с дальнейшим насыщением мозговой системы позитивного эмоционального поведения до оптимального режима её деятельности.

РИСУНОК2

Д н и

Введение пБ-ЮО □ Введение пАБ-ЮО

По оси ординат—количество ответов в % По оси абсцисс - дни введения

Динамика рефлекторных ответов при введении пБ-ЮО и иАБ-ЮО

ТАБЛИЦА 1

Влияние потенцированных форм мозгоспецифическнх белков Б-ЮО

и АЗ-100 на ЛП (с) условно- рефлекторной реакции избегания у крыс (М=т).

Введение препарата С нестабильными условными рефлексами + введение Б-ЮО <п=7) С прочло выработанными условными рефлексами +■ введение 8-100 (п=7) С прочно выработанными условными рефлексами + введение АЭ-ЮО (п=11)

Фон 9,15±0,76 6,58±1,48 7,44±0,93

1- ое 6,28±1.50 4,10±0,98 12,25±2,31"

2-ое 7,27±1,31 6,70±1,43 11,15±2,37"*

3-ое 5,83±1,0* 3,86±1,51 15,3±2,41

4-ое 7,01 ±0,80* 6,52±1,07 17,3±2,89***

5- оэ 11,34±4,0 6,64±1,16 19,3±2,51*"

После 1-го 5,25±3,08 5,16±1,18 7,81+0,87

После 2-го 4,65±0,89* 3.72+0,70 7,35±1,15

После 3-го 7,58±1,36 3,78±1,11 10.82±1,71

После 4-го 10,75±1,13 4,6410,49 12.73±1,63

Примечание: *-р<0.05 **- р-0.1-0.05 *"-р<0.01

пАБ-ЮО, напротив, в большинстве случаев угнетала РСС как при первом, так и последующих ежедневных введениях препарата, что демонстрирует подавление системы положительного эмоционального реагирования («эффект предупреждения»)

рисунок з А

Динамика частоты реакции самостямулпцпи латерального гипоталамуса при ежсдпешюи впадении пБ-ЮО (А) я «АЯ-ЮО (Б).

14.3. Изучение влияния пв-ЮО и пАЭ-ЮО на нейрональную активность интактных животных показало, что пЭ-ЮО и пА5-1 СО вызывают динамические изменения в импульсной активности нейронов гиппокампа. Однако, первично реакцией на п5-100 была активация, в дальнейшем сменяющаяся торможением, а пАЭ вызывает торможение

нейрональной активности или сразу, или, в ряде случаев, после непродолжительной фазы начальной активации.

При изучении нейрональной активности лимбических структур у животных со сформированной зависимостью от психоактивных веществ особое внимание уделялось воздействию потенцированных препаратов на пачечно-групповую активность, являющуюся электрографическим коррелятом «оборванной» патологической мотивации (К.В.Судаков, 1986).

При исследовании нейронной активности гиппокампа у животных, находящихся в состоянии морфинной абстиненции, оказалось, что как nS-ЮО так и nAS-ЮО подавляют пачечную активность либо снижают число разрядов в пачке нейронов гиппокампа животных, находящихся в состоянии абстиненции, т.е. сказывают тормозное влияние на генерацию ПД, формирование абстинентного синдрома и механизмы, обусловливающие влечение к морфину.

Такая же тенденция наблюдается и при исследовании воздействия nAS-ЮО на активность нейронов перифокальной области гипоталамуса животных, получающих nAS-ЮО на фоне введения им алкоголя в различных режимах (острая и хроническая интоксикация, обрыв алкоголизации).

Кроме joro, подавление пачечной активности сопровождалось позитивными поведенческими стигмами (уменьшением уровня агрессивности животных, нормализацией сна).

14.4. Исследование влияния nAS-ЮО на функциональную активность изолированных нейронов показало, что все вырианты разведений nAS-100, в том числе гомеопатические в концентрациях 10"12 масс, долей и 10"

400 _ V

масс, долей, оказывают качественно идентичный, но в различной степени выраженный эффект: деполяризуют мембрану, снижают амплитуду потенциала действия, увеличивают максимальную скорость его нарастания, снижают максимальную проводимость, способствуют инактивации каналов. При этом выраженность изменений электрических характеристик мембраны уменьшается пропорционально снижению разведений nAS-ЮО. (рис.4).

РИСУНОК 4

Изменение максимальной скорости нарастания потенциала действия гигантских нейронов нодглоточпого ганглия внпограднон улитки при аппликации аптител к антигену 8-100 п различных разведениях.

14.5. Изучение синаптической эффективности потенцированной Ав-100 проводилось на модели длительной посттетанической потенциации (ДПТП) в переживающих срезах гиппокампа.

