Автореферат и диссертация по медицине (14.01.02) на тему:Молекулярно-генетические и клинические варианты синдрома резистентности к андрогенам

4856777

Колодкина Анна Александровна

Молекулярно-генетические и клинические варианты синдрома резистентности к андрогенам

14.01.02 - Эндокринология

- 6 ОКТ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2011

4856777

Работа выполнена в ФГУ «Эндокринологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской

Федерации

(Директор - академик РАН и РАМН, профессор И.И.Дедов)

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

Тюльпаков Анатолий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Болотова Нина Викторовна доктор биологических наук, профессор Рубцов Петр Михайлович Ведущая организация: Российский национальный

исследовательский медицинский

университет имени Н.И. Пирогова

Защита состоится «26» октября 2011 г. в 14 часов на заседай!

Диссертационного совета Д. 208.126.01 в ФГУ «Эндокринологический научнь

центр» Минздравсоцразвития по адресу: Москва,

ул. Дм.Ульянова, дом 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ЭН Минздравсоцразвития

Автореферат разослан «23» октября 2011 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Е.А.Трошин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Одной из причин, приводящих к нарушению формирования пола у мальчиков (НФП 46XY), является нарушение периферического действия андрогенов. К этой группе заболеваний, характеризующейся НФП при сохранной продукции тестостерона яичками, на данный момент принято относить две нозологические формы - синдром резистентности к андрогенам (CPA) и дефицит 5а-редуктазы второго типа (5-APII). Несмотря на то, что эти два состояния могут иметь аналогичные клинические проявления (отсутствие производных мюллеровых протоков при различной степени маскулинизации наружных гениталий, варьирующей от феминного строения до микропениса), в их основе лежат различные патогенетические механизмы.

CPA - заболевание, имеющее Х-сцепленный рецессивный характер наследования, представляет собой полную или частичную нечувствительность тканей к мужским половым гормонам. Дефицит 5-APII - аутосомно-рецессивная форма НФП 46XY, обусловленная дефектом периферической конверсии тестостерона (Т) в дигидротестостерон (ДГТ), более активный андроген, обладающий большим сродством к андрогеновому рецептору и играющий основную роль в формировании наружных гениталий у плода мужского пола. В период новорожденное™, когда необходимо определить пол воспитания ребенка, дифференцировать по клинической картине эти состояния невозможно. При гормональном обследовании у пациентов с нарушением периферического действия андрогенов определяется нормальный или повышенный уровень Т. Диагностическим критерием для дефицита 5-APII считается повышенное соотношение Т/ДГТ в крови, который в норме не превышает 25. Однако, на данный момент разными авторами отмечена недостаточная информативность данного критерия, особенно у детей допубертатного возраста.

Патогенез CPA обуславливает выбор женского пола воспитания ввиду неэффективности терапии андрогенами во взрослом возрасте, в то время как при дефиците 5-APII вероятное влияние Т на дифференцировку головного мозга во внутриутробном периоде и выраженная маскулинизация в пубертате, а также выраженный маскулинизирующий эффект от терапии, проведенной в раннем возрасте, делают предпочтительным выбор мужского пола воспитания.

Вклад этих заболеваний в структуру НФП 46XY в российской популяции изучен

недостаточно. В литературе имеются данные исследования гена AR лишь у небольшого

числа пациентов с НФП 46XY, которые были получены без учета секвенирования экзона

3

1. Молекулярно-генетическая верификация дефицита 5-АРИ ранее не проводилась: двух исследованиях, основанных на результатах клинико-гормонального обследован больных с НФП 46ХУ, была отмечена высокая встречаемость дефицита 5-АР составившая 46% и 61% .

В настоящем исследовании среди российских пациентов с НФП 46ХУ нами бы. оценена встречаемость дефектов генов АИ и 5Я05Л2 в структуре нарушен: периферического действия андрогенов. Выявление молекулярных дефектов указанш генов проводилось по результатам полного секвенирования их кодирующ последовательностей и примыкающих фрагментов интронов.

Цель исследования:

Исследовать роль дефектов генов АИ и 5Я05А2 в структуре НФП 46Х обусловленных нарушением периферического действия андрогенов.

