Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Острые лейкозы с перестройками генов BCR/ABL и гена MLL

На правах рукописи

Вернюк Мария Андреевна

ОСТРЫЕ ЛЕЙКОЗЫ С ПЕРЕСТРОЙКАМИ ГЕНОВ BCR/ABL

И ГЕНА MLL

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук Е.Н. Паровичникова

кандидат биологических наук А.В. Мисюрин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. И. Дризе

доктор медицинских наук, профессор А. К. Голенков

Ведущее научное учреждение:

Государственное учреждение Научно-Исследовательский Институт детской гематологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится ^ М&Я^ 2005 г. в., час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.042.01 при Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 125167 Москва, Новозыковский проезд, д.4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Автореферат разослан 2005 года

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

Актуальность проблемы

В настоящее время ни одно клиническое исследование, направленное на улучшение результатов терапии острых лейкозов (ОЛ), не проводится без определения цитогенетических маркеров опухолевых клеток. Исходное выделение факторов риска позволяет с самого начала выбрать необходимую терапевтическую тактику в зависимости от выявленных изменений.

Приблизительно у 5-10% больных ОЛ не удается получить достаточного для цитогенетического исследования количества метафаз. Кроме того, у трети больных с эффективным цитогенетическим анализом определяется нормальный кариотип. Поэтому, для выявления химерных генов или продуктов их транскрипции как при первичной диагностике ОЛ, так и в динамике заболевания используют более чувствительные методы: флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH) и обратнотранскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР).

Молекулярно-генетическая характеристика отдельных вариантов ОЛ позволяет выбирать прецизионную, а не унифицированную терапевтическую тактику. К одним из самых достоверных прогностических признаков, обусловливающих неудовлетворительные результаты лечения ОЛ, относят обнаружение t(9;22)(q34;q11) или ее молекулярного эквивалента химерного BCR/ABL и перестроек с участием региона q23 хромосомы 11, в частности, частичной тандемной дупликации (ЧТД) гена MLL BCR/ABL-позитивные острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ) составляют 20-50% ОЛЛ взрослых [Bloomfield C.D., 1986; Kurzrock R., 1988; Preti H.A., 1994; Radich J.P., 2002], BCR/ABL-позитивные острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) - до 2% [Кобзев Ю.Н., 2001; Hru§ak О., 2002]. Хромосомные перестройки с участием региона 11q23 обнаруживаются приблизительно в 5-11% случаев первичных ОМЛ взрослых (значительно чаще у молодых больных), в 3-10% ОЛЛ и до 80% вторичных ОМЛ [Bernard O.A., 1995; Birke M., 2002; Faderl S., 1998; Pui C.H., 1995; Smith M.A., 1996]. Эти хромосомные аберрации, являясь факторами неблагоприятного прогноза, обусловливают непродолжительность полных ремиссий, частое развитие первичной резистентности, высокий риск ранних рецидивов и неудовлетворительную общую выживаемость при использовании стандартных протоколов химиотерапии (XT). По данным D.Hoeltzer и соавт., полная ремиссия достигается в 65% случаев BCR/ABL-позитивных и 83% BCR/ABL-негативных ОЛЛ, однако 5-летняя безрецидивная выживаемость больных с

BCR/ABL-позитивными ОЛЛ составляет всего 8%, в сравнении с 45% при BCR/ABL-негативных ОЛЛ В исследовании Schoch С и соавт (2003 г), медиана общей выживаемости больных с впервые выявленными ОМЛ с реаранжировкой гена MLL составила всего 10 мес. [Schoch С, 2003]. Это диктует необходимость интенсификации лечения (трансплантация стволовых гемопоэтических клеток) на ранних этапах от момента достижения первой ремиссии и, возможно, проведение в дальнейшем биологической терапии.

На момент первичной диагностики острого лейкоза объем опухолевой массы составляет более 1012 лейкемических клеток При достижении "морфологической" ремиссии может сохраняться до Ю10 бластных клеток [Liu Yin J A 2002], которые не могут быть выявлены при световой микроскопии Использование ОТ-ПЦР дает возможность выявлять одну опухолевую клетку с молекулярной перестройкой на исследуемых клеток, те проводить детекцию минимальной резидуальной болезни (МРБ). Мониторинг МРБ позволяет определять конкретные терапевтические подходы при персистенции остаточной популяции опухолевых клеток или молекулярном рецидиве, а также оценивать эффективность новых методов лечения. Изучение особенностей ОЛ с перестройками генов BCR/ABL и гена MLL, моноторинг МРБ в процессе лечения, оценка эффективности терапевтического воздействия стали целью нашего исследования

Цель работы Детекция и мониторинг минимальной резидуальной болезни при острых лейкозах с перестройками генов BCR/ABL и частичной тандемной дупликацией гена MLL методом ОТ-ПЦР

Задачи:

1 Отработать метод выявления частичной тандемной дупликацией гена MLL с помощью ОТ-ПЦР

2 Определить молекулярные, клинико-лабораторные характеристики и эффективность современной химиотерапии острых лейкозов с перестройками генов BCR/ABL и частичной тандемной дупликацией гена MLL

3 Изучить частоту достижения молекулярных ремиссий и их продолжительность в зависимости от методов лечения острых лейкозов (химиотерапия, трансплантация стволовых гемопоэтических клеток)

4 Определить критерии молекулярной диагностики острых лейкозов с перестройками генов BCR/ABL и MLL-дупликацией.

5 Разработать алгоритм мониторинга химерных транскриптов (субстрат и частота проведения исследования, чувствительность метода ОТ-ПЦР).

6 Оценить эффективность биологического метода лечения минимальной резидуальной болезни ("INF+ATRA").

7 Определить оптимальную терапевтическую тактику у больных острыми лейкозами с перестройками генов BCR/ABL и частичной тандемной дупликацией гена MLL.

Научная новизна:

Определена эффективная терапевтическая тактика у больных с BCR/ABL-позитивными острыми лейкозами и острыми лейкозами с частичной тандемной дупликацией гена MLL на основе молекулярно-генетических исследований.

Практическая ценность:

1 Отработан метод выявления частичной тандемной дупликации гена MLL, который стал основой создания тест-системы для диагностики этой молекулярной перестройки у больных острыми лейкозами.

2 Определены критерии молекулярной диагностики BCR/ABL-позитивных острых лейкозов и острых лейкозов с частичной тандемной дупликацией гена MLL.

3 Разработан алгоритм мониторинга минимальной резидуальной болезни (субстрат и частота проведения исследования, чувствительность метода ОТ-ПЦР) при BCR/ABL-позитивных острых лейкозах и острых лейкозах с частичной тандемной дупликацией гена MLL.

4 Определена оптимальная программа лечения BCR/ABL-позитивных острых лейкозов и острых лейкозов с частичной тандемной дупликацией гена MLL с применением на ранних сроках от момента достижения первой полной ремиссии трансплантации аллогенных или аутологичных стволовых гемопоэтических клеток и биологической терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1 Отработан метод выявления частичной тандемной дупликации гена MLL, который стал основой создания тест-системы для диагностики этой молекулярной перестройки у больных острыми лейкозами.

2 Химерный транскрипт BCR/ABL методом обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции на момент первичной диагностики обнаруживают у 27,8% больных острыми лимфобластными лейкозами и у 13,5% - острыми миелоидными лейкозами Частичная тандемная дупликация гена MLL выявляется при диагностике острых лейкозов с одинаковой частотой (11%).

3 Молекулярная ремиссия при этих формах острых лейкозов достигается позже клинико-гематологической ремиссии на 4-8 месяцев, а молекулярный рецидив развивается раньше гематологического на 2 месяца.

4 Медиана безрецидивной выживаемости при BCR/ABL-позитивных острых лейкозах и острых лейкозах с частичной тандемной дупликацией гена MLL значительно меньше, чем при острых лейкозах без этих молекулярных перестроек.

5 Определена оптимальная программа лечения BCR/ABL-позитивных острых лейкозов и острых лейкозов с частичной тандемной дупликацией гена MLL с применением на ранних сроках от момента достижения первой полной ремиссии трансплантации аллогенных или аутологичных стволовых гемопоэтических клеток и биологической терапии.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, 1 работа находится в печати.

Апробация диссертации.

