Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Молекулярно-генетический мониторинг минимальной остаточной болезни после алло-ТГСК у больных множественной миеломой

На правах рукописи УДК: 616 - 006.448 - 089.843 - 036.66] - 07

ЗАГРИВНАЯ Мария Викторовна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ ПОСЛЕ АЛЛО-ТГСК У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

- 2 ЛЕК 2010

004615617

Работа выполнена на кафедре Гематологии, трансфузиологии и трансплантологии ГОУ ВПО СПбГМУ имени академика И.П.Павлова Росздрава, в Институте детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой ГОУ ВПО СПбГМУ им. академика И.П. Павлова Росздрава, в Центре трансплантации костного мозга Университетской клиники Эппендорф, г. Гамбург (Германия) и в Отделении трансплантации костного мозга, Istituto Nazionale Tumori, г. Милан (Италия).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Афанасьев

Борис Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Капустин Сергей Игоревич

доктор медицинских наук, профессор

Климко

Николай Николаевич

Ведущая организация: Государственное учреждение Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится «_»_2010 г. в_часов,

на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при ФГУ «Российский НИИ Гематологии и Трансфузиологии» Федерального медико - биологического агентства (193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-ая Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский НИИ Гематологии и Трансфузиологии» Федерального медико - биологического агентства

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Т.В.Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Множественная миелома (ММ) - злокачественное новообразование из плазматических клеток, которые являются конечным продуктом дифференцировки B-клеток и в норме обычно продуцируют антитела (Абдулкадыров 2004). В странах Запада ММ - причина приблизительно 1% всех смертей, связанных с онкологией (Bataille et al., 1994).

Существенную роль в терапии ММ играет аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Ряд исследований показал, что пациенты, достигшие полной клинической ремиссии (ПР) после алло-ТГСК, характеризуются длительной выживаемостью (Martinez-Lopez et al. 2007). При применении алло-ТГСК после стандартной миелоаблативной подготовки и после подготовки по щадящим схемам достигается высокий уровень ПР, варьирующий в пределах 27% - 81% (Bensinger et al., 1996; Gahrton et al. 2001; Garban et al. 2006; Kröger et al. 2002; Kröger et al. 2003; Maloney et al. 2003; Bruno et al 2007). Около 50% пациентов с ПР после стандартной миелоаблативной алло-ТГСК достигают молекулярной ремиссии (MP) (Corradini at al. 1999; Martineiii et al. 2000), которая ассоциирована с очень низким риском рецидива (Corradini et al. 2003). Таким образом, для улучшения результатов алло-ТГСК требуется достижение ПР и, в особенности, MP. Одним из способов достижения ПР является проведение посттрансплантационной терапии. Самой распространенной адоптивной терапией после алло-ТГСК является инфузия донорских лимфоцитов (ИДЛ) (Kroger et al., 2009).

Для определения статуса MP и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) с количественной (в режиме "реального времени") и качественной оценкой опухоль-специфичной последовательности ДНК или РНК. Самым чувствительным, на сегодняшний день, является качественный ПЦР анализ. Именно с его появлением, наряду с термином «клиническая ремиссия» появилось понятие «молекулярная ремиссия» (Rasmussen et al., 2004; Corradini et. al., 1999; Corradini et al., 1997). Наиболее универсальной мишенью для молекулярной диагностики МОБ у больных ММ служит VDJ перестройка гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) (Lokhorst et al., 2002). Неповторимый для каждого пациента характер перестройки гена IgH определяет необходимость разработки эффективной методики подбора индивидуальных тест-систем.

3

Разработка методики важна и для стандартизации процедуры молекулярного мониторинга МОБ у больных ММ, что необходимо для сопоставления результатов терапии, полученных в различных клиниках. Следует отметить, что при проведении молекулярного мониторинга МОБ у больных ММ после алло-ТГСК не учитываются особенности аллогенной трансплантации и инфузий донорских лимфоцитов, которые могут повлиять на эффективность молекулярного мониторинга.

Важной проблемой при организации молекулярного мониторинга у больных ММ после алло-ТГСК служит отсутствие диагностических образцов костного мозга (КМ). Как правило, аллогенные трансплантации проводятся в специализированных центрах, куда пациенты поступают после определенной терапии, приводящей к снижению опухолевой массы в КМ. В лучшем случае, для этих пациентов имеются образцы в виде цитологических препаратов КМ, полученных до начала терапии. Это не позволяет использовать для разработки тест-систем методики, основанные на обратно-транскриптазной ПЦР, материалом для которой служит тотальная РНК (Жеребцова, 2008).

Все это и обусловило актуальность данного исследования.

Цель исследования

Разработать и апробировать в клинических условиях методики молекулярно-генетического мониторинга минимальной остаточной болезни после алло-ТГСК у больных множественной миеломой.

Задачи исследования

1. Разработать алгоритм подбора индивидуальных опухоль-специфичных тест-систем на основе клональной УО.Г-перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина (^Н) для мониторинга МОБ у больных ММ.

2. Апробировать в клинических условиях и сравнить эффективность различных методик молекулярно-генетического мониторинга МОБ ММ, основанных на анализе опухоль-специфичной УБ.1-перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина (количественный ПЦР-анализ в режиме "реального времени" и качественный ПЦР-анализ).

3. Выявить особенности использования разработанных тест-систем при молекулярной диагностике МОБ у больных ММ после проведения алло-ТГСК и инфузий донорских лимфоцитов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. VDJ-перестройка гена IgH является стабильным маркером МОБ после проведения алло-ТГСК у больных ММ. Комплексирование качественного и количественного методов молекулярного анализа данного маркера обеспечивает надежный контроль эффективности терапии больных ММ при проведении алло-ТГСК и позволяет оперативно принимать терапевтические меры при превышении уровня молекулярной ремиссии.

2. Молекулярная диагностика клональной VDJ-перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина обладает более высокой, по сравнению со стандартными методами анализа, чувствительностью при выявлении опухолевых клеток при ММ. Обогащение исследуемого материала при помощи селекции CD138+ клеток на аппарате MACS позволяет повысить чувствительность используемых тест-систем при молекулярной диагностике МОБ у больных ММ.

3. В случае применения алло-ТГСК и ИДЛ диагностика МОБ путем детекции опухоль-специфичной перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина должна проводиться не ранее окончания периода регенерации КМ.

Научная новизна

Впервые разработан снижающий трудоемкость анализа алгоритм индивидуального подбора опухоль-специфичных тест-систем для молекулярного мониторинга МОБ ММ. Достоинством алгоритма является четко структурированная последовательность операций, условия выполнения которых оптимизированы с целью повышения чувствительности и специфичности анализа. Данный алгоритм, основанный на анализе ДНК, позволяет с минимальными затратами времени и материалов подобрать индивидуальную опухоль-специфичную тест-систему с использованием не только свежего диагностического материала, но и архивного, что имеет высокую практическую значимость.

Впервые для подбора специфичных тест-систем при мониторинге МОБ ММ обоснована необходимость сравнения нуклеотидной последовательности клональной опухолевой перестройки гена IgH с рекомбинированными генами IgH.

Показано, что специфичность тест-систем для качественного анализа («nested» ПЦР), подобранных до начала алло-ТГСК, при мониторинге МОБ ММ сохраняется в течение не менее чем 4,5 лет.

Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг МОБ у пациентов, получивших терапию с применением ауто-алло тандемного подхода, адоптивной терапии малыми дозами талидомида и ИДЛ. Аллогенная ТГСК проводилась со сниженной интенсивностью кондиционирования: флударабин (150 мг/м2), мелфалан (140 мг/м2), и анти-тимоцитарный глобулин (ATG: 3 х 1020 мг/кг) три месяца спустя после циторедуктивной ауто-ТГСК (мелфалан 200 мг/м2).