Задачи исследования:

1. Среди больных с НФП 46ХУ по клинико-гормональным критериям (вкпюч; ЖХ-МС/МС) выделить группу пациентов с нарушением периферическо действия андрогенов

2. Оценить распространенность дефектов генов АЯ и 8РЮ5А2 при НФП 46Х обусловленного нарушением периферического действия андрогенов

3. Оценить роль гормональных методов исследования в дифференциальж диагностике синдрома нарушения периферического действия андрогенов

4. Провести анализ корреляции генотип-фенотип в группе пациентов выявленными мутациями

Научная новизна:

Впервые в России проведено полное исследование кодирующ« последовательности гена АИ у 77 пациентов с нарушением периферического действ1 андрогенов. Выявлено 24 мутации у 29 пациентов с нарушением периферическо! действия андрогенов. Из 24 выявленных мутаций в гене АИ 12 мутаций (50%) были ране описаны и 12 (50%) описываются впервые. Наибольшее число мутаций нами бы/ выявлено в ранее не исследовавшемся зкзоне 1, что составило 25%.

Доказано отсутствие достоверных гормональных критериев дифференциальной диагностики различных форм нарушений формирования пола с сохранной секрецией тестостерона в допубертатный период, в том числе доказана неинформативность определения соотношения Т/ДГТ у пациентов допубертатного возраста.

Впервые в России описаны случаи дефицита 5-APII (3 пациента) с молекулярно-генетическим подтверждением диагноза. Показана низкая частота данного заболевания в структуре НФП 46XY.

В ходе работы также было выявлено два пациента с дефицитом 17(3-гидроксистероиддегидрогеназы 3 типа (17ГСДЗ), наблюдавшиеся ранее с диагнозом «синдром резистентности к андрогенам, неполная форма». Диагноз был подтвержден молекулярно-генетически.

Практическая значимость:

Показано, что при нарушении периферического действия андрогенов 41,6% случаев НФП 46XY с неоднозначным строением гениталий вызваны дефектами генов AR и SRD5A2, остальные случаи требуют уточнения причин данного состояния и поиска других патогенетических факторов.

Исследование гормонального профиля (включая определение соотношения Т/ДГТ) не позволяют провести дифференциальную диагностику между CPA и дефицитом 5-APII, таким образом всем пациентам с НФП 46XY с сохранной секрецией Т показано последовательно исследовать гены AR и SRD5A2.

На основании полученных данных разработан алгоритм дифференциальной диагностики заболеваний у пациентов с НФП 46XY.

Полученные данные могут быть использованы для проведения пренатальной диагностики в семьях с верифицированным прежде молекулярно-генетическим диагнозом.

Апробация работы.

Основные результаты исследования по материалам диссертации доложены на всероссийском конгрессе "Современные технологии в эндокринологии" (23-26 ноября 2009, г. Москва), на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (14-18 мая 2010 г, г. Ростов-на-Дону), на конгрессе «Молекулярные основы клинической медицины, возможное и реальное» (6-9 июня 2010 г, г. Санкт-Петербург). Диссертация апробирована на межотделенческой конференции ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий (17 декабря 2010 года).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в журнале, рецензируемом ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, состоит из введени 4 глав (обзора литературы, материалов и методов исследования, результат! собственных исследований, обсуждения), выводов, практических рекомендаций, спис литературы, включающего 7 отечественных и 126 зарубежных источника. Рабо' содержит 15 таблиц и 21 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Из первоначальной когорты 124 пациентов с НФП 46ХУ было отобрано 77 больных нарушением периферического действия андрогенов, критериями которого являло! отсутствие дериватов мюллеровых протоков, а также наличие сохранного биосинте: тестостерона, оцененного по данным исследования базального профиля стероидов и; (и) после стимуляции ХГЧ. Медиана возраста на момент обследования составила 6 Л! (от 5 месяцев до 50 лет). Семейный анамнез был отягощен по НФП 46ХУ у 12 пациенто В зависимости от степени нарушения строения наружных гениталий больные бьи распределены по группам:

Группа 1. 16 (20,8%) пациентов с правильным женским строением наружнь гениталий. Все они были зарегистрированы в женском поле. 7 пациенток из этой групп были допубертатного возраста, и поводом для обращения послужило обнаружение яич! в содержимом паховых грыж или опухолевидных образований в области паховых канало 9 других больных обратились в период полового созревания с жалобами на отсутсты менструаций. Средний возраст первичного обращения составил 11,6±6 лет.

Группа 2. 21 (27,3%) пациент, у которых отмечалась незначительная вирилизац! наружных гениталий (1-2 по шкале Прадера). В данной группе отмечался самый ранн1 возраст обращения к эндокринологам 5,6±5 лет. 9 человек из 21 были зарегистрирован в женском поле (42,9%), из них только у 3 в роддоме был установлен диагноз НФП, другие 6 обратились для обследования позже, когда родители самостоятелы обнаружили объемные образования в губомошоночных складках. У 12 пациентов (57,1° из группы 2 был установлен мужской пол при рождении.

