Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние полисахаридов из морских водорослей и трав на систему комплемента

На правах рукописи __

Назарова Ирина Владимировна

ВЛИЯНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ II ТРАВ ПА СИСТЕМУ КОМПЛЕМЕНТА

14.00.25 - фармаколога?

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ВЛАДИВОСТОК -1999

На правах рукописи

Назарова Ирина Владимировна

ВЛИЯНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ II ТРАВ НА СИСТЕМУ КОМПЛЕМЕНТА

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ВЛАДИВОСТОК-1999

Работа выполнена в лаборатории цитофизиологии и фармакологии Института биологии моря Дальневосточного отделения РАН (г. Владивосток)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.С. Хотимченко

Научный консультант:

доктор медицинских наук Б.М. Ковалев

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор H.H. Беседнова

доктор медицинских наук О.И. Кириллов

Ведущая организация:

НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Защита состоится 1999 г. в /У час.

на заседании диссертационного совета К 084.24.02 при Владивостокском государственном медицинском университете по адресу: 690600, г. Владивосток, пр. Острякова 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан " ¿Г " CjßHtjfyj 1999 г. Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук ¿/Lutt^ß^^ E.B. Елисеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В связи с ростом заболеваемости, обусловленной первичными и вторичными иммунодефицитными состояниями, злокачественными опухолями, ВИЧ инфекцией и другой иммунозависимой патологией, актуальным для медицины является поиск новых высокоэффективных и малотоксичных иммуномодуляторов с целенаправленным воздействием на отдельные звенья иммунной системы (Лазарева, Алехин, 1985; Зем-сков и др., 1997; Ковальчук, Чередеев, 1998). Одним из таких звеньев является система комплемента, от активирования или ингибирования которой во многом зависят развитие в организме инфекционной и неинфекционной патологии, сроки купирования и эффективность лечения заболеваний. Система комплемента интегрирует работу всей иммунной системы, о чем свидетельствует наличие рецепторов к компонентам комплемента на иммунокомпетентных клетках (ИКК). Рецепторы к СЗЬ - компоненту обнаружены на макрофагах, нейтрофилах и В-лимфоцитах (Фриммель, Брок, 1986; Вавилова, Голосова, 1990). К фактору В альтернативного пути - на макрофагах, к фактору Н альтернативного пути - на В-лимфоцитах, к СЦ-субкомпоненту - на лимфоцитах, лейкоцитах и тромбоцитах (Таран, 1993).

Из иммунотропных препаратов, применяемых в отечественной медицине, лишь зимозан влияет на активность системы комплемента (Вавилова, Голосова, 1990). Между тем, возможность фармакологического воздействия на эту систему открывает новые перспективы запуска защитных реакций организма.

В качестве потенциальных лекарственных препаратов большое внимание привлекают природные соединения полисахаридной природы благодаря их нетоксичности, большой степени свободы дозирования, экологически чистым и экономичным технологиям производства. Источниками полисахаридов (ПС) могут быть бактерии, мхи, лишайники, грибы, высшие растения, а также водоросли. Важно подчеркнуть, что иммуномодулирующий эффект некоторых ПС из морских водорослей и трав более выражен, чем бактериальных, дрожжевых и растительных ПС (Снопе! е1 а1., 1991; Е1-1оиаИе1а1.,1993;Игнатенко, 1994; Лоенко и др., 1997; Назарова и др., 1998).

Высокая биологическая активность полисахаридов из морских водорослей и трав предполагает возможность их дальнейшего исследования с целью получения и последующего применения в медицине в качестве иммуномодуляторов. В отечественной и зарубежной литературе имеются сведения о влиянии полисахаридов из морских гид-

робионтов на ИКК, такие как Т- и В-лимфоциты (Bash, Cochran, 1980; Brenan, Parish, 1986), натуральные киллеры (Brennan et al., 1995), макрофаги (R.Goldman, 1988; Иг-натенко, 1994; Запорожец и др., 1990; Y.Yoshizawa et al., 1996), а также на гуморальное звено иммунного ответа, в частности, на продукцию иммуноглобулинов (Mancino, Minucci, 1983; Беседнова и др.,1990, 1993; Johansen et al., 1994) и лимфокинов (Shikita et al., 1981; Damle et al., 1992). В то же время, влияние этих ПС на систему комплемента практически не исследовалось, что и предопределило направление нашей работы.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явился экспериментальный поиск и оценка эффективности перспективных иммуномодуляторов, действующих на систему комплемента, среди полисахаридов различных групп из морских водорослей и трав. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить иммуномодулирующее действие различных ПС из морских водорослей и трав на систему комплемента in vitro и отобрать наиболее перспективные из mix.

2. Изучить механизмы действия ПС на реакции активирования комплемента по классическому (КПК) и альтернативному (АПК) пути.

3. Сравнить действие ПС, влияющих на комплемент-зависимый гемолиз, с действием их на другие звенья иммунной системы.

4. Выяснить связь структуры исследуемых ПС с их иммуномодулирующей активностью.

Научная новизна

Исследованы иммуномодулирующие свойства новых высокоочищенных полисахаридов из морских водорослей и трав Дальневосточного региона: зостерина, различных фракций фукоиданов и каррагинанов, альгината натрия, а также препарата транс-лам, полученного ферментативной трансформацией из природного ламинарана и ряда других.

Препараты впервые протестированы на моделях активирования комплемента по классическому и альтернативному пути in vitro.

Разработан чувствительный способ моноспецифического определения in vitro степени активирования КПК. Особенностью данного метода является использование в реакции активирования КПК коммерческого сухого комплемента морской свинки, применяющегося для реакции связывания комплемента (РСК), у которого, по резуль-

тэтам нашего исследования, полностью отсутствует способность к активированию комплемента по альтернативному пути.

Модифицирована методика Адачн (Adachi et al., 1990) активирования комплемента по альтернативному пути.

Теоретическая и практическая значимость работы

Совокупность полученных данных, их системный анализ позволяют дополнить существующие представления о механизмах активирования комплемента.

Предлагаемые методики активирования комплемента по классическому и альтернативному пути in vitro позволяют осуществить скрининг биологически активных веществ, способных влиять на комплемент.

Практическая значимость работы состоит в том, что отобрана группа перспективных иммуномодуляторов полисахаридной природы из морских водорослей, влияющих на КПК и АПК in vitro, охарактеризованы их физические и химические свойства, описана биологическая активность и действие на основные звенья иммунной системы. Исследованные ПС рекомендованы для использования с целью иммунокоррекции в качестве биологически активных пищевых добавок. Наиболее эффективные полисахариды - каррагинаны и фукоиданы предложены для дальнейшего изучения с целью создания из них лекарственных препаратов, влияющих на систему комплемента.