Основные положения работы доложены на XXIII Международной гематологической школе "Лейкозы и лимфомы Терапия и фундаментальные исследования" (Москва, 2003 г), Всеросийском декаднике по гематологии (Москва, 2002 и 2003 гг).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 112 страницах, состоит из введения, обзора

литературы, методической главы, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 15 рисунками. Диссертация выполнена в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН (руководитель член-корреспондент РАМН, проф. Савченко В.Г.), совместно с лабораторией генной инженерии ГНЦ РАМН (зав. к.б.н. А.В. Мисюрин) и лабораторией кариологии ГНЦ РАМН (зав. д.м.н., проф. Е.В. Домрачева), а также при участии сотрудников других подразделений ГНЦ РАМН (директор академик РАМН и РАН А.И. Воробьев).

Соавторами работ, опубликованных по теме диссертации являются д.м.н. Е.Н. Паровичникова, к.б.н. А.В. Мисюрин, проф. Е.В. Домрачева, к.м.н. В Г. Исаев, чл.-корр. В.Г. Савченко, к.м.н. И.А. Демидова, к.м.н. А.И. Удовиченко, Е.В. Аксенова, Е.В. Лисовская, Е.Н. Шуравина.

Содержание работы.

Общаяхарактеристика больных.

В настоящее исследование включено 70 больных острыми лейкозами, наблюдавшихся в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (руководитель член-корр. РАМН Савченко В.Г.) ГНЦ РАМН (директор академик А.И. Воробьев) в период с 2000 по 2004 гг. Среди них было 30 мужчин и 40 женщин. Медиана возраста составила 30 лет (15-74). Кровь и костный мозг больных исследовали в различные сроки: до начала лечения, в периоды индукции и консолидации ремиссии, включая посттрансплантационный период, и на этапе поддерживающей терапии. В среднем каждому больному выполнено 6 исследований (от 1 до 19).

Все больные были разделены на 2 основные группы: 1) больные ОМЛ, !-я группа; 2) больные ОЛЛ, 11-я группа. Обе группы, в зависимости от наличия или отсутствия предшествующей химиотерапии, были разделены на 2 подгруппы: первичные больные, молекулярное исследование которым выполнено до начала XI и пациенты, включенные в исследование на фоне проводимой ХТ. Больные с острыми промиелоцитарными лейкозами в исследование не включены.

В 1-ю группу включено 44 больных ОМЛ (18 мужчин и 26 женщин, медиана возраста 38 лет (15-74)), из них 37 первичных и 7 - на фоне проводимой ХТ.

Первый больной включен в исследование в июле 2000 г., последний в мае 2004 г. Минимальный срок наблюдения 1 мес, максимальный 48,5 мес.

Острый миелобластный недифференцированный лейкоз диагностирован у 1-й больной (2,3%), острый миелобластный лейкоз с созреванием (М2) - у 15-ти (34,1%), острый миеломонобластный (М4) - у 21-го больного (47,7%), острый монобластный (М5) - у 5-ти пациентов (11,4%) и у 2-х (4,5%) эритробластный (М6) вариант ОМЛ. Лечение больных ОМЛ проводили по протоколу ГНЦ РАМН "ОМЛ 01.01" [В Г. Савченко, 2002]. В качестве консолидации ремиссии 4-м больным ОМЛ выполнена трансплантация аллогенных и 6-ти - аутологичных стволовых гемопоэтических клеток

Во II-ю группу включено 26 больных ОЛЛ (12 мужчин и 14 женщин, медиана возраста 24 года (16-55)), из них 18 первичных и 8 - на фоне проводимой XT. Первый больной включен в исследование в августе 2001 г. Минимальный срок наблюдения 2 мес., максимальный 33,5 мес. Иммунофенотипирование бластных клеток костного мозга было выполнено 24-м пациентам, определены следующие иммунологические варианты ОЛЛ про-В - у 4-х больных (16,7%), common - у 7-ми (29,2%), пре-В - у 10-ти (41,6%), пре-Т - у 1-го (4,2%), зрелый-Т у 1-го (4,2%) и в 1-м случае (4,2%) был недифференцируемый вариант ОЛЛ. Лечение проводилось по протоколам ГНЦ РАМН "ОЛЛ 01 95" и "3x3" ("ОЛЛ 06.99") [В Г. Савченко, 2002], 1-й пациентке с BCR/ABL-позитивным ОЛЛ выполнена ауто-ТКМ.

Контрольную группу в исследовании составили 13 здоровых доноров (7 мужчин и 6 женщин, медиана возраста 27 лет (14-56)).

Методыисследования.

Цитогенетическое исследование клеток костного мозга (стандартное и методом D-FISH) проводили в лаборатории кариологии ГНЦ РАМН (зав. д.м.н., проф Е В Домрачева) Молекулярно-генетическое исследование костного мозга и периферической крови методом ОТ-ПЦР выполняли в лаборатории генной инженерии ГНЦ РАМН (зав к б.н А.В. Мисюрин).

Двухэтапная обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция.

Для выявления химерных транскриптов BCR/ABL и частичной тандемной дупликации гена MLL использовали метод ОТ-ПЦР, который был выбран с учетом его специфичности, высокой чувствительности и относительной быстроты выполнения С целью повышения чувствительности метода (10"6),

амплификацию проводили в два этапа с двумя парами праймеров (ПЦР I и ПЦР II). Праймеры были синтезированы в лаборатории генной инженерии ГНЦ РАМН (зав. лаб. к.б.н. А.В.Мисюрин) согласно секвенсу Международной базы данных GenBank. Нуклеотидные последовательности праймеров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в исследовании, и размер амплифицируемых фрагментов.

Этап ПЦР Последовательности праймеров Химерный транскрипт, соединение - размер амллифиц. фрагмента

ПЦР 1 ЗЬаИ 5'-AGT-GTT-GAT-CCT-GTA-ATG-GT-3' 12М 5 -TCT-GAC-TAT-GAG-CGT-GCA-GA-3' р 210 Ь2а2 - 419 п.н. Ь3а2 - 494 п.н.

ПЦР II 3bal2 5'-CAG-CAG-ATA-CTC-AGC-GGC-ATT-G-3' D1 5'-GGA-GCT-GCA-GAT-GCT-GAC-CAA-C-3'

ПЦР 1 ЗЬаИ 54AGT-GTT-GAT-CCT-GTA-ATG-GT-3" ES1 5-ATG-GAA-GGG-GAG-GGC-AAG-GGC-3' р 190 е1а2 - 502 п.н.

ПЦР II 3bal2 5'-CAG-CAG-ATA-CTC-AGC-GGC-ATT-G-3' D8 5 '-GCA-ACA-GTC-CTT-CGA-CAG-CAG-C-3'

ПЦР 1 3.1с 5'-AGG-AGA-GAG-TTT-ACC-TGC-TC-3' mll-c 5'-AGG-ACC-GCC-AAG-AAA-AGA-3" ЧТД MLL экзон 2-8 - 396 п.н.

ПЦР II 3.2с 5'-ACA-CAG-ATG-GAT-CTG-AGA-GG-3" mll-1 5'-AAA-CCA-CCT-CCG-GTC-AAT-AA-3'

Правильность полученных фрагментов была подтверждена секвенированием продуктов ПЦР при помощи модифицированного метода Сэнгера с использованием термостабильной ДНК-полимеразы [Innis M , 1988] Исследование выполнял сотрудник лаборатории генной инженерии ГНЦ РАМН В.Л.Сурин

Флюоресцентная гибридизациям situ (FISH)

11-ти больным (5 ОМЛ и 6 ОЛЛ) с выявленным BCR/ABL-транскриптом проведено дополнительное ретроспективное исследование костного мозга методом D-FISH Исследование выполнено в лаборатории кариологии ГНЦ РАМН к.м.н. О.А.Виноградовой Для выявления t(9,22)(q34,q11) использовали ДНК-пробу (LSI BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe (Vysis США)), состоящую из 2-х локусспецифических проб BCR и ABL

Гибридизацию выполняли по протоколу фирмы-производителя В каждом случае анализировали 200 интерфазных ядер с четкими сигналами Для определения границ нормальных значений анализировали 1000 ядер от 5 здоровых доноров костного мозга Границы нормальных значений для t(9,22)(q34,q11) й 0,3%

Стандартное цитогенетическое исследование

Клетки костного мозга культивировали в питательной среде RPMI 1640 ("Siqma") с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамина и антибиотиков 24 часа, с целью задержки митоза последние 16 часов с добавлением колхицина G-дифференциальное окрашивание хромосом проводили с использованием краски Wright ("Merck"). При возможности анализировали 20 митозов. Кариотип описывали в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой ISCN, 1995.