Практическая значимость

Внедрение результатов исследования в клиническую практику позволит повысить эффективность диагностики МОБ у больных ММ, что способствует своевременному принятию терапевтических мер по снижению риска рецидива заболевания.

Разработанный алгоритм может быть использован для сравнения режимов кондиционирования, для оценки эффективности иммуномодулирующей терапии, например, инфузий донорских лимфоцитов.

Апробация материалов диссертации

Результаты исследования представлены на 30, 31 и 32 Ежегодных симпозиумах ЕВМТ (г. Барселона, Испания, 2004; г. Прага, Чехия, 2005; г. Гамбург, Германия 2006), на XVI съезде Wilsede «Modern Trends in Human Leukemias XVI», 2005 г. (г. Гамбург, Германия), конференции «Биотехнология и Онкология», 2005 г. (Санкт-Петербург), на 46-ой и 47-ой ежегодных конференциях Американского гематологического общества (The American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition), 2004 г., 2005 г.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты настоящего исследования используются в Институте детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой ГОУ ВПО СПбГМУ им. академика И.П. Павлова (г. Санкт-Петербург) и в Центре трансплантации костного мозга Университетской клиники Эппендорф, г. Гамбург (Германия) для

мониторига МОБ у больных ММ, а также в качестве эталона при разработке других методов анализа (Lioznov et al., 2008; Kröger et al., 2009).

Установленные в работе факты могут быть использованы в лекционных курсах ВУЗов медицинского и биологического профиля, а также в соответствующих учебниках, методических пособиях и руководствах.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них - 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации:

Материалы диссертации изложены в одной книге на 137 страницах текста, содержат 21 таблицу и 19 рисунков. Список использованных источников включает в себя 10 работ отечественных и 126 работ зарубежных авторов. Диссертация состоит из: - 4 частей, в которых изложены результаты собственных исследований; - заключения, включающего и практические рекомендации; - выводов; - списка использованных источников.

Личный вклад автора

Разработка дизайна всех исследований, первичная обработка части клинического материала, все этапы молекулярного мониторинга, разработка методик, обобщение полученных результатов проведены автором самостоятельно. Изложение всех разделов диссертации, оформление работы выполнены соискателем.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных больных. Объектом исследования послужила группа из 45 больных ММ, получавших лечение в Центре трансплантации костного мозга Университетской клиники Гамбург-Эппендорф (г. Гамбург, Германия). Все больные получали терапию с применением ауто-алло тандемного подхода и с использованием адоптивной терапии малыми

дозами талидомида и ИДЛ. Аллогенная ТГСК проводилась со сниженной интенсивностью кондиционирования: флударабин (150 мг/м2), мелфалан (140 мг/м2), и анти-тимоцитарный глобулин (ATG: 3*10-20 мг/кг) три месяца спустя после циторедуктивной ауто-ТГСК (мелфалан 200 мг/м2). Для 8-ми пациентов были доступны цитологические препараты.

Использованные методы идентификации VDJ последовательности иммуноглобулинового гена. Амплификация выполнялась с использованием 500 нг ДНК в соответствии с методикой, изложенной ранее (Deane et al., 1991; Voena et al., 1997). Для идентификации последовательности VDJ иммуноглобулинового гена проводился ПЦР анализ с четырьмя наборами VH семейств-специфичных прямых праймеров и одним обратным праймером JH. Фрагменты ожидаемой длины вырезали из геля и выделяли из них ДНК с использованием набора "DNA gel extraction kit" (QIAGEN, Германия). Выделенную таким образом ДНК секвенировали на аппарате ABI PRISM Model 377 фирмы Applied Biosystems, США. Полученные моноклональные VDJ последовательности с четким CDR3 участком сравнивались с опубликованными функциональными V, D и J- сегментами в генетических базах данных IMGT (http://imgt.cines.fr/) и BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). ДНК, выделенная из поликлональных последовательностей, замораживалась при температуре -20°С. Затем выполнялась процедура клонирования для выделения моноклональной последовательности IgH гена опухолевого клона из набора поликлональных иммуноглобулиновых последовательностей нормальных В-клеток (Voena С. et al., 1997). Опухоль-специфичные праймеры подбирались с использованием программы Primer Express (Applied Biosystems, США).

Качественный молекулярный анализ. Качественный анализ выполнялся в два этапа: первый - обогащение с использованием соответствующих семейств-специфичных праймеров, второй - с использованием пары опухоль-специфичных праймеров. Для контроля качества амплификации параллельно проводился ПЦР анализ гена НСК (ген человеческой гемопоэтической клеточной киназы). Путем тестирования серии последовательных разведений клеток миеломной линии TIB-196 в лейкоцитах периферической крови здоровых доноров (buffy coat, ВС) показана максимальная чувствительность используемого метода - 1 опухолевая клетка на 106 нормальных клеток.

Количественный молекулярный анализ (ПЦР в режиме реального времени). TaqMan IgH зонды были помечены следующим образом: на 5' конце с помощью FAM (6-carboxy fluorescein) и на 3' конце TAMRA (6-carboxy-tetramethil rhodamin). Проводили мультиплексную ПЦР: вторая реакция определяла количество гена человеческой гемопоэтической клеточной киназы ИСК. Применялись две стратегии TaqMan:

• с тест-системой, включающей: опухоль-специфичный прямой праймер в V-сегменте, семейств-специфичный зонд, расположенный в сегменте J, а, также, семейств-специфичный обратный праймер в J-сегменте (Bruggemann et al., 2000; Verhagen et al., 2000)

• с тест-системой, включающей: опухоль-специфичные праймеры, комплементарные участкам CDR2/FR3 и CDR3, а также семейств-специфичный зонд, располагающийся в V - сегменте (FR3-y4acTOK) (Ladetto et al., 2000).

Опухоль-специфичные праймеры были подобраны с помощью разработанного нами алгоритма подбора праймеров для качественного анализа (рис.1).

При создании тест-систем по Bruggemann, теоретическая температура плавления прямого опухоль-специфичного праймера была до 2 градусов ниже по сравнению с температурой плавления обратного семейств-специфичного праймера. Для тест-системы по Ladetto, температура отжига/синтеза в ПЦР (+60°С) на несколько градусов превосходила теоретическую температуру плавления обоих специфичных праймеров.

Амплификация проводилась на аппарате ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, США). Данные были собраны и обработаны с помощью программы Sequence Detector software (Applied Biosystems, США). Для получения индивидуальных для каждого пациента калибровочных кривых, были произведены серийные разведения ДНК пациентов, выделенных из диагностических образцов КМ (100%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01%) в смеси, состоящей из 10-20 образцов ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови доноров крови. За условные 100% опухолевых клеток брали диагностический/контрольный образец ДНК пациента. Результаты количественного мониторинга МОБ были нормализованы по первому образцу.

Чувствительность методики протестировали на серии ДНК, выделенных из разведений клеточной линии TIB-196 в ВС доноров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Алгоритм индивидуального подбора праймеров для мониторинга МОБ у больных ММ. Разработанный алгоритм для подбора опухоль-специфичных праймеров включает несколько последовательных шагов (рис. 1). Если подобранные праймеры оказываются неспецифичными, возникает цикл -необходимо вернуться назад на несколько шагов и подобрать другие праймеры. В случае, когда подобранные праймеры специфичны, принимается решение об использовании индивидуальной тест-системы для мониторинга МОБ ММ. Сравнение с базами генетических данных. Выявление уникальных черт нуклеотидной последовательности гена IgH опухолевого клона. На сайте Marie-Paule Lefranc-international ImMunoGeneTics database (http://imgt.cines.fr/) путем сравнения имеющейся последовательности и опубликованных терминальных последовательностей V, D и J сегментов, можно определить тип VDJ перестройки, точковые мутации, а также N1 и Ы2-регионы: представленные добавочными нуклеотидами в участках соединения V, D и J -сегментов.

