Автореферат и диссертация по медицине (14.01.03) на тему:Обеспечение отодоступности с помощью наноразмерных носителей и отопротективный эффект звукового прекондиционирования (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ИВАНОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ОБЕСПЕЧЕНИЕ ОТОДОСТУПНОСТИ С ПОМОЩЬЮ НАНОРАЗМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И ОТОПРОТЕКТИВЫЙ ЭФФЕКТ ЗВУКОВОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.03 - болезни уха, горла и носа 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

2 4 АПР 2014

005547573

Санкт-Петербург - 2014

Работа выполнена на базе лаборатории слуха и речи НИЦ и кафедре патофизиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Журавский Сергей Григорьевич, доктор медицинских наук Галагудза Михаил Михайлович, доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Пащинин Александр Николаевич - доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра оториноларингологии, профессор Дергунов Анатолии Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, кафедра патофизиологии, профессор

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «\3» О ¡5" 2014 года в У^часов на заседании диссертационного совета Д 208.090.04 при ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8), телефон: (812)234-09-61; e-mail: dissovspbgmu02@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Миниздрава РФ (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8), сайт университета: www.spb-gmu.ru Автореферат разослан » ОУу 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук

Актуальность темы исследования. Основная проблема фармакотерапии заболеваний внутреннего уха - наличие гемато-лабиринтного барьера (ГЛБ), непроницаемого для большинства ксенобиотиков (McCall А.А. et al., 2010).

Решение данной проблемы в настоящее время обсуждается на уровне экспериментальных исследований. При этом уже можно обозначить два направления, наиболее перспективных для клиники. Первое - это контролируемое «включение» эндогенных механизмов защиты рецептор-ных структур внутреннего уха (Theneshkumar S. et al., 2009). Второе - адресная доставка фармакологических цитопротекторов, обеспечивающая прохождение препаратов через ГЛБ (McCall А.А. et al., 2010).

Направление эндогенной защиты на практике может быть реализовано путем интенсификации общебиологических механизмов пре- и посткондиционирования (Васина Л.В. и соавт., 2009). Для внутреннего уха физиологически-адекватным и при этом легко воспроизводимым в клинике индуктором защитных клеточных механизмов является звуковой стимул неповреждающей интенсивности - звуковой вариант прекондициони-рования (ЗПреК) (Canlon В. et al., 1992; Canlon В. et al., 1998; Yoshida N. et al., 2000).

Другое направление - активно разрабатываемая концепция адресной (таргетной) доставки лекарственных препаратов с цитопротективной активностью (Varadan V.K. et al., 2008). Методики адресной доставки, применяемые с учетом биологических особенностей улитки смогут обеспечивать отодоступность лекарственных препаратов непосредственно к органу-мишени - спиральному органу (СО).

Настоящая гипотеза сформулирована при учете двух известных биологических феноменов: 1) фиксированные тканевые макрофаги, например, печени, селезенки, легкого способны захватывать из кровяного русла частицы наноразмерной величины (Choi J. et al., 2007; Xie Y.T. et al., 2012) и 2) ряд несенсорных элементов СО, перициты капилляров улитки обладают собственной макрофагальной активностью (Винников Я.А. и соавт., 1961; Chodyniki S. 1971; Fredelius L. et al., 1990; Abrashkin K.A. et al., 2006). Предполагается, что нанообъекты-переносчики, нагруженные фармакологическими препаратами, благодаря своему размеру, будут активно захватываться несенсорным эпителием СО, непосредственно контактирующим с системой капилляров внутреннего уха. Предполагается, что подобный способ будет обеспечивать избирательную доставку лекарственных препаратов к сенсорным элементам СО, что открывает перспективы эффективного предотвращения токсического и гипоксического повреждений улитки.

Цель исследования: изучить возможность достижения неспецифической лекарственной отодоступности с помощью наноразмерных носителей и отопротективный эффект звукового прекондиционирования для последующего клинического применения.

Задачи исследования:

1. На экспериментальной модели острого сенсоневрального повреждения слухового анализатора (цисплатиновой ототоксичности) оценить слухосо-храняющий эффект феномена звукового прекондиционирования; разработать его параметры, ориентированные на клинические условия.

2. Оценить токсичность для периферического и центрального звена слухового анализатора наночастиц кремнезема и природного полимера хитозана - предлагаемых кандидатов на роль лекарственных переносчиков для методики направленной доставки.

3. Оценить острую и хроническую системную токсичность нанообъектов кремнезема и хитозана.

4. Изучить возможность достижения неспецифической отодоступности фармакологических препаратов при участии лекарственного переносчика, представленного дисперсными частицами хитозана нано- и субмикронных размеров.

Научная новизна. В эксперименте выявлены защитные возможности феномена ЗПреК, проводимого в режиме акустической нагрузки, адекватной в отношении возможности клинического применения. Впервые показан отопротективный эффект короткой по времени экспозиции звуковой стимуляции, проводимой перед созданием повреждающего воздействия путем введения ототоксического препарата (цисплатина).