Группа 3. 40 (51,9%) больных с выраженной вирилизацией (3-5 по шкале Прадерг Все пациенты были зарегистрированы в мужском поле. Средний возраст первично! обращения составил 8±6,1 лет.

В зависимости от возраста пациентам проводилось гормональное обследовани которое для детей допубертатного возраста включало определение базальных

стимулированных на пробе с ХГЧ уровней Т и ДГТ. У пациентов, достигших половой зрелости, определялись уровни ЛГ, ФСГ, Т. Всем пациента был выполнен анализ гена АИ. Пациентам, у которых не были выявлены мутации в гене АИ, исследовался ген 5Я05Л2.

Методы обследования Гормональные исследования:

Определение Т, ЛГ, ФСГ проводилось на автоматическом анализаторе Vitras ECi (Johnson&Johnson, Ortho-Clinical Diagnostics) (гормональная лаборатория ФГУ ЭНЦ), андростендион и ДГТ определялись иммуноферментными методами с использованием коммерческих наборов (лаборатория ООО «Научный Центр ЭфиС»), Дополнительно исследование стероидного профиля в сыворотке крови (мультистероидный анализ) проводилось методом тандемной хромато-масс-спектрометрии на приборе Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS с использованием источника ионизации ESI (лаборатория отделения наследственных эндокринопатий ФГУ ЭНЦ).

При исследовании стероидных гормонов определялись их базальные уровни, а также показатели через 72 ч после 3-дневной стимуляции ХГЧ (2000 Ед м2/сут).

Рассчитывалось соотношение Т/ДГТ, при этом оба показателя выражались в нмоль/л.

Молекулярно-генетические исследования

Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. С помощью ПЦР амплифицировали фрагменты геномной ДНК, включающие кодирующие последовательности генов AR и SRD5A2 с примыкающими участками интронов (рис.1). После электрофореза в 1% агарозном геле продукты ПЦР выделяли и очищали с использованием набора Wizard PCR Preps DNA Purificaion System и затем секвенировали на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer Model 3130 (Applied Biosystems).

I II III IV V VI VII VIII

F E1?2 ^¡R

ЁТрЗ

E2F E2R E3F E3R E4F E4R E5F E5R E6F

Ген AR

I II III IV V

Е1Р Е1Я Е2Р ЕЗЯ Е4Р Е4Я Е5Р Е5Р

Ген 8И05А2

Рис.1 Схематичное изображение генов и используемых олигонуклеотидов

Для ПЦР и секвенирования гена АЯ использовались следующие олигонуклеотиды: АК_Е1 F: б'-СССАТСАТСАСАСССТСТТСА-З', АК_Е1 К: б'-СССАССТАССАСССССТАСА-З', АК_Е1 Р2: б'-ССТССАТСАССААСАССААССТ -3', А1Ч_Е1 РЗ: б'-ССТСТСССТСССАСТССТТСТ-З', АКЕ1И2: 5 -СТССССТСССТСАССАТСТС-3', АК_Е2Р: 5'-ССТСАСАСТТСАСТТСССТАТТТСТС-3', АК_Е2К: б'-СССТТСССААТСАСТСТАТТТСТСА-З', АК_ЕЗР: б'-ОТССАСАТАТСАТСАССАТСТСААТТС-З', АК_ЕЗР: б'-СССТСАСССТСТСТСТАСАССАТ-З', АИ_Е4Р: б'-САСТСТСТСАССАСССАСААТССТ-З', АИ_Е4К: б'-ССАТСАСТССТСтеСАТСААТС-З', АК_Е5Р: 5'-СССССААТАССАСАССАТСТС Т-3', АВ_Е5Я: 5'-СССАСААСТССАСАТСАААТСАС-3', АК_Е7Р: 5'-СССССААССАСАСАСАСТТСА-3', АЯ_Е6Р: 5'-ССАСССАТСССААТСАСАСАСАТТС-3', АК_Е8К: б'-СССААСССАСТССАСАОСАСТАСТС-З',

Для ПЦР и секвенирования гена 8КЭ5А2 использовались следующ^ олигонуклеотиды:

8КО_Е1Р:5'-САСССССССАТССАССТТСАС-3', ЗКО_Е1К:5'-ССТТССТСССТССССССТСТАС-3', 5ЯО_Е2Р:5,-СТССТСТСАССТТААСАААСАС-3', ЭКО_ЕЗН: б'-САСТСТССССТСТССАТСТС-З', ЗКЭ_Е4Р: 5'-САСССАСССТССАСССССАС АТ-3', SRD_E4R: 5'-СТССТАСТСТСАТССАССТААСТТС-3', SRD_5F: б'-СССТСТСССААССАСАААТААС-З', SRD_5R: 5'-СССАССССАССТСССАСААС-3'

В качестве референсных последовательностей кДНК для генов AR, SRD5A2 и HSD17B3 использовались ссылки Genbank (http://vww.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) под номерами М20132.1, М74047 и NM_000197.1, соответственно.