Однако, анализ с помощью данной базы не позволяет выявить в IgH последовательности такие мутации, как делеции, дупликации и инсерции. Часто невозможно получить полную картину места соединения V, D и J-сегментов. В результате, не удается выявить индивидуальные особенности уникального CDR3 региона миеломного клона, и, соответственно, подобрать специфичные праймеры. Поэтому нами предложено дополнительно использовать базу данных IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) (подраздел «Ig sequences»). Эта база позволяет сравнить исследуемую последовательность не только с терминальными генами, но и с рекомбинированными VDJ последовательностями других В клеток.

Выявленные таким образом уникальные черты IgH последовательности миеломного клона обеспечивают высокую специфичность индивидуальных опухоль-специфичных праймеров.

Рисунок 1 - Алгоритм подбора опухоль-специфичных праймеров для молекулярно-генетического мониторинга МОБ у больных ММ. Оптимизированные этапы показаны серым тоном.

Подбор опухоль-специфичных праймеров. Критерии для подбора опухоль-специфичных праймеров. По данным Виллемса П. и Воена К. (Willems et al., 2000; Voena et al., 1997) и результатам собственных экспериментов были сформулированы критерии подбора миелома-специфичных праймеров:

• критерии подбора прямого праймера: - одно или несколько последних оснований на 3' конце праймера комплементарны точковой мутации в области FR1, CDR1, FR2 или CDR3.

• критерии подбора обратного праймера: - несколько последних оснований на 3' конце праймера располагаются в участках N1 или N2 в местах соединения V, D, J - сегментов.

11

При отсутствии N-нуклеотидов, для подбора специфичных праймеров использовались точечные мутации, а также, в отдельных случаях, места инсерций, делеций или дупликаций. Выбор локализации мутаций на 3' конце праймеров неслучаен. Показано, что различие в одном или нескольких нуклеотидах между матричной ДНК и 3'- концом одного из праймеров препятствует Taq - опосредованному синтезу (Wobble - эффект). Более того, было показано (Bottema et al., 1993), что в случае смещения мутации с 3' конца на расстояние в 3 - 4 нуклеотида от 3' конца, для обеспечения специфичности амплификации появляется необходимость подбора индивидуальных концентраций хлорида магния.

Выбор оптимальной температуры отжига праймеров (для качественного анализа). При разработке алгоритма подбора праймеров выполнено экспериментальное исследование влияния температуры их отжига на специфичность анализа. Определение индивидуальной температуры отжига праймеров выполнялось при помощи температурного градиента (T-gradient) с ДНК пациента, использованной при получении VDJ-последовательности опухолевого клона. Для верхней границы температурного градиента, как правило, использовался предел в +67°С. Выявлено, что оптимальным для специфичности праймеров является температура отжига на 10-13 градусов превосходящая теоретическую температуру плавления праймеров (+47°С -+57°С), которая определялась с помощью программы Primer Express. Использование меньших температур отжига праймеров часто было ассоциировано с их пониженной специфичностью. Необходимо отметить, что наши выводы о влиянии повышенной температуры отжига на специфичность амплификации полностью соответствуют результатам других работ, посвященных специфичной амплификации (Bottema et al., 1993).

Тестирование опухоль-специфичных праймеров выполнялось на контрольных образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови 10-20 доноров.

Апробация в клинических условиях методики молекулярно-генетического анализа при мониторинге МОБ у больных ММ. Качественный анализ. Для

18-ти пациентов удалось определить нуклеотидную последовательность клональной перестройки гена IgH (из них для 4-х по цитологическим препаратам).

Опухоль-специфичные тест-системы с использованием алгоритма и критериев для подбора опухоль-специфичных праймеров для качественного ПЦР анализа были подобраны для 13 пациентов (12 после алло-ТГСК, один пациент до алло-ТГСК (ММ11)) и для одной клеточной линии (TIB-196) (табл.1 и 2).

Мониторинг МОБ с использованием качественного ПЦР анализа был проведен для 12 пациентов после алло-ТГСК (рис. 2).

У 6 пациентов наблюдался смешанный (+/-) ПЦР (ММ1, ММ5, ММ8, ММ 12) и положительный (+) ПЦР результат (ММ9, ММ4). У одного пациента (ММ8) наблюдалось прогрессирование заболевания (ПЗ), у 2-х пациентов (ММ1, ММ5) - рецидив, еще два пациента имели частичный ответ (ММ4, ММ9). Один пациент (ММЗ), находясь в молекулярной ремиссии (MP), умер от пневмонии через 4 месяца после алло-ТГСК (родственная ТГСК). У пациента ММ 10 на фоне отрицательного ПЦР результата (-) произошел экстрамедуллярный рецидив (14 месяцев после алло-ТГСК). Еще два пациента достигли стойкой MP. Так, пациент ММ2 имел отрицательный результат ПЦР анализа с 12 по 30 месяц после алло-ТГСК (неродственная ТСК). Иммунофиксация была отрицательной с 4,5 месяца. Пациент ММ6 (IgG kappa, III А) после окончания курса циклоспорина А (111 день после родственной алло-ТГСК) 2 месяца спустя получил ИДЛ (1х 106 СОЗ+клеток/кг), после чего через 6 месяцев у него развилась слабая (mild) РТПХ (I, кожа), которая полностью исчезла после краткого курса преднизолона. Пациент ММ6 достиг MP через II месяцев после алло-ТГСК. MP наблюдалась на протяжении еще, как минимум, 19 месяцев. Пациент ММ 12 (IgG lambda, III А) после окончания курса циклоспорина А (134 день после алло-ТГСК) на фоне позитивной иммунофиксации через 3 месяца получил ИДЛ (1х Ю6СОЗ+клеток/кг). Иммунофиксация оставалась положительной еще 13 недель, когда после первой ИДЛ пациент получил вторую ИДЛ (1*106 СОЗ+клеток/кг). В результате, через 13 месяцев после алло-ТГСК была достигнута MP. Однако, вскоре результат ПЦР анализа снова стал позитивным (18 месяцев после алло-ТГСК). Сделан вывод о том, что качественный мониторинг МОБ должен найти применение при алло-ТГСК у больных ММ. Показано, что аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток с режимами кондиционирования со сниженной интенсивностью доз может индуцировать молекулярную ремиссию.

Таблица 1 - Участки гена тяжелой цепи иммуноглобулина пациентов и клеточной миеломной линии Т1В-196 комплементарные обратным опухоль-специфичным праймерам для качественного анализа. Выделено синим шрифтом1

г -ГН ШС-Т УЫШ->- О.ГОТ га-з шс-т варнавтвз Б1_АЬТ г -3 номер \Т>1 перестройка

пв-ш »^^ГГ-Т=ТГГ<АГ.-ТДШЛаВ» •-«„СТАСТ.чГАС-. ТС-ААА:-: :Т!»АО ТАТАА . ТСС- х-.::-: юю.ч

:о.п «ТАС ОАГГПТССАОТООГТА :'."-- сссс ОС-ТТА . . - „ ■ х-нг^

2С>1 -- : йС-СгТСАО«;А ТСсгс ' :: —гта с та- ХКУ.М:

ИсЛёПС 1Х-С7А ' -ТААА-.АА.А АААГАА ЮЮ"-Г

(нет рег.-льтэтоз -о ср^Ененню) тстссс . ■ --.-ата^а-ас« ОТС-.ТСТЗГ^Т к:ссс -пларшАТАОСА^ООС :&>--£>

>.И[5 ; л.^— ,__■■. Г-.Ч I зет ТТА&АТСТСТОО я, г -гизстсгС пу/ч?-^: -■=1 ¿-лг1 ЮЮС- юн.-:

>."■-16 лг^с*эпгпгт*А7САСССС-СТОСТА-- - — -..а"-.: :-■■•■ Т6СТА" :лт7гс-АС7!<:т:..у:-аг гон:::-: :С-Е:-

«К4СТГГТГГГ1ТГ гг-.-С: :тгтаасс:сто& км: - асгсс ссСПТ&а с -- юн:-

r-.C-.IS ч.икеиЛЧ-'лГГЛ'Т^ГДА^-- о СХ-7АА ;! т 1&К."