Статистическую обработку полученных данных проводили методом четырехпольных таблиц с использованием критерия X.2 Эффективность лечения оценивалась посредством построения кривых общей и безрецидивной выживаемостей с использованием метода Каплан-Майера.

Основные понятия

• Полная клинико-гематологическая ремиссия - состояние кроветворной ткани, при котором в пунктате костного мозга обнаруживается 5% и менее бластных клеток при нормальном соотношении всех ростков кроветворения, количестве нейтрофилов в периферической крови

и отсутствии экстрамедуллярных очагов лейкемического роста Указанные показатели должны сохраняться в стабильном состоянии не менее 1 месяца.

• Молекулярная ремиссия - это полная клинико-гематологическая ремиссия острого лейкоза при отсутствии исходно определявшихся методом ПЦР молекулярных маркеров. Для достоверности результата анализ должен быть проведен дважды в динамике.

• Минимальная резидуальная болезнь - остаточная популяция лейкемических клеток, выявить которую можно лишь с помощью новых высокочувствительных молекулярно-генетических методов, когда при световой микроскопии в костном мозге определяется не более 5% бластных клеток при нормальных показателях периферической крови и отсутствии экстрамедулярных очагов.

• Молекулярный рецидив констатируется, если на фоне полной клинико-гематологической ремиссии, после периода, когда гибридный транскрипт не определялся, вновь выявляется исходный молекулярный маркер. Результат должен быть подтвержден в 2-х последовательных исследованиях (через 2-4 недели).

• BCR/ABL-позитивным острый лейкоз считается, когда:

1) при стандартном цитогенетическом исследовании выявлена t(9;22)(q34;q11) или методом FISH обнаружен сливной ген BCR/ABL, или

2) в 2-х и более последовательных исследованиях методом ОТ-ПЦР обнаружен химерный транскрипт BCR/ABL.

• острый лейкоз с ЧТД гена MLL считается, если частичная тандемная дупликации гена MLL методом ОТ-ПЦР обнаружена в 2-х и более исследованиях, выполненных в динамике.

• Общая выживаемость позволяет оценить число реально оставшихся в живых больных ОЛ на фоне проведенной терапии. Для построения кривой общей выживаемости анализируют временные параметры всех больных, включенных в исследование. Точкой отсчета является день начала терапии. Событием считается только смерть больного от любой причины и на кривой отображается ступенькой, идущей вниз. Больных, живых во время проведения анализа, расценивают, как случай, и отмечают на кривой черточкой, т.е. цензурируют. Больных, судьба которых неизвестна, цензурируют в тот момент, когда было известно, что они живы. Больных, отказавшихся от лечения, цензурируют в день отказа от терапии. Больных, которым выполнялась ТКМ, цензурируют в день проведения ТКМ.

• Безрецидивная выживаемость. При построении кривой безрецидивной выживаемости учитывают только тех больных, у которых была достигнута полная ремиссия. Точкой отсчета считается дата достижения ремиссии. Событиями считаются рецидив и смерть от любой причины. Цензурируют только тех больных, которые были живы и находились в полной ремиссии в момент проведения анализа. Больных, судьба которых неизвестна, цензурируют в тот момент, когда было известно, что они живы в полной ремиссии. Больных, у которых была достигнута полная ремиссия, но они отказались от лечения в ремиссии, цензурируют в день отказа от терапии. Больных, которым выполнялась ТКМ, цензурируют в день проведения ТКМ.

Результатыисследования.

Больные с острыми миелоидными лейкозами (1-ягруппа).

Больные с впервые выявленными BCR/ABL-позитивными ОМЛ

Из 37-ми первичных больных ОМЛ методом ОТ-ПЦР химерный транскрипт ВОЯ/ЛВ1_ более 2-х раз выявлен у 5-ти. В 6-м случае исследование было выполнено однократно, но стандартным цитогенетическим методом обнаружена 1(9,22)ДО4 я11). Таким образом, ВОЯ/ЛВ1_-позитивные ОМЛ в нашем исследовании составили 16,2% от первичных ОМЛ. Если учитывать только данные эффективного стандартного цитогенетического исследования на момент диагностики ОЛ, то ВОЯ/ЛВ1_-позитивные ОМЛ составили 7,7%.

В сравнительный анализ включили больных с молекулярно доказанными ВОЯ/ЛВ1_-позитивными ОМЛ. Отличий по первичным клинико-лабораторным показателям между больными с ВОЯ/ЛВ1_-позитивными ОМЛ (п=6) и с ВОЯ/ЛВ1_-негативными ОМЛ (п=31) не выявлено.

На момент диагностики ОМЛ стандартное цитогенетическое исследование выполнено 28-ми из 31-го больного с ВОЯ/ЛВ1_-негативными ОМЛ, причем у 8-ми из них (28,6%) провести анализ кариотипа было невозможно из-за отсутствия митозов. Нормальный кариотип выявлен у 15-ти из 20-ти (75%) первичных больных с ВОЯ/ЛВ1_-негативными ОМЛ Из 6-ти больных с ВОЯ/ЛВ1_-позитивными ОМЛ нормальный кариотип выявлен у 2-х В остальных случаях всех первичных ОМЛ с эффективным цитогенетическим анализом обнаружены различные хромосомные аберрации, в том числе и 1(9 22)(я34 я11) у 2-х больных с ВОЯ/ЛВ1_-позитивными ОМЛ. У 1-го больного в дебюте заболевания были обнаружены структурные маркерные хромосомы, конкретизировать которые не удалось из-за невысокого качества метафаз, а в финале болезни выявлена 1(9,22)(я34,я11). Таким образом, несовпадение между ОТ-ПЦР и стандартным цитогенетическим исследованием отмечено в 3-х случаях Однако, у этих больных ВОЯ/ЛВ1_-транскрипт определялся более 3-х раз (3-8).

Из 6-ти первичных ВОЯ/ЛВ1_-позитивных ОМЛ в 5-ти случаях методом ОТ-ПЦР химерный транскрипт был обнаружен при установлении диагноза. У 1-го больного при первичном исследовании молекулярный маркер не выявлен но при диагностике рецидива ОМЛ были обнаружены и химерный транскрипт ВОЯ/ЛВ1_ (р190), и ЧТД гена МП. Позднее, через 3 мес, при стандартном цитогенетическом исследовании выявлена 1(9,22)(д34,д11). При этом от

момента развития рецидива до гибели больного молекулярные маркеры выявлялись четырежды. У 2-х больных с резистентными к ХТ формами ОМЛ гибридный транскрипт сохранялся все время наблюдения (в течение 8-ми мес). В 2-х случаях на различных сроках проводимого лечения достигнута молекулярная ремиссия. У 1-й из этих больных транскрипт выявляли в течение 11 мес. (первичнорезистентная форма ОМЛ, морфологическая ремиссия достигнута после 3-х курсов ХТ), только на 60-й день после алло-ТСКК получен негативный результат ОТ-ПЦР. У 2-го больного химерный ВСЯ/АВ_ определялся в течение 5,5 мес. и "исчез" после 4-го курса ХТ (морфологическая ремиссия была достигнута после 1-го курса индукции).

3-м из 6-ти больных с ВСЯ/АВ_-позитивными ОМЛ ретроспективно выполнен анализ О-ПБН. Сливной ген ВСЯ/ДВ_ выявлен только у 1-го пациента с ранее обнаруженной стандартным методом ^9;22)(д34;я11). Противоречия в полученных результатах трактовать трудно. Возможно, это связано с различной чувствительностью методов, которая отличается на 3 порядка (10"3 и 10"6). Не исключены и ложноположительные результаты ПЦР.

По данным литературы, ВСЯ/АВЬпозитивные ОМЛ составляют 1-2% от впервые выявленных ОМЛ взрослых [Кобзев Ю.Н., 2001; Нгиёйк О., 2002], однако подробной характеристики этой формы ОЛ практически нигде не представлено. До сих пор не ясно, что это: первичный ОМЛ или ХМЛ, дебютировавший с бластного криза. Четких критериев дифференциальной диагностики нет. Более высокий процент ВСЯ/АВ_-позитивных случаев ОМЛ в нашем исследовании, вероятно, объясняется небольшой группой обследованных и очень высокой чувствительностью двухраундовой ОТ-ПЦР (1 ВСЯ/ДВ_-позитивная клетка на 106 клеток без молекулярной перестройки).