Обнаружены признаки гепато- и спленотоксичности (гранулемо-образование) сохраняющиеся в течение 60 дней после однократного парентерального введения суспензии наночастиц кремнезема диаметром 13±2 нм в дозе 2 мг/мл.

Впервые обсуждается возможность хитозана, представленного в форме дисперсных частиц субмикронного размера, способствовать при парентеральном введении повышению отодоступности фармакологического препарата с известными отодепрессивными свойствами (на примере аминогликозидного антибиотика амикацина).

Теоретическая и практическая значимость. Для профилактики ототоксического повреждения (в частности, цисплатином) в клинических условиях целесообразно использовать методики, направленные на стимуляцию механизмов эндогенной клеточной защиты в рамках концепции

прекондиционирования. Протокол ЗПреК в виде экспозиции акустического тонального сигнала 5 кГц и интенсивностью 100 дБ непрерывно в течение 15 минут по своим аудиологическим характеристикам представляется наиболее оптимальным для клинических условий и может быть адаптирован для онкологической практики с целью профилактики ятрогенного сен-соневрального повреждения слухового анализатора в процессе проводимой терапии, имеющей высокий риск ототоксического осложнения.

Обнаруженные в эксперименте проявления органотоксичности наночастиц кремнезема, а именно, развитие реактивного хронического асептического воспаления в печени и селезенке по типу «гранулем инородных тел», делает нецелесообразным дальнейшее изучение этого материала в качестве лекарственного переносчика для условий парентерального применения.

Известная фармакологическая проблема в сурдологии и отоневро-логии - форсирование лекарственным средством ГЛБ может быть решена достижением состояния неспецифически повышенной органодоступности к улитке при применении лекарственных переносчиков из биосовместимых, биодеградируемых материалов, способных находиться в форме частиц околонаноразмерных величин.

Выявленное свойство хитозана, структурно организованного в виде дисперсных частиц нано- и субмикронных размеров, неспецифическим образом увеличивать прохождение лекарственных препаратов через ГЛБ, становится основанием для продолжения изучения этого природного полимера в качестве парентерального носителя для осуществления направленной доставки лекарственных препаратов к внутреннему уху.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Степень ототоксического повреждения цисплатином может быть снижена превентивными мероприятиями, проводимыми по принципу прекондиционирования, с применением в качестве прекондиционирующего стимула коротких эпизодов акустической нагрузки, физиологически адекватной для слухового анализатора.

2. Хитозан, будучи органическим природным полимером, при парентеральном введении не обладает кохлеарной и системной токсичностью, тогда как кремнезем, представленный в виде частиц наноразмерной величины, вызывает в части паренхиматозных органов стойкие патологические изменения, связанные с его замедленной биодеградацией.

3. Задача достижения неспецифической отодоступности фармакологических препаратов может быть решена реализацией принципов направленной доставки с использованием лекарственного переносчика, представленного суспензией частиц околонаноразмерной величины из природного биосовместимого материала хитозана.

Апробация работы. Основные фрагменты исследования представлены в материалах ряда научных собраний: Международной конференции оториноларингологов Республики Казахстан (Астана, 15 января 2011 г.), IV ежегодной научно-практической конференции с международным участием «Нарушение слуха и современные технологии реабилитации» (Санкт-Петербург, 10 марта 2011 г.), VI ежегодной научно-практической конференции с международным участием «Нарушение слуха и современные технологии реабилитации» (Санкт-Петербург, 29 марта 2013 г.); VI Всероссийской конференции-школы по физиологии слуха и речи, посвященной памяти член.-корр. АН СССР Г.В. Гершуни (Санкт-Петербург, 26-28 ноября 2013 г.); V Международного молодежного медицинского конгресса (Санкт-Петербург, 4-6 декабря 2013 г.).

Материалы диссертации неоднократно обсуждались на научных заседаниях лаборатории слуха и речи НИЦ ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (2010-2013, г. С.-Петербург).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них в изданиях, рекомендуемых ВАК 3 статьи, а так же 1 публикация в международном рецензируемом журнале.

Объем н структура диссертации. Рукопись диссертации изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований» с их обсуждением, «Выводы», «Заключение», «Практические рекомендации», списка литературы. Работа содержит 16 таблиц и 38 рисунков. Список литературы включает 165 источников, из них - 32 работ отечественных, 133 - зарубежных авторов.

Диссертация выполнена в рамках государственного задания лаборатории слуха и речи НИЦ ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (2012-2014 гг.) «Функция и адаптация слуховой системы в условиях нормы и депривации врожденного и приобретенного характера», являясь фрагментом прикладной научной программы «Экспериментальная оценка свойства ототропности среди нанообъектов неорганической и органической природы (биодеградация, органотоксичность, отопротекция и ото-повреждение» (№ госрегистрации 01201266679), а также при поддержке фанта Президента РФ (НШ- 161.2014.7).