пЛЯАТТАТГАТ&.-.ТАЬ'АСЛОСТГАТГлТ:^?. ■—г-ат.а-с :ТГАТ:- •ггастт&ата-тс-.-х-с-

лйПС .-.-Л --Ч-ТЛГЦ- а 7 геСПТСАСТА &ТОС& - г-ПАА&АТС-йса, :,_а— ас гонг:-: юн:-!

г.^с-аа-тасса-,- -■Т:Т ТМ-ь- .., ОАОАС -..-оа-тас «-70.а- 7 аа. г ЮН."4

S2.ii: - - 7- ' ~АГ ас-ас - СТТС&А ТС<АА -:21*з7&АС7АСС-а- аас i - с .. 1иг5

>ТТАСЛДАЛТГЯ^1С(ЭТАтТЛЛДС|ггс&'тастг> ;-ас-7а-:-хсссаос& ГГАТАА гг??гтаг-с-а ЮНГ:."-? юн:^

1 Строчными буквами показаны индивидуальные отличия в последовательности гена ^Н. Второй, третий и четвертый столбцы -результат анализа региона СЭЯЗ, полученный с помощью базы данных 1МОТ. Пятый столбец - с помощью ^ВЬАЗТ. Шестой столбец -номер клональной У0.1 перестройки гена ^Н.

Таблица 2 - Опухоль-спсцифичные праймеры, подобранные для 13 пациентов (ММ 1 -ММ 13) и миеломной линии TIB-196 (качественный анализ)

Пацисн- ты/кл. линия Прямой праймер 5 -3' Обратный праймер 5 -3' T °c

TIB-196 AAAC'TATGCtCcGAg (FR3) AAGTGTACGAGTAGTCAAAG

ММ1 TCCGCCAGGCTCCg (FR2) TCGAACCAGAGCCTCCG 67

ММ2 GGTgTCATACATTAGTAccgac (CDR2) CAGGTCCACGGGTGG 67

ММЗ OTCTGGGGCTGAaGTGg (FRI) GGCTGCTCAGACGCACT 67

ММ4 TTAGAgGCAAAGCTTACAGTG (CDR2) ACTGCTATTTCTTTGCTTGG 64

ММ5 GAgTCACCTTTGGTGATCATTg (CDR1) GCGTCATTCCACGGTCC' 67

ММ6 TGGTGcCTCCATCAaTcc (CDR1) GACCCCAGAAGTCAAACAGAA 56

ММ7 TCCCTCACtTGtGCTGTCaAc (FRI) AGGTC'AAAGGGGGAGTAGACG 57

ММ8 GTGGGTCTCAAGTATTAGcc (CDR2) GAACCAATTGCCGGAA 60

ММ9 GGTGACTCCATCAGCAGTGGTAt (CDR1) CCCCAGATATCAAAAGTCCCAAC 64

ММ10 CTTCTGGATACACCTTCAtCGa (CDR1) GTAATTGTAGCCATCTAAAAGGGA 67

MMI1 CCGTCAGCAatgatggm (CDR!) □TCAGATTCACCGTACTCGTG 67

ММ12 CCTCTGGATTCACCTTCAGgAa (CDR1) AGGTAGTCACCGTAGTCATTACGCT 67

ММ13 AGGGGCTGGAGTGGATa (FR2) CCAATACTCTAAGTACCCAACT 60

Количественный анализ (в режиме реального времени). Для 4-х пациентов и клеточной линии Т1В-196 были подобраны праймеры для количественного анализа в реальном времени (табл. 3 (Т1В-196, пациенты ММ 1, 4, 9 - тест-системы на основе опухоль-специфичного прямого праймера, семейств-специфичного зонда и праймера, пациент ММ 11 - тест-система с двумя опухоль-специфичными праймерами и семейств-специфичным зондом).

Так, пациент ММ 1 через 33 месяца после алло-ТГСК достиг полной ремиссии, подтвержденной с помощью метода иммунофиксации (рис. 3). При этом качественный ПЦР анализ, проведенный через 35 мссяцсв после алло-

15

Периф кровь

ММ 1 ММ 2 ММ 3

ММ 4 ММ 5 ММ 6 ММ 7 мме ММ 9 ММ 10. ММ 11 ММ 12 ММ 13

а_

JDS,

Тал+ИДЛ.

_о +

. о .

Л А

'А Ж Ik

Рецидив

• •

99 9

чр

О

ООО

S

<S (S S

О ПР

jQ_О. ■■

О т (Т.

идл

л

идл

С Q.0

IS) s>

sf (f

о •

ii

Результат Nested ПЦР анализа

0 - отрицательный;

# - положительный;

О ■ слабо-положительный;

ф - ложно-отрицательный".

16 20 24 28 32

Месяцы после алло-ТГСК Условные обозначения: Результат иммунофиксации;

ПР ЧР

пз р

,2. ЭМР

д - отрицательный; А - положительный;

- полная ремиссия;

- частичная ремиссия;

- лрогрессирование заболевания;

- рецидив заболевания;

- экстрамедуллярный рецидив; V Тал+ИДЛ- талидомид, вливания

донорских лимфоцитов.__

Рисунок 2 - Мониторинг МОБ у больных ММ с применением качественного

ПЦР анализа.

ТГСК, показал наличие МОБ, что могло говорить о существующем риске рецидива. Результат, полученный с помощью метода иммунофиксации, был отрицательным вплоть до 36-го месяца после алло-ТГСК. Через 39 месяцев после алло-ТГСК положительный результат, полученный с помощью метода иммунофиксации выявил рецидив. Чтобы купировать рецидив был проведен курс талидомида и ИДЛ, затем (на 44-й месяц после алло - ТГСК) была зафиксирована полная ремиссия (получен отрицательный результат при анализе путем иммунофиксации).

Таблица 3 - TaqMan зонды и праймеры для клеточной линии TIB-106 и пациентов ММ1, ММ4, ММ9, ММ112_ _ _ _ _

Пациент/ Клеточная линия Опухоль-специфичные праймеры Семейств-специф. праймер обратный) Семейств-специф. зонд

TIB-196 FP 5'ССС ТТТ TTG GAG TGa ТТА ТТА ТАа cTt tg 3' JH6-R* JHQ6*

ММ1 FP 5' GGA GTG GTT Acg gag get CT 3' JH5-R** JHQ1.4,5**

ММ4 FP 5' TAG Ate tcc ccc aag caa aga a 3' JH4-R** JHQl.4,5**

ММ9 FP 5' GTG TAT TAC TGT GCG get tcG T 3' JH3-R* JHQ3*

ММ11 FP 5' cTA TcT gTA TcA CCG c(GGG/-)AG 13' RP 5'Aga tTC ACC GTA ctc gtg 3' нет M-VH4***

Однократный количественный и качественный молекулярный анализ (47-ой месяц), показал следующий результат: качественный анализ дал слабоположительный результат, а количественный анализ показал, что процентное содержание опухолевых клеток в периферической крови пациента превышает процентное содержание опухолевых клеток в образце КМ. Через 55 месяцев число остаточных клеток в КМ, по данным количественного анализа, стало расти.

Применение качественного и количественного методов молекулярного мониторинга проиллюстрировано примером ретроспективного анализа.

Для достижения наилучшего результата в клинических условиях также рекомендуется комплексировать количественный и качественный анализ, а именно: проводить количественную оценку МОБ при каждом положительном результате, полученном при качественном анализе и проводить качественный анализ при отрицательном результате, полученном с помощью количественного анализа. Это необходимо как для определения MP, имеющей высокую прогностическую важность, так и для выявления ранних динамических изменений МОБ, что позволит своевременно скорректировать курс проводимой терапии.