Формирование. ДПТП - Са2+ - зависимый процесс, и Са2+ -связывающий белок Э-ЮО доминирует в обеспечении этого феномена.

Аппликация натизной АЭ в разведении 1:50 подавляла индукцию ДПТП в срезах гиппокампа. Однако 20 минутная преинкубация среза в потенцированной АБ-ЮО в концентрации 10"12 массовых долей приводила к тему, что при последующем добавлении натизной АЭ-ЮО в срезах формировалась ДПТП, аналогичная таковой в контрольных препаратах, не подвергавшихся воздействию антител.

Таким образом, аппликация потенцированной АБ вызывала отмену блокирующего эффекта нативной АБ (рис. 5).

РИСУНОК5

Демонстрация "бппатического" эффекта на модели ДПТП.

а — выработка длительной посттеташческой потенциации (ДПТП) в присутствии анти-Б-100 (в конечном разведении 1:50). 1-3 — при инкубации в среде Ямамото с анти-5-100 в течение 20 мин с интервалами между стимулами 5-7 мин; 4-6 — через 10 мин после 1-й тетанизации с интервалами 3-4 мин; 7, 8 — через 10 и 25 мин соответственно после 2-й тетанизации. Амплитуда тестирующего стимула 12 В.

6— выработка ДПТП в присутствии потенцированной анти-Б-ЮО в концентрации 10-12 масс, долей (40 мкл). 1-3 — при инкубации в среде Ямамото с шгги-Б-ЮО в концентрации 10-12 масс, долей течение 20 мин с интервалами между стимулами 5-7 мин; 4-6 — в течение 10 мин после 1-й тетанизации с интервалами 3-4 мин 7-11 — в течение 30 мин после 2-й тетанизации с интервалами 5-7 мин. Амплитуда тестирующего стимула 20 В.

в— выработка ДПТП в присутствии гнтя-Б-ЮО в концентрации 10-12 масс, долей (40 мкл) и в разведении 1:50.1-3 — при инхуба-ции в среде Ямамото санти-Б-ЮОв концентрации 10-12 масс, долей в течение 20 мня с интерзалами между стимулами 10 мин;

4-6 — при инкубации с добавлением анти-Б-ЮО в течение 20 мия с интервалами 5-7 мин; 7-10 — в течение 10 мин после 1-й тетанизации с интервалами 2-3 мин; 11-21 — в течение 40 мин после 2-й тетанизации с интервалами 3-5 мин. Амплитуда тестирующего стимула 10В.

Аналогичный эффект был продемонстрирован также с использованием моноклональных антител к антигену 5 F5 - В6, специфически маркирующего зону мшистых волокон гиппокампа в концентрациях 10"12 и 10"400 масс, долей..

14.6. Изучение влияний nS-ЮО и nAS-ЮО на иммунологический статус животных показало, что 7 - дневное введение интактным животным препаратов сопровождается рядом неспецифических реакций: повышением содержания циркулирующих иммунокомплексов в сыворотке крови; снижением относительного содержания суммарных лимфоцитов в группе с nS-ЮО и его повышением в группе с nAS-100, а также повышением содержания эозинофипьных гранулоцитов.

При хронической (трехмесячной) алкоголизации наблюдалась дальнейшая активация гуморального иммунного ответа, сопровождающаяся повышением содержания ЦИК более, чем в 2 раза в группе с nS-ЮО и практически в четыре раза в группе с nAS-ЮО, что коррелировало со снижением выраженности алкогольной мотивации. Так, в группе крыс, принимавших nS-ЮО, появлялось амбивалентное отношение к алкоголю, а в группе с nAS-ЮО - отказ от его приема в подавляющем большинстве случаев.

14.7. Предварительные результаты клинической апробации показали быстродействие препарата «Пропротен-1С0» (nAS-ЮО), что позволило уже черех несколько часов от начала терапии идентифицировать группу испытуемых, принимающих препарат (I) и группу получающих плацебо (II) [В дальнейшем больные I группы продолжали получать только nAS-100, а II - стандартную дезинтоксикационную терапию, что привело к следующим результатам: спустя 24 часа общая тяжесть симптоматики в I группе составила 185 условных баллов, во II - 322; тяжесть симптоматики у одного больного I группы составила в среднем 6,17 балла, II - 10,7 балла. Спустя 24 часа эти цифры соответственно составили 48 и 166; 1,6 и 5,53].

14.7.1. Наиболее эффективен прием пАЭ-ЮО оказался в отношении соматовегетативных, аффективных и диссомнических растройств, менее эффективен - в отношении тремора и нервномышечной координации.

