Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Антиагрегантная и проагрегантная активность некрахмальных полисахаридов

На правах рукописи

Шокур Ольга Андреевна

Антнагрегантная и проагрегантная активность некрахмальных полисахаридов

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005549204

2; МАЯ 2014

Владивосток - 2014

005549204

Работа выполнена в Государственном бюджетном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель д.б.п., профессор Хотимченко Юрий Степанович Оф и циал ы 1 ые оп понеНТ1.1:

Зориков Петр Семенович, д.б.н., профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Горнотаежная станция им. В.Л. Комарова Дальневосточного отделения Российской академии наук, заведующий лабораторией лекарственных растений

Кушнсрова Наталья Федоровна, д.б.н., профессор. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева Дальневосточного отделения Российской академии наук, заведующая лабораторией биохимии

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «25» июня 2014г. в 15:00 ч.

на заседании диссертационного совета Д 208.007.03 при Тихоокеанском государственном медицинском университете по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Остря кова, д. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тихоокеанского государственного медицинского университета и на сайте http://vgmu.ru/

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секпетарь

Просекова Елена Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Основным фактором риска нарушений деятельности сердечно-сосудистой системы является патологическая активация тромбоцитов, которая приводит к тромбоэмболическим осложнениям (Weyrich, Zimmerman, 2004; Gawaz et al. 2005).

Ключевым механизмом формирования тромба является повышенная склонность тромбоцитов к агрегации, и этот факт стал патофизиологическим обоснованием для создания и клинического применения антиагрегантных средств (Schneider, 2011; Smyth, 2011; Angiolillo, 2012). Механизм действия этих веществ может быть обусловлен угнетением синтеза простагландинов за счет ацетилирования циклоксигеназы арахидоновой кислоты с последующим снижением уровня тромбоксана А2 в тромбоцитах (ацетилсалициловая кислота), либо пнгибированием P2Y12 рецепторов (клопи-догрель), либо подавлением самих гликопротеиновых рецепторов ПЬЛПа, расположенных на мембране тромбоцитов (абциксимаб, эптифибатид, тирофибан) (Gomes, Verbeugt, 2003; Karha, Cannon, 2008; Hagemeyer, Peter, 2010; Ueno et al., 2010; Picker, 2013).

Имеющиеся в арсенале современной фармакологии ингибиторы агрегации тромбоцитов доказали свою эффективность при проведении первичной и вторичной профилактики инфаркта миокарда и ишемического инсульта и в лечении острого коронарного синдрома (Saiimuganathan et al., 2001; Boersma et al., 2002; Thiele et al., 2012; Aradi et al., 2013; Sutcliffe et al., 2013). Вместе с тем, применение антиагрегантных средств сопряжено с риском нежелательных эффектов и осложнений, таких как диспепсические расстройства, желудочно-кишечные кровотечения, поражение периферической нервной системы, аллергические реакции, тромбоцитопения (Cerbone, 2009; Chan et al, 2012; Tsai et al., 2012). Нередко встречаются случаи резистентности к аспирину и ютопидогрелю (Musallam et al., 2011). Эти обстоятельства ставят перед фармакологами и фармацевтами актуальную задачу поиска новых и безопасных средств, предназначенных для лечения и предупреждения тромботических поражений сосудов.

Углеводные биополимеры, составляющие группу некрахмальных полисахаридов, характеризуются широким спектром фармакологических эффектов, низкой токсичностью и высокой степенью безопасности (de Andrade Moura et al., 2001; Mayer, Hamman, 2004; Mousa, 2010; Vilahur, Badimon, 2013). К таким соединениям относятся

пектины, альгинаты, фукоиданы, каррагинаны, хитозаны. Показано, что эти полисахариды обладают умеренной гипохолестеринемической, гипотриглицеридемической и гипогликемической активностью и способностью влиять на ключевые звенья регуляции гемостаза (Хотимченко и др., 2001а, б, 2005; Panlasigui et а!., 2003; Оводов, 2009; Хотимченко, 2009; Ustyuzhanina et al., 2013). Некоторые высокосульфатирован-ные полисахариды, выделенные из морских водорослей, по антикоагулянтной активности не уступают гепарину (Farias et al., 2000; Cicala et al., 2007; Cipriani et al., 2009; de Azevedo et al., 2009) и рассматриваются в качестве перспективных источников прямых антикоагулянтов (Camara et al., 2011). Вместе с тем, опубликованные сведения в отношении эффектов растительных полисахаридов на процессы агрегации тромбоцитов противоречивы. В одних случаях образцы полисахаридов проявляли протромботические и проагрегантные свойства (de Azevedo et al., 2009; Hagimori et al., 2009; Rodrigues et al., 2011; Manne et al., 2013), в других, наоборот, оказывали ан-титромботическую и антиагрегантную активность (Zhu et al., 2010; Chen et al. 2011; Zhao et al., 2012; Bijak et al., 2013; Sokolova et al., 2013b). В настоящей работе на одних и тех же экспериментальных моделях проведена сравнительная количественная оценка проагрегантных и антиагрегантных свойств у представителей всех групп растительных некрахмальных полисахаридов: пектинов, альгинатов, каррагинанов и фу-коиданов.

Цель работы: установление закономерных связей структуры некрахмальных полисахаридов с их проагрегантной и антиагрегантной активностью, как теоретической основы для разработки новых лекарственных препаратов, предназначенных для применения в качестве антиагрегантных средств. Задачи работы:

1. изучить влияние пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоиданов на спонтанную агрегацию тромбоцитов человека;

2. изучить влияние пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоиданов на агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную АДФ, коллагеном и адреналином;

3. исследовать воздействие фукоиданов на агрегацию и коагуляцию крови у экспериментальных животных при парентеральном введении;

4. исследовать воздействие каррагинанов и фукоиданов на показатели агрегации и коагуляции крови у экспериментальных животных при пероральном введении;

5. оценить антитромботический потенциал образцов фукоидана на модели острого артериального тромбоза.