Разработанный метод определения степени активирования КПК может быть использован как модель для изучения и поиска различных иммуномодуляторов, способных влиять на КПК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Вещества полисахаридной структуры из морских водорослей и трав способны активно влиять на состояние иммунной системы, в том числе на активирование комплемента по классическому и альтернативному пути.

2. Для проявления полисахаридами из морских водорослей и трав способности влиять на комплемент-зависимый гемолиз необходимы: относительно высокая молекулярная масса и высокий отрицательный заряд. Для сульфатированных полисахаридов способность влиять на реакции активирования комплемента находится в прямо пропорциональной зависимости от степени сульфатирования. Степень сульфатирова-ния не является достаточным условием для проявления активности ПС, имеет значение моносахаридный состав: для галактанов - наличие D-галактозы, для фукоиданов -высокий процент содержания фукозы.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на Региональной Ассамблее "Здоровье населения Дальнего Востока" (Владивосток, 1996г.); на V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998г.); на III Дальневосточном международном симпозиуме "Актуальные проблемы в онкологии" (Владивосток, 1998г.).

Публикации и вклад автора Все результаты, изложенные в диссертации получены автором лично и отражены в публикациях. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них две журнальные статьи.

Работа выполнена в лаборатории цитофизиологии и фармакологии Института биологии моря Дальневосточного отделен™ РАН. Отдельные этапы работы выполнялись в соавторстве с сотрудниками лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и библиографии. Работа содержит 13 таблиц и 23 рисунка. Библиография включает 259 наименований источников литературы, из которых 9] - на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования Для реакции активирования АПК использовали желатин-вероналовый буфер рН 7,4, содержащий ЭГТА и Mg2t (0.05М ЭГТА-ЖВБ-Mg2*). Этот основной буфер может храниться при +4°С в течение месяца. Рабочий буфер (0,01М ЭГТА-ЖВБ-Mg2+), готовили ex tempore разведением основного в пять раз. 0,01 М ЭДТА готовили, добавляя 292,3 мг ЭДТА к 100 мл физиологического раствора и доводили на рН-метре до рН 7,4 с помощью концентрированного NaOH.

Образцы полисахаридов и зимозан были растворяли в 0,05М ЭГГА-ЖВБ-Mg24 до концентраций: 0,5, 1,10, 20 и 100 мг/мл. Источником комплемента служила усредненная человеческая свежеприготовленная сыворотка от здоровых доноров. Натив-

ные или отмытые консервированные несенсибилизированные эритроциты кролика готовили в концентрации 5х107 клеток/мл в рабочем буфере 0,01M ЭГТА-ЖВБ-Mg2*.

Для реакции активирования КПК источником комплемента служил сухой комплемент морской свинки ("Биомед", Россия), который разводили 1:10 физиологическим раствором. Для приготовления гемолитической системы нативные или отмытые консервированные в растворе Олсвера эритроциты барана готовили в концентрации 1,5х108клеток /на 1 мл физиологического раствора и сенсибилизировали равным количеством стандартной гемолитической сыворотки кролика, иммунизированного эритроцитами барана ("Биомед", Россия) в титре 1:1000.

В реакции активирования (РА) КПК применяли ЖВБ рН 7,4, не содержаний ЭГТА, но включающий в себя 0,003 M Mg2+ и 0,001 M Са2+, обозначаемый как ЖВБ-Mg2+-Ca2+ и использовали для разведения исследуемых образцов. Рабочий буфер готовили ex tempore разведением основного в пять раз.

Для исследований были отобраны образцы ПС из красных водорослей: агар, ага-роза тип la (Sigma, США); к-каррагинан, Х-каррагинан (смесь к и X фракций), X-каррагинан высокомолекулярный и низкомолекулярный, выделенные из Clwndrus armatus; из бурых водорослей: альгинат натрия, выделенный из Laminaria japónica, фукоиданы и ламинараны, выделенные из L. japónica, L cichorioides, L guryanovae и Fucus evanescens, продукт ферментной трансформации ламинарана из L cichorioides -транслам (ТИБОХ ДВО РАН); го морской травы Zostera marina - зостерин.

Для сравнительной оценки влияния ПС из морских водорослей и трав на РА АПК и КПК были исследованы образцы ПС хитинов и хитозанов различной степени N-ацетилирования, различного заряда и отличающиеся по молекулярному весу, полученные из хитина панциря камчатского краба Camchaticus paralitlwdes, и полисаха-рнд-белковый комплекс митилан, выделеный из мидии Cremmytilus grayanus (ТИБОХ ДВО РАН). Были протестированы также лекарственные препараты: гепарин (фирмы Sigma, США), метотрексат ("Pharmacia Upjohn", Швеция-Бельгия), 5-фторурацил и винкристин ("G.Richter", Венгрия), циклофосфан (МЕДТЕХ, Россия), фосфэстрол (АО "Органика", Россия), эстрадурин ("Pharmacia", Швеция), депо-провера ("Upjohn s.a. Puurs", Бельгия), преднизолон и дексаметазон ("G.Richter", Венгрия), интерферон человеческий лейкоцитарный (предприятие по производству бактерийных препаратов Томского НИИ вакцин и сывороток, Россия).

Модифицированным метод определения степени активирования комплемента по альтернативному пути in vitro. Метод Адачи (Adachi et al., 1990) был нами модифицирован как микрометод, были подобраны оптимальные количества источника комплемента для получения результатов с различными концентрациями сыворотки и разработаны оптимальные технологии приготовления реактивов.

Ход реакции активирования АПК

К 200 мкл сыворотки добавляли 50 мкл исследуемого образца, разведенного в 0,05М 3ITA-5KBB-Mg2+. Пробирки с полученной смесью инкубировали в течение часа при 37 С. Затем в каждую пробирку добавляли по 150 мкл рабочего буфера (0,01М ЭГТА-ЖВБ-Mg21"), по 100 мкл эритроцитов кролика и помещали в термостат при 37 С до появления лизиса в пробирке с контрольным 100% гемолизом. После этого в каждую пробирку добавляли по 1 мл охлажденного 0,01М раствора ЭДТА, для остановки активирования комплемента, центрифугировали и оптическую плотность супернатан-та измеряли на спектрофотометре "Specol ZV" (ГДР) при длине волны 414 нм. За 100%-ный гемолиз принимали показатель оптической плотности в контрольной пробирке с полным гемолизом.