15. Обсуждение результатов

15.1. Показанные в экспериментах с УРАН и РСС «системные» ответы на введение пБ-ЮО и пАБ-ЮО крайне важны для теории биологической активности сверхмалых доз, так как клинические реакции на потенцированные препараты в гомеопатической практике продемонстрированы лишь при соблюдении особых условий (принцип подобия, индивидуальная чувствительность больного к гомеопатическим дозам лекарственного средства).

Наличие очерченного для каждого из исследуемых препаратов системного ответа, естественно, потребовало перехода на более простые уровни изучения их биологической активности с целью выяснения механизмов действия потенцированных средств.

15.2. Избранные модели исследования синаптической эффективности (ДПТП в срезах гиппокампа) и клеточных эффектов (электрические характеристики нейрональных мембран) являются вполне оптимальными для решения поставленных задач. Они позволяют адекватно продемонстрировать и в достаточной степени формализовать нейротропную активность выбранных для изучения потенцированных лекарственных средств, а также проявить зависимость эффекта от степени разведения ("дозы") потенцированного вещества.

На моделях УРАИ и РСС было показано, что потенцированные нейротропные препараты возможно использовать в качестве патогенетических средств при терапии патологических влечений, т.к. они обладают особыми нейробиологическими свойствами:

- способностью гармонично насыщать мозговую систему позитивного эмоционального подкрепления до урозня равновесных эмоциональных состояний;

- неизвестным ранее для психофармакологии свойством - купировать зависимость от психоактивного вещества в отсутствие

последовательного нарастания дозы. (Эпштейн О.И., Воробьева Т.М., Берченко О.Г. и др., 1997).

15.2.1. В продолжение этих работ, с целью более углубленного изучения воздействия потенцированных препаратов на структурном уровне, была исследована нейрональная активность змоциогенных лимбических структур - гипоталамуса и гиппокампа (как у интактных животных, так и на фоне интоксикации алкоголем и морфином). Результаты исследований показали, что nAS-ЮО более перспективен для внедрения в наркологическую практику. Поэтому именно этот препарат был предложен для дальнейшего изучения на клеточном и межклеточном уровне, а после завершения клинических исследований предложен Фармакологическому комитету МЗ РФ в качестве препарата для купирования алкогольной абстиненции.

15.3. Что трудно было предвосхитить, начиная исследование нейротроПных физиологических эффектов потенцированных форм вообще и «гомеопатизированных» вариантов антител к видонеспецифическому антигену S-100, в частности?

Во-первых, феноменологию этих влияний. Тщательно анализируя литературу проблемы и сопоставляя этот анализ с известными сзедениями о хорошо исследованных эффектах антител к нейрсспецифическим антигенам, невозможно было a priori определить так называемый сенситизирующий феномен , лежащий в основе явления бипатии.

Во-вторых, еще трудней было до опытной проверки предвосхитить сам нейрофизиологический механизм этого явления. И хотя к настоящему времени мы не располагаем точными сведениями о генезе и структуре феномена, возможно предложить несколько экспериментально проверяемых положений. Имеется возможность локализовать его механизм как на пре-, так и на постсинаптическом уровнях. В первом случае в модели (ДПТП) это подлежит проверке с использованием метода парной стимуляции мшистых волокон зубчатой фасции; во-втором же настоятельно требуется внутриклеточное исследование поля СА3 постсинаптической клетки. Предполагая участие Са - зависимого механизма в фундаментальных процессах,

обеспечивающих состояние синаптической структуры в целом, необходимо, в третьих, изучить изменение синаптической чувствительности под влиянием потенцированных форм. Для этого следует изменять концентрацию Са2+

в питательной среде либо вообще элиминировать Са из нее и проводить исследование в безкальцевых средах.

Таким образом, впервые за весь период существования гомеопатической технологии предложена модель целостного многоуровнего скрининга лекарственного средства в потенцированной форме с "узкими" показаниями, а в качестве исходного вещества выбраны антитела к мозгоспецифическим антигенам. Естественно, что как любое продуктивное исследование, наша работа формирует больше вопросов, нежели предлагает ответов. Но именно эти обстоятельства гарантируют эффективное развитие проблемы в целом и, в первую очередь, несомненный прогресс на всех этапах создания лекарств.

16. Выводы

16.1. Ежедневное введение животным потенцированных форм Э-ЮО и АБ-ЮО сопровождается непременным ответом мозга, заключающемся в активирующем влиянии на интегративную деятельность пЭ-ЮО и тормозном пАЗ-100.