Научная новизна и теоретическое значение работы. Проведена сравнительная количественная оценка проагрегантной и антиагрегантной активности у представителей всех групп растительных некрахмальных полисахаридов: пектинов, альгина-тов, каррагинанов и фукоиданов. Проведен анализ зависимости уровня агрегационной активности некрахмальных полисахаридов от химической структуры и молекулярной массы. Установлены наиболее эффективные образцы некрахмальных полисахаридов в отношении антиагрегантной и проагрегантной активности.

Теоретическое значение работы заключается в установлении новых закономерных связей структуры и физико-химических свойств некрахмальных полисахаридов с их антиагрегантной и проагрегантной активностью.

Практическая значимость исследования. Препараты некрахмальных полисахаридов можно рассматривать в качестве дополнительных средств в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся тромбоэмболическими нарушениями. Полученные экспериментальные данные являются основой для более глубоких доклинических исследований и клинических испытаний новых фармацевтических субстанций, обладающих антикоагулянтной и антитромботической активностью.

Разработан точный, легко воспроизводимый и высокоэффективный в исполнении способ диагностики артериального тромбоза у лабораторных животных, основанного на анализе формы объемной пульсовой волны, регистрируемой фотоплетиз-мографическим методом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сульфатированные некрахмальные полисахариды способны оказывать двойной эффект на агрегацию: повышают спонтанную агрегацию и ослабляют индуцированную.

2. Механизм антитромбоцитарного действия сульфатированных полисахаридов при индуцированной агрегации обусловлен конкурентными взаимоотношениями с эндогенными агонистами рецепторов на тромбоцитах.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на отчетной конференции в рамках целевой комплексной программы фундаментальных научных исследований ДВО РАН (Перспективные направления развития на-нотехнологии в ДВО РАН): «Получение, исследование и моделирование биогенных и

биомиметических наноструктурированных материалов» (Владивосток, 2010), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), Международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки» (Краснодар, 2012), IX, X Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2012, 2013), Юбилейном XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013), IX Международной научно-практической конференции «Новые достижения европейской науки» (София, 2013), V Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», (Санкт-Петербург, 2013), XVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека», (Самара, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 5 статей в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Личный вклад автора. Лично автором проделан основной объем работ по выделению, очистке, характеристике экспериментальных образцов полисахаридов, разработке дизайна экспериментов, планированию и проведению опытов с животными и исследований in vitro, систематизации, анализу экспериментальных данных, статистической обработке результатов, обобщению литературных данных по теме диссертации. Оригинальный метод регистрации количественных параметров экспериментального тромбоза на крысах разработан совместно со старшим научным сотрудником лаборатории биофизики клетки Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН к.б.н. A.A. Карпенко.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 128 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Текст диссертации иллюстрирован 17 таблицами и 40 рисунками. Список литературы включает наименование 277 первоисточников.

Благодарности. Автор благодарит сотрудника Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН Карпенко Александра Александровича за помощь в разработке способа диагностики экспериментального тромбоза у лабораторных животных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы Получение экспериментальных образцов. В работе использовали коммерческие образцы некрахмальных полисахаридов: цитрусовый пектин (Herbstreith&Fox KG, Germany), альгинат натрия («High Quality Pharma», France), высококачественные i-, к-, Х-каррагинаны («Sigma-Aldrich», USA), а также собственные препараты полисахаридов: низкоэтерифицированный пектин, низкомолекулярные пектины, фукоидан.

Низкоэтерифциованный пектин со степенью этернфикации 9,6% получали методом щелочной деэтерификации из коммерческого высокоэтерифицированного цитрусового пектина (Khotimchenko et al., 2010). Низкомолекулярные пектины получали из низкоэтерифицированного пектина методом кислотного гидролиза (Khotimchenko, 2012). Фукоидан получали из бурой водоросли Saccharina japónica (J.E. Areschoug, 1851) C.E. Lane, C. Mayes, Druehl et G.W. Saunders, 2006 методом солянокислой экстракции (Lee et al., 2004).

Стандартизация полученных образцов. Содержание уроновых кислот определяли фотометрическим методом, основанным на реакции образовании окрашенного соединения мета-гидроксидифенила (МГДФ) с продуктами деградаций уроновой кислоты в серной кислоте (Blumenkrantz, Asboe Hansen, 1973). Относительную долю свободных карбоксильных групп (степень деэтерификации) определяли титриметри-ческим методом (Afanasyev et al., 1984). Молекулярную массу полисахаридов определяли методом эксклюзиониой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с гидрофильным полимерным сорбентом Shodex Asahipak GS-320 7Е.

Содержание фукозы определяли спектрофотометрическим методом при двух длинах волн: 396 нм и 430 нм (Dische, Shettles, 1948). Суммарное содержание Сахаров измеряли фенол-сернокислым методом (Dubois et al., 1979). Количество сульфатных групп измеряли турбидиметрическим методом (Dodgson, 1961). Для определения белковых примесей использовали микробиуретовый метод (Itzhaki, Gill, 1964).

Оценка антнагрегантной и проагрегантнои активности некрахмальных полисахаридов in vitro Получение обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Плазму крови получали от 79 условно здоровых добровольцев с соблюдением процедуры добровольного информированного согласия на участие в исследовании, описанная манипуляция была одобрена Этическим комитетом Тихоокеанского государственного медицинского университета (протокол № 3 от 27.12.2010).

Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов. Спонтанную агрегацию тромбоцитов и их концентрацию измеряли на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ "БИОЛА", Россия). Формирование микроагрегатов в ОТП было записано с использованием высокочувствительного метода, основанного на анализе флуктуаций светового потока в суспензии тромбоцитов (Gabbasov Z.A., 1989). Определяли максимальный размер агрегатов R (уровень агрегации). Прибор был откалиброван по размеру отдельных тромбоцитов, принятых за 1. Агрегацию тромбоцитов выражали в условных единицах (у.е.).

Индуцированная агрегация тромбоцитов. Индуцированную агрегацию тромбоцитов регистрировали турбидиметрически на основании световой агрегато-метрии на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ "БИОЛА", Россия) согласно методу Борна (Born, 1962, O'Brien, 1962). Процесс образования агрегатов визуализировали графически. Степень агрегации тромбоцитов выражали в % от максимального уровеня светопропускания (Т%, макс).