Наиболее часто при ВСЯ/АВ_-позитивных ОМЛ обнаруживают химерный р210 [уап Эопдеп уУМ., 1999], сообщения о выявлении р190 единичные. В нашем исследовании в 5-ти из 6-ти ВСЯ/АВ_-позитивных первичных ОМЛ обнаружен р210 (в 4-х Ь3а2 соединение, в 1-м Ь2а2) ив 1-м - р190 (е1а2 соединение).

Результаты терапии первичных больных с ВСЯ/АВ_-позитивными ОМЛ в сравнении с ВСЯ/АВЬнегативными ОМЛ представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты терапии первичных больных ОМЛ.

Событие ВСЯ/АВ!.- ОМЛ, п=31 ВСР/АВ1.+ ОМЛ, п=6 Р

Ремиссия после индукции 21 (67,7%) 3 (50%) 0,4

Первичная резистентность 9 (29%) 3 (50%) 0,3

Смерть в индукции 1 (3,2%) 0 0,6

Рецидив 7 (33,3%) 2 (66,6%) 0,57

Сохраняется 1-я ремиссия 12 (57,1%) 1 (33,3%) 0,4

Живы 16(51,6%) 2 (33,3%) 0,35

После 1-го курса индукции ремиссия достигнута практически у одинакового процента больных с BCR/ABL-негативными и с BCR/ABL-позитивными ОМЛ. Следует отметить, что при BCR/ABL-позитивных ОМЛ рецидивы были ранними и резистентными к XI. Из 7-ми рецидивов при BCR/ABL-негативных ОМЛ 2 рецидива были поздними, на последующих этапах ХТ достигнута вторая ремиссия.

На момент окончания исследования (октябрь 2004 г.) из 31-го больного с BCR/ABL-негативными ОМЛ были живы 16 (51,6%), из 6-ти пациентов с BCR/ABL-позитивными ОМЛ - 2-е (1-му из них выполнена ауто-ТКМ, 2-й -алло-ТСКК). Медиана общей выживаемости больных с BCR/ABL-позитивными ОМЛ составила всего 12,5 мес. Первая ремиссия сохранялась более, чем у половины больных с BCR/ABL-негативными ОМЛ и только у 1-го пациента с BCR/ABL-позитивным ОМЛ, которому была выполнена ауто-ТКМ. Кривые безрецидивной выживаемости первичных больных ОМЛ в зависимости от того, определялся у них BCR/ABL-транскрипт или нет представлены на рис. 1.

% больных

1-ВСР/АВ1_-негативные ОМЛ 2 -ВС И/АВ ^позитивные ОМЛ

р=0,49

2

о 1 мес.

О 10 20 30 40 50 60

Рис.1 Безрецидивная выживаемость первичных больных ОМЛ.

Как видно из рис.1, медиана безрецидивной выживаемости больных с ВОЯ/ЛВ1_-позитивными ОМЛ составила всего 6,25 мес. У больных с ВОЯ/ЛВ1_-негативными ОМЛ медиана безрецидивной выживаемости на момент окончания исследования не достигнута, так как у 57,1% больных сохранялась первая ремиссия. Но, различия статистически недостоверны (р=0,49).

Результаты лечения первичных больных с ВОЯ/ЛВ1_-позитивными ОМЛ в нашем исследовании сопоставимы с опубликованными данными, из которых следует, что на стандартных протоколах ХТ при ВОЯ/ЛВ1_-позитивных ОЛ отмечается более низкий процент достижения полных ремиссий, их непродолжительность и высокий риск развития ранних рецидивов 2002].

Первичные больные ОМЛ с частичной тандемнойдупликациейгена MLL.

ЧТД гена МП методом ОТ-ПЦР из 37-ми впервичных больных ОМЛ более 2-х раз выявлена у 5-ти (13,5%), причем у 1-го из них молекулярная перестройка обнаружена только при диагностике рецидива заболевания. При ОМЛ с МЬЬ-дупликацией в сравнении с ОМЛ без нее была более глубокая тромбоцитопения (медианы 49х109/л и 73x109/л, соответственно) и выше ЛДГ (медианы 1404 и/1 и 793 и/1, соответственно). Периферическая лимфаденопатия при ОМЛ с МП-дупликацией встречалась чаще, чем при ОМЛ без нее: в 80% и 37,5%, соответственно. Данные объективного обследования свидетельствуют о том, что объем опухолевой массы при ОМЛ с ЧТД МП был существенно больше, чем при ОМЛ без этой молекулярной перестройки.

На момент диагностики ОМЛ эффективное стандартное цитогенетическое исследование выполнено 23-м из 32-х больных без ЧТД МЬЬ и 3-м из 5-ти, у кого молекулярная перестройка была обнаружена. Нормальный кариотип выявлен у 16-ти (69,6%) первичных больных ОМЛ без ЧТД гена МП и у 1-го больного с МП-дупликацией. В остальных случаях первичных ОМЛ обнаружены различные хромосомные перестройки, в том числе 1(10;11)(р12;я13-21) у 1-го больного ОМЛ с ЧТД гена МП.

У 4-х из 5-ти первичных больных ОМЛ с ЧТД гена МП химерный транскрипт методом ОТ-ПЦР был обнаружен при установлении диагноза и многократно в дальнейшем. У 3-х больных гибридный транскрипт выявлялся на всех этапах наблюдения (в течение 4-х, 6-ти и 8-ми мес). У 1-го больного

ЧТД гена MLL и BCR/ABL-транскрипт обнаружены в момент диагностики рецидива заболевания и определялись в течение 4 мес. В 1-м случае через 9 мес. от начала лечения на 60-й день после ауто-ТСКК была достигнута молекулярная ремиссия (морфологическая после 1-го курса индукции), которая сохраняется на момент окончания исследования (7 мес). Это подтверждает необходимость ранней и агрессивной консолидации первой ремиссии у больных ОМЛ с ЧТД гена MLL.

По данным литературы, ЧТД гена MLL встречается приблизительно в 11% первичных ОМЛ без хромосомных перестроек [Caligiuri M.A., 1998; Park J.P., 2000]. В нашем исследовании из всех первичных ОМЛ на момент диагностики заболевания процент обнаружения MLL-дупликации составил 10,8%.

Результаты лечения первичных больных ОМЛ с и без ЧТД гена MLL представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты терапии первичных больных ОМЛ в зависимости от выявления MLL-дупликации.

1 Событие ОМЛ без ЧТД MLL,п=32 ОМЛ с ЧТД MLL,n=5 Р

Ремиссия после индукции 20 (62,5%) 4 (80%) 0,44

Первичная резистентность 11 (34,4%) 1 (20%) 0,52

Смерть в индукции 1 (3,1%) 0 0,68

Рецидив 6 (30%) 3 (75%) 0,045

Сохраняется 1-я ремиссия 12 (60%) 1 (25%) 0,44

рКивы 18(56,2%) 1 (20%) 0,16

Несмотря на высокую частоту достижения ремиссии после 1-го курса индукции, рецидивы у больных ОМЛ с дупликацией гена М__ развивались чаще, чем у больных ОМЛ без молекулярной перестройки (75% в сравнении с 30%) (различие статистически достоверно, р=0,045). Все рецидивы ОМЛ с ЧТД гена М__ были ранними и резистентными к ХТ. Из 6-ти рецидивов ОМЛ без ЧТД М__ 4 были ранними и 2 поздними. При поздних рецидивах на последующих этапах лечения достигнута вторая ремиссия.

К моменту окончания исследования из 32-х больных ОМЛ без М__ -дупликации были живы 18 (56,2%). Из 5-ти больных ОМЛ с ЧТД гена М__ была жива только 1 пациентка, продолжительность жизни от начала терапии 17 мес. Медиана общей выживаемости больных ОМЛ с ЧТД гена М__ составила всего 11 мес. Первая ремиссия сохранялась у 12-ти больных ОМЛ

без ЧТД гена MLL и 1-й пациентки с MLL-дупликацией. С целью консолидации ремиссии ей была выполнена ауто-ТСКК. На рис.2 представлены кривые безрецидивной выживаемости первичных больных ОМЛ в зависимости от выявления ЧТД гена MLL.