16.2. Показанные системные изменения в деятельности мозга базируются на присущих потенцированным средствам специфических молекулярно-клеточных эффектах.

16.3. Наиболее фундаментальное из выявленных свойств потенцированных препаратов - их влияние на клеточную мембрану. Сенситизирующий эффект как базовое физиологическое свойство потенцированных средств, очевидно, лежит в основе впервые выявленного нами ранее феномена - изменения физиологической активности исходного вещества при его сочетанном взаимодействии с потенцированной формой, названного нами «бипатическим».

16.4. Наиболее достоверно бипатический феномен продемонстрирован на модели ДПТП при сочетанной инкубации срезов гиппокампа в АБ-ЮО и ее потенцированной формы.

16.5. Сенситизирующий эффект, вероятно, лежит и в основе способности nAS-ЮО изменять толерантность организма к воздействию психоактивных веществ.

15.6. Потенцированная nAS-ЮО уменьшает выраженность патологического влечения животных к алкоголю и морфину, купирует синдром лишения при алкогольной и морфинной зависимости, активизирует неспецифический гуморальный ответ при длительной интоксикации алкоголем, что являетя предпосылкой для создания на основе потенцированных антител принципиально новых средств для наркологической практики.

16.7. nAS-ЮО в клинических условиях оказывает купирующее действие в отношении алкогольного абстинентного синдрома, достаточное для монотерапии как при среде-тяжелых, так, в большинстве случаев, и при тяжелых состояниях.

17. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Эпштейн О.И., Береговой Н.А., Сорокина Н.С., Старостина М.В., Штарк М.Б. Влияние различных разведений потенцированных антител к мозгоспецифическому белку S-100 на динамику посттетанической потенциации в переживающих срезах гиппокампа.// Бюллетень экспер. биологии и медицины, 1999 - Т.127. - №3. - С.317-320.

2. Эпштейн О.И., Гайнутдинов Х.Л., Штарк М.Б. Влияние гомеопатических доз антител к антигену S-100 на электрические характеристики нейрональных мембран.//Бюллетень экспер. биологии и медицины. - 1999 - Т.127 - №4. - С 466-467.

3. Эпштейн О.И., Воробьева Т.М., Берченко О.Г., Гейко В.В., Гарбузова С.Н., Бевзюк Д.А. Влияние потенцированной формы антител к мозгоспецифическому белку S-100 на интегративную деятельность мозга.// Бюллетень экпер. биологии - 1SS9 - Т.127 - №5 - С.547-549.

4. Береговой Н.А., Панкова Т.М., Сорокина Н.С., Старостина М.В., Штарк М.Б., Эпштейн О.И. К вопросу о влиянии различных разведений моноклональных антител 5F5-B6 на динамику

посттетанической потенциации в переживающих срезах гиппокампа//Бюллетень СО РАМН,-1999-№1 - (91)-С.88-91.

5. Эпштейн О.И., Запара Т.А., Симонова О.Г. Влияние потенцированного морфина на электрические параметры изолированных нейронов//Бюллетень СО РАМН,- 1999-№1-(91) -С.91-92.

6. Павлов И.Ф., Эпштейн О.И. Поведенческие эффекты потенцированных форм морфина// Бюллетень СО РАМН, - 1999-№1-(91)- С.91-92.

7. Александрова Н.В., Гофман А.Г., Крылов E.H., Эпштейн О.И. Опыт использования потенцированных препаратов при купировании алкогольного абстинентного синдрома и опийного абстинентного синдрома // Бюллетень СО РАМН, - 1999-№1 - (91) - С.94-98.

8. Эпштейн О.И., Береговой H.A., Штарк М.Б. Синаптические эффекты потенцированных нейротропных веществ./A/l Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" /Тезисы докл., М., 1999, С 77.

9. Воробьева Т.М., Берченко О.Г., Гарбузова С.Н., Эпштейн О.И., Зак М.С. Влияние потенцированных нейротропных веществ на интегративную деятельность мозга // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" /Тезисы докл., М., 1999, С 19.

10. Эпштейн О.И., Воробьева Т.М., Берченко О.Г. и др. Информационно-онтологические модели адаптации -М., 1997, 165с.

11. Эпштейн О.И., Воробьева Т.М. Некоторые новые представления о феномене системной адаптации (архитектура регуляции функций)// Биоуправление - 3. Теория и практика. Новосибирск., 1998 (Ред.М.Штарк, Р.Колл, США-Россия), С 266-272.

12. Эпштейн О.И. Возможные механизмы действия потенцированных лекарственных средств и некоторые вопросы функционирования биосистем////Бюллетень СО РАМН, - 1999-№1 - (91) - С.132-148