Процент гемолиза в опытных пробирках вычисляли как отношение к 100% гемолизу за вычетом показателей контроля цветности вещества, контроля цветности сыворотки и контроля эритроцитов. За 100% гемолиз принимали полный гемолиз в пробирке, где вместо образца добавляли 50 мкл 0,05М ЭГТА-ЖВБ-Mg2" . Контроль эритроцитов служил для исключения возможного гемолиза из-за прямого токсического действия на эритроциты исследуемых веществ. Для этого вместо сыворотки использовали 200 мкл 0,9% NaCl. Контроль цветности сыворотки использовали для исключения влияния окрашенности источника комплемента на показатель оптической плотности. Для этого к 200 мкл сыворотки добавляли 300 мкл 0,9% раствора NaCl. Контроль 0% гемолиза служил для сравнения степени торможения комплемент-зависимого гемолиза исследуемых веществ. Для контроля 0% гемолиза вместо исследуемых образцов использовали 50 мкл зимозана в концентрациях, идентичных концентрациям исследуемых полисахаридов. Для постановки РА АПК, сыворотка должна быть очищена от собственных гемолизинов, чтобы параллельно с альтернативным не происходило активирования классического пути.

Новый метод определения in vitro степени активирования комплемента по классическому пути. В методике Адачи выключение классического звена системы комплемента осуществляется посредством добавления в реакцию раствора ЭГТА. Не-сенсибилизированные эритроциты кролика, используемые в этой реакции, являются активирующим фактором для АПК и клетками-мишенями для комплемента. Для моноспецифического определения классического пути комплемента необходимо блокирование альтернативного звена на уровне пропердина, факторов В и D и других регу-ляторпых белков без воздействия на СЗ компонент. В разработанном нами способе моноспецифического определения in vitro степени активирования КПК используется сухой комплемента морской свинки, который, как показали наши исследования с зи-мозаном, не способен активировать АПК из-за дефекта регуляториых белков (Ковалев и др., 1988).

Для уточнения механизма предложенной реакции, параллельно с РА КПК с идентичными образцами проводили РА АПК по методике Адачи. РА КПК мы проводили макрометодом, с сохранением пропорции реагирующих веществ аналогично РА АПК.

Ход реакции активирования КПК

К 0,4 мл рабочего титра раствора комплемента добавляли 0,1 мл исследуемого образца, разведенного в >KBB-Mg2+-Ca2+. Смесь инкубировали в течение часа при 37°С. В каждую пробирку добавляли 0,3 мл рабочего буфера 5KBE-Mg2+-Ca2t и 0,2 мл гемолитической системы и вновь инкубировали при 37 С до появления лизиса в контрольной пробирке со 100% гемолизом. Затем в каждую пробирку добавляли по 2 мл охлажденного 0,01М раствора ЭДТА, центрифугировали и оптическую плотность су-пернатанта измеряли на спектрофотометре при 414 нм. За 100%-ный гемолиз принимали показатель оптической плотности в контрольной пробирке с полным гемолизом. Процент гемолиза в опытных пробирках вычисляли как отношение показателя оптической плотности опыта к показателю оптической плотности в контрольной пробирке со 100% гемолизом за вычетом показателей контроля окраски вещества, контроля окраски источника комплемента и контроля эритроцитов и выражали в процентах.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с учетом t -критерия Стыодента для числа наблюдений п<30; достоверными считали результаты при р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенных экспериментов показали, что среди ПС из красных водорослей высокомолекулярные сульфатированные к- и Х-каррагинаны и их смесь обладают наибольшей активностью в РА АПК и КПК, в отличие от несульфатирован-ных ПС - агара и агарозы, которые не влияли на комплемент-зависимый гемолиз в обеих реакциях. В точке 50% торможения гемолиза в РА АПК концентрации высокомолекулярных каррагинанов составили 16, 13 и 10 мг/мл для к-, А,- и Х-каррагинанов, соответственно, и были сравнимы с концентрацией зимозана - 15 мг/мл (табл.1). Низкомолекулярный Х-каррагинан не оказал выраженного влияния на РА АПК в концентрации 5 и 10 мг/мл, однако, в концентрации 20 мг/мл, остаточный гемолиз составил 31 ± 2,2 %. Концентрации, вызывающие 50%-ное снижение гемолиза в РА КПК для к, Е- и высокомолекулярной ^-фракций составили соответственно : 0,7; 0,4 и 0,3 мг/мл. Более активными в этой реакции оказались высокомолекулярная Х- и Х-фракции кар-рагинана, которые снижали гемолиз более, чем на 50% в концентрации 0,5 мг/мл. Остаточный гемолиз при этом составил 30,5 ± 3.0 и 44 ± 5,8 % соответствешю. Каппа-каррагинан в этой концентрации менее активным, вызывая гемолиз 76,4± 9,2%.

Таблица 1. Концентрации галактанов, необходимые для достижения 50% снижения гемолиза в РА АПК и РА КПК.

Вещество Концентрация (мг/мл)

РА АПК РА КПК

к-каррагинан 16± 1,2 0,7 ± 0,2

Х- каррагинан 10± 0,9 0,4 ±0,2

Х-каррагинан в/м 13 ±1,2 0,3 ± 0,2

^-каррагинан н/м 16 ±1,5 нет точки 50% гемолиза

агароза тип 1а нет точки 50% гемолиза нет точки 50% гемолиза

агар тип 1а нет точки 50% гемолиза нет точки 50% гемолиза

зимозан 15±1,3 нет точки 50% гемолиза

Полисахариды бурых водорослей влияют на активирование комплемента in vitro в зависимости от химического строения. Сульфатированные ПС - фукоиданы активно

снижают комплемент-зависимый гемолиз. Высокоочшценные ламинараны, транслам и альгинат натрия, напротив не влияли на активирование АПК и КПК.

Наибольшую активность в РА АПК проявил фукоидан II высокой степени очистки из бурой водоросли L. áchoriohles. В концентрации 20 мг/мл остаточный гемолиз составил 10 ± 0,4%. Зимозан в этой концентрации был в три раза менее активным, остаточный гемолиз составил 33,5% ± 2,9. Данный фукоидан снижал гемолиз и в меньших концентрациях; при 1 мг/мл гемолиз составил 33 ± 2,0%; при 0,5 мг/мл -66 ± 1%. Фукоидан I из этой же водоросли был почти также активен в концентрациях 20 и 10 мг/мл, остаточный гемолиз 15 ± 1,1 и 20 ± 1,6%, соответственно. При более низких концентрациях фукоидан I значительно уступал фукоидану II, но не зимозану. Образцы фукоиданов из F. evanescens были менее активны, чем из L. cichorioides и значимо влияли на течение РА АПК лишь в концентрациях 20 и 10 мг/мл. Фукоидан из бурой водоросли L japónica незначительно влиял на ход РА АПК в исследуемом диапазоне концентраций, уступая зимозану. Таким образом, среди фукоиданов наиболее мощно снижал комплемент-зависимый гемолиз в РА АПК фукоидан II из L. cichorioides.