О 10 20 30 40 50 60

Рис.2. Безрецидивная выживаемость первичных больных ОМЛ.

Как видно из рис.2, медиана безрецидивной выживаемости первичных больных ОМЛ с ЧТД гена MLL составила всего 3,75 мес. При ОМЛ без MLL-дупликации медиана безрецидивной выживаемости не достигнута, так как у 60% больных на момент окончания исследования сохранялась первая ремиссия. Однако, различия статистически не достоверны (р=0,14)

ОМЛ с частичной тандемной дупликаций гена MLL характеризует агрессивное течение и неблагоприятный прогноз с высоким риском развития ранних рецидивов и неудовлетворительной общей выживаемостью [Caligiuri M.A., 1998; Dohner К., 2002; Schoch С, 2003]. По данным литературы и результатам нашего исследования, при ОМЛ с ЧТД гена MLL ремиссия достигается более, чем у 80% больных, однако длительность ее составляет всего несколько месяцев. Ранняя и агрессивная консолидация первой ремиссии может иметь решающее значение для увеличения безрецидивной выживаемости больных ОМЛ с ЧТД гена MLL.

Больные ОМЛ, включенные в исследование на фоне проводимойХТ. Из 7-ми больных, включенных в исследование на фоне XI, методом ОТ-ПЦР химерный ВСЯ/А^-транскрипт однократно обнаружен у 4-х (57,1%), дважды в динамике только у 1-го больного (14,3%).

Более 2-х раз ЧТД гена МП обнаружена у 2-х (28,6%) из 7-ми пациентов, причем у 1-го из них найдены оба молекулярных маркера (ВОЯ/ЛВ1_-транскрипт и МП-дупликация). На момент включения в исследование у обоих больных был рецидив ОМЛ. Эти случаи трудно трактовать. В 1-м, несмотря на то, что обнаружены обе молекулярные перестройки и то, что ЧТД гена МП определялась более 3-х лет, длительное время (более 35 мес.) на фоне терапии малыми дозами цитарабина сохраняется третья ремиссия ОМЛ. Во 2-м случае, несмотря на высокодозную консолидацию второй ремиссии (ауто-ТСКК), развился резистентный рецидив. Заключение (ОМЛ):

Подводя итоги по обсуждению результатов лечения ОМЛ в зависимости от выявления химерных транскриптов ВОЯ/ЛВ1_ и ЧТД гена МП, следует выделить следующие закономерности:

- во-первых, при ОМЛ обнаружение ВОЯ/ЛВ1_ и ЧТД гена МП методом ОТ-ПЦР не редкое событие. Из 44-х обследованных больных ОМЛ ВОЯ/ЛВ1_ выявлен у 7-ми (15,9%), ЧТД гена МП так же у 7-ми (15,9%). Из 26-ти больных с эффективным цитогенетическим анализом на момент диагностики ОМЛ 1(9;22)(я34;я11) обнаружена у 2-х (7,7%), 1(10;11 )(р12;я13-21) - у 1-го больного (3,8%); методом ОТ-ПЦР из 37-ми первичных больных ВОЯ/ЛВ1_-транскрипт выявлен у 5-ти (13,5%), ЧТД гена МП - у 4-х больных (10,8%);

- во-вторых, одновременно оба молекулярных маркера при первичном исследовании не обнаружены, а в момент диагностики рецидива ОМЛ выявлены у 2-х (4,5%) из 44-х больных. В таких случаях необходимо мониторировать оба транскрипта, так как один из них может "исчезать" на фоне ХТ, а другой персистировать;

- в-третьих, молекулярная ремиссия достигнута у 2-х из 4-х больных с ВОЯ/ЛВ1_-позитивными ОМЛ и 1-го из 4-х больных ОМЛ с ЧТД гена МП, причем по времени существенно позже клинико-гематологической ремиссии (в среднем на 8 мес);

- в-четвертых, при отсутствии молекулярных маркеров в дебюте ОМЛ, в рецидиве заболевания возможно появление лейкемического клона с перестройкой генов ВОЯ/ЛВЬ и МЬЬ-дупликацией, особенно, если при первичной диагностике обнаружены хромосомные изменения, трактовать которые не удается из-за плохого качества митозов. В таких случаях в

рецидиве целесообразно выполнять как стандартное цитогенетическое исследование, так и молекулярный анализ;

- в-пятых, при малом числе наблюдений, тем не менее отчетливо видны худшие долгосрочные результаты: выше процент рецидивов, ниже показатели общей выживаемости;

- в-шестых, создается впечатление, что ранняя и агрессивная консолидация первой ремиссии (трансплантация аллогенных или аутологичных стволовых гемопоэтических клеток) позволяет увеличить общую и безрецидивную выживаемость этих больных.

Больные с острыми лимфобластными лейкозами (11-я группа).

Больные с впервые выявленными BCR/ABL-позитивными ОЛЛ.

В нашем исследовании из 18-ти первичных больных ОЛЛ химерный транскрипт BCR/ABL однократно был обнаружен у 8-ми (44,4%). Более 2-х раз молекулярный маркер выявлен у 5-ти больных (27,8%), причем у всех -при установлении диагноза. Важно отметить, что ЛДГ на момент диагностики при BCR/ABL-позитивных ОЛЛ была втрое больше, чем при BCR/ABL-негативных (медианы 1587 u/l и 515 u/l, соответственно).

Почти в половине случаев BCR/ABL-негативных ОЛЛ (в 6-ти из 13-ти) и в 1-м из 5-ти BCR/ABL-позитивных ОЛЛ анализ кариотипа был неинформативным из-за отсутствия митозов. Из первичных ОЛЛ с эффективным цитогенетическим анализом, нормальный кариотип выявлен у 6-ти из 7-ми больных с BCR/ABL-негативными ОЛЛ и у 2-х из 4-х с BCR/ABL-позитивными ОЛЛ. В 2-х случаях BCR/ABL-позитивных ОЛЛ выявлен гипердиплоидный набор хромосом, в 1-м из них с t(9;22)(q34;q11).

У больной с t(9;22)(q34;q11) молекулярная ремиссия достигнута после 11-х фаз индукции (морфологическая после 1-й) и сохранялась все время наблюдения (26 мес). С целью консолидации первой ремиссии ей была выполнена ауто-ТКМ (в костномозговой взвеси BCR/ABL не обнаружен). У 2-го больного молекулярная ремиссия достигнута через 15 мес. от начала терапии и сохранялась до конца наблюдения (5 мес). У 3-го больного молекулярная ремиссия достигнута одновременно с морфологической (через 6 мес. от начала лечения, первичнорезистентная форма ОЛЛ) и сохранялась 7,5 мес. Молекулярный рецидив диагностирован также одновременно с морфологическим, резистентным к XT. У 2-х больных обнаружены 2 варианта

BCR/ABL-транскрипта: р190 и р210. У 1-й из них молекулярная ремиссия достигнута на 2 мес. позже морфологической и сохранялась до конца исследования (12 мес). У 2-й больной BCR/ABL-транскрипт (и MLL-дупликация) определялись все время наблюдения (6 мес).

D-FISH выполнен 2-м из 5-ти первичных больных ОЛЛ: химерный ген BCR/ABL не обнаружен. Противоречия в результатах ОТ-ПЦР и D-FISH, вероятно, связаны с различной чувствительностью методов.

По данным литературы, t(9;22)(q34;q11) или ее молекулярный эквивалент химерный BCR/ABL в 30-40% обнаруживают при common и пре-В ОЛЛ, часто при этом выявляется экспрессия CD34+ и миелоидных антигенов [HruSak О., 2002; Westbrook C.A , 1992]. В нашем исследовании, BCR/ABL-транскрипт выявлен только у больных с common и пре-В ОЛЛ. Экспрессия CD34 антигена обнаружена в 3-х из 5-ти случаев BCR/ABL-позитивных и в 4-х из 11-ти BCR/ABL-негативных ОЛЛ. Коэкспрессия миелоидных антигенов наблюдалась с одинаковой частотой. По данным публикаций в 60-77% случаев BCR/ABL-позитивных ОЛЛ выявляется р190, в 20-40% - р210 [van Dongen JJM., 1999; van Rhee F., 1995]. Одновременно оба варианта химерного транскрипта определяются у 3% больных В., 2002] В

нашем исследовании у всех первичных больных с BCR/ABL-позитивными ОЛЛ обнаружен р190 (е1а2 соединение), у 2-х из них, но не одновременно, также выявлялся р210 (Ь3а2 соединение)

Результаты терапии первичных больных с BCR/ABL-позитивными и с BCR/ABL-негативными ОЛЛ, представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты терапии первичных больных ОЛЛ.