Определение влияния сульфатированных некрахмальных полисахаридов на гемостаз в экспериментах in vivo

Экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с правилами бережного обращения с лабораторными животными и с разрешения этического комитета при Тихоокеанском государственном медицинском университете (Протокол № 3 дело № 13 от 27.12.2010 года), манипуляции с животными по разработке модели тромбоза были одобрены Комиссией по биомедицинской этике Института биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН (протокол № 1 от 6.03.2013 г.).

Экспериментальные модели. Разработаны две экспериментальные модели для определения влияния сульфатированных некрахмальных полисахаридов на гемостаз in vivo. В первой экспериментальной модели мы исследовали воздействие X-каррагинанов и фукоидана на показатели гемостаза крови у экспериментальных животных при пероральном введении через зонд. Крысам-самцам (п=26) вводили расто-вор лямбда-каррагинана в дозе 250 мг/кг или растовор фукоидна в дозе 500 мг/кг массы тела (фукоидана в препарате 50%) один раз в сутки в течение 28 дней. Контрольным животным вводили дистиллированную воду. На 29-й день у животных под наркозом производили внутрисердечный забор крови.

Во второй экспериментальной модели исследовали воздействие фукоидана на гемостаз крови у экспериментальных животных при парентеральном введении. Эксперименты выполняли на 60 крысах-самцах, массой 300 - 350 г. Перед введением фу-

коидана и препаратов сравнения крыс наркотизировали смесью золетила и ксилазина. Фукоидан вводили в яремную вену, а в качестве препаратов сравнения использовали антиагрегант диклофенак и прямой антикоагулянт гепарин. Контрольным животным вводили изотонический раствор натрия хлорида.

В экспериментах оценивали влияние сульфатированных некрахмальных полисахаридов на агрегацию тромбоцитов, коагуляцию плазмы и количественный и качественный состав клеток крови. Материалом для исследований служили кровь и ее фракции: обогащенная тромбоцитами плазма, бсстромбоцитарная плазма. Кровь для исследования получали пункцией сердца.

Агрегацию тромбоцитов изучали турбометрическим методом по Борну (Born, 1962) на двухканальпом лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ "БИОЛА"). В качестве индуктора агрегации использовали раствор АДФ в конечной концентрации 5 мкМ. Степень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегато-граммы и времени наступления дезагрегации.

Состояние параметров коагуляционного гемостаза (активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновос время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) и концентрация фибриногена) оценивали ручным способом, методики выполняли с помощью наборов «Технология-стандарт» (Россия). Определяли качественный и количественный состав клеток крови на автоматическом анализаторе ADVIA 70.

Разработка оригинального способа диагностики экспериментального тромбоза у лабораторных животных и определение антитромботической активности сульфатированных некрахмальных полисахаридов

Для разработки точного, легко воспроизводимого и простого в исполнении способа регистрации артериального тромбоза у мелких животных использовали модель тромбоза с аппликацией хлорида железа трехвалентного (FeCl3) в качестве химического агента, индуцирующего тромбоз. Крыс-самцов весом 300 г анестезировали и фиксировали на лабораторной установке. Правую сонную артерию изолировали, пометали п датчик для регистрации процесса тромбообразования и смазывали вазелиновым маслом для предотвращения высыхания сосуда. Формирование тромба индуцировали путем аппликации сонной артерии фильтровальной бумагой (2 х5 мм), смоченной 25% раствором FeCl3, в течение 10 мин (рис. 1А, В). Эксперимент продолжался 60 мин с момента индукции тромбоза, после чего тромб выделяли и взвешивали (Vogel, 2008).

Рис.1. А. Общий вид экспериментальной установки для диагностики экспериментального тромбоза у крыс. ! - микроманипуляторы КММ-1; 2- держатели; 3 - датчик; 4 -электронный блок плетизмографа; 5 - самописец М-307/1. В. система детекции. В. Сформированный тромб.

Электронная часть установки - плетизмографа состояла из датчика на основе оптрона «светодиод - фототранзистор» с открытым оптическим каналом от проигрывателя CD-RW/DVD SN-324 (Samsung, Korea) (рис. 1Б), преобразователя ток-напряжение и источника питания. Сигнал с датчика наблюдали на осциллографе С1-73 (НИИРИТ, СССР) и показания записывали на двухкоординатном самописце М-307/1 (ТочПрибор, СССР). Запись осуществляли мри режиме развертки 1-25 с/см.

Функциональное состояние сосудов оценивали по характеру фотоплетизмо-грамм (рис. 2). Время наступления окклюзии (тромбоформирование) при апробации метода составляло в среднем 26 мин с момента аппликации FeCI^. Амплитуда электрического сигнала, отражающая величину «объемного пульса», до окклюзии составила 0,2-0,225 V, после окклюзии - 0,05-0,075 V. Частота волн 1-го порядка до и после окклюзии сосуда практически не менялась и составляла 229,2±3,6 уд/мин; эти параметры полностью определяются работой сердца.

i' 1 1 I s 1 i'i 1 '' t Им i I M 11 I > t1 H Рис. 2. Протокол записи

'и .I'A'.ii.'i.H.ifiv ^.И'ДчУЧ' ^IH,

окклюзионной плетиз-

, , .."Ä'IliU'ii'iVHi. IM? WW* мограммы' 3aPeniCTf-

' • •>• 1 1 1 " 11 <• г 1 '1' 4 1 рованноц с сосуда: I -^ N i w и волна 1 порядка, coot' л - N . „ . \ . -i f, j;i RPTrTRVTTiTrTair гргтбптп-

1 'li^ PN / ^ N '

IV

teWl/'