Личный вклад автора. Все разделы работы выполнены с участием автора. Автором проведен анализ литературных данных, самостоятельно выполнена экспериментальная часть исследования, статистическая обработка результатов экспериментов, их оценка, подготовлены научные публикации.

Содержание работы.

Материалы и методы исследования.

Эксперименты проведены на 251 крысах-самцах стока Wistar (питомник «Рапполово» РАМН (Россия), без признаков соматической патологии и воспалительных процессов в среднем ухе. Все эксперименты проведены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (Национальный Институт Здоровья США., 1996) и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У. 2005) и были одобрены этическим комитетом ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Минздрава РФ.

Диагностические методики.

Отоакустическая эмиссия на частоте продукта искажения (ПИ ОАЭ). Для объективной оценки функционального состояния периферического звена слухового анализатора использовалась ПИ ОАЭ, проводилась сразу после общей анестезии (тиопентал 50 мг/кг внутрибрюшин-но) поочередно на обоих ушах. В работе использовался прибор «Нейро-Аудио» («Нейрософт», Россия), оснащенный программным обеспечением «Neuro-Aud io.NET».

Коротколатентные слуховые вызванные потенциалы (КСВП). Для

оценки функциональной активности периферического и центрального отдела слухового анализатора использовался метод регистрации КСВП. Регистрация КСВП проводилась на приборе «Нейро-Аудио» («Нейрософт», Россия), с программным обеспечением «Neuro-Audio.NET». Порог остроты слуха у животных оценивался путем выявления минимальной интенсивности звукового стимула, при котором идентифицировался III пик. Функциональное состояние периферического и центрального звена слухового анализатора оценивалось по межпиковой латентности при интенсивности звукового стимула 100 дБ для всех исследуемых животных. Анализ параметров сердечно-сосудистой системы в остром эксперименте. Измерение параметров системной гемодинамики проводили датчиком давления (Baxter, США) через катетер, введённый в аорту через общую сонную артерию, и регистрировали на персональном компьютере с помощью программного обеспечения PhysExp Gold.

В ходе эксперимента регистрировали электрокардиограмму (ЭКГ) с помощью прибора «Кардиотехника-ЭКГ8» (ЗАО «Инкарт», Россия). Атомно-абсорбционный анализ. Процесс биодеградации экзогенно вводимого кремнезема изучен методом атомно-абсорбционной спектроскопии. В эксперименте анализировались образцы ткани печени на атомно-абсорбционном спектрометре с электротермической атомизацией и Зеймановской коррекцией неселективного поглощения МГА-915.

Полученную концентрацию кремния в минерализате пересчитывали на сухую массу пробы и выражали в мкг/г.

Гистологические исследования. Проводили гистологическое исследование тканей следующих органов: сердца, печени, почек, после окраски их гематоксилин-эозином, толуидиновым синим. Срезы микроскопировали на световом микроскопе Axiostar PLUS (Carl Zeiss, Германия). Клинические и биохимические анализы крови. Клинический анализ крови осуществляли на гематологическом анализаторе MICROS-8 (АВХ) (Франция). Биохимические показатели (общий билирубин, глюкоза, щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза, креатинин) анализировали на биохимическом автоматическом анализаторе «Cobas Integra-400» (Япония). Лейкоцитарная формула оценивалась визуально микроскопией при окраске по Романовскому-Гимзе, скорость оседания эритроцитов - по методу Панченкова.

Методы статистической обработки. Статистический анализ проводился при помощи статистического пакета SPSS. Сравнение качественных данных выполнялось с использованием точного метода Фишера. Динамика количественных показателей оценивалась с использованием дисперсионного анализа для повторных измерений. Уровень значимости различий принимали: р<0,05. Данные представлены в виде процентных соотношений или среднего и 95% доверительного интервала.

Модели острого ототокснческого повреждения. Модель цисплатиновой ототоксичности. Для получения сенсоневраль-ного повреждения использовалось внутривенное введение раствора цисплатина (0,5 мг/мл), в дозе 7 мг/кг однократно. Режим введения: 1/2 дозы в течение 2 минут, перерыв 15 минут, 1/2 дозы в течение 2 минут через инфузомат. В эксперименте использовался фармакологический препарат - Cisplatin-Teva 100 мг/ 100 мл (Pharmachemie B.V.). Модель аминогликозидной ототоксичности. Для получения сенсонев-рального повреждения использовалось однократное внутривенное введение амикацина в дозе 250 мг/кг, в 1 мл физиологического раствора в течение 10 минут через инфузомат.

Изучаемые кандидаты на роль лекарственных переносчиков к внутреннему уху.

Кремнезем. Использован кремнезем (nSi02) в виде сферических частиц с диаметром 12-16 нм (Аэросил А-380, «Вектон», Россия). Суспензия для введения содержала концентрацию кремнезема 2 мг/мл. Хитозан. Хитозан, представленный в виде сферических частиц субмикронных размеров (340 нм). Для синтеза использовался хитозан производства фирмы Fluka Chemie, BioChemika line, MM = 80 кДа, степень деаце-тилирования 80%, зольность 0,5%, 1 мл суспензии частиц хитозана содержал около 3,3x108 частиц, что при пересчете соответствовало раствору хитозана с концентрацией 5 мкг/мл.