Обозначение мутаций проводили в соответствии с рекомендациями Den Dünnen и Antonarakis.

Статистический анализ проводился с помощью пакета статистических программ Statistica 8.0. При непараметрическом распределении для анализа различий данных применялся критерий Манна-Уитни для несвязанных групп. Достоверным считался уровень значимости р<0,05. Выявление корреляционной зависимости проводилось с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ НАБЛЮДЕНИЙ

Результаты и обсуждение

Нами было обследовано 124 пациента с НФП 46XY, в соответствии с нашими критериями было отобрано 79 пациентов из 74 семей.

В ходе дальнейшего обследования, у двух пациенток, пубертатного возраста, наблюдавшихся с диагнозом «тестикулярная феминизация», на основании значительного повышения уровня андростендиона был заподозрен дефицит 17ГСДЗ. Дефицит 17ГСДЗ был в обоих случаях подтвержден молекулярно-генетически - выявлены следующие мутации в гене HSD17B3: c.728-734delGATAACCp.l244fsX254/c.277+4A>T и с.277+4А>Т. Представленные случаи являются первым описанием дефицита 17ГСДЗ в отечественной литературе. Мутация 734delGATAACCp.l244fsX254/c.277+4A>T описывается впервые, с.277+4А>Т описана ранее и является одной из часто встречаемых мутаций.

Окончательно в группу с нарушением периферического действия андрогенов было включено 77 пациентов. Медиана возраста на момент обследования составила 6 лет (от 5 месяцев до 50 лет).

Во всех случаях при гормональном обследовании определялся нормальный или высокий уровень Т и ДГТ (после стимуляции ХГЧ). Подробно результаты гормонального исследования изложены в табл. 1 и табл. 2.

Таблица 1. Результаты исследования уровня Т и ДГТ у пациентов допубертат>. возраста на фоне проведения 3-дневной пробы сХГЧ.

группа 1 (5 пациентов) группа 2 (15 пациентов) группа 3 (26 пациентов)

Т (нмоль/л) 10,4±5 13,3±9,7 11,8+10,8

ДГТ (нмоль/л) 2,6±3,4 1,6±1.15 1,6±1,4

т/дгт 6,6±3,6 11,5+10,6 11,9±10,7

Таблица 2. Результаты гормонального обследования у пациентов достигши пубертатного возраста

группа 1 (9 пациентов) группа 2 (1 пациент) группа 3 (14 пациентов)

ЛГ (Ед/л) 20,6±4,5 10,1 8,1±5,6

ФСГ (Ед/л) 8,3±8,9 4 6,6±3,4

Т (нмоль/л) 23,5±7,6 37 38,3±14,6

Всем 77 пациентам был проведен анализ гена AR, в результате чего был выявлено 24 мутации у 29 пациентов, что подтвердило в этих случаях диагноз CPA (Ta6j 3). Мутация А596Т была выявлена у 2 неродственных пациентов. Мутация R840I выявлена у 2 сибсов с НПФ CPA, и мутация N705S у 3 пациенток из одной семьи с полно формой CPA {2 сестры и тетя).

Мутации были выявлены по всей длине последовательности гена AR: в экзоне ' кодирующем трансактивационный домен гена, обнаружено 25 % мутаций, в экзонах 2 и ; кодирующих ДНК-связывающую область, выявлено 12,5%, и в экзонах 4,5,6,7 и { кодирующих лиганд-связывающий домен, выявлено 62,5% мутаций. Следует отметить что в базе данных мутаций гена AR (http://www.mcgill.ca/androgendb/) дефекты в перво! экзоне встречаются существенно реже, чем в остальных экзонах гена.