При тестировании способности фукоиданов действовать на классический путь комплемента наиболее активным также оказался высокоочищенный фукоидан II из L cichorioides. В концентрациях от 20 до 1 мг/мл он практически одинаково мощно снижал комплемент-зависимый гемолиз, который в итоге составил 6,3 ± 2,4; 4,8 ± 4,0; 4,2 ± 0,2 и 6,7 ± 1,7% для концентраций ПС 20, 10, 5 и 1 мг/мл соответственно. Начиная с концентрации 1 мг/мл, эффект снюкения гемолиза был прямо пропорционален дозе, и остаточный гемолиз составлял 18,8 ± 4,1% при 0,5 мг/мл. Для достижения точки 50%-ного гемолиза необходимая концентрация составила 0,2 мг/мл, что демонстрирует высокую активность данного образца. По сравнению с активированием фу-коиданом II комплемента по АПК (для 1 и 0,5 мг/мл гемолиз был 33 ±2,0 и 66 ± 1%), в КПК зтот образец проявил значительно большую активность (6,7 ± 1,7 и 18,8 ± 4,1% соответственно). Фукоидан I из L cichorioides не действовал на КПК; процент гемолиза при 20 мг/мл составит 78 ±7,6%. Образцы из F. evanescens были не активны в концентрациях 10 мг/мл и ниже, и лишь в концентрации 20 мг/мл фукоидан I продемонстрировал остаточный гемолиз 41,7 ± 6,4%. Для достижения 50% гемолиза доза этого ПС составила 17 + 2,2 мг/мл. Фукоидан из L japónica был еще менее активным,

чем из Я еуапезсем. Этот образец действовал на КПК лишь в концентрациях более 20 мг/мл, демонстрируя гемолиз 50% и выше (табл.2).

Таблица 2. Концентрации полисахаридов бурых водорослей, необходимые для достижения 50% - ного гемолиза в реакциях активирования комплемента

Источник Полисахарид Доза (мг/мл) для достижения 50% гемолиза АПК Доза (мг/мл) для достижения 50% гемолиза КПК

Fucus evanescens Фукоидан I 9 ±0,3 17 ±2

Фукоидан II 9 ±2,4 нет

Laminaria japónica Фукоидан I 20 ±2,0 34 ±1,0

Laminaria cichorioides Фукоидан I 6 ±0,4 нет

Фукоидан II 0,7 ±0,1 0,2 ±0,1

Ламинаран I 17 ±0,4 14 ±1,0

Ламинаран П 95 ±5,4 нет

Ламинаран Ш нет нет

Транслам нет нет

Laminaria guryanovae Ламинаран I нет нет

Fucus evanescens ЛаминаранI нет нет

Saccharomyces cerevisiae Зимозан 15 ±2,1 нет

Ламинараны из L guryanovae и F. evanescens, а также высоко очищенный лами-наран III из водоросли L. cichorioides не влияли на гемолитическую активность комплемента по классическому и альтернативному пути. Однако менее очищенный ла-минаран II и, более выраженно, ламинаран I с примесью фукозы из L cichorioides, проявляли способность снижать гемолиз в РА АПК и КПК. Ламинаран I в РА АПК в концентрациях 20 и 10 мг/мл вызывал гемолиз 46 ± 2,17 и 60± 2,9%, а ламинаран II при 100 мг/мл - 50 ±3,0% гемолиз (табл.2). При активировании комплемента по классическому пути для ламинарана I показатели гемолиза составили при концентрациях 20 и 10 мг/мл соответственно 45 ±6,4 и 56 ± 4,8%. Ламинарану II в дозе 20 мг/мл соответствовал показатель гемолиза 66 ±4,32%, в остальных концентрациях гемолиз приближался к 100%.

Транслам не изменял гемолитическую активность комплемента в обеих реакциях. Таким образом, очищенные растворимые Р-1,3;1,6 - глюканы и их синтетические производные не влияли на реакции активирования комплемента.

Альпгаат натрия также не влиял на реакции активирования комплемента.

Образцы зостерина во всех исследуемых концентрациях не снижали гемолиз, демонстрируя остаточный гемолиз 99 ±4,4 и 98 ± 5,3 в АПК и 98 ±3,0 и 97 ± 2,0% в КПК в концентрации 100 мг/мл.

Нами протестированы поликатионные хитозаны с различной степенью К-ацетилирования и молекулярной массой и полианионные образцы, представленью 0-карбоксиметил и О-карбоксиэтил производными хитина и М-сукциноил хитозаном. Все положительно заряженные образцы: хитозаны 4% ЫАс 19% ЫАс 55% КЛс, а также высокомолекулярный и низкомолекулярный хитозаны, не сникали процент гемолиза в РА АПК. Среди анионных полисахаридов снижали гемолитическую активность комплемента О-карбоксиметнл и О-карбоксиэтил производные хитина. Показатели гемолиза для этих ПС в концентрациях 20 и 10 мг/мл составили 37 ± 2,1 и 48 ± 2,1% для хитин-0-СН2С00Н и 50 ± 4,1 и 82,1 ± 3,6% для хитин-0-СН2СН2С00Н соответственно (табл.3). В меньших концентрация указанные ПС не были активны. Не влиял на ход РА АПК М-сукциноил хитозан, процент гемолиза для которого составил 98,2 ± 6,5; 98,4 ± 3,5 и 100 ± 5% для концентраций 20, 10 и 5 мг/мл, соответственно.

Таблица 3. Остаточный гемолиз (%) в реакциях активирования комплемента

при действии хитинов и хитозанов.