ветствующая сердечно-

4Х ^Ь'1 № Ii1« му ритму; 11"волна 2

>• -1- •• а I' и ii v >S< ' > '' " порядка, соответствую-

\ ■••■■''*.■.'.%,„,, „ " I_2,5с щая дыхательному рит-

i ' "^'Vw^W.ii'.vÄWv.i ,

i I му; a — амплитуда ооъ-

„ I емного пульса. Угол от-

л I I *4 клонения плетизмо-

t; ч ■ . .■■. граммы (а) в начале

il ОККЛЮЗИОННОГО ПрИрОС-

|! та кровенаполнения со-

ставил 57°; полный окклюзионнын прирост объема кровенаполнения сосуда (Н) — 0,75v. Плетизмограммы а - h: скорость развертки 2,5 с/см; амплитуда 0,25 V/см; на кривой с режим развертки увеличен до 0,25 с/см; на кривой е наблюдается начало окклюзии сосуда. Показания плетизмограмм а, Ь, с, d, е от начала индукции тромбоза представлены на 20, 21, 22, 23, 24 мин, соответственно.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием статистической программы Instat (Graph Pad Software Inc. USA, 2005). Проверку выборки на нормальность распределения осуществляли с использованием критерия Шапиро-Уилка (для малых выборок). Для оценки результатов исследований использовали непараметрические критерии Манна-Уитни или Вилкоксона. Данные для непараметрических тестов представлены в виде медианы (Me) и значений квартального диапазона (25%; 75%). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Характеристика экспериментальных образцов

В табл. 1 представлены физико-химические характеристики образцов пектинов.

Таблица 1

Физико-химические характеристики экспериментальных образцов пектинов.

Наименование показателя

Наименование Степень эте- Молекулярная Содержание уро-

рификации, % масса, кДа новых кислот, %

Пектин высокоэтерифицированный 60,2 82,4 74,3

Пектин низкоэтерифицированный 9,6 55,4 73,7

Пектин низкомолекулярный 1 0 1,3 87,3

Пектин низкомолекулярный 2 0 9,8 86,5

В выделенном нами фукоидане из бурой водоросли Saccharina japónica концентрация фукозы составляла 38.2%, суммарное содержание Сахаров - 77.8%, эфир-носвязанной серной кислоты —31%; содержание белка не превышало 10%.

Аптиагрегаптная и проагрегантная активность некрахмальных полисахаридов in vitro Изменение спонтанной агрегации тромбоцитов под действием пектинов

Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов при внесении растворов высокомолекулярных пектинов выявило их способность образовывать агрегаты малого размера (табл. 2). Так, при концентрации высокоэтерифицированного пектина 0,05 мг/мл степень агрегации повышалась в 2,3 раза, а в дозе 0,125 и 0,25 мг/мл - в 2,7 и 3,8 раз, соответственно. Пектин со степенью этерификации 9,6% в концентрации 0,05 мг/мл повышал степень агрегации в 1,4 раза, при концентрации 0,125 мг/мл - в 1,5, а при концентрации 0,25 мг/мл - в 3,6 раз (табл. 2). Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов при внесении растворов низкомолекулярных пектинов с молекулярной массой 1,3 кДа и 9,8 кДа не выявило способности образовывать агрегаты: различия не были статистически значимыми (табл. 2).

Под влиянием низкоэтерифнцированного пектина со степенью этерификации 9,6% уровень агрегации повышался, но в меньшей степени, чем под влиянием высокоэтерифицированного пектина. Низкомолекулярные образцы пектинов не вызывали повышения спонтанной агрегации.

Таблица 2

Степень спонтанной агрегации тромбоцитов под влиянием пектинов.

Конечная концентрация, мг/мл Степень агрегации, у.е.

высокоэтерифи-цированный пектин низкоэтерифи-цированный пектин пектин с молекулярной массой 1,3 кДа пектин с молекулярной массой 9,8 кДа

0 2,47 (2,02; 3,02) 2,74 (2,02; 3,75) 2,19 (1,83:2,97) 2,66 (2,05; 4,07)

0,05 5,73 (3,76; 11,75)* 3,8 (3,1; 7,14)* 2,31 (1,99; 2,79) 6,075 (3,83; 17,45)

0,125 6,76 (3,71; 10,95)* 4,12(2,94; 6,99)* ¡2,31 (2,02; 2,88) 4.13 (2,9; 13,1)

0,25 9,44 (3,11; 12,03)* 9,89 (2,24; 14,2)* 3,15 (2,43; 4,86) 4,46 (3,29; 14,5)

Здесь и в табл. 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13: * - достоверное отличие (р < 0.05) по сравнению с контролем. Данные представлены в виде медианы и значений квартального диапазона (25%; 75%).

Изменение индуцированной агрегации тромбоцитов под действием пектинов

Коллаген, адреналин и АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов (%) под влиянием высокоэтерифицированного пектина не менялась (табл. 3).

Таблица 3

Максимальная степень агрегации тромбоцитов под влиянием высокоэтерифицированного пектина.

Концентрация пектина, мг/мл Максимальный уровень светопропускания, %

Используемый индуктор агрегации

АДФ 5 мкМ Коллаген 10 мкг/мл Адреналин 2 мг/мл

0 42,3(31,83:52,75) 30,40 (30,3:51,1) 25,7 (25,6; 55,7)

0,05 46,85 (31,73:56,33) 43,2 (33,8:49,1) 28,3(25,1; 41,8)

0,125 44,65 (32,9; 53,15) 37,5 (31,5:50,5) 26,5 (25,3; 47,4)

АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов под действием высокоэтерифицированного пектина со степенью этерификации 60,2%, искусственно деэтерифици-ровапного пектина со степенью этерификации 9,6%, низкомолекулярных пектинов с молекулярной массой 1,3 кДа и 9,8 кДа не изменялась: различия не были статистически значимыми (табл. 4).

Таблица 4

Степень АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов под влиянием низкомолекулярных пектинов.

Конечная концентрация пектина, мг/мл Максимальный уровень светопропускания, %

пектин с молекулярной массой 1,3 кДа пектин с молекулярной массой 9,8 кДа

0 (контроль) 40,8 (37,8; 52,6) 41,4 (35,8; 48,48)

0,05 36,85 (32,6; 46,63) 38,7 (35,4; 47,03)

0,125 39,4 (35,4; 46,6) 39,15 (32,28:45,55)

0,25 37,65 (32,45; 45,38) 37,15 (30,1; 51,7)

Изменение спонтанной агрегации тромбоцитов под действием альгппатов

Низкие концентрации раствора альгината натрия вызывали большее повышение агрегации по сравнению с пектинами. Альгинат в концентрации 0,05 мг/мл достоверно повышал степень агрегации в 2,7 раз, а в дозе 0,125 мг/мл - в 4 раза, увеличение же концентрации до 0,25 мг/мл не вызывало значимого повышения агрегации (табл. 5). Таким образом, независимо от используемого полисахарида происходило повышение агрегации, но количество клеток в агрегатах не превышало 10 (табл. 5).