Хотя общие результаты индукционной терапии практически одинаковые, долгосрочные результаты лечения ВСЯ/АВ1_-позитивных ОЛЛ остаются

крайне неудовлетворительными. В нашем исследовании различий в общей выживаемости больных с BCR/ABL-неraтивными и с BCR/ABL-позитивными ОЛЛ не получено: медианы практически одинаковые и составили около 18-ти мес. На момент окончания исследования первая ремиссия сохранялась у 2-х из 4-х первичных больных с BCR/ABL-позитивными и у 7-ми из 10-ти с BCR/ABL-негативными ОЛЛ. Учитывая, что группы больных ОЛЛ очень малы, а 5 больных, включенных в исследование на фоне XI, были на ранних этапах индукции ремиссии (1-2 нед.), то кривые безрецидивной выживаемости мы построили для них общие (рис.3).

5 40 20 29 30

Рис. 3 Безрецидивная выживаемость первичных больных ОЛЛ.

Медиана безрецидивной выживаемости больных с BCR/ABL-позитивными ОЛЛ составила 8,75 мес; при BCR/ABL-негативных ОЛЛ медиана не достигнута, так как у 70% больных на момент окончания исследования сохранялась первая ремиссия.

Следует отметить, что при выполнении трансплантации аутологичных стволовых гемопоэтических клеток у больных с исходно BCR/ABL-позитивным ОЛЛ даже после достижения молекулярной ремиссии необходимо выполнять молекулярное исследование аутотрансплантата, так как по нашему наблюдению, при отсутствии BCR/ABL в костном мозге и периферической крови, в лейкоконцентрате на фоне стимуляции Г-КСФ химерный транскрипт может определяться.

Первичные больные ОЛЛ с частичной тандемной дупликацией гена МП Из 18-ти больных с впервые выявленными ОЛЛ ЧТД гена МП в нашем исследовании однократно обнаружена у 4-х (22,2%). Более 2-х раз М__-

дупликация выявлена у 2-х больных (11,1%). Следует отметить некоторое сходство между этими двумя случаями: возраст моложе 30 лет, диагностирован common вариант ОЛЛ, у обоих больных была выраженная гепатоспленомегалия и периферическая лимфаденопатия, глубокая тромбоцитопения и молекулярная ремиссия не достигнута.

В 1-м случае ОЛЛ оказался первичнорезистентным, ремиссию удалось получить только после курса "RACOD", однако длительность ее составила всего 4 мес. 2-й случай интересен тем, что у больной одновременно обнаружены оба молекулярных маркера: ЧТД гена MLL и BCR/ABL-транскрипт. Ремиссия достигнута после 1-й фазы индукции, длительность ее составила всего 2,5 мес. Стандартным цитогенетическим методом при диагностике рецидива выявлен гиперплоидный хромосомный набор с трисомией 11. Молекулярные маркеры определялись все время наблюдения (6 мес). Противорецидивная XT в обоих случаях эффекта не оказала. Продолжительность жизни больных с момента начала лечения составила 19 и 10 мес.

Больные ОЛЛ, включенные в исследование на фоне проводимойХТ.

Из 8-ми больных ОЛЛ, обследованных на фоне XT, методом ОТ-ПЦР химерный транскрипт BCR/ABL более 2-х раз был выявлен у 4-х. У 3-х из них был обнаружен химерный р190, у 1-го - р210 (Ь2а2 соединение). У 2-х больных на различных сроках терапии была достигнута молекулярная ремиссия: у 1-го одновременно с морфологической, у 2-го - через 4 мес. после. Молекулярный рецидив у этих больных был зарегистрирован раньше морфологического: в 1-м случае - на 1,5 мес, во 2-м - на 3 мес. Оба рецидива были ранними и резистентными к XT, длительность ремиссии составила 4 и 10 мес. У 1-го из этих больных в финале болезни был так же обнаружен и р210 (Ь3а2 соединение). У 3-й больной методом ОТ-ПЦР трижды, с перерывами в 10-12 мес, выявлялся BCR/ABL-транскрипт (р190), с мая 2004 г. у нее сохраняется молекулярная ремиссия. Эта больная включена в наше исследование на фоне третьей ремиссии острого лейкоза (исходно были выявлены множественные хромосомные поломки). Ретроспективно методом D-FISH сливной ген BCR/ABL не обнаружен. У 4-го больного при включении в наше исследование выявлены р210 и ЧТД гена MLL; оба транскрипта сохранялись все время наблюдения (8 мес).

3-м из 4-х больных с ВСЯ/АВ_-позитивными ОЛЛ на момент включения в исследование проводили индукционную терапию. У 2-х ремиссия достигнута после завершения 1-й фазы индукции, однако впоследствие развились ранние резистентные рецидивы. В случае ОЛЛ с двумя выявленными химерными транскриптами (ВСЯ/АВ_ и ЧТД гена МП) констатирована первичная резистентность к ХТ, короткая (4 мес.) ремиссия была достигнута после курса "ЯАСОР", рецидив так же был резистентным.

На момент завершения исследования жива 1 пациентка с ВСЯ/АВ_-позитивным ОЛЛ, включенная в исследование в третьей ремиссии, у нее сохранялась полная ремиссия. Заключение (ОЛЛ):

Резюмируя результаты лечения ОЛЛ в зависимости от выявления химерных транскриптов ВСЯ/АВ_ и ЧТД гена М__, следует отметить следующие наблюдения:

- во-первых, из 26-ти больных ОЛЛ ВСЯ/АВ_-транскрипт обнаружен у трети обследованных (у 34,6%); ЧТД гена М__ определялась реже - в 11,5% случаев. На момент диагностики ОЛЛ из 11-ти больных с эффективным анализом кариотипа !(9;22)(я34;я11) выявлена у 1-й больной (9,1%), методом ОТ-ПЦР из 18-ти первичных больных ВСЯ/АВ_-транскрипт обнаружен у 5-ти (27,8%), ЧТД гена М__ - у 2-х больных (11,1%).

- во-вторых, оба молекулярных маркера одномоментно обнаружены у 2-х (7,7%) из 26-ти больных ОЛЛ; прогноз в таких случаях крайне неблагоприятный;

- в-третьих, молекулярная ремиссия достигнута у 4-х из 5-ти больных с ВСЯ/АВ_-позитивными ОЛЛ, но существенно позже клинико-гематологической (в среднем на 4 мес); при ОЛЛ с ЧТД гена М__ молекулярная ремиссия не достигнута;

в четвертых, молекулярный рецидив развивается раньше гематологического (в среднем на 2 мес); так же возможна персистенция МРБ, без развития гематологического рецидива;

- в-пятых, при небольшом числе наблюдений, тем не менее отчетливо видны худшие долгосрочные результаты терапии как при ВСЯ/АВ_-позитивных ОЛЛ, так и при ОЛЛ с М__-дупликацией;

- в- шестых, у больных с исходно ВСЯ/АВ_-позитивными ОЛЛ, которым проводится забор аутологичных стволовых гемопоэтических клеток для

выполнения аутотрансплантации, необходимо проводить молекулярное исследование клеточной взвеси СКК, так как при отсутствии BCR/ABL в костном мозге и периферической крови больного, в лейкоконцентрате на фоне стимуляции Г-КСФ химерный транскрипт может определяться В такиой ситуации не рекомендуется использовать заготовленный лейкоконцентрат, а целесообразно заготовить костный мозг;

- в-седьмых, ранняя интенсификация терапии (трансплантация костного мозга или стволовых клеток крови) на сроке до 6 мес. от момента достижения первой ремиссии позволяет улучшать долгосрочные результаты у больных с BCR/ABL-позитивными ОЛЛ.

Контрольная группа (III-я).