Вещества КПК АПК

20 мг/мл 10мг/мл 20 мг/мл 10 мг/мл

Высокомолекулярн. хитозан 9,1±4,8 47,0+4,4 89,3±2,3 90,1±3,2

Хитозан 4% NAc 61,1±5,7 98,7+9,3 100,0+6,8 98,4±3,9

19% NAc 70,6±2,8 89,5±9,9 91,4±6,6 95,5±8,4

55% NAc 100,0+4,1 99,3±4,5 100,0±3,9 95,3+5,8

Низкомолекулярн. хитозан 93,1±7,2 94,3±9,0 100,0±2,8 98,6±5,3

N-сукциноил хитозан 93,0+3,8 94,0±3,1 98,2±6,5 98,4±3,5

Хитин-0-СН2С00Н 57,3±5,5 60,0+6,4 37,0±2,1 48,0+2,1

Ximni-0-CH2CH3C00H 67,9±8,8 92,2±8,9 50,0+4,1 82,1+3,6

В РА КПК, в отличие от реакции акпгоирования АПК, высокомолекулярный хитозан в концентрациях 20 и 10 мг/мл демонстрировал снижение комплемент-зависимого гемолиза, который в итоге составил 9,1 ± 4,8 и 47,0 ± 4,4%. Небольшую

активность показал хитозан 4% ЫАс в концентрации 20 мг/мл, гемолиз 61,1 ± 5,7% (табл.3).

Среди анионных ПС О-карбоксиметил- и О-карбоксиэтил-производные хитина, в концентрации 20 мг/мл снижали гемолиз до показателей 57,3 ± 5,5 и 67,9 ± 8,8% соответственно. В концентрации 10 мг/мл активным оставался только 0-карбоксиметил-хитин, демонстрируя остаточный гемолиз 60 ± 6,4%. Образец М-сукциноил хитозана не влиял на РА КПК.

При сравнении результатов обеих реакций, можно отметить, что характер действия тестируемых ПС, исключая высокомолекулярный хитозан, примерно одинаков и в АПК, и КПК.

Нейтральный высокомолекулярный полисахарид-белковый комплекс митилан, углеводная часть которого представлена гликогеноподобным высоко разветвленным а1,4;1,6-В-глюканом, не изменял комплемент-зависимый гемолиз в обеих реакциях.

Гепарин, препарат полисахаридного строения, снижал комплемент-зависисмый гемолиз в обеих реакциях. Однако, в отличие от большинства тестированных отрицательно заряженных полисахаридов, он в два раза активнее влиял на альтернативный путь комплемента, чем на классический. Концентрация гепарина, необходимая для достижения 50% гемолиза, составила 2 мг/мл для КПК и 1 мг/мл для АПК. Для зимо-зана в АПК она была значительно выше - 15 мг/мл.

Нами были тестированы лекарственные препараты различных групп на способность снижать комплемент-зависимый гемолиз.

Исследованные глкжокортикоиды (преднизолон и дексаметазон) и гестагеста-ген депо-провера не изменяли гемолитическую активность комплемента в обеих реакциях.

Эстрадурин, напротив, при концентрации 2x10"2 М оказал значительное - до 90% торможение АПК-зависимого гемолиза (остаточный гемолиз 11±0,4%) и был активнее, чем стандартный активатор АПК - зимозан (остаточный гемолиз для 10% концентрации зимозана 22 ± 3,5%). Фосфэстрол обнаружил значимое действие на РА АПК в концентрации 1x10"' М (остаточный гемолиз 45 ± 1,0%). В концентрации 1,5х10"2 М фосфэстрол незначительно снижал гемолиз до показателей 73,2 ± 1,0%, что сравнимо с зимозаном - 80 ± 2,0%.

В РА КПК проявили выраженную активность фосфэстрол и эстрадурин, остаточный гемолиз для них в концентрации 1 х 102 М составил 35,9 ± 6,1% и 54,1 ± 5,1% соответственно (табл.4).

Эстрогенные препараты активно действовали в КПК, но для выявления их влияния на АПК, требовались дозы на порядок выше. Эстрадурин в разведении 1х10'2 М уже не влиял достоверно на АПК, демонстрируя остаточный гемолиз 79 ± 4,0%, но снижал гемолиз в РА КПК до показателя 54 ±5,1%.

Циклофосфан, метотрексат, 5-фторурацил, винкристин и интерферон, не влияли на комплемент-зависимый гемолиз в реакциях активирования комплемента по классическому и альтернативному пути, демонстрируя показатели гемолитической активности, близкие к 100% во всех исследуемых концентрациях.

Таблица 4. Влияние гормональных лекарственных препаратов

на активирование комплемента по классическому и альтернативному пути.

Препарат Концентрация РА КПК РА АПК

гемолиза (%) гемолиза (%)

Фосфэстрол 2x10"2 М 19,4 ±3,5 99 ±0,4

1x10" М 35,9 ±6,1 97 ± 0,9

ЫО-'М 86,9 ± 7,3 97 ± 0,4

Эстрадурин 2x10" М 11,7 ±3,3 И ±0,4

Ь10':М 54,1+5,1 79 ±4,0

1x10"'М 83,6 ±10,5 94 ± 2,0

Преднизолон 2х10"-М 96,3 ±4,3 93 ± 6,4

1х10"2М 98,1 ±4,5 91 ±4,6

1x10 "' М 90,5 ± 9,4 90 ±4,0

Дексаметазон 2x10"2 М 98,2 ±5,4 95 ±4,4

1х10"2М 96,5 ±5,6 98 ± 5,2

ыо-'м 97 ±5,1 96 ±6,3

Депо-провера 2x10"" М 90,3 ± 8,3 95 ± 3,6

1x10" М 98,1 ±9,5 95 ± 3,5

МО-'М 97,6 ± 10,4 91 ±3,7

Зимозан 10% р-р 96,3 ± 8,4 22 ±3,5

2% р-р 92,1 ±6,0 33 ±2,8

1% р-р 94,4 ± 5,5 65 ±3,4

В проведенных нами исследованиях возможны два механизма влияния химических веществ на комплемент: 1. Активация и потребление (прямая активация, путем

запуска КПК или АПК либо опосредованная, за счет влияния на ингибиторы. 2. Инактивация отдельных компонентов комплемента.

Снижение гемолиза в реакциях активирования in vitro, являющееся результатом влияния исследуемых веществ на комплемент и регистрируемое в данных реакциях, следует рассматривать именно как торможение реакций активирования АПК или КГ1К in vitro, но не как ингибирование системы комплемента. При инкубировании тестируемого вещества с источником комплемента на первом этапе РА, то есть в опыте, возможны два пути воздействия вещества на комплемент и, следовательно, два различных механизма дальнейшего течения реакции активирования комплемента.

Первый путь осуществляется, если исследуемое вещество является активатором системы комплемента. Последовательный каскад ферментативных реакций приводит к образованию комплекса С5ЬС6С7, который должен необратимо связаться с мембраной для дальнейшей сборки мембраноатакующего комплекса. In vitro для этого служат мембраны эритроцитов, которые привносятся в систему лишь через час после инкубирования тестируемого вещества с комплементом. При этом ферментативные реакции протекают значительно быстрее, а образовавшийся комплекс С5ЬС6С7, не будучи прикрепленным к клеточной поверхности, теряет гемолитическую активность и агрегирует (Таран, 1993). Следовательно, вначале активированный, но потерявший гемолитическую активность из-за отсутствия мишени на первом этапе реакции, агрегированный комплемент уже не вызывает гемолиза сенсибилизированных эритроцитов, добавляемых на втором этапе реакции активирования КПК. Чем больше активировался комплемент, тем больше он израсходовался и тем меньший процент гемолиза наблюдается в эксперименте.