Таблица 5

Степень спонтанной агрегации тромбоцитов под влиянием альгината натрия.

Альгинат натрия, мг/мл Степень агрегации, у.е.

0(контроль) 2,58 (1,96; 5,26)

0,05 7,05 (3,75; 11,35)*

0,125 10,30 (2,73; 21,2)*

0,25 4,79 (3,31; 2,87)

Изменение индуцированной агрегации тромбоцитов под действием альгннатов

АДФ-, коллаген и адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов под дей-

ствием альгината натрия статистически значимо не изменялась (табл. 6).

Таблица 6

Максимальная степень агрегации тромбоцитов под влиянием альгината натрия.

Концентрация альгината, мг/мл Индуктор агрегации

АДФ 5 мкМ Коллаген 10 мкг/мл Адреналин 2 мг/мл

0 46,9(30,1; 54,8) 49,95 (45,1; 54,8) 47,75 (46; 49,13)

0,05 52,6 (43,75; 61) 50,05 (48,2; 51,98) 43,7 (41,68; 45,8)

0,125 43,7 (26; 54,9) 46,65 (44,43; 48,73) 40,1 (39,03; 40,88)

Изменение спонтанной агрегации тромбоцитов под действием каррагннанов

Спонтанная агрегация дозозависимо менялась, регистрировали ее повышение для всех видов каррагннанов. Спонтанная агрегация при введении сульфатированных полисахаридов в дозе 0,5 мг/мл увеличивалась в 2-13 раз. С повышением концентрации выше 1 мг/мл образовывались крупные агрегаты, состоящие более чем из 100 клеток (рис. ЗА).

Изменение индуцированной агрегации тромбоцитов под действием каррагннанов Х-Каррагинан в дозе 0,5 мг/мл не вызывал статистически значимых изменений степени агрегации тромбоцитов. Прн добавлении в плазму 1 мг/мл Х-каррагинана наблюдали достоверное снижение агрегации тромбоцитов, вызванной 5 мкМ АДФ, процент ингибирования составил 67,7%. При увеличении дозы Х-каррагинана до 2,5 мг/мл понижение агрегации составило 94,4%. Х-каррагинан в дозе 0,5 мг/мл вызвал достоверное снижение коллаген-индуцированной агрегации на 27,8% по сравнению с контролем. При внесении в плазму 1 мг/мл Х-каррагинана наблюдали снижение коллаген-индуцированной агрегации на 74,2%, при добавлении 2,5 мг/мл полисахарида регистрировали снижение агрегации на 98,1%. Под действием индуктора адреналина Х-каррагинан в дозе 0,5 мг/мл статистически значимых отличий в агрегации тромбоцитов не вызывал. Х-каррагинан в дозе 1 мг/мл снижал адреналин-индуцированную агрегацию на 63,3%, а прн увеличении дозы Х-каррагинана в 2,5 раза снижал агрегацию на 94,5% (табл. 7). 1-Каррагинан удлинял латентную фазу коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов в 1,5 раза. Нормальная агрегация тромбоцитов под действием агониста коллагена характеризовалась достаточно выраженной латентной фазой. Агрегация тромбоцитов после внесения раствора ^-каррагинана характеризуется удлинением лаг-фазы по сравнению с контролем.

Таблица 7

Максимальная степень агрегации тромбоцитов под влиянием Х-каррагинана.

Концентрация X-каррагинана, мг/мл Индуктор агрегации

АДФ 5 мкМ Коллаген 10 мкг/ мл Адреналин 2 мг/мл

0(контроль) 50,15(42,0; 57,18) 55,3 (40,6; 59,4) 40,30 (36,05; 52,95)

0,5 52,0(56,9; 49,15) 41,6 (37,15; 45,20)' 45,85 (40,88; 51,58)

1 16,2 (13,80; 20,90)' 14,25 (10,35; 17,07)' 14,80(13,3; 17,90)

2,5 2,83 (2,44; 3,22) 1,075 (0,97; 1,555)' 2,20 (1,85; 2,88)'

1-Каррагинан в дозе 0,5 мг/мл снижал агрегацию тромбоцитов на 37,6 % под

действием индуктора АДФ, при повышении дозы в 2 раза наблюдали достоверное снижение АДФ-индуцированной агрегации на 72,9%, при увеличении концентрации полисахарида еще в 2,5 раза степень ингибирования составила 95,8%. 1-каррагинан в концентрации 0,5 мг/мл снижал процент светопропускания коллаген-индуцированной агрегации на 25,4%, в дозе 1 мг/мл понижал на 80,7%, при добавлении 2,5 мг/мл I-каррагинана регистрировали снижение агрегации на 94,5%. При добавлении I-каррагинана в дозе 0,5 мг/мл степень ослабления адренапин-индуцированной агрегации составила 19,3% по сравнению с контролем, 1-каррагинан в концентрации 1 мг/мл снижал степень агрегации на 61,4 %. 1-Каррагинан в дозе 2,5 мг/мл наблюдали достоверное снижение агрегации тромбоцитов, вызванной адреналином, процент ингибирования составил 91,2% (табл. 8).

Таблица 8

Максимальная степень агрегации тромбоцитов под влиянием 1-каррагинана.