Контрольную группу в нашем исследовании составили 13 здоровых доноров. Было исследовано 7 образцов костного мозга и 6 периферической крови. Химерных транскриптов BCR/ABL и ЧТД гена MLL методом ОТ-ПЦР не обнаружено. Однако по данным нескольких исследований, у здоровых доноров в периферической крови и костном мозге обнаружены химерные транскрипты BCR/ABL и ЧТД гена MLL [Caldas С, 1998; Marcucci G., 1998]. Прогностическая значимость этих находок не ясна. Возможно, это объясняется спонтанными мутациями, в результате которых образуются сливные транскрипты.

Выводы:

1. При первичной диагностике острых лейкозов методом ОТ-ПЦР частичная тандемная дупликация гена MLL выявлена с частотой 11%. Создана тест-система для диагностики этой молекулярной перестройки. При стандартном цитогенетическом исследовании t(10;11)(p12;q13-21) обнаружена только при острых миелоидных лейкозах в 3,8% случаев. Острые лейкозы с MLL-дупликацией характеризуются большим объемом опухолевой массы и частым развитием ранних рецидивов, резистентных к химиотерапии.

2. Химерный транскрипт BCR/ABL методом ОТ-ПЦР обнаружен при первичной диагностике острых лимфобластных лейкозов у 27,8% больных, острых миелоидных - у 13,5%. Стандартным цитогенетическим методом частота выявления t(9;22)(q34;q11) существенно ниже и составила при острых лимфобластных лейкозах 9,1%, при острых миелоидных - 7,7%.

ВСЯ/ЛВЬпозитивные острые лейкозы характеризуются высокой частотой развития ранних резистентных рецидивов.

3. На стандартных протоколах химиотерапии при ВСЯ/ЛВЬпозитивных острых лейкозах и острых лейкозах с МП-дупликацией достигаются молекулярные ремиссии, но констатируются они реже и позже клинико-гематологических на 4-8 месяцев. Молекулярный рецидив развивается раньше гематологического (в среднем на 2 месяца), в связи с чем в течение первого года лечения мониторировать минимальную резидуальную болезнь необходимо с частотой 1 раз в 2 месяца.

4. Медиана безрецидивной выживаемости при ВСЯ/ЛВЬпозитивных острых лейкозах и острых лейкозах с частичной тандемной дупликацией гена МП менее 9 месяцев. При острых лейкозах без этих молекулярных перестроек более чем у 50% больных сохраняется первая ремиссия.

5. Ранняя и агрессивная консолидация (трансплантация аллогенных или аутологичных гемопоэтических стволовых клеток) на сроке 6-8 месяцев от момента достижения первой ремиссии позволяет улучшать долгосрочные результаты терапии у больных с выявленными молекулярными перестройками.

6 Биологическое лечение интерфероном-альфа в сочетании с полностью транс-ретиноевой кислотой после выполнения трансплантации аллогенных или аутологичных гемопоэтических стволовых клеток является эффективным методом лечения минимальной резидуальной болезни, что подтверждается отсутствием молекулярных рецидивов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1) М.А.Вернюк, Е.Н.Паровичникова, А.В.Мисюрин, И.А.Демидова, В.Г.Исаев, В Г.Савченко, Е.В.Домрачева, А.И.Удовиченко "РИ-позитивные острые лейкозы - молекулярный мониторинг и эффективность лечения". Материалы конференции "Новое в гематологии и клинической трансфузиологии", Москва 15-16 апреля 2003 г. Проблемы гематологии и переливания крови 2003, №2, с.35.

2) М.А.Вернюк, Е.Н.Паровичникова, А.В.Мисюрин, В.Г.Исаев, В.Г.Савченко, Е.В. Домрачева "Частичная дупликация МП гена при острых лейкозах" Материалы конференции "Новое в гематологии и клинической

трансфузиологии", Москва 13-15 апреля 2004г. Проблемы гематологии и переливания крови 2004, №2, с.36-37.

3) М.А.Вернюк "Перестройки М__ гена при острых лейкозах". Проблемы гематологии и переливания крови 2004, №3, с.36-42.

4) Е.В.Аксенова, Е.В.Лисовская, И.А.Демидова, Е.Н.Шуравина, М.А.Вернюк, А.В.Мисюрин "Тест-системы на основе метода ОТ-ПЦР для определения экспрессии химерных онкогенов при лейкозах". Здравоохранение и медицинская техника 2005, №2, стр. 11.

Отпечатано в ООО «Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94.

Подписано в печать 31.03.2005 г. Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. 1.0 п.л. Бумага New SvetoCopy.

4

>

2 2 AR? 2005

Актуальность проблемы.

В настоящее время ни одно клиническое исследование, направленное на улучшение результатов терапии острых лейкозов (ОЛ), не проводится без определения цитогенетических маркеров опухолевых клеток. Методом поперечного окрашивания хромосом аномалии кариотипа выявляются у 7090% больных ОЛ. Однако, приблизительно у 5-10% больных не удается получить достаточного количества метафаз для цитогенетического исследования. Кроме того, у трети больных с эффективным цитогенетическим анализом определяется нормальный кариотил. Поэтому, для выявления химерных генов или продуктов их транскрипции как при первичной диагностике ОЛ, так и в динамике заболевания используют более чувствительные методы: флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH) и обратнотранскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР).

Молекулярно-генетическая характеристика отдельных вариантов ОЛ позволяет выбирать прецизионную, а не унифицированную терапевтическую тактику. Обнаружение транслокации t(9;22)(q34;q11) и/или ее молекулярного эквивалента химерного гена BCR/ABL и перестроек с участием региона q23 хромосомы 11 (локуса гена MLL) является принципиальным. Эти хромосомные аберрации, являясь факторами неблагоприятного прогноза, обусловливают непродолжительность полных ремиссий, частое развитие первичной резистентности, высокий риск ранних рецидивов и неудовлетворительную общую выживаемость при использовании стандартных протоколов химиотерапии (XT). Это диктует необходимость интенсификации лечения (трансплантация костного мозга или стволовых клеток крови) на ранних этапах от момента достижения первой ремиссии и, возможно, проведение в дальнейшем биологической терапии.

На момент первичной диагностики острого лейкоза объем опухолевой массы составляет более 1012 лейкемических клеток. При достижении "морфологической" ремиссии может сохраняться до Ю10 бластных клеток [54], которые не могут быть выявлены при световой микроскопии. Использование метода FISH позволяет выявить одну опухолевую клетку с молекулярной перестройкой на 103 исследуемых клеток, ОТ-ПЦР - одну на 106, т.е. проводить детекцию минимальной резидуальной болезни (МРБ). Мониторинг МРБ позволяет определять конкретные терапевтические подходы при персистенции остаточной популяции опухолевых клеток или молекулярном рецидиве, а также оценивать эффективность новых методов лечения.

Все эти нерешенные вопросы послужили поводом для проведения нашего исследования.

Цель исследования:

Детекция и мониторинг минимальной резидуальной болезни при острых лейкозах с перестройками генов BCR/ABL и частичной тандемной дупликацией гена MLL методом ОТ-ПЦР.

Задачи исследования:

1. Отработать метод выявления частичной тандемной дупликации гена MLL с помощью ОТ-ПЦР.

2. Определить молекулярные, клинико-лабораторные характеристики и эффективность современной химиотерапии острых лейкозов с перестройками генов BCR/ABL и частичной тандемной дупликацией гена MLL

3. Изучить частоту достижения молекулярных ремиссий и их продолжительность в зависимости от методов лечения острых лейкозов (химиотерапия, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток).

4. Определить критерии молекулярной диагностики острых лейкозов с перестройками генов BCR/ABL и MLL-дупликацией.

5. Разработать алгоритм мониторинга химерных транскриптов BCR/ABL и частичной тандемной дупликации гена MLL (субстрат и частота проведения исследования, чувствительность метода ОТ-ПЦР).

6. Оценить эффективность биологического метода лечения минимальной резидуальной болезни ("INF+ATRA").

7. Определить оптимальную терапевтическую тактику у больных острыми лейкозами с перестройками генов BCR/ABL и частичной тандемной дупликацией гена MLL.

Научная новизна:

Определена эффективная терапевтическая тактика у больных с BCR/ABL-позитивными острыми лейкозами и острыми лейкозами с частичной тандемной дупликацией гена MLL на основе молекулярно-генетических исследований.