Результаты собственных исследований.

Сравнение отопротективного эффекта различных протоколов звукового прекондиционирования.

В исследовании использовались 84 крысы-самца стока \Vistar: 12 групп по 7 животных в каждой. В группах №№ 1, 8, 9, 10, 11, 12 вводился физиологический раствор 7 мл/кг; в группах №№ 2, 3, 4, 5, 6, 7 - свежеприготовленный раствор цисплатина 1 мг/мл в дозе 7 мг/кг в таком же объеме. В группах №№ 3-12 перед введением исследуемых веществ проводилось «озвучивание» акустическим сигналом тона 5 кГц в звукоизолированной камере с условиями свободного звукового поля (Таблица 1).

Регистрация амплитуды ПИ ОАЭ проводилась трижды: за 1 сутки до и спустя 1-е и 3-е сутки после введения препарата.

Таблица 1 - Исследуемые протоколы звукового прекондиционирования

Группы Характер акустической стимуляции топом 5 кГц

М» 3 и 8 интенсивность 100 дБ, непрерывно 5 минут

М» 4 и 9 интенсивность 100 дБ, дискретно: трижды по 5 минут нагрузки, с двумя 5 минутными перерывами

№№5 и 10 интенсивность 100 дБ, непрерывно 15 минут

№№ 6 и 11 интенсивность 90 дБ, непрерывно 15 минут

№№7 и 12 интенсивность 80 дБ, непрерывно 15 минут

Значение амплитуды ПИ ОАЭ во всех группах к 3-му дню после введения цисплатина оказывались ниже, чем перед началом эксперимента. По результатам статистического анализа можно говорить, что во всех наблюдаемых группах цисплатин проявлял свое ототоксическое действие независимо от протокола «озвучивания». В тоже время, анализ материала позволяет видеть, что все группы с введением цисплатина и предшествующим озвучиванием отличаются между собой по интенсивности депрессии ПИ ОАЭ (Рисунок 1). Иными словами, разные протоколы ЗПреК демонстрировали разный отопротективный эффект.

Значение медианы (наиболее часто встречаемого значения) в 4, 6 и 7 фуппах было отрицательно (Рисунок 2), что говорит о наименьшей выраженности в этих группах отопротективного эффекта ЗПреК. Иная ситуация наблюдалась в группах 5 и 3. При сравнении этих двух групп наименьшее из среднего отклонения оказалось в группе 5 (амплитуда ПИ ОАЭ снизилась меньше всего). Это говорит о максимально выраженном отопротективном эффекте этого протокола ЗПреК.

Рисунок 1 - Степень угнетения амплитуды ПИ ОАЭ для всех оцениваемых частот в группах с различными протоколами ЗПреК.

•10

т

а

5

з

группа

представлены значения среднего, среднего отклонения и медианы Рисунок 2 - Сравнение изменений показателей ОАЭ к 3-им суткам после введения цисплатина при различных протоколах ЗПреК.

При сравнении всех групп на 3 сутки после введения цисплатина только группа № 5 статистически значимо (р<0,05) отличалась от 4, 6 и 7 групп.

Таким образом, только протокол акустической экспозиции тона 5 кГц проводимой непрерывно в течении 15 минут при интенсивности 100 дБ (группа 5) имел значимое отличие от всех иных групп эксперимента. В группе с такой же интенсивностью стимула (группа 3), но при более короткой экспозиции также проявлялся защитный эффект ЗПреК, но менее выраженный. Группы 4, 6 и 7 не отличались между собой и в них амплитуда ОАЭ была снижена более всего, что делало их мало отличимыми от группы сравнения исключительно с введением цисплатина.

Исследование острой н хронической органной токсичности изучаемых наночастиц кремнезема и хитозаиа.

Исследование ото- и нейротоксических свойств изучаемых соединений кремния и хитозаиа.

В зависимости от вводимых препаратов выделено 3 группы (п=10): группа №1 - физиологический раствор 1 мл (контрольная группа); группа №2 - 1 мл суспензии нано частиц хитозана (НЧХтз); фуппа № 3 - 1 мл суспензии наночастиц кремнезема (НЧК). Суспензии наночастиц изучаемых соединений вводились однократно с помощью инфузомата со скоростью 0,1 мл/мин в бедренную вену.

1. Оценка влияния кремнезема и хитозана на функциональную активность периферического звена слухового анализатора (анализ показателей ПИ ОАЭ).

Дисперсионный анализ для повторных измерений во времени (ANOVA) показал несущественное изменение (увеличение) показателей амплитуды ПИ ОАЭ спустя 7, 21 и 60 дней после введения препаратов независимо от группы (р>0,05).

Таким образом, показано отсутствие угнетающего эффекта изучаемых нанообъектов кремнезема и хитозана на амплитуду ПИ ОАЭ спустя 7, 21 и 60 дней после введения препаратов, что говорит об отсутствии у них ототоксических свойств.