Применение опухоль-специфичных тест-систем в клинических условиях показало, что при мониторинге МОБ тест-системы, подобранные до начала алло-ТГСК остаются специфичными в течение не менее 4,5 лет.

" Строчными буквами в опухоль-специфичных праймерах отмечены места, комплементарные

индивидуальным нуклеотидам клональной перестройки гена IgH. (nnn/-) - обозначено место делеции 3 нуклеотидов (GGG/-). (TIB-196 сравнение с V-QUEST/IMGT; MM 1.4,9,11 - сравнение с GcncBank/IgBLAST). FP -прямой праймер, RP -обратный праймер. "Vcrhagen O.J. е( al. 2000: ** Bruggcmann М. ct al. 2000; *** Ladetto М. et al., 2000

Магнитная селекция и последующий количественный анализ в линии клеток СБ 138+. Нами было предположено, что методика магнитной селекции может быть использована для повышения чувствительности количественного

анализа, для чего было проведено тестовое исследование образцов, полученных после магнитной селекции CD 13 8+ лимфоцитов с использованием аппарата MACS (Myltenyi Biotech).

Данная методика применялась параллельно с количественным и качественным ПЦР анализом. В диссертации приведены данные для образцов, для которых имелись результаты количественного анализа как в образце до магнитной селекции, так и в CD 138+ образце. Пациент ММ1: содержание опухолевых клеток в образце Д + 1672 без селекции - 2% в CD 138+ образце >100% (580% - по отношению к первому образцу). Пациент ММ4: условный процент опухолевых клеток в образце Д + 1051 без селекции - 0% (отсутствуют), в CD 138+ образце - 36%. В образце Д+1268 без селекции - 0% (отсутствуют), в CD 138+ образце - 20%. Пациент ММ 9: условный процент опухолевых клеток в образце Д+1354 без селекции - 2%, в CD 138+ образце >100% (1790%). В образце Д+ 1524 без селекции <1%, в CD 138+ образце -37%. В образце Д+1571 без селекции <1%, в CD 138+ образце - 58%. Пациент ММ11: контрольный образец - до селекции - 100%, в CD 138+ образце >100% (710%). Образец, полученный через 330 дней - до селекции - 3%, в CD 138+ образце >100% (150%).

Предварительные данные тестового исследования позволяют утверждать, что методика магнитной селекции может быть использована для повышения чувствительности молекулярного мониторинга.

Особенности использования опухоль-специфичных тест-систем на основе VDJ перестройки гена IgH в молекулярной диагностике МОБ ММ при алло-ТГСК. Эффективность мониторинга МОБ зависит от качества забора материала, от времени забора материала и от номера V - сегмента клональной перестройки. Если забор диагностического материала производится в период активной регенерации КМ - это может привести к фоновой амплификации клональных перестроек сходных с перестройкой опухолевого клона, что снижает чувствительность метода. Если при подборе опухоль-специфичных тест-систем не было уделено должного внимания их специфичности, то в период активной регенерации КМ выше вероятность получения ложноположительного результата анализа. Причем эта вероятность может также зависеть и от номера V сегмента VDJ перестройки IgH опухолевого клона, так как в ходе периода регенерации V сегменты имеют различную

динамику восстановления. По данным Беллуччи Р, Фумокса Ф, Гокмена Е (Ве11иса Й а1., 2002; Ритоих е1 а1., 1993; Ооктеп с1 а!., 1998) в первые 3 месяца после алло-ТГСК и ИДЛ наблюдается период активной регенерации В-клеток и восстановления репертуара перестроек 1§Н. Исходя из этого, предложены пути минимизации влияния последствий алло-ТГСК и ИДЛ на молекулярный мониторинг МОБ ММ: наряду с анализом с терминальными V, О и .1 сегментами в 1МСТ, выполнять сравнение с рекомбинированными У0.1 последовательностями других В клеток в базе данных ^ВЬАБТ с целью учета возможных нуклеотидных совпадений с репертуаром ^Н регенерирующего КМ; - при тестировании праймеров на специфичность использовать не менее 10 отрицательных контролей, полученных от здоровых доноров (ВС). Важность сравнения с рекомбинированными последовательностями показана на

примере анализа последовательности УТО перестройки клеточной линии Т1В-196 в базе данных ОепеВапк/^ВЬА8Т (рис. 4). Нами обнаружено, что V сегмент (за исключением нескольких точечных мутаций), N1-участок (полностью) и часть О-ссгмснта (N1 и Б составляют часть СОЯЗ-региоиа) клональной последовательности Т1В-196 комплементарны последовательности АУ429938. Факт совпадения У-сегмента, а также достаточно протяженной части СЭЯЗ-региона последовательности опухолевого клона с последовательностью из базы данных говорит о том, что теоретически такие совпадения могут иметь место и в процессе молекулярного мониторинга МОБ, когда в массе поликлональных последовательностей, имеющихся в нормальных В-лимфоцитах, случайно окажется перестройка сходная с опухолевой последовательностью.

Таким образом, сравнение опухолевой последовательности только с терминальными V, Б и I- сегментами является необходимым, но не достаточным условием для создания высокоспецифичных тест-систем.

Проблема ложноотрпцательных результатов при молекулярном мониторинге МОБ у больных ММ. По результатам мониторинга МОБ у двух пациентов (ММ7 и ММ 13) на фоне положительной иммунофиксации наблюдается стабильный отрицательный результат ПЦР анализа, что может говорить о ложноотрицательном результате молекулярного мониторинга. Необходимо упомянуть, что в ряде случаев для дизайна опухоль-специфичных

тест-систем мы вынужденно пользовались образцами, полученными уже после ряда этапов проводимой терапии.

Так, для определения клональной \Т).1 последовательности гена ^Н пациента ММ 7 был использован образец, содержащий 12 % плазматических клеток (что даже больше рекомендуемых 10 % (ОгаиЬе а а1., 2001), но время забора образца (за 57 суток до алпо-ТГСК) не гарантирует присутствия достаточного числа опухолевых клеток.

Для пациента ММ 13 был использован образец, полученный через б месяцев после установления диагноза и за 3 месяца до алло-ТГСК. Содержание плазматических клеток - 3 %. При идентификации номера вариабельного участка гена 1§Н у пациентов ММ7 и ММ13, имеющих ложноотрицательный ПЦР результат, нами обнаружен ЮНУ4-34 вариант УН семейства гена ^Н (Табл. 2). У пациента ММ7 полный номер клональной перестройки был ЮНУ4-34*01 ЮН02-2*01 ЮШ4*02. У пациента ММ 13 полный номер клональной перестройки был ЮНУ4-34*01 Ю1ШЗ-9*01 КЖП*01.

По литературным данным некоторые варианты УН - семейства гена ^Н [УНЗ-49, УНЗ-5Э и УН4.21 (УН4-34)] не обнаружены ни у одного больного ММ, но широко распространены в нормальных циркулирующих В-клетках, при аутоиммунных заболеваниях и других В-лимфопролиферативных заболеваниях й а1., 1996). Нами сделано предположение, что в данном случае в образцах над опухолевым клоном преобладал другой, не опухолевый клон. Поэтому был сделан вывод, что, во-первых, при разработке тест-систем для мониторинга МОБ обнаружение клонального варианта ЮНУ4-34 может быть сопряжено с ложноотрицательным результатом, а, во-вторых, для разработки диагностических тест-систем следует брать диагностические образцы КМ, в частности, в виде цитологических препаратов.

Необходимо все же отметить, что мы считаем открытым вопрос «немиеломных» вариантов перестроек. В частности, среди полученных нами клональных последовательностей встретился вариант ЮНУЗ-49 (пациент ММ5). Данный вариант, как было отмечено выше, до сих пор не был обнаружен ни у одного больного ММ (Яе^ М.В. е1 а1., 1996). Диагностическим материалом в данном случае служил цитологический препарат КМ, полученный до терапии. Четкая нуклеотидная последовательность гена ^Н была получена путем прямого секвенирования.