Концентрация t- каррагинана, мг/мл Индуктор агрегации

АДФ 5 мкМ Коллаген 10 мкг/мл Адреналин 2 мг/мл

0(контроль) 51,6 (44,30; 58,10) 47,4 (31,93; 60,28) 41,4 (30,4; 45,3)

0,5 32,2 (27,75; 37,83)' 35,35 (31,55; 41,63)' 33,40 (25,73:36,93)'

1 14,0(10,50; 22,70)' 9,16(1,1; 17,70)' 16,00(11,80; 19,70)*

2,5 2,19 (1,7; 4,10)' 2,63 (2,17; 4,88)' 3,61 (2,65; 7,5)"

Исследуемые полисахариды в малой концентрации преимущественно подавляли вторую фазу АДФ-индуцированной агрегации. Нормальная агрегация тромбоцитов характеризуется первой волной, индуцированной агонистом АДФ, за которой следует вторая волна, в результате выброса тромбоцитарного пула. Кривая агрегации тромбоцитов после внесения раствора 1-каррагинана характеризуется только первой волной, индуцированной агонистом АДФ (рис. ЗБ). С увеличением концентрации растворов

каррагинанов исследуемые вещества иншбировали и первую фазу АДФ-индуцированиой агрегации.

При внесении растворов к-каррагинана во всех исследуемых концентрациях не выявлялось достоверного различия в индуцированной агрегации тромбоцитов.

уел ед

Рис. ЗА. Агрегатограммы спонтанной агрегации тромбоцитов под влиянием 1-каррагинана. Кривые спонтанной агрегации тромбоцитов в норме (1), под действием 1-каррагинана в концентрациях 0,05 мг/мл (2) и 0,1 мг/мл (3).

По оси абсцисс - образование агрегатов тромбоцитов в реальном времени, мин; по оси ординат - уровень спонтанной агрегации выраженный в условных единицах (у.е.), где за 1 у.е. принимается диаметр одного тромбоцита.

Рис. ЗЬ. Агрегатограммы АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов под действием 1-каррагинана. Нормальная агрегация тромбоцитов (1); агрегация тромбоцитов после добавления 1-каррагинана в дозе 0,5 мг/мл (2).

Изменение спонтанной агрегации тромбоцитов под действием фукоидана

Без добавления индукторов в плазму, обогащенную тромбоцитами, фукоидан вызывал слипание тромбоцитов, что регистрировалось повышением спонтанной агрегации. При внесении раствора фукоидана в концентрации 0,045 мг/мл степень свето-пропускания плазмы повышалась до 10,5% (9,86; 13,2) против 1.43% (0,87; 1,43) в контроле (р=0,016; критерий Вилкоксона для парных выборок). Фукоидан в дозе 0,18 мг/мл повышал степень светопропускания плазмы до 26,5% (24,1; 29,5) против 1,43% (0,87; 1,43) в контроле; р=0,022).

Изменение индуцированной агрегации тромбоцитов под действием фукоидана

В экспериментах с индуцированной агрегацией тромбоцитов фукоидан проявлял выраженный антиагрегантный эффект. В нашем исследовании АДФ-индунированная агрегация тромбоцитов при добавлении фукоидана уменьшалась до-

зозависимо относительно контрольных значений (табл. 9). В концентрации 0,045 мг/мл достоверно снижалась степень светопропускания на 20,8%, а в дозе 0,18 и 0,45 мг/мл - на 30,5 и 59,5%, соответственно. При использовании коллагена в качестве индуктора агрегации, фукоидан в дозе 0,045 мг/мл уменьшал светопропускание плазмы на 24,7%, в дозе 0,18 мг/мл - на 34,9%, в дозе 0,45 мг/мл - на 61,1%. Таким, образом, независимо от используемого индуктора, происходило равное снижение агрегации. Это может быть связано с тем, что изучаемое соединение одинаково влияет на функциональную активность рецепторов мембран тромбоцитов и не связано со специфической активацией конкретной группы рецепторов.

Под влиянием фукоидана продолжительность латентной фазы коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов сокращалась. Агрегация тромбоцитов после внесения раствора фукоидана в дозе 0,045 мг/мл характеризовалась сокращением лаг-фазы по сравнению с контролем в 2,6 раза, при повышении концентрации выше 0,09 мг/мл длительность латентной фазы сокращалась в 7 раз, что свидетельствует о сокращении времени активации кровяных пластинок.

Агрегация тромбоцитов после внесения раствора фукоидана в дозе 0,045 мг/мл характеризовалась только первой волной, индуцированной агонистом АДФ. Возможно, при внесении фукоидана в плазму происходит взаимодействие с тромбоцитарным пулом, после чего истощенный пул не может полноценно реагировать на внесение индукторов агрегации.

Таблица 9

Максимальная степень индуцированной агрегации тромбоцитов под влиянием

фукоидана, выделенного из бурой морской водоросли Saccharina japónica.

Концентрация фукоидана, мг/мл Степень агрегации, %

АДФ, 5 мкМ коллаген, 0.1 мг/мл

0 (контроль) 53,8 (37,7; 58,2) 55,8 (38,6; 58,6)

0,045 42,6 (39,75; 52,8)* 42 (41,1; 47,8)*

0,09 48,7 (37,6; 52,4)* 37 (33,55; 47,45)*

0,18 37,4 (30,4; 46,15)* 36,35 (24,75; 41,15)*

0,45 21,8 (16,0; 30,8)* 21,7 (19,1; 26,8)*

Как видно из результатов, исследованные в нашей работе соединения способствовали активации тромбоцитов в опытах без использования индукторов агрегации. Однако сульфатрованные полисахариды эффективно ингибировали агрегацию тромбоцитов при использовании в качестве проагрсгантов АДФ, коллагена

и адреналина. Наиболее активные в опытах in vitro соединения были изучены во второй части работы на крысах в экспериментах in vivo.

Влияние сульфатированных полисахаридов на гемостаз В результате эксперимента, при пероральном приеме лямбда-каррагинана у экспериментальных животных отмечали снижение индуцированной агрегации тромбоцитов крыс на 17,4% по сравнению с контролем (р<0,05; критерий Манна-Уитни) (табл. 10). По результатам исследования общего анализа крови наблюдали достоверное повышение количества лейкоцитов на 39,5%, тромбокрита на 17,3%, при этом изменений остальных показателей не было обнаружено. У крыс, которым вводили фукоидан, было обнаружено снижение индуцированной агрегации тромбоцитов на 15,6% по сравнению с контролем (р<0,05) (табл. 10). При пероральном приеме фу-коидана достоверных изменений в формуле крови крыс не было обнаружено. При оценке коагуляционного звена не было обнаружено статистически значимых различий между контрольной и опытными группами.