2. Оценка влияния кремнезема и хитозана на функциональную активность центрального звена слухового анализатора (анализ показателей КСВП).

По данным КСВП в вышеуказанных группах не было выявлено признаков снижения порога остроты слуха - минимальной интенсивности звукового сигнала, вызывающей появление III волны (Таблица 2).

К 60-м суткам после введения суспензий НЧК и НЧХтз группы статистически значимо не отличались от контрольной по всем межпиковым интервалам (Таблица 3).

Таблица 2 — Показатель минимальной интенсивности звукового стимула, вызывающего появление III волны КСВП (ANOVA, post-hoc-теет)_

Исследуемые препараты (п=10) Порог регистрации III пика, дБ УЗД

До введения препарата Через 60 дней после введения препарата

Физиологический раствор 40.02±5.94 42.33±5.17*

НЧХтз 40.4±6.15 39.57±4.44*

НЧК 39.32±3.09 43.74±5.16*

Условные обозначения: В таблице представлены значения средних и стандартные ошибки средних, * - р>0,05

Таблица 3 - Латентность пиков КСВП через 60 дней после введения изучаемых препаратов _

Пики Латентность, мс

Физиологический НЧХтз НЧК

раствор (п=10) (п=10) (п= 10)

1 1.07±0.05 1.10±0.08* 1.07±0.04*

II 1.80±0.04 1.82±0.04* 1.82±0.06*

III 2.63±0.04 2.61±0.05* 2.60±0.06*

IV 3.31±0.08 3.29±0.11* 3.33±0.1*

OnO(I-IV) 2.24±0.06 2.21±0.08* 2.22±0.11*

Условные обозначения: ОПО - общая продолжительность ответа между пиками I и IV. В таблице представлены значения средних и стандартные ошибки средних, * - р>0,05, (ANOVA, post-hoc - тест)

Отсутствие статистически значимых отличий как в общей продолжительности ответа между I и IV пиками, так и в латентности отдельных пиков между экспериментальными группами (2 и 3 группы) и контролем (1 группа), позволяет говорить об отсутствии свойств нейротоксично-сти у изучаемых НЧК и НЧХтз, как на периферическое, так и на центральное звено слухового анализатора.

Исследование острой системной токсичности суспензий из НЧК и НЧХтз (влияние на параметры системной гемодинамики и на параметры электрической активности сердца).

Для экспериментальной оценки острой токсичности НЧК и НЧХтз изучались их гемодинамические эффекты (влияние на артериальное давление) и влияния на параметры ЭКГ.

В зависимости от вводимых препаратов выделено 3 группы (п=10): группа №1 — физиологический раствор 1 мл (контрольная группа); группа №2 - 1 мл суспензии НЧХтз. группа № 3 - 1 мл суспензии НЧК.

Исследуемые вещества вводили через катетер, помещенный в бедренную вену (наркотизация - нембутал 60 мг/кг, внутрибрюшинно). Объем первой внутривенной инфузии каждой из тестируемых суспензий составлял 0,2 мл, а объем двух последующих - 0,4 мл.

Во всех фуппах животных внутривенное введение НЧК и НЧХтз не приводило к изменениям картины ЭКГ и существенным изменениям частоты сердечных сокращений в течение всего времени наблюдения, так же не было отмечено ни одного летального исхода.

Таким образом, внутривенные инфузии суспензии образцов НЧК и НЧХтз вызывали незначительные изменения гемодинамических параметров, что указывает на отсутствие острой токсичности у изучаемых нанообъектов.

Исследование хронической системном токсичности суспензий из НЧК и НЧХтз.

В зависимости от вводимых препаратов выделено 3 группы (п=12): группа №1 - физиологический раствор 1 мл (контрольная группа); группа №2 - 1 мл суспензии НЧХтз; группа № 3 - 1 мл суспензии НЧК.

Через 5, 21 и 60 суток после инфузии изучаемых препаратов у животных контрольной и экспериментальных групп (п=4 в каждой точке) из нижней полой вены осуществляли забор крови для проведения клинического и биохимического анализа.

Парентеральное введение суспензий из НЧК и НЧХтз не приводит к достоверному изменению уровня таких биохимических маркеров как креатинин, щелочная фосфатаза, аланинаминотранфераза и общий билирубин. Таким образом, можно констатировать отсутствие токсического влияния от введения суспензий НЧК и НЧХтз на функциональную активность печени и почек лабораторных животных в хроническом эксперименте.

По данным клинического анализа крови в различные сроки после внутривенного введения суспензии НЧК и НЧХтз достоверные различия в содержании клеток крови, гемоглобина и СОЭ между группой контроля и экспериментальными группами не выявлены, что указывает на отсутствие миелотоксического эффекта у изучаемых образцов.

Изучение процесса биодеградации кремнезема в экспериментальных условиях in vivo.