Практическая ценность:

1. Отработан метод выявления частичной тандемной дупликации гена MLL, который стал основой создания тест-системы для диагностики данной молекулярной перестройки у больных острыми лейкозами.

2. Определены критерии молекулярной диагностики BCR/ABL-позитивных острых лейкозов и острых лейкозов с частичной тандемной дупликацией гена MLL.

3. Разработан алгоритм мониторинга минимальной резидуальной болезни (субстрат и частота проведения исследования, чувствительность метода ОТ-ПЦР) при BCR/ABL-позитивных острых лейкозах и острых лейкозах с частичной тандемной дупликацией гена MLL.

4. Определена оптимальная программа лечения BCR/ABL-позитивных острых лейкозов и острых лейкозов с частичной тандемной дупликацией гена MLL с применением на ранних сроках от момента достижения первой полной ремиссии трансплантации аплогенных или аутологичных гемопоэтических стволовых клеток и биологической терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Отработан метод выявления частичной тандемной дупликации гена MLL, который стал основой создания тест-системы для диагностики данной молекулярной перестройки у больных острыми лейкозами.

2. Химерный транскриггг BCR/ABL «методом обратнаггранскриптазной полимеразной цепной реакции на момент первичной диагностики обнаруживают у 27,8% больных острыми лимфобларгными лейкозами и у 13,5% - острыми миелоидными лейкозами. Частичная тандемная дупликация гена MLL выявляется при диагностике острых лейкозов с одинаковой частотой (11%).

3. Молекулярная ремиссия при этих формах острых лейкозов достигается позже клинико-гематологической на 4-8 месяцев; а молекулярный рецидив развивается раньше гематологического на 2 месяца.

4. Медиана безрецидивной выживаемости при BCR/ABL-позитивных острых лейкозах и острых лейкозах с частичной тандемной дупликацией гена MLL существенно меньше, чем при острых лейкозах без этих молекулярных перестроек.

5. Определена оптимальная программа лечения BCR/ABL-позитивных острых лейкозов и острых лейкозов с частичной тандемной дупликацией гена MLL с применением на ранних сроках от момента достижения первой полной ремиссии трансплантации аплогенных или аутологичных гемопоэтических стволовых клеток и биологической терапии.

Выводы:

1. Создана тест-система для диагностики частичной тандемной дупликации гена MLL методом ОТ-ПЦР. При первичной диагностике острых лейкозов частичная тандемная дупликация гена MLL выявлена с частотой 11%, тогда как при стандартном цигогенетическом исследовании транслокация t(10;11)(p12;q13-21) обнаружена только при острых миелоидных лейкозах в 3,8% случаев. Острые лейкозы с MLL-дупликацией характеризуются большим объемом опухолевой массы и частым развитием ранних рецидивов, резистентных к химиотерапии.

2. Химерный транскрипт BCR/ABL методом ОТ-ПЦР обнаружен при первичной диагностике острых лимфобластных лейкозов у 27,8% больных, острых миелоидных — у 13,5%. Стандартным цитогенетическим методом частота выявления транслокации t(9;22)(q34;q11) существенно ниже и составила при острых лимфобластных лейкозах 9,1%, при острых миелоидных - 7,7%. BCR/ABL-позитивные острые лейкозы характеризуются высокой частотой развития ранних резистентных рецидивов.

3. На стандартных протоколах химиотерапии при BCR/ABL-позитивных острых лейкозах и острых лейкозах с MLL-дупликацией достигаются молекулярные ремиссии, но констатируются они реже и позже клинико-гематологических на 4-8 месяцев. Молекулярный рецидив развивается раньше гематологического (в среднем на 2 месяца), в связи с чем в течение первого года лечения мониторировать минимальную резидуальную болезнь необходимо с частотой один раз в 2 месяца.

4. Медиана безрецидивной выживаемости при BCR/ABL-позитивных острых лейкозах и острых лейкозах с частичной тандемной дупликацией гена MLL менее 9 месяцев. При острых лейкозах без этих молекулярных перестроек медиана безрецидивной выживаемости не достинута, так как более, чем у 50% больных сохранялась первая ремиссия.

5. Ранняя и агрессивная консолидация (трансплантация аллогенных или аутологичных гемопоэтических стволовых клеток) на сроке 6-8 месяцев от момента достижения первой ремиссии позволяет улучшать долгосрочные результаты терапии у больных с выявленными молекулярными перестройками.

6. Биологическое лечение интерфероном-альфа в сочетании с полностью транс-ретиноевой кислотой после выполнения трансплантации аллогенных или аутологичных гемопоэтических стволовых клеток является эффективным методом лечения минимальной резидуальной болезни, что подтверждается отсутствием молекулярных рецидивов.

Заключение.

Клинические пилотные и рандомизированные исследования остаются одними из самых объективных методов сбора и анализа информации по различным видам лечения больных острыми лейкозами. При этом удается выделить те биологические особенности острого лейкоза, которые в дальнейшем будут определять терапевтическую тактику в каждом конкретном случае. При острых лейкозах является принципиальным обнаружение транслокации t(9;22)(q34;q11) и перестроек с участием региона q23 хромосомы 11, как факторов неблагоприятного прогноза, обусловливающих непродолжительность полных ремиссий, высокий риск развития ранних резистегггных рецидивов и неудовлетворительную общую выживаемость при использовании стандартных протоколов химиотерапии.

Новые терапевтические способы воздействия на лейкемические клетки или новые лекарственные препараты могут принципиально изменять прогноз заболевания у больных этой группы риска. С целью достижения молекулярных ремиссий и увеличения их продолжительности при острых лейкозах с указанными хромосомными аберрациями, новые терапевтические подходы должны применяться на самых ранних этапах лечения. Для оценки клинического значения мониторинга минимальной резидуальной болезни у больных с реаранжировкой гена MLL необходимы перспективные исследования больших групп пациентов.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Характеристика больных.

В исследование включено 70 больных острым лейкозом, наблюдавшихся в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (руководитель член-корреспондент РАМН В.Г. Савченко) Гематологического Научного центра РАМН (директор академик РАМН и РАН А.И. Воробьев) в период с 2000 по 2004 гг. Среди них было 30 мужчин и 40 женщин. Медиана возраста составила 30 лет (15-74).

Образцы крови и костного мозга больных исследовали в различные сроки: до начала лечения, в периоды индукции и консолидации ремиссии, включая посттрансплантационный период, и на зтапе поддерживающей терапии. Всего выделено 458 образцов РНК. В среднем каждому больному было выполнено 6 исследований (от 1 до 19). Общее число реакций обратной транскрипции 89, полимеразных цепных реакций 562.

Все обследованные больные были разделены на 2 основные группы: 1) больные с острыми миелоидными лейкозами, 1-я группа; 2) больные с острыми лимфобластными лейкозами, 11-я группа. Обе группы, в зависимости от наличия или отсутствия предшествующей химиотерапии, были разделены на две подгруппы: первичные больные, молекулярное исследование которым выполнено до начала химиотерапии и пациенты, включенные в исследование на фоне проводимой XT. Больные с острыми промиелоцитарными лейкозами в исследование не включены. В качестве группы контроля были обследованы 13 здоровых доноров.

2.1.1. Больные с острыми миелоидными лейкозами (1-я группа).

В группу включено 44 пациента с острыми миелоидными лейкозами (18 мужчин и 26 женщин, медиана возраста 38 лет (15-74)).

2.1.1.а) Первичные больные ОМЛ (1-я подгруппа).

Было обследовано 37 пациентов с впервые выявленными острыми миелоидными лейкозами: 16 мужчин и 21 женщина, медиана возраста 38 лет

15-74). Первый больной включен в исследование в июле 2000 г., последний в мае 2004 г. Минимальный срок наблюдения 1 мес., максимальный 48,5 мес.

В подфуппе было: с острым миелобласгным недифференцированным лейкозом 1 больная (2,7%), с острым миелобласгным лейкозом с созреванием (М2) - 13 больных (31,1%), с острым миеломонобластным (М4) — 17 больных (45,9%), с острым монобластным (М5) - 4 пациента (10,8%) и 2-е (5,4%) с эритробластным (Мб) вариантом OMJ1. Результаты исследования периферической крови и костного мозга больных на момент диагностики острого лейкоза приведены в таблицей.