Последовательность гипермутирована и имеет делецию и дупликацию. Такой высокий уровень мутаций характерен для ММ.

1MCT/V-(.H'EST

Results of [MGT/JunctioiiAiialysis

Analysis of the JVHCTIOl]

. ..igaccctttuggagtjauauata..

IGHVl-2'02 ICHDJ-l

1 JHE6I0H

..tttggacgtclgg

Alignment for Y-GENE:

ш--AiCCTTXTCGACTCCTA..

>2Ш6_ lOHVl-2'02 c-TTfACCC-CTA-TAT..

X92^08_ IGHVI-2'ОЗ C-TTCACCG-CTA-TAT..

2123KL. IGHVW01 C-TTCACCO-CTA-TAT..

X07«8„ IGHVl-2"0l c-TTCACCO-CTA-TAT..

.. TATCCCTGCATACGACAGGCCCCTGGGCACGGGCTTGAGTGGGTCGOATGOATCAACCCTAACAGTGGTGiKACA..

....AT«-A----G-G-X--

. IGHV1-I8'0l c

Г-АССА-СТАТОТ..

........ATG-A----G-G.............

........ATG-A— -G-G.............

........АТС AG----G-G..........—

. AACTATGCTiTCGAGATTTCAC... GWAGGGTCACCATGACCAGAGACiCGTCCTTCAiTAiAGCCTACATGOACCTOAC-AAGTCTGAGATCTGACGACTCGGCCiTil

X9:'2Q8 212310..

П99Ш.

. IGHVI-2'02 . . IGHVl-2'ОЭ . . IGHV1-2*M .

IGHV1-18'01.-------

-A---ACG—С----

—G.....0--C.........

TCGGCCGTGTnTACTGTGCGAAAAGTCACCCTTTTTGGAGTGATTATTATAACTTT'jACTACTCOTA

_ IGHVI-2'01 A-—T.....A...........G-GA

, ICHVI-18'01 A.........A...........G-GA

GeneBank laBLAST:

VHl-2

1001¿7

AF167661

АГ062226

ШИ19 AB019-H1

4*

"J

Рисунок 4 - Анализ клональной последовательности гена 1§Н клеточной линии Т1В-

196 в базах данных 1МОТ и ОепеВапк/^ВЫ!. Условные обозначения: 1. 1МОТ/У-<Зие81: «-» - нуклеотиды идентичные нуклеотидам в последовательности пациента; «...» - отсутствие гомологичной последовательности в данном участке; БУКВЫ - нуклеотиды отличные от нуклеогидов в УБ.1 последовательности пациента. 2. ОепВапк/^ВЬАЗТ: «....» - нуклеотиды идентичные нуклеотидам в \та последовательности пациента; «-» - отсутствие гомологичной последовательности в данном участке; БУКВЫ -нуклеотиды, отличные от нуклеотидов в У0.1 последовательности пациента.

* - Ь00021, Е00167 - последовательности \J-266 (Т1В-196), опубликованные в базе данных.

** - АУ429938 - последовательность вариабельного участка ^Н, получешия из лимфоцита С05+ пуповиниой крови (выделено черной рамкой).

выводы

1. Разработанный в рамках настоящего исследования алгоритм для подбора опухоль-специфичных праймеров позволяет с минимальными затратами времени и материалов подбирать индивидуальные опухоль-специфичные тест-системы. Алгоритм учитывает особенности аллогенной трансплантации и инфузий донорских лимфоцитов, которые могут повлиять на эффективность молекулярного мониторинга. Это является важным шагом на' пути стандартизации молекулярного анализа МОБ у больных ММ после алло-ТГСК.

2. Апробация в клинических условиях молекулярного мониторинга МОБ, выполненная для оценки эффективности терапии ММ на основе алло-ТГСК с режимами кондиционирования со сниженной интенсивностью доз показала, что данные методики являются эффективным инструментом для оценки МОБ у больных ММ после алло-ТГСК

3. Комплексирование качественного и количественного методов ПЦР - анализа обеспечивает надежный контроль эффективности терапии. Высокая чувствительность качественного ПЦР анализа (1*106) позволяет использовать его для определения молекулярной ремиссии и выявления МОБ. Количественная ПЦР в реальном времени позволяет проводить динамический мониторинг МОБ.

4. Магнитная селекция CD 138+ лимфоцитов с использованием аппарата MACS (Myltenyi Biotech) значительно повышает чувствительность количественного анализа при оценке МОБ у больных ММ с помощью разработанного алгоритма.

5. Специфичность тест-систем на основе перестройки гена IgH миеломного клона сохраняется в течение не менее 4,5 лет после аллогенной трансплантации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При внедрении молекулярного мониторинга МОБ больных ММ в клиническую практику рекомендуется использовать разработанный

23

алгоритм и методику индивидуального подбора специфичных праймеров, это уменьшает трудоемкость операции подбора.

2. При мониторинге МОБ у больных ММ молекулярно-генетический анализ

должен выполняться с учетом следующих методических требований:

• после проведения алло-ТГСК и ИДЛ молекулярный мониторинг за эффективностью терапии необходимо продолжать только после завершения периода активной регенерации в КМ, продолжающейся в течение 3-х месяцев после алло-ТГСК и между 3 и 6 месяцами после ИДЛ;

• для предотвращения ложно-положительных результатов необходимо подбирать тест-системы с учетом возможных нуклеотидных совпадений с репертуаром 1§Н регенерирующего КМ, в связи с чем наряду с анализом с терминальными V, Б и .1 сегментами, необходимо выполнять теоретическое сравнение с библиотекой рекомбинированных последовательностей других В клеток;

• во избежание получения ложно-отрицательных результатов не следует использовать тест-системы на основе клональной перестройки гена ^Н с вариабельным участком У4-34;

• при тестировании праймеров на специфичность необходимо использовать не менее 10 отрицательных контролей, полученных от здоровых доноров (ВС).

3. При комплексировании качественной и количественной методик анализа рекомендуется проводить количественную оценку МОБ при положительных результатах, полученных при качественном анализе и проводить качественный анализ при отрицательных результатах, полученных с помощью количественного анализа. Это необходимо как для определения МР, имеющей высокую прогностическую важность, так и для выявления ранних динамических изменений МОБ, что позволит своевременно скорректировать курс проводимой терапии.

4. Методика определения нуклеотидной последовательности опухолевой клональной перестройки гена 1§Н на основе ПЦР анализа ДНК позволяет подбирать индивидуальные тест-системы для пациентов, получавших ранее терапию, при условии, что сохранен диагностический материал в виде ДНК,

цитологических препаратов или замороженных клеток. Для обеспечения молекулярного мониторинга терапии ММ диагностические образцы КМ больных ММ с достаточным содержанием опухолевых клеток, полученные до начала терапии, необходимо помещать в банк ДНК, что, в дальнейшем, обеспечит возможность подбора индивидуальных высокоспецифичных тест-систем. Для этого необходимо в директивном порядке организовать такие банки ДНК во всех крупных лечебных заведениях, в которых проводится диагностика и терапия ММ, разработать инструктивные документы, регламентирующие отбор, передачу в банк, хранение, доступ и обмен образцами ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ3

1. Загривная М.В., Badbaran A., Fehse В., Kröger N., Zander A.R., Афанасьев

Б.В. Молекулярный анализ минимальной остаточной болезни у больных множественной миеломой после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова. - СПб.: Изд-во СПбГМУ - 2008. - т. 15, N 1. -С. 45 - 50.

2. Загривная М.В., Бадбаран А., Фезе Б., Крегер Н., Цандер А., Афанасьев Б.В.