Второй путь реализуется, если исследуемое вещество ингибирует или связывает компоненты комплемента и регуляторные белки. Инактивированный комплемент не может участвовать в реакции иммунного лизиса, процент гемолиза в итоге снижается.

Следовательно, причиной регистрируемого снижения комплемент-зависисмого гемолиза в экспериментах может явиться и активирование и ингибирование системы комплемента веществом. Доказательством этому служат следующие факты. По данным большинства литературных источников зимозан является классическим активатором АПК (Lew et al.,1986; Вавилова, Голосова, 1990; Adachi et al., 1990). Катрин Блондин с соавторами (Blondín et al., 1994), исследуя радиоиммунным методом компоненты, субкомпоненты и продукты активирования комплемента после воздействия

фуканов, заключают, что фукоиданы ингибируют и классический, и альтернативный пути активирования комплемента. В проводимых же нами тестах и зимозан (в РА АПК), и фукоиданы (в обеих реакциях), тормозили реакции активирования комплемента.

Таим образом, оцешгеая результаты предлагаемых реакций, можно с уверенностью сделать заключение о способности данного вещества влиять (если это вещество тормозит РА) или о его неспособности влиять (если торможения гемолиза не наблюдается) на систему комплемента. Учитывая процент снижения гемолиза, можно делать выводы об интенсивности влияния данного препарата на комплемент и сравнивать препараты по силе воздействия. Используемые реакции позволяют с достоверностью исследовать и отбирать концентрации веществ, способные влиять на комплемент. Однако по результатам, полученным в реакциях активирования АПК и КПК, невозможно судить о векторе влияния тестируемых веществ на комплемент. Для выяснения того факта, имеет ли место активирование или ингибирование системы комплемента, необходимы дополнительные исследоваши отдельных компонентов, субкомпонентов и продуктов активирования комплемента. Экономичные и простые методы активирования комплемента по классическому и альтернативному пути предпочтительны для проведения скрининговых исследований и отбора перспективных препаратов, способных влиять на систему комплемента, с целью 1« дальнейшего, более глубокого изучения.

Результаты, полученные в реакциях активирования КПК и АПК, позволяют проанализировать связь химического строения вещества с их способностью влиять или не влиять на оба пути активирования комплемента.

Роль сульфатных групп. Наиболее выраженную активность в обеих реакциях проявили сульфатированные ПС: высокомолекулярные Х- и к-каррагинаны и фукоиданы, которые вызывали достоверную задержку гемолиза более чем на 50% в РА АПК в концентрациях от 20 до 10 мг/мл для каррагинанов и от 20 до 1 мг/мл для фу-коиданов, а при активировании по классическому пути - до концентрации 0,5 мг/мл и ниже для обоих полисахаридов. Сульфатированный ПС гепарин тормозил гемолиз в обеих реакциях, но в два раза активнее в альтернативном пути, чем в классическом. Гепарин был менее активным в снижении КПК - зависимого гемолиза, чем карраги-наны и фукоиданы, но более активен в АПК, чем каррагинаны и менее активен, чем фукоиданы.

Среди сульфатированных галактанов в обеих реакциях активны только каррагинаны, причем активность ^-каррагинана выше, чем к-каррагинана. Это, по-видимому, связано с содержанием сульфатных групп в их молекулах. Так в к-каррапшане присутствует одна сульфогруппа в 4-м положении (З-О-галактозы, а в X-каррагинане две-три сульфогруппы во 2-м и 6-м положениях а-Б-галактозы и во 2-м положении Р-Б-галактозы. Оба каррапшана проявляли высокую активность в реакциях активирования комплемента, то есть наличие по крайней мере одной сульфогруппы на дисахарид в молекуле галактана является необходимым условием для влияния галактанов на комплемент-зависимый гемолиз. При этом положение суль-фогрупп не является значимым, а увеличение степени сульфатирования повышает активность ПС.

Агар и агароза не проявили активности в обеих реакциях, что также, по-видимому, связано с низким процентом сульфатирования этих ПС. Содержание сульфата в агаре и агарозе не превышает 0,4%, в то время как каррагинаны высоко суль-фатированы (примерно на 20%). С другой стороны, можно предположить, что отсутствие активности агара и агарозы вызвано наличием в их молекулах Ь-галактозы. Из-, вестно, что в группе агара и агарозы 4-0-замещенный остаток галактозы принадлежит к Ь-ряду, в группе каррагинана - к Э-ряду (Усов, 1985).

Присутствие сульфогрупп является определяющим и для фукоиданов. В реакциях активирования комплемента наиболее мощное действие демонстрировал фукои-дан II из Ь. сккогшЫех с 38% содержанием сульфогрупп. Возможно, именно в связи с большей степенью сульфатирования по сравнению с каррагинанами, максимальный процент сульфогрупп у которых отмечен в суммарной фракции (28%), фукоидан II из и ск1юпои1е5, более интенсивно, чем каррагинаны, снижал гемолиз.

Высокое содержание сульфатных групп является необходимым, но не достаточным условием для способности фукоиданов влиять на реакции активирования комплемента. Фукоидан I из Ь. аскогкпйеь с содержанием сульфатов 36%, практически равным их содержанию в фукоидане II, значительно менее интенсивно тормозил обе реакции активирования комплемента. Однако эти два образца отличаются по мо-носахаридному составу: фукоидан II на 100% состоит из фукозных остатков, а фукоидан I лишь на 74% и содержит, кроме того, остатки галактозы (11%), глюкозы (9%), рамнозы (5%) и ксилозы (1%). Следовательно, моносахаридный состав полисахарида также играет роль в его способности влиять на комплемент-зависимый гемолиз.

Моносахариднын состав имеет сушествеииое значение для влияния ПС на комплемент. Наиболее активными полисахаридами, влияющими на оба пути активирования комплемента, являются фукоиданы, каррагинаны и гепарин. Все они имеют сходство не только по наличию сульфогрупп, но и в том, что являются биополимерами, имеющими пиранозную структуру, хотя и различаются по моносахаридному составу. Фукоидан состоит из фукозы, каррагинан из галактозы и гепарин - гетерополи-сахарид из глюкуроновой кислоты и глюкозамина). Для всех трех перечисленных ПС общим также является наличие 1-»3 связей между моносахаридами.