Таблица 3. Мутации выявленные в гене AR у пациентов

Мутация Замена нуклеотидов Характеристика мутации Экзон Домен Форма эабопевания

Q114X САА—»ТАА нонсенс 1 Трансактивационный домен Полная форма CPA

Е522Х GAA—TAA нонсенс 1 Трансактивационный домен Полная форма CPA

c.491delTp.L164feX172 делеция одного нуклеотида 1 Трансактивационный домен Полная форма CPA

G324S GGC-AGC миссенс 1 Трансактивационный домен Неполная форма CPA

G258R GGG—AGG миссенс 1 Трансактивационный домен Неполная форма CPA

с.163 171 ins CTGCTG p.L55 Q58insLL вставка Трансактивационный домен Неполная форма CPA

Del E2 делеция экэона 2 2 ДНК-свяэывающий домен Полная форма CPA

T575I ACT—»АТТ миссенс 2 ДНК-свяэывающий домен Неполная форма CPA

A596T (выявлена у двух неродственных пациентов) GCC—»АСС миссенс 3 ДНК-связывающий домен Неполная форма CPA

N705S AAT-AGT миссенс 4 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

F697L ТТТ-СТТ миссенс 4 Лиганд-связывающий домен Неполная форма CPA

W741L TGG-TTG миссенс 5 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

A765V GCC-TCC миссенс 5 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

Полная форма CPA A748V GCG-*GTG миссенс 5 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

F725L ТТС—СТС миссенс 5 Лиганд-связывающий домен Неполная форма CPA

S778P ТСС-ССС миссенс 6 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

Y781C ТАС—»TGC миссенс 6 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

R831X CGA-»TGA нонсенс 7 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

V866M GTG-ATG миссенс 7 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

D828V GAT-+GTT миссенс 7 Лиганд-связывающий домен Неполная форма CPA

I842T ATT—»ACT миссенс 7 Лиганд-связывающий домен Неполная форма CPA

R840H CGT-CAT миссенс 7 Лиганд-связывающий домен Неполная форма CPA

V889M GTG-ATG миссенс 8 Лиганд-связывающий домен Полная форма CPA

М895Т ATG-ACG миссенс 8 Лиганд-связывающий домен Неполная форма CPA

Жирным шрифтом выделены впервые описываемые мутации

Однако, в двух недавно проведенных исследованиях также отмечена вы&. частота мутаций в экзоне 1 (около 20%). Эта ситуация, по-видимому, связана с тем, ч-экзон 1 кодирует более половины белка андрогенового рецептора, и в более рант исследованиях не представлялось возможным исследовать этот участок гена. Вс мутации, выявленные в экзоне 1, ранее описаны не были.

Из 24 выявленных нами мутаций в гене AR 12 мутаций (50%) были ранее описан! 12 мутаций (50%) выявлены впервые. Среди них мутации Q114X, Е522Х и c.491de p.L164feX172 приводили к преждевременному прерыванию трансляции белка АР, ожидаемому полному нарушению его функции. В пользу патологической значимое! других впервые выявленных нами мутаций могут свидетельствовать консервативное! заменяемых аминокислотных остатков, а также их местоположение. Так, мутации G324! G258R и c.163_171ins CTGCTG p.L55_Q58insLL расположены в трансактивационно домене гена AR. Можно предположить, что они приводят к нарушению трансактивации нарушению N- и С-концевого взаимодействия двух молекул АР при образована гомодимера, что принципиально важно для общей транскрипционной активност рецептора. Мутация T575I наиболее вероятно приводит к нарушению ДНК-связывающе способности рецептора, в то время как мутации F697L, A748V, S778P и Y781C локализованные в лиганд-связывающем регионе белка АР, предположительно вызывак нарушение связывания рецептора с гормоном.

Мы провели анализ консервативности измененных в результате миссенс-мутаци аминокислотных остатков. Как видно (табл. 4), большинство изучаемых позиций был высоко консервативны, что с большой степенью вероятности может свидетельствовать функциональной значимости выявленных изменений.

Нонсенс-мутации, делеции и сплайсинг-мутации определялись у пациентов групп 1 (полная форма CPA). Миссенс-мутации выявлялись у пациентов со всеми формам заболевания (55,2% - группа 1, 44,8% - группы 2 и 3), однако значимой корреляции межд формами заболевания и местоположением мутации не обнаружено (г=-0,034, р=0,87).

Таблица 4. Анализ консервативности последовательностей белков андрогенового рецептора из разных групп Позвоночных

Мутация G258R G324S T575I F697L A748V S778P Y781C D828V

Дефектная последовательность SPREQ SLSCS ALICC DSLAA VFVMG HKPRM RMCSQ PWGL

Homo sapiens (человек) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VF'AM G HKSRM RMYSQ PVDGL

Pan troglodytes (шимпанзе) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

Callithrix jacchus (игрунка) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VF AM G HKSRM RMYSQ PVDGL

Eulemur fulvus collaris (лемур) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

Equus caballus (лошадь) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

Bos taurus (бык) SPGEQ SLSCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

Sus scrofa (свинья) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

Crocuta crocuta (гиена) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

Mus musculus (мышь) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

Rattus norvegicus (крыса) SPGEQ SLGCS ALTCG DSFAA VFAMG HKSRM RMYSQ PVDGL

В нашей когорте пациентов мутации в гене AR выявлены в 37,66% случаев. В аналогичных исследованиях выявляемость мутаций в гене AR составила 44,4% и 40,4%.