Таблица 10

Степень светопропускания и время дезагрегации тромбоцитов крови крыс при пероральном введении экспериментальным животным сульфатированных полисахаридов,

Показатель агрегации Группа

Физ. раствор Каррагинан Фукоидан

Степень светопропускания, % 32,5 (29,55; 35,28) 28,3 (22,4; 30,7)* 28,8 (20,1; 29,9)*

Время дезагрегации, с 182(167; 195) 183 (167; 204) 187 (157,5; 203,5)

Таким образом, лямбда-каррагинан и фукоидан снижают агрегацию тромбоцитов крыс, при этом показатель агрегации остается в пределах нормальных значений.

Влияние фукоидапа на гемостаз при парентеральном введении

Фукоидан оказывал достоверный дозозависимый антикоагулянтный эффект (табл. 11). Исследуемый полисахарид в концентрации 0,31 мг/кг удлинял АЧТВ в 1,66 раза по сравнению с контролем, в концентрации 1,25 мг/кг - в 3,24 раза, а в дозе 2,5 мг/кг - в 3,6 раз (р< 0,05). Фукоидан в концентрации 1,25 мг/кг увеличивал тест тром-бинового времени в 1,74 раза, а в дозе 2,5 мг/кг не вызывал свертываемости плазмы. Фукоидан изменял тест протромбинового времени в плазме крыс только в высоких дозах. Концентрация фибриногена в плазме не изменялась при всех исследуемых дозах.

Таблица 11

Влияние фукоидана и препаратов сравнения на коагуляцию крови у крыс.

Вещество, мг/кг ПВ, с АЧТВ, с ТВ, с фибриноген, мг/л

физ. раствор 20,5 (18,2:24,25) 17,05 (15,98; 18,98) 40,3 (38,6; 42,78) 1,4 (1,1; 1,74)

фукоидан, 0,31 22,7 (22,1;23,3) 28,3* (26,6;29,9) 40,0 (34; 54,2) 1,74 (1,4; 1,76)

фукоидан, 1,25 27.7(16,9;29,6) 55,30* (25,8; 92,5) 70,3* (57,5: 100) 1,49 (0,96;2,74)

фукоидан, 2,5 >100 60,95* (21,6; 100) >100 1.2 (1.1; 2,76)

гепарин, 0,67 15,7* (15.3; 17) 14,5* (14,2; 14,7) 39,4 (38,9; 39,8) 0,52*(0,5;0,55)

гепарин, 1,15 25,7 (19,75; 30,3) 58,9* (17,3; 100) >100 0

гепарин, 2,4 13,4* (12,9; 13,9) >100 >100 0

гепарин, 4,8 >100 >100 >100 0

диклофенак, 1,25 21,0 (20,2; 21,7) 17,5 (17,1; 17,9) 45,4* (43,4; 47,4) 1,02(0,72; 1,7)

днклофенак, 2,5 19,75(15,2; 22,3) 16,1 (15,38;19,05) 38,6(36,3:44,3) 1,28(0,98:1,64)

Примечание: >100 - отсутствие свертываемости плазмы более 100 с; ПВ - протром-биновое время; АЧТВ - активированное частичное тромбиновое время; ТВ — тромби-новое время.

Фукоидан уменьшал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов дозозави-симо. В концентрации фукоидана 1,25 мг/кг агрегация тромбоцитов снижалась на 14,4%, а в концентрации 2,5 мг/кг - на 27,3%. Фукоидан в дозе 1,25 к 2,5 мг/кг сокращал время наступления дезагрегации на 11,2 и 29 %, соответственно. Антиагре-гантный эффект полисахарида был сопоставим с активностью диклофенака (табл. 12).

Таблица 12

Влияние фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japónica, и

препаратов сравнения на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов у крыс.

Препарат, доза Время наступления дезагрегации, с Максимальная степень агрегации, %

физ. раствор (контроль) 241 (217, 322) 44 (38,6; 47,55)

фукоидан 1,25 мг/кг 214 (167,5; 223)* 37,65 (30,08; 40,35)*

фукоидан 2,5 мг/кг 171 (150; 192)* 32 (28,8; 35,9)*

диклофенак 2,4 мг/кг 204,5 (181,5;225,8)* 38,6(28:40,5)*

гепарин 2,4 мг/кг 275 (199; 311) 36,2 (30,25; 41,8)

В группе животных, которым вводили фукоидан в дозе 2,5 мг/кг, количество тромбоцитов периферической крови уменьшилось на 23% по сравнению с контрольной группой (р=0,043). Однако изменение данного показателя в группе фукоидана было меньше, чем в группе животных, которым вводили гепарин.

Таким образом, фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Saccharina japónica, влияет на гемостаз крови крыс. В низких дозах фукоидан ингибнрует внутренний путь свертывания крови, а при увеличении вводимой дозы ингибнрует и внешний, и внутренний пути гемостаза. Удлинение теста тромбннового времени под действием фукоидана свидетельствует о способности полисахарида влиять на завершающий этап процесса свертывания. Степень антикоагулянтной активности фукоидана может быть сопоставима с таковой у гепарина. В то же время фукоидан в отличие от гепарина не вызывает такого побочного эффекта, как тромбоцитопения.

Антитромботичсская активность фукондана

Фукоидан проявлял антитромботическую активность на модели фотоплетизмо-графической регистрации тромбоза сонной артерии крыс. При внутривенном введении фукоидана и гепарина в дозе 1,25 мг/кг, окклюзия сосуда не происходила в течение 60 минут, в то время как в контроле время наступления окклюзии составляло в среднем 26±4 мин. Масса образовавшегося тромба составила 5,3±0,38 мг в контроле, 3±0,43 мг при введении фукоидана и 2,5±0,06 мг при введении гепарина.