Фукоидан в основной цепи состоит из полимерной а-1-З-связанной фукозы с а-фукозными остатками в ответвлениях, по одному на каждые 2-3 фукозных остатка основной цепи, и с сульфатными группами при С4 позициях остатка фукозы (Ра1апакаг е1 а1., 1993). По данным других авторов (В1опсНп, 1994), фукоиданы выделенные из разных источников могут отличаться расположением сульфатных групп (сульфатированы по С2 или по С4) и, возможно, даже типом гликозидной связи (либо 1->3, либо 1—>2 связи). Фукоиданы иногда содержат галактозу, ксилозу и уроновые кислоты.

Повторяющимся дисахаридом в молекуле линейного ПС каррагинана является каррабиоза, при этом остатки О-галактозы также соединены регулярно чередующимися (31 ->4- и а!->3- связями. Например, молекула к-каррагинана состоит из повторяющейся каррабиозы: —>3-0-галактозил-Р 1-)4-3,б-ангидро-0-галактозил-а1-> (Кочетков и др., 1967; Усов, 1985). В молекуле Х-каррапшана ангидросахар замещен на Б-галактозу.

Полисахарид гепарин, относящийся к семейству гликозаминогиканов, состоит из остатков глюкуроновой кислоты и глюкозамина, этерифицированного серной кислотой, соединенных регулярно чередующимися 1-»4- и 1—>3- связями. Сходство химического строения каррагинанов и фукоиданов с гепарином, проявляющееся в сульфатировании, в стереохимических конфигурациях, анионных замещениях, типах гликозидных связей и пиранозном строении моносахаридов обусловливает сходство их биологической активности, в частности, достаточно интенсивное снижение комплемент-зависимого гемолиза этими ПС в РА АПК и КПК. Однако в действии этих веществ были отмечены некоторые различия. Каррагинаны и фукоиданы более интенсивно задерживали гемолиз в РА КПК, чем в АПК. Гепарин, наоборот, был в

два раза активней в РА АПК, чем КПК. По-видимому, механизм влияния гепарина на комплемент отличается от такового у каррагинанов и фукоиданов.

Альшнаты, состоящие из остатков Р-Б-маннуроновой и а-Ь-гулуроновой кислот; а также ламинараны, представляющие собой полимер из остатков Б-глюкозы, соединенных между собой р-1—>3, и реже р-1—>6 связями, как и Р-глюкан - транслам, не влияли на активирование комплемента в обеих реакциях, в отличие от водонерас-творимого Р-глюкана - зимозана, снижающего гемолиз в реакции активирования альтернативного пути комплемента.

Роль молекулярной массы. Согласно литературным данным (АёасЫ е1 а1.,1990), например для глюканов, необходимым условием активирования АПК является высокая (>250000) молекулярная масса. Аналогичную зависимость мы наблюдали для сульфатированных галактанов и производных хитинов и хитозанов.

Каррагинаны к-, Х- и высокомолекулярная Х- фракция (молекулярная масса >500 кБа) активно влияли на ход гемолиза, вызывая достоверную задержку последнего в обеих реакциях активирования комплемента более чем на 50% в концентрациях от 20 до 10 мг/мл. Высокомолекулярный Х-каррагинан в РА АПК обладал активностью более значительной, чем стандартный активатор АПК зимозан, а в РА КПК он снижал гемолиз в концентрациях, на порядок меньших, чем в АПК. Следует отметить, что низкомолекулярный Х-каррагинан (молекулярная масса 25-35 кОа) не обладал активностью в реакции активирования КПК, но в реакции активирования АПК в дозе 20 мг/мл тормозил комплемент-зависимый гемолиз. Эта активность низкомолекулярного ПС при данной концентрации может быть связана с образованием за счет межмолекулярных взаимодействий в присутствии двухвалентных катионов высокомолекулярных ассоциатов, способных запускать каскад комплемента (Усов и др., 1985).

Высокомолекулярные О-карбоксиметил- и О-карбоксиэтил- производные хитина (молекулярная масса 200 Ша) тормозили обе реакции активирования комплемента, а высокомолекулярный хитозан (200 кЭа) - только КПК. Низкомолекулярный хитозан (10 Ша) не действовал на гемолитическую активность в обеих реакциях. Однако высокомолекулярный К- сукциноил хитозан (молекулярная масса 200 кБа) не влиял на показатели остаточного гемолиза.

Фукоидан II из Ь. ас1юпои1ез, наиболее интенсивно снижающий гемолиз в РА АПК и КПК, имел невысокую молекулярную массу, порядка 20 - 30 Ша, сравнимую с молекулярной массой низкомолекулярного Л- каррагинана.

Гепарин, имеющий молекулярную массу 15-17кБа, интенсивно снижал комплемент-зависимый гемолиз в обеих реакциях.

Следовательно, большая молекулярная масса не всегда является основным фактором для проявления активности полисахаридов в отношении комплемента. Для влияшгя на комплемент глюканов, каррагинанов, хитинов и хитозанов высокая молекулярная масса является необходимым условием.

Способность формировать гидроколлоиды. Производные хитина и карраги-наны, проявившие активность в РА комплемента, обладают гель-формирующим свойством. Можно предположить, что это влияет на их активность в данной реакции. Но зостерш!, пектины, агар, также обладают свойством формировать гели и золи, имеют отрицательный заряд и, тем не менее, не влияют на течение данных реакций. Фукоидан II из Ь. ас1югюШе.ч, показавший мощное снижение гемолиза, напротив, не является гель-формирующим полисахаридом.

Анализ влияния заряда полисахарида на способность снижать комплемент-зависимый гемолиз показал, что наиболее выраженную активность в обеих реакциях -проявили полианионные высоко сульфатированные полисахариды: каррагинаны и фуковданы. Все действовавшие анионные ПС снижали гемолиз в дозозависимой манере. Карбоксиалкилированные производные хитина также проявили активность в обоих тестах. Карбоксиметилированный хитин сильнее тормозил АПК-зависимый гемолиз по сравнению с его карбоксиэтильным производным. В то же время И-сукциноил хитозан оказался неактивным в реакциях активирования АПК и КПК. Очевидно, конформация молекулы первых двух соединений отличается от последнего. Однако, не все полисахариды, имеющие отрицательный заряд, проявили активность в РА АПК, также как и в РА КПК. Большая часть анионных полисахаридов (зостерин, альгинат натрия, Л- сукциноил хитозан) оказалась неактивной. Следовательно не только заряд полисахарида является причиной его активности. В реакции активирования АПК ни один из представленных поликатионных и нейтральных образцов не влиял значимо на течение данной реакции. Однако положительно заряженный высокомолекулярный хитозан проявил активность при активировании классического пути, причём при повышении степени Ы-ацетилирования активность хитозана

снижалась. По-видимому, роль заряда молекулы ПС менее важна, чем конформация молекулы полисахаридов для образования специфического комплекса с С1 и СЗ компонентами комплемента с последующим распадом на активные компоненты и включением каскада комплемента.