Мутации в группе 1 (фенотип полной формы CPA) были доказаны в 93,75%, что существенно выше, чем в группах 2 и 3 (фенотип неполной формы CPA, 27,45%). Эти данные согласуются с данными аналогичных исследований, где доказанные мутации у пациентов с полной формой CPA составляли 83-85%, а при неполной форме CPA 1624,8%.

У 40 пациентов с невыявленными мутациями в гене AR исследовался ген SRD5A2. Ген SRD5A2 не исследовался у 8 пациентов, у которых очевидно прослеживался X-сцепленный вариант наследования и у пациентов с выраженной гинекомастией.

У 3 из 40 больных выявлены составные гетерозиготные мутации в гене SRD5A2. c.599_600delA p.E200feX278/p.Y91 Н, p.AI5S/p.E197K и c.599_600delA p.E200feX278/G196S. Данные мутации ранее не описаны. Во всех случаях родители являлись гетерозиготными носителями данных мутаций. Эти 3 пациента клинически были включены в группу 2. При рождении они были зарегистрированы в женском поле, а после уточнения диагноза пол воспитания был сменен с женского на мужской.

□ АК(-), 5РШ5А2(-) ^ АИ(+) В ЗРЮ5А2(+)

Рис. 2 Выявляемость мутаций в зависимости от степени маскулинизации С целью выявления возможных гормональных маркеров для дифференциальной диагностики были проанализированы гормональные показатели у пациентов с выявленными мутациями в генах AR, SRD5A2 и у пациентов с неуточненным диагнозом. Было выявлено достоверное повышение уровня ЛГ у пациентов пубертатного возраста с выявленными мутациями в гене AR по сравнению с пациентами этой же возрастной группы, но с неуточненным диагнозом. По остальным показателям достоверных различий в группах у пациентов с доказанными мутациями в гене AR и SRD5A2 и таковыми с неверифицированным диагнозом обнаружено не было (рис. 3).

s

5 5

0

1 4 к

Ч 3

SRD5A2 (*)

AR(-), SRD5A2 (-)

з Median □ 25%-75% - X Min-Мак

Ч 20

SRD5A2 (•) AR(-), SRD5A2 (->

Рис. 3 Уровни ДГТ и соотношение Т/ДГТ у детей допубертатного возраста AR(+) - пациенты с молекулярно-генетически подтвержденным CPA SRD5A2(+) - пациенты с доказанным дефицитом 5-APII AR(-),SRD5A2(-) - пациенты с неуточненным диагнозом

Следует подчеркнуть, что по результатам гормонального обследования не выявлено разницы в гормональных показателях и разницы в значениях соотношения Т/ДГТ у пациентов с доказанными мутациями в гене SRD5A2 и другими пациентами. Диагностическим критерием дефицита 5-APII является повышение соотношение Т/ДГТ в крови выше 25. В 3 случаях дефицита 5-APII оценка Т/ДГТ соотношения оказалась не информативной: соотношение Т к ДГТ на фоне стимуляции ХГЧ соответствовало

нормальным значениям (7,66; 7.85; 7,8). Соответственно, гормональная диагностика не имеет достаточной диагностической ценности и не позволяет дифференцировать дефицит 5-АРИ и СРА

При молекулярно-генетическом подтверждении диагноза дефицит 5-АРИ был выявлен нами лишь у 3 из 77 пациентов (3,9%). По данным зарубежных исследований частота встречаемости дефицита 5-АРП среди пациентов с НФП 46ХУ варьирует от 14,6 % до 20% в зависимости от частоты близкородственных браков в популяции. По ранее опубликованным российским данным дефицит 5-АРМ составил 46% - 61% от общего числа пациентов с НФП. В другой работе, автором диагностирован дефицит 5-АРП у 364 человек из 595 пациентов с НФП 46ХУ, однако, приведенные данные не были подтверждены молекулярно-генетически.

Из 29 пациентов с доказанным дефектом АЯ 16 пациентов, были первоначально зарегистрированы в женском поле (среди них 15 - из группы 1), а 13 человек при рождении зарегистрированы в мужском поле (группа 2, группа 3). После уточнения диагноза пол был изменен на женский у 2 больных. У остальных, несмотря на плохую перспективу адаптации, был сохранен мужской пол, так как диагноз был поставлен поздно (рис. 4).