В эксперименте использованы 20 крыс-самцов стока Wistar. Суспензия из НЧК вводилась внутривенно в дозе 2 мг/мл, объемом 1 мл с последующим забором образцов ткани печени массой 2-3 г через 1 час, 10, 20 и 30 дней после введения.

Для контроля были использованы животные с внутривенным введением 1 мл физиологического раствора (п=8).

Физиологический фон содержание кремния в печени у контрольных крыс в среднем составляет 4,4 ± 1,55 мкг/г. Через 1 час после введения НЧК содержание кремния в тканях печени статистически значимо (р<0,05) отличалось от контроля и было резко повышено до 282,3 ± 62,65 мкг/г. На десятый и двадцатый день после инфузии НЧК содержание кремния в печени становилось значительно ниже предыдущего уровня (81,5 ± 9,25 и 30,2 ± 7,48 мкг/г соответственно) (р<0,05). Однако, на 30-й день содержание кремния статически значимого не отличалось от его содержания на 20 сутки (31,5 ± 11,87 мкг/г) (р>0,05). Полученный результат может объясняться, появлением стабильного внутриклеточного пула эндогенного кремнезема, сформированного за счет фагоцитоза НЧК клетками Купфера и в меньшей степени интернализацией в гепатоциты и другие клетки печени.

Морфологическая картина внутренних органов в условиях парентерального применения кремнезема.

Гистологический анализ микропрепаратов различных органов животных выявил ряд характерных особенностей тканей печени и селезенки после внутривенного введения НЧК. Начиная уже с момента 3 часов после введения препарата и на протяжении всего 60-дневного срока эксперимента наблюдались гепатоциты сорбирующие частицы кремнезема. Концентрирование конгломератов из частиц кремнезема в клетке «в виде шара» предполагает их преимущественную сорбцию на поверхности ядер гепа-тоцитов. Наблюдаемое расположение конгломератов из НЧК «в виде слепков» демонстрировало их накопление в желчных ходах, что характеризует заключительный этап экскреции.

Патоморфологической находкой в тканях печени и селезенки в условиях введения НЧК являлись очаги гранулемообразования.

По морфологическим признакам очаги в печени представляли собой скопления клеток макрофагальной группы, вероятнее всего, клеток Купфера. Появление подобных очагов наблюдалось уже к 5-му дню после введения препаратов, достигая максимума к 21-му дню и некоторой регрессиии к 60-му дню наблюдения. В процессе наблюдения очаги гранулемообразования не трансформировались в очаги септического воспаления, некроза или апоптоза. В селезенке наблюдались аналогичные изменения.

Выявленные in vivo признаки замедленной биодеградации НЧК, проявляющиеся его накоплением в тканях, а так же кремнезем-ассоциированные патоморфологические изменения (гранулемообразова-ние в печени и селезенке), явились основанием для заключения о токсич-

ности изучаемого соединения кремния и исключили данный субстрат из дальнейшего протокола исследований.

Анализ биодеградации хитозана в организме не проводился в силу отсутствия разногласий в мировой литературе (8ал¥ауа1^1 У. е1 а1., 1983; ¡липе М. е1 а1., 1998; 1ауакишаг Я. е1 а1., 2011) по вопросу о биологической безопасности этого природного полимера.

Исследование способности наночастиц хитозана изменять отодоступность лекарственного препарата с известным отодепрессив-ным эффектом.

Выделено 8 групп животных (по 5 крыс в каждой), получавшие следующие внутривенные введения:

1 и 5 группа (контрольные) - 1 мл физиологического раствора;

2 и 6 группа - 1 мл суспензии НЧХтз;

3 и 7 группа - 250 мг/кг амикацина в 1 мл физиологического раствора;

4 и 8 группа - 250 мг/кг амикацина в 1 мл суспензии НЧХтз.

В 1, 2, 3, 4 группах инъекции проводились в условиях относительного звукового покоя. В группах 5, 6, 7, 8 - сразу после проведения функциональной нагрузки в виде экспозиции акустического стимула подачей непрерывного тона 2 кГц с интенсивностью 100 дБ в течение 1 часа в свободном звуковом поле в помещении акустической камеры.

Регистрация амплитуды ПИ ОАЭ проводилась трижды: за 1 сутки до инъекции и спустя 1-е и 7-е сутки после. Сравнение показателей ПИ ОАЭ проводилось по обоим ушам на 4 стандартных точках (3077 Гц, 4 кГц, 5 кГц, 6400 кГц).

Введение физиологического раствора, как при акустической стимуляции, так и без нее (группы 1 и 5) не сопровождалось статистически значимыми изменениями амплитуды ПИ ОАЭ, что указывает на отсутствие собственного отоповреждающего эффекта выбранного акустического воздействия.

Введение суспензии НЧХтз на физиологическом растворе не изменяло амплитуду ПИ ОАЭ как в условиях покоя (группа 2) (р=0,19), так и после акустической стимуляции (группа 6) (р=0,3). Результат указывает на отсутствие острой кохлеарной токсичности однократного внутривенного введения суспензии на основе НЧХтз.