Выявление и количественная оценка «минимальной остаточной болезни (МОБ)» у больных множественной миеломой после аллогенной трансплантации стволовых гемопоэтических клеток // Сб.тр. 1-й российско-американской конф. «Биотехнология и онкология». - СПб., 2005. - С. 105.

3. Zagrivnaja M., Fehse В., Zander A., Kröger N. Induction of molecular remission

by donor lymphocyte infusions in patients with multiple myeloma and residual disease after dose-reduced conditioning and

Жирным шрифтом отмечены статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата биологических наук.

allogeneic stem cell transplantation.//Bone Marrow Transplantation. - March, 2004.- Vol. 33, suppl. 1. - P. 326.

4. Kroeger N., Shimoni A., Zagrivnaja M., Ayuk F., Lioznov M., Schieder H., Fehse

B., Zabelina T., Nagler A., Zander A. Low dose thalidomide and donor lymphocyte infusion as adoptive immunotherapy after allogeneic stem cell transplantation in patients with multiple myeloma. // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts).- 2004. -Vol 104 (11): abstract 1646. - P. 457a.

5. Zagrivnaja M.V., Badbaran A., Corradini P., Fehse B., Zander A., Kroger N.

Prognostic significance of molecular remission determined by highly specific PCR after dose-redused aloogeneic stem cell transplantation (SCT) in patients with multiple myeloma. // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts).-2004. - Vol 104 (11): abstract 4420-P. 188b.

6. Kröger N., Shimoni A., Zagrivnaja M., Ayuk F., Lioznov M., Schieder H.,

Renges H., Fehse B., Zabelina T., Nagler A., Zander A.R. Low-dose thalidomide and donor lymphocyte infusion as adoptive immunotherapy after allogeneic stem cell transplantation in patients with multiple myeloma // Blood. - 2004. - Vol. 104(10). - PP. 3361-3363.

7. Kroger N., Zagrivnaja M., Schwartz S., Badbaran A., Zabelina T., Ayuk F.,

Zander A., Fehse B. Kinetics of plasma-cell chimerism after allogeneic stem cell transplantation by highly-sensitive realtime PCR based on single-nucleotide polymorphism (SNP) and its value to quantify minimal residual disease in patients with multiple myeloma // Experimental Hematology. - 2006. -Vol. 34(5). -PP. 688-693.

8. Zagrivnaja M., Badbaran A., Dietrich M., Corradini P., Fehse B., Zander A.,

Kröger N. Molecular remission (MR) after dose-reduced allograft in patients with multiple myeloma. // Bone Marrow Transplantation. - March 2005,- Vol 35, suppl. 2,- P. 157.

9. Kröger N., Shimoni A., Zagrivnaja M., Ayuk F., Lioznov M., Schieder H., Renges

H., Fehse B., Zabelina T., Nagler A., Zander A. Low-dose thalidomide and donor lymphocyte infusion as adoptive immunotherapy after allogeneic stem cell transplantation in

patients with multiple myeloma.//Bone Marrow Transplantation. -March 2005.- Vol 35, suppl. 2,- P. 47.

10. Kroeger N., Zagrivnaja M., Schwartz S., Badbaran A., Zabelina T., Ayuk F.,

Zander A., Fehse B. Kinetics of Plasma-Cell Chimerism after Allogeneic Stem Cell Transplantation by Real-Time PCR and Its Value To Quantify Minimal Residual Disease in Patients with Multiple Myeloma.// Blood (ASH Annual Meeting Abstracts). -Nov 2005. - Vol 106 (11): abstract. - P. 2748.

11. Kröger N., Zagrivnaja M., Schwartz S., Badbaran A., Zabelina T., Lioznov M.,

Ayuk F., Zander A., Fehse B. Kinetics of plasma-cell chimerism after allogeneic stem cell transplantation// Bone Marrow Transplantation. - March 2006.- Vol 37, suppl. 1. - P. 7.

Подписано в печать 28.10.2010 Формат 60х84'/1б Офсетная печать Печ. л. 1.0 Уч.-изд.л. 1.0 Тираж 100 Заказ 01/11

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт»

(191015, г. Санкт-Петербург, ул. Шпалерная, дом 51, офис 345)

Актуальность проблемы

Множественная миелома (ММ) - злокачественное новообразование из плазматических клеток, которые являются конечным продуктом дифференцировки В-клеток и в норме обычно продуцируют антитела (Абдулкадыров 2004). В странах Запада ММ - причина приблизительно 1% всех смертей связанных с онкологией [21]. Существенную роль в терапии ММ играет аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Ряд исследований показал, что пациенты, достигшие полной клинической ремиссии (ПР) после алло-ТГСК, характеризуются длительной выживаемостью [90]. При применении алло-ТГСК после стандартной миелоаблативной подготовки и после подготовки по щадящим схемам достигается высокий уровень ПР, варьирующий в пределах 27% - 81% [23, 27, 53, 54, 68, 70, 87]. Около 50% пациентов с ПР после стандартной миелоаблативной алло-ТГСК достигают молекулярной ремиссии (МР)[37, 89], которая ассоциирована с очень низким риском рецидива [39]. Таким образом, для улучшения результатов алло-ТГСК требуется достижение ПР и, в особенности, МР. Одним из способов достижения ПР является проведение посттрансплантационной терапии. Самой распространенной адоптивной терапией после алло-ТГСК является инфузия донорских лимфоцитов (ИДЛ) [77].

Для определения статуса МР и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) с количественной (в режиме "реального времени") и качественной оценкой опухоль-специфичной последовательности ДНК или РНК. Самым чувствительным, на сегодняшний день, является качественный ПЦР анализ. Именно с его появлением, наряду с термином «клиническая ремиссия» появилось понятие «молекулярная ремиссия» [36, 37, 101]. Наиболее универсальной мишенью для молекулярной диагностики МОБ у больных ММ служит \Т)1 перестройка гена тяжелой цепи иммуноглобулина (^Н) [85]. Неповторимый для каждого пациента характер перестройки гена ^Н определяет необходимость разработки эффективной методики подбора индивидуальных тест-систем. Разработка методики важна также для стандартизации процедуры молекулярного мониторинга МОБ у больных множественной миеломой, что необходимо для сопоставления результатов терапии, полученных в различных клиниках. Следует отметить, что при проведении молекулярного мониторинга МОБ у больных ММ после алло-ТГСК не учитываются особенности аллогенной трансплантации и инфузий донорских лимфоцитов, которые могут повлиять на эффективность молекулярного мониторинга.

Важной проблемой при организации молекулярного мониторинга у больных ММ после алло-ТГСК служит отсутствие диагностических образцов костного мозга (КМ). Как правило, аллогенные трансплантации проводятся в специализированных центрах, куда пациенты поступают после определенной терапии, приводящей к снижению опухолевой массы в КМ: В лучшем случае, для этих пациентов имеются образцы в виде цитологических препаратов КМ, полученных до начала терапии. Это не позволяет использовать для разработки тест-систем методики, основанные на обратно-транскриптазной ПЦР, материалом для которой служит тотальная РНК [7].

Все это и обусловило актуальность данного исследования.

Цель исследования

Разработать и апробировать в клинических условиях методики молекулярно-генетического мониторинга минимальной остаточной болезни после алло-ТГСК у больных множественной миеломой.

Задачи исследования

1. Разработать алгоритм подбора индивидуальных опухоль-специфичных тест-систем на основе клональной УБ1-перестройки гена ^Н для мониторинга МОБ у больных ММ.

2. Апробировать в клинических условиях и сравнить эффективность различных методик молекулярно-генетического мониторинга МОБ ММ, основанных на анализе опухоль-специфичной "УТЛ-перестройки гена ^Н (количественный ПЦР-анализ в режие "реального времени" и качественный ПЦР-анализ).