Представители нейтральных полисахаридов а-глюкан митилан и разветвленный полусинтетический Р-глюкан транслам, оказались не способными влиять на АПК и КПК. Возможно, что в растворимой форме эти глюканы не могут связываться с компонентами комплемента, в отличие от водонерастворимого Р-глюкана - зимозана -стандартного активатора АПК.

Особый интерес для анализа механизмов торможения реакций активирования комплемента вызывают эстрогенные препараты фосфэстрол и эстрадурин. Они не являются ПС, имеют низкую молекулярную массу, не сульфатированы и не обладают гель-формируюшими свойствами (фосфэстрол растворим, эстрадурин нет, применяется в виде суспензии) и по заряду нейтральны. Фосфэстрол не является стероидным соединением, эстрадурин, напротив, является производным стерина. Не смотря на различное строение, фосфэстрол и эстрадурин мощно снижали комплемент-зависимый гемолиз в обеих реакциях. Сходством в химическом строении этих препа-" ратов является лишь то, что оба вещества содержат остатки фосфорной кислоты. Остальные стероидные препараты, такие как преднизолон и дексаметазон, а также депо- -провера, не показали активности в обеих тест-системах. Эстрадурин, в основе которого лежит молекула стерина, отличается от глюкокортикоидов только строением радикалов. Кроме того, он как и полисахариды, является полимеризованным препаратом, что также, видимо, имеет значение для влияния на комплемент. По-видимому, уникальная конформация различных по природе полисахаридов и веществ, не являющихся полисахаридами, позволяет им взаимодействовать с соответствующими компонентами комплемента, активируя их и запуская каскад реакций, что дает возможность направленного регулирования реактивности иммунной системы.

Таким образом, нами определены некоторые закономерности в строении и физико-химических свойствах для веществ различных химических групп, определяющие их способность влиять на комплемент-зависимый гемолиз. Прослеживаются устойчивые связи между структурой и способностью влиять на реакции активирования комплемента внутри каждой из исследуемых групп.

выводы

1. Сульфатированные фукогликаны - фукоиданы из бурых водорослей и суль-фатированные галактаны - каррагинаны из красных водорослей интенсивно снижают комплемент-зависимый гемолиз в реакциях активирования комплемента по классическому и альтернативному пути. Активность сульфатированных полисахаридов прямо пропорциональна степени сульфатирования их молекулы. Положение сульфогрупп в молекуле не является значимым.

2. В реакциях активирования комплемента по классическому и альтернативному пути среди водорослевых полисахаридов только анионные образцы (каррагинаны и фукоиданы) были способны тормозить обе реакции активирования комплемента. Нейтральные образцы (транслам, ламинаран) не влияли на активирование комплемента.

3. Среди полисахаридов и полисахарид-содержащих биополимеров не водорослевого происхождения: хитинов, хитозанов, митилана и гепарина, в реакции активирования альтернативного пути комплемента ни один из представленных поликатион-ных (хитозаны различной степени N-ацетилирования) и нейтральных (митилан) об- разцов не влиял комплемент-зависимый гемолиз. Активны только отрицательно заряженные полисахариды (карбоксилированные производные хитина, гепарин). В реакции активирования комплемента по классическому пути также снижали гемолиз только анионные полисахариды, за исключением положительно заряженного высокомолекулярного хитозана, задерживавшего гемолиз в данной реакции.

4. Высокомолекулярные каррагинаны, производные хитинов и хитозаны оказывают более выраженное влияние на комплемент-зависимый гемолиз, чем низкомолекулярные.

5. Фукоиданы с высоким содержанием фукозы более интенсивно влияют на реакции активирования комплемента по классическому и альтернативному пути, чем фукоиданы с низким содержанием фукозы.

6. Эстрогенные гормональные препараты фосфэстрол и эстрадурин интенсивно влияют на альтернативный и классический пути активирования комплемента, снижая комплемент-зависимый гемолиз. Глюкокортикоиды преднизолон и дексаметазон, гес-таген депо-провера не влияют на реакции активирования комплемента in vitro.

7. Альгинат натрия, транслам, зостерин и митилан не влияют на реакции активирования комплемента по классическому и альтернативному пути. Следовательно,

известное из литературы их стимулирующее действие на макрофаги осуществляется без стадии опсонизации компонентами комплемента.

8. Каррагинаны и фукоиданы, наиболее интенсивно тормозящие реакции активирования комплемента in vitro, предлагаются для дальнейшего изучения с целью создания из них лекарственных препаратов, влияющих на систему комплемента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

¡.Назарова И.В., Шевченко Н.М. Влияние биополимеров из морских гидробио-нтов на активацию комплемента по альтернативному пути // В сб: Здоровье населения Дальнего Востока. Владивосток: Изд-во «Уссури», - 1996. - С.244-245.

2. Ковалев Б.М., Назарова И.В., Хотимченко Ю.С. Методика определения in vitro степени активирования комплемента по классическому пути // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - №1. - С. 34-37. *

3 Назарова И.В., Шевченко Н.М., Ковалев Б.М., Хотимченко Ю.С. Иммуномо-дулирующие свойства полисахаридов из красных водорослей: влияние на систему комплемента // Биология моря. - 1998. - Т. 24. - №1. - С.49-52.

4. Назарова И.В., Хотимченко Ю.С., Шевченко Н.М. Влияние сульфатирован-ных галактанов из красных водорослей, используемых как пищевые добавки, на акта- _ вирование альтернативного пути комплемента // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тез. докл. М.: Фармединфо, - 1998. - С.387-388.

5. Назарова И.В., Шевченко Н.М. Действие полисахаридов бурых водорослей на активирование комплемента по альтернативному пути // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тез. докл. М.: Фармединфо, - 1998. - С.388.

6. Назарова И.В., Ковалев Б.М., Хотимченко Ю.С. Влияние некоторых лекарственных препаратов, применяемых в онкологической практике, на систему комплемента // III Дальневосточный международный симпозиум "Актуальные проблемы в онкологии". Тез. докл. Владивосток: Дальнаука, - 1998. - С. 195.