Введение раствора амикацина в дозе 250 мг/кг угнетало амплитуду ПИ ОАЭ на всех исследуемых частотах, как в группе без функциональной нагрузки (группа 3) (р=0,012), так и в группе с фоновой звуковой стимуляцией (группа 7) (р=0,040), демонстрируя адекватность используемой дозы аминогликозидного антибиотика задаче получения модели острого ототоксического повреждения. При этом в условиях покоя введение амикацина, как на физиологическом растворе (группа 3), так и на суспензии

из НЧХтз (группа 4) статистически значимо не отличались по степени уг-нения амплитуды ПИ ОАЭ (р=0,43). В то же время, в группах с акустической нагрузкой на 7-й день после введения амикацина с суспензией НЧХтз (группа 8) отмечалось статистически значимо большая степень депрессии амплитуды ПИ ОАЭ, чем при введении одного амикацина (группа 7) (р=0,004) (Рисунок 3).

ДО ВВСДСН11Я Ч. 1 1 С)ЖН 4,1 7 суток

Рисунок 3 - Динамика изменения амплитуды ПИ ОАЭ на всех частотах в группах со звуковой стимуляцией.

Из трех наблюдаемых групп только в группе №8 на частоте 6400Гц - максимальной из оцениваемых частот - наблюдались значимые различия между амплитудой ПИ ОАЭ до введения амикацина и к концу 7-х суток после его введения (р=0,0004). Таким образом, на частоте, где максимально выражен ототоксический эффект амикацина, снижение амплитуды значимо только в 8 группе - группе с введением амикацина, адсорбированного на частицах хитозана. Важно заметить, что депрессия ПИ ОАЭ в этом случае наблюдалась в течение всего срока наблюдения.

В группе 8 также наблюдалось значимое снижение амплитуд на всех исследуемых частотах ПИ ОАЭ от 1 до 1-х суток после введения (р=0,036), что указывает на прогрессирующее снижения функции рецеп-торного звена слухового анализатора за этот период наблюдения (Рисунок 4). Различия между 1 и 2 исследованием были незначимы.

Таким образом, в результате проведенного эксперимента показано, что только однократное введение амикацина совместно с суспензией НЧХтз проявляется формированием стабильного ототоксического эффекта на всех исследуемых частотах в течение всего периода наблюдения. В

то время как введение амикацина на физиологическом растворе вызывает угнетение ПИ ОАЭ только на I сутки после введения, с последующим частичным восстановлением его уровня к 7-ым суткам.

Условные обозначения: 11о оси абсцисс: 1,2,3,4-частоты анализа ПИ ОАЭ 3077, 4000, 5000. 6400 Гц соответственно.

Рисунок 4 - Динамика изменений амплитуды ПИ ОАЭ, регистрируемой между 1 и 7 сутками после введения препаратов.

Получение отрицательных значений в группах введения физиологического раствора и амикацина на фоне акустической стимуляции (Рисунок 4) означает, что показатель амплитуды ПИ ОАЭ в этих группах (№5 и №7) на 7 сутках выше, чем показатель на первых сутках после введения. Это указывает на восстановление в группе №7 амплитуды ПИ ОАЭ к исходному уровню по всему диапазону изучаемых частотах, кроме самой низкой точки 1 (3077 Гц). Напротив, в группе №8 (Амика-цин+НЧХтз+акустическая смимуляция) снижение амплитуды ПИ ОАЭ отмечается на всех частотах к 7-ым суткам после введения препарата.

Выводы

1. Протокол акустической экспозиции непрерывного тонального сигнала частотой 5 кГц в течение 15 минут при интенсивности 100 дБ обладает значимым отопротективным эффектом в режиме прекондиционирующего воздействия на модели ятрогенного (цисплатинового) сенсоневрального повреждения слухового анализатора.

2. Наночастицы кремнезема и хитозана в условиях однократной внутривенной инфузии не оказывают признаков угнетающего воздействия на функциональное состояние центрального и периферического звена слухового анализатора.

группа ^

4-

>

а

§-2-|

-4-

группа

группа 8

[]

1 2

34 1234 1234 частота

3. Наночастицы кремнезема и хитозана в условиях однократной внутривенной инфузии не вызывали увеличения общей летальности, гемодина-мических нарушений, клинико-лабораторных маркеров гемато-, нефро-, гепатотоксичности. Выявленная in vivo замедленная биодефадация нано-частиц кремнезема, сопровождающаяся формированием в печени и селезенке участков асептического воспаления (гранулем инородных тел) расценивается бесспорно токсическим проявлением введения этого вещества.

4. Суспензия из наноразмерных частиц хитозана в физиологическом растворе, применяемая в качестве парентерального носителя, потенцирует ототоксический эффект однократного введения амикацина в условиях функционально адекватной акустической нафузки.