2 группа

SRD5A2(+)

3 группа

AR(+L

AR(+)

SRD5A2(+)

AR(+)

Рис. 4. Смена пола воспитания по результатам проведенного обследования у пациентов с неправильным строением гениталий (группы 2 и 3). AR(+) - пациенты с молекулярно-генетически подтвержденным CPA. SRD5A2(+) - пациенты с доказанным дефицитом 5-АРП.

Из 5 пациентов группы 2 с CPA один больной был зарегистрирован в женском поле, другие 4 пациента воспитывались в мужском поле. После уточнения диагноза смена паспортного пола на женский была изменена только у одного пациента. В группе 3 все 9 пациентов с CPA при рождении были зарегистрированы в мужском поле, смена пола на женский также проведена только у одного пациента. Всем 3 пациентам с доказанным дефицитом 5-APII пол воспитания был сменен с женского на мужской. Мы столкнулись с проблемой поздней диагностики в группах 2 и 3, в которых средний возраст обращения к эндокринологу составил 6 лет (минимальный - 3 недели). В 17,8% случаев паспортный пол был определен на основании кариотипа, в остальных случаях - только на основании строения наружных половых органов. В группе 1 средний возраст первичного обращения составил 11,6±6 лет, что имеет объективные причины, поскольку заболевание выявляется при обнаружении гонад или при обращении по поводу первичной аменореи. Уточнение диагноза в раннем возрасте в этой группе не имеет столь решающего значения, так как пол воспитания является однозначно женским.

Ранняя диагностика заболевания наиболее важна у пациентов с минимальной вирилизацией, так как именно в этой группе пациентов больше всего вопросов о половой принадлежности ребенка.

У 45 пациентов (58,4%) причина НФП осталась неясна. В группе 1 диагноз не был подтвержден у 1 пациентки (6,25%), с классической картиной полной формы CPA.

Среди пациентов с неоднозначными гениталиями диагноз не установлен у 44 пациентов (72,1%). У 3 пациентов, достигших пубертатного возраста, клиническая картина заболевания соответствовала неполной форме CPA, у 1 из этих пациентов семейный анамнез указывал на Х-сцепленный характер наследования заболевания. Возможно, что у этих пациентов и у пациентки из первой группы, имеются дефекты в интронной части гена AR, которые приводят к нарушению сплайсинга, и, соответственно, к синтезу неполноценного белка рецептора. Другим вероятным объяснением может быть дефект или нарушение соотношений белков-корегуляторов, при непосредственном взаимодействии с которыми стимулируются андроген-чувствительные элементы. На данный момент известно около 150 коактиваторов и корепрессоров для андрогенового рецептора, механизм действия которых еще до конца не изучен.

Выводы:

1) У пациентов с НФП 46XY с правильным женским строением наружных гениталий наиболее часто выявляется дефект гена AR (93,75%).

2) Более половины случаев НФП 46XY с нарушением периферического действия андрогенов с неоднозначным строением гениталий не обусловлены дефектами генов AR и SRD5A2, что требует уточнения причин данного состояния и поиска других патогенетических факторов

3) В Российской популяции дефицит 5-APII является редкой патологией в структуре нарушения формирования пола 46XY.

4) Исследование гормонального профиля (включая определение соотношения Т/ДГТ) не позволяет провести дифференциальную диагностику между CPA и дефицитом 5-APII у детей допубертатного возраста

5) Всем пациентам с НФП 46XY, обусловленным нарушением периферического действия андрогенов, необходимо исследовать гены AR и SRD5A2

Практические рекомендации:

Наиболее актуальным вопросом для практического врача является определение пола воспитания у новорожденных с неправильным строением наружных гениталий. Поставить точный диагноз необходимо в максимально ранние сроки с целью оптимальной психосоциальной адаптации. По результатам нашей работы был разработан следующий алгоритм обследования пациентов с НФП 46 ХУ:

1. В случае отсутствия дериватов мюллеровых протоков в первую очередь целесообразно исследовать мультистероидный профиль методом тандемной хромато-масс-спектрометрии на фоне проведения стимуляционной пробы с ХГЧ, что позволит сразу исключить различные формы нарушения стероидогенеза, а также дефект рецептора к ЛГ. При невозможности использования тандемной хромато-масс-спектрометрии на пробе с ХГЧ оцениваются показатели: андростендион, Т.

2. При выявлении высокого уровня Т на стимуляции ХГЧ следует подозревать состояния, связанные с нарушением периферического действия андрогенов. Соотношение Т/ДГТ не имеет достаточной диагностической ценности в дифференциальной диагностике CPA и дефицита 5-APII. Следующим этапом являются молекулярно-генетические методы исследования.