Проведенные исследования показали, что свойства некрахмальных полисахаридов в отношении аггрегации тромбоцитов зависят от природы полимера. Пектины с низким молекулярным весом не влияют на агрегацию тромбоцитов, как спонтанную, так и индуцированную. Альгинат натрия, высокомолекулярные пектины с различной степенью этерификации увеличивают спонтанную агрегацию, не влияя на индуцированную. Наиболее эффективными препаратами являются сульфатированные некрахмальные полисахариды: каррагинаны, фукоидан, при этом их активность в значительной степени зависит от степени сульфатирования. Так, к-каррагинан, как минимально сульфатированный полисахарид, не вызывал снижение индуцированной агрегации тромбоцитов. Максимально сульфатированный ^.-каррагинан вызывал существенное снижение индуцированной агрегации. В экспериментах in vivo сульфатированные полисахариды способны снижать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах in vitro пектины, альгинат натрия, фукоидан, лямбда-, йота- и каппа-каррагпнаны повышают спонтанную агрегацию тромбоцитов человека. Сульфатированные некрахмальные полисахариды, фукоидан и каррагинаны, оказывают проагрегантное действие, образуя крупные конгломераты, состоящие более чем из 100 клеток. Несульфатированные полисахариды пектины и альгинат натрия проявляют низкую проагрегантную активность, формируя конгломераты, состоящие не более чем из 10 клеток.

2. В экспериментах in vitro индуцированная агрегация тромбоцитов, инициированная АДФ, коллагеном или адреналином, снижается дозозависимым образом под действием фукоидана, выделенного из бурой морской водоросли Saccharina japónica, лямбда- ir йота-каррагинанов. Пектины, альгинат натрия и каппа-каррагинан не влияют на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

3. При парентеральном введении экспериментальным животным фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Saccharina japónica, снижает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, сокращая время дезагрегации и удлиняя продолжительность активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и тромбинового времени. С повышением вводимой дозы фукоидана увеличивается АЧТВ, тромбиновое и протромбиновое время.

4. При энтеральном введении фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Saccharina japónica, и лямбда-каррагинан достоверно снижают АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов крыс и не влияют на АЧТВ, тромбиновое и протромбиновое время и содержание фибриногена.

5. На модели артериального тромбоза сонной артерии крыс фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Saccharina japónica, оказывает дозозависи-мое антитромботическое действие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хотимченко М.Ю., Шокур O.A., Ламаш Н.Е. Оценка возможности применения кар-рагинана для адресной доставки противоопухолевых лекарственных средств // Тихоокеанский медицинский журнал. 2010. № 2. С. 59-62.

2. Шокур O.A., Хожаенко Е.В., Рукина Н.Ю., Простакишина А.Б. Влияние каррагина-нов на агрегацию тромбоцитов in vitro // Тихоокеанский медицинский журнал. 2013. № 2. С. 25-28.

3. Шокур O.A., Хотимченко Ю.С. Влияние фукоидана, выделенного из бурой морской

водоросли Saccharina japónica, на агрегацию тромбоцитов in vitro II Биология моря. 2013. Т. 39. №5. С. 380-383.

4. Khotimchenko М., Poleschuk Т., Savchenko О., Shokur О. Comparative lead-removing activity of the non-starch polysaccharides // J. Med. Sei. 2013. V. 13. № 8. P. 647-656.

5. Шокур O.A., Сергеева H.B., Макарова K.H. Антикозгулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Saccharina japónica in vivo// Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15, № 3 (6). С. 2024-2026.

6. Ковалев В.В., Хотимченко М.Ю., Макарова К.Е., Хотимченко Ю.С., Шокур O.A. Разработка наноносителем адресной доставки лекарственных средств на основе углеводных биополимеров: связывание дакарбазина, доксорубицина и циклофосфамида йота-каррагинаном // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН. Владивосток: Изд-во «Дальнаука», 2010. Т. 3. С. 127-133.

7. Шокур O.A., Хотимченко Ю.С. Влияние каррагинанов на агрегацию тромбоцитов in vitro II Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», Казань, 18-21 сентября 2012 г. М.: Изд-во «Фолиум». 2012. С.201-202.

8. Шокур O.A., Хотимченко Ю.С. Влияние фукоидана на агрегацию тромбоцитов in vitro II Человек и лекарство: материалы IX Дальневосточного регионального конгресса с международным участием, 20-21 сентября 2012 г. Владивосток: Изд-во «ДВ Медицина»,

2012. №3. С. 120.

9. Шокур O.A., Хотимченко Ю.С. Скрининг некрахмальных полисахаридов, влияющих на агрегацию тромбоцитов in vitro П Материалы Международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки», 18 июня 2012 г. Краснодар: Изд-во «Априори», 2012. С. 51.

10. Шокур O.A., Хотимченко Ю.С. Влияние сульфатированных некрахмальных полисахаридов на показатели гемостаза крови крыс И Сборник материалов XX российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 15-19 апреля 2013 г. М.: Изд-во ЗАО РИЦ «Человек и лекарство», 2013. С. 473.

11. Шокур O.A., Макарова К.Е., Хожаенко Е.В., Хотимченко Р.Ю. Разработка метода получения низкомолекулярных пектинов // Человек и лекарство: материалы X Дальневосточного регионального конгресса с международным участием, 19-20 сентября 2013 г. Владивосток: Изд-во «ДВ Медицина», 2013. № 4. С. 87-88.

12. Шокур O.A. Изменение агрегации тромбоцитов in vitro под влиянием пектинов и альгината // Материалы IX Международной научно-практической конференции «Новые достижения европейской науки», София, 17-25 июня 2013 г. Болгария: Изд-во «Бял ГРАД-БГ»,

2013. Т.Н. С. 31-34.

13. Шокур O.A., Карпенко A.A. Фотоплетизмографическая регистрация артериального тромбоза сонной артерии крыс // Материалы V Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 14-15 ноября 2013 г. СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2013. С. 202-206.

Шокур Ольга Андреевна

АНТИАГРЕГАНТНАЯ И ПРОАГРЕГАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 16.04.2014г. Формат 60x84 1/16. Усл. п. л. 1.39. Тираж 120 экз. Заказ 181 Отпечатано в дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10.