Практические рекомендации:

1. Для профилактики ототоксического повреждения (в частности, циспла-тином) в клинических условиях целесообразно использовать методики, направленные на стимуляцию механизмов эндогенной цитопротекции в рамках концепции прекондиционирования. Выявленный протокол ЗПреК при экспозиции акустического тонального сигнала 5 кГц, интенсивностью 100 дБ, непрерывно в течение 15 минут по своим аудиологическим характеристикам представляется оптимальным для применения в клинических условиях и может быть адаптирован для онкологической практики с целью профилактики ятрогенного повреждения слуха в процессе проводимой терапии, имеющей высокий риск ототоксического осложнения.

2. Обнаруженные в эксперименте признаки органотоксичности суспензии в физиологическом растворе НЧК со средним размером частиц 12-16 нм и концентрацией кремния 2 мг/мл (замедленная биодефадация кремнезема с развитием реактивного процесса асептического воспаления в печени и селезенке - гранулем инородных тел) делают нецелесообразным дальнейшее изучение этого материала в качестве парентерального переносчика лекарственных препаратов;

3. Проблема достижения «полезной» ототропности лекарственного средства связанная с существованием высокоселективного ГЛБ может быть решена при развитии состояния неспецифически повышенной органодо-ступности к улитке путем применения лекарственных носителей из биосовместимых, биодефадируемых материалов, способных находиться в форме дисперстных частиц околонаноразмерных величин;

4. Выявленное свойство хитозана, сфуктурно организованного в виде дисперсных частиц субмикронных размеров, обеспечивать неспецифическую проницаемость ГЛБ становится основанием для продолжения изучения этого природного полимера в качестве субсфата для синтеза фанс-портных частиц, осуществляющих направленную доставку лекарственных препаратов ко внуфеннему уху.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. Иванов, С.А. Особенности скрининга цисплатиновой ототоксичности / С.А.Иванов // IV ежегодная научно-практическая конференция с международным участием «Нарушение слуха и современные технологии реабилитации»: мат-лы конф. - СПб., 2011. - С. 15-16.

2. Иванов, С.А. Отопротекция при цисплатиновой ототоксичности: перспективы клинического применения / С.А.Иванов, С.Г.Журавский, М.М.Галагудза // Международный научно-практический журнал Республиканской Ассоциации оториноларингологов: мат-лы конф. - Астана, 2011. - С.32.

3. Иванов, С.А. Оценка ототоксичности кремниевых наноносителей в эксперименте методом отоакустической эмиссии / С.А.Иванов, А.В.Пискун // Российская Оториноларингология. - 2012. - N 2. - С.77-81.

4. Иванов, С.А. Цисплатнновая ототоксичность (обзор литературы) / С.А.Иванов, С.Г.Журавский, М.М.Галагудза // Вестник оториноларингологии. - 2012. - N 4. - С.82-87.

5. Ivanov, S. In vivo toxicity of intravenously administered silica and silicon nanoparti-clcs / S.Ivanov, S.Zhuravsky, G.Yukina, V.Tomson, D.Korolev, M.Galagudza // Materials. - 2012. -N 5. - P. 1873-1889.

6. Журавский, С.Г. Феномены ripe- и посткондиционирования: от старого принципа к новой стратегии терапии / С.Г.Журавский, М.М.Галагудза, М.С.Просвирнина, С.А.Иванов // Бюллетень ФЦСКиЭ им. В.А. Алмазова. - 2012,- N 5. - С.16-29.

7. Иванов, С.А. Молекулярные механизмы огопротекции в условиях феномена звукового нрекондиционирования (обзор литературы) / С.А.Иванов, С.Г.Журавский, М.М.Галагудза// Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. - 2013. -Т. 23, N 6. - С.69-76.

8. Иванов, С.А. Сравнительная характеристика влияния общих анестетиков на слуховой анализатор в эксперименте / С.А.Иванов // VI ежегодная научно-практическая конференция с международным участием «Нарушение слуха и современные технологии реабилитации»: мат-лы конф. - СПб., 2013. - С.9-10.

9. Иванов, С.А. Хитозан увеличивает ототоксичность амикацина в условиях акустической стимуляции / С.А.Иванов, П.В.Попрядухин, А.А.Паневип // VI Всероссийская конференция-школа, посвященная памяти чл.-корр. АН СССР Г.В. Гер-шуни «Физиология слуха и речи»: мат-лы конф. - СПб., 2013. - С.56-57.

10. Паневин, А.А. Хнтозан потенцирует ототоксичность амикацина в условиях физиологически-адекватной нагрузки слухового анализатора / А.А.Паневин, С.А.Иванов, П.В.Попрядухин, П.А.Андоскин, С.Г.Журавский // Российская Оториноларингология. - 2013. -JV» 6 - С.99-102.

11. Иванов, С.А. Суспензия наночастиц хитозана как средство повышения кохлеодоступности лекарственных препаратов / А.А.Паневин, С.А.Иванов // V международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения-2013»: мат-лы конф. - СПб., 2013. - С. 189.

Лицензия ИД№ 00597 от 15.12.99 Подписано в печать 19.03.14. Усл. печ. л. 1.25. Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 197022. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого 6-8 Издательство СПбГМУ