3. Первоначально следует проводить исследование гена AR, так как данная нозология имеет более высокую частоту встречаемости. Проводится последовательным секвенированием всех экзонов данного гена. Нами предложена модификация анализа гена AR: реакция ПЦР для экзонов 6, 7 и 8 проводится одномоментно с праймерами 6F и 8R, что позволяет сократить время исследования и снизить стоимость анализа.

4. При отсутствии дефектов в гене AR, проводят анализ гена SRD5A2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Клиническая, гормональная и молекулярно-генетическая характеристики трех случаев нарушения формирования пола (НФП) 46XY, обусловленного дефицитом 5а-редуктазы II типа. /Колодкина A.A., Карманов М.Е., Калинченко Н.Ю., Нижник А.Н., Нокель М.А., Файзулин А.К., Тюльпаков А.Н. //Проблемы эндокринологии. 2010, Том 56, №3, стр. 34-40

2. Молекулярно-генетическая верификация двух случаев нарушения формирования пола 46XY, обусловленных дефицитом 5а-редуктазы II типа. /Колодкина A.A., Карманов М.Е., Калинченко Н.Ю., Тюльпаков А.Н.// Сборник тезисов. VII Всероссийская научно-практическая конференция «Приоритетный национальный проект «Здоровье», задачи детской эндокринологии в его реализации», 2009, стр.46

3. Анализ генов андрогенового рецептора (AR) и 5а-редуктазы II типа (SRD5A2) при нарушении формирования пола 46XY. /Колодкина A.A., Карманов М.Е., Калинченко Н.Ю., Тюльпаков А.Н.// Сборник тезисов. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков «Молекулярные основы наследственной патологии», 2010, стр.87

4. Клиническая, гормональная и молекулярно-генетическая характеристики двух случаев нарушения формирования пола (НФП) 46XY, обусловленного дефицитом 17р-гидроксистероиддегидрогеназы 3 типа. /Колодкина A.A., Калинченко Н.Ю., Нижник А.Н., Нокель М.А, Тюльпаков А.Н. //

Проблемы эндокринологии. 2011, Том 57, №3, стр.25-30

5. Дефекты генов AR и SRD5A2 у пациентов с нарушением периферического действия андрогенов. /Колодкина A.A., Калинченко Н.Ю., Нижник А.Н., Файзулин А.К., Карманов М.Е., Тюльпаков А.Н.// Проблемы эндокринологии. 2011, Том 57, №5

Список сокращений 17ГСДЗ - 17(3-гидроксистероиддегидрогеназа 3 типа 5-АРИ - 5а-редуктаза 2 типа АР - андрогеновый рецептр ДГТ - дигидротестостерон

ЖХ-МС/МС - метод жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии

ЛГ-лютеинизирующий гормон

НФП 46ХУ - нарушение формирования пола

СРА - синдром резистентности к андрогенам

Т - тестостерон

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

Подписано в печать: 23.05.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 815 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Актуальность темы.

Одной из причин, приводящих к нарушению формирования пола у мальчиков (НФП 46XY), является нарушение периферического действия андрогенов. К этой группе заболеваний, характеризующейся НФП при сохранной продукции тестостерона яичками, на данный момент принято относить две нозологические формы - синдром резистентности к андрогенам (CPA) и дефицит 5а-редуктазы второго типа (5-APII). Несмотря на то, что эти два состояния могут иметь аналогичные клинические1 проявления (отсутствие производных мюллеровых протоков при различной' степени маскулинизации наружных гениталий, варьирующей от феминного-строения до микропениса), в их основе лежат различные патогенетические механизмы.

CPA - заболевание, имеющее Х-сцепленныи рецессивный, характер' наследования, представляет собой полную или частичную нечувствительность тканей к мужским половым,гормонам. Дефицит 5-АР1Г - аутосомно-рецессивная форма НФП 46XY, обусловленная дефектом периферической конверсии-тестостеронаs(T) в дигидротестостерон (ДГТ), более активный андроген, обладающий, большим сродством- к андрогеновому рецептору и играющий, основную роль в формировании' наружных гениталий у плода мужского пола. В период- новорожденности, когда необходимо определить пол воспитания ребенка, дифференцировать по клинической картине эти состояния невозможно. При гормональном обследовании у пациентов с нарушением периферического действия андрогенов определяется нормальный или повышенный уровень Т. Диагностическим критерием для дефицита 5-APII считается повышенное' соотношение Т/ДГТ в крови, который в норме не превышает 25. Однако, на данный момент разными авторами отмечена недостаточная