3. Выявить особенности использования разработанных тест-систем при молекулярной диагностике МОБ у больных ММ после проведения алло-ТГСК и инфузий донорских лимфоцитов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. УЕ)1-перестройка гена ^Н является стабильным маркером МОБ после проведения алло-ТГСК у больных ММ. Комплексирование качественного и количественного методов молекулярного анализа данного маркера обеспечивает надежный контроль эффективности терапии больных ММ при проведении алло-ТГСК и позволяет оперативно принимать терапевтические меры при превышении уровня молекулярной ремиссии.

2. Молекулярная диагностика клональной УЕ)1-перестройки гена ^Н обладает более высокой, по сравнению со стандартными методами анализа,

12

Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг МОБ у пациентов, получивших терапию с применением ауто-алло тандемного подхода, адоптивной терапии малыми дозами талидомида и ИДЛ. Аллогенная ТГСК проводилась со сниженной интенсивностью кондиционирования: флударабин (150 мг/м2), мелфалан (140 мг/м2), и анти-тимоцитарный глобулин (ATG: 3 х 10-20 мг/кг) три месяца спустя после л циторедуктивной ауто-ТГСК (мелфалан 200 мг/м ).

Практическая значимость

Внедрение результатов исследования в клиническую практику позволит повысить эффективность диагностики МОБ у больных ММ, что способствует своевременному принятию терапевтических мер по снижению риска рецидива заболевания.

Разработанный алгоритм может быть использован для сравнения режимов кондиционирования, для оценки эффективности иммуномодулирующей терапии, например, инфузий донорских лимфоцитов.

Апробация результатов исследования

Результаты исследования представлены на 30, 31 и 32 Ежегодных симпозиумах ЕВМТ (г. Барселона, Испания, 2004; г. Прага, Чехия, 2005; г. Гамбург, Германия 2006)[73, 75, 133, 135], на XVI съезде Wilsede «Modern Trends in Human Leukemias XVI», 2005 г. (Германия, г. Гамбург), конференции «Биотехнология и Онкология», 2005 г. (Санкт-Петербург)[9], на 46 и 47 ежегодных конференциях Американского гематологического общества (The American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition), 2004 г., 2005 г.[72, 74, 134].

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты настоящего исследования используются в Институте детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой ГОУ ВПО СПбГМУ им. академика И.П. Павлова (г. Санкт-Петербург) и в Центре трансплантации костного мозга Университетской клиники Эппендорф, г. Гамбург (Германия) для мониторига МОБ у больных ММ, а также в качестве эталона для разработки других методов анализа [77, 83].

Установленные в работе факты могут быть использованы в лекционных курсах ВУЗов медицинского и биологического профиля, а также в соответствующих учебниках, методических пособиях и руководствах.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них — 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК [8, 73, 76]. Соавторами работ, опубликованных по теме диссертации, являются: д.м.н. профессор Б.В. Афанасьев, MD профессор N. Kroger, MD профессор A. Zander, PhD профессор Fehse В., MD профессор Corradini P., MD профессор A. Nagler, MD A. Shimoni, MD F. Ayuk, PhD M.V. Lioznov, MD T. Zabelina, MD H. Schieder, H. Renges, S.Schwartz, A. Badbaran, M. Dietrich.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены в одной книге на 137 страницах текста, содержат 21 таблицу и 19 рисунков. Список использованных источников включает в себя 10 работ отечественных и 126 работ зарубежных

15 авторов. Диссертация состоит из: - 4 частей, в которых изложены результаты собственных исследований; - заключения, включающего и практические рекомендации; - выводов; - списка использованных источников.

Личный вклад автора

Разработка дизайна всех исследований, первичная обработка части клинического материала, все этапы молекулярного мониторинга, разработка методик, обобщение полученных результатов проведены автором самостоятельно. Изложение всех разделов диссертации, оформление работы выполнены соискателем.

1 Молекулярно-генетнческие методы анализа при мониторинге результатов терапии ММ. (Состояние проблемы)

Выводы

1. Разработанный в рамках настоящего исследования алгоритм для подбора опухоль-специфичных праймеров позволяет с минимальными затратами времени и материалов подбирать индивидуальные опухоль-специфичные тест-системы. Алгоритм учитывает особенности аллогенной трансплантации и инфузий донорских лимфоцитов, которые могут повлиять на эффективность молекулярного мониторинга. Это является важным шагом на пути стандартизации молекулярного анализа МОБ у больных ММ после алло-ТГСК.

2. Апробация в клинических условиях молекулярного мониторинга МОБ, выполненная для оценки эффективности терапии ММ на основе алло-ТГСК с режимами кондиционирования со сниженной интенсивностью доз показала, что данные методики являются эффективным инструментом для оценки МОБ у больных ММ после алло-ТГСК.

3. Комплексирование качественного и количественного методов ПЦР -анализа обеспечивает надежный контроль эффективности терапии. Высокая чувствительность качественного ПЦР анализа (1*106) позволяет использовать его для определения молекулярной ремиссии и выявления МОБ. Количественная ПЦР в реальном времени позволяет проводить динамический мониторинг МОБ.

4. Магнитная селекция CD138+ лимфоцитов с использованием аппарата MACS (Myltenyi Biotech) значительно повышает чувствительность количественного анализа при оценке МОБ у больных ММ с помощью разработанного алгоритма.

5. Специфичность тест-систем на основе перестройки гена IgH1 миеломного клона сохраняется в течение не менее 4,5 лет после аллогенной трансплантации.

Практические рекомендации

1. При внедрении молекулярного мониторинга МОБ больных ММ в клиническую практику рекомендуется использовать разработанный алгоритм и методику индивидуального подбора специфичных праймеров, это уменьшает трудоемкость операции подбора.

2. При мониторинге МОБ у больных ММ молекулярно-генетический анализ должен выполняться с учетом, следующих методических требований: после проведения алло-ТГСК и ИДЛ молекулярный мониторинг за эффективностью терапии необходимо продолжать только после завершения периода активной регенерации в КМ, продолжающейся в тучение 3-х месяцев после алло-ТГСК и между 3 и 6 месяцами после ИДЛ; для предотвращения ложно-положительных результатов необходимо подбирать тест-системы с учетом возможных нуклеотидных совпадений с репертуаром IgH регенерирующего КМ, в связи с чем наряду с анализом с терминальными V, D и J сегментами, необходимо выполнять теоретическое сравнение с библиотекой рекомбинированных VDJ последовательностей других В клеток;

115 во избежание получения ложно-отрицательных результатов не следует использовать тест-системы на основе клональной перестройки гена IgH с вариабельным участком V4-34; при тестировании праймеров на специфичность необходимо использовать не менее 10 Отрицательных контролей, полученных от здоровых доноров (ВС).

3. При комплексировании качественной и количественной методик анализа рекомендуется проводить количественную оценку МОБ при положительных результатах, полученных при качественном анализе и проводить качественный анализ при отрицательных результатах, полученных с помощью количественного анализа. Это необходимо как для определения MP, имеющей высокую прогностическую важность, так и для выявления ранних динамических изменений МОБ, что позволит своевременно скорректировать курс проводимой терапии.

4. Методика определения нуклеотидной последовательности опухолевой клональной перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина на основе ПЦР анализа ДНК дает возможность подбора индивидуальных тест-систем для пациентов, получавших ранее терапию в различных клиниках, при условии, что сохранен диагностический материал в виде ДНК, цитологических препаратов или замороженных клеток. Для обеспечения молекулярного мониторинга терапии ММ диагностические образцы КМ больных ММ с достаточным содержанием опухолевых клеток, полученные до начала терапии, необходимо помещать в банк ДНК, что, в дальнейшем, обеспечит возможность подбора индивидуальных высокоспецифичных тест-систем. Для реализации этого положения на практике необходимо в директивном порядке организовать такие банки ДНК во всех крупных лечебных заведениях, в которых проводится диагностика и терапия ММ, разработать инструктивные документы, рег

116 ламентирующие отбор, передачу в банк, хранение, доступ и обмен образцами ДНК.