Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Молекулярно-генетическая диагностика и прогноз лейкозов у детей
- Ученая степень
- доктора медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.29
Автореферат диссертации по медицине на тему Молекулярно-генетическая диагностика и прогноз лейкозов у детей
На правах рукописи
\
Сергеев
Александр Григорьевич
Молекулярно-генетическая диагностика и прогноз лейкозов у детей
14.00.29 - гематология и переливание крови
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Москва -1998
Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики Межрегионального детского онкогематологического центра Областной детской клинической больницы № 1 г. Екатеринбурга.
Научный консультант: доктор медицинских наук, академик РАЕН, профессор Румянцев А.Г.
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН,
профессор Кисляк Н.С. доктор медицинских наук, профессор Ковалева Л.Г. доктор медицинских наук, профессор Кулешов Н.П.
Ведущая организация: Онкологический научный центр РАМН, г. Москва
Защита состоится " ^ У " 1998 г. в /У часов
на заседании диссертационного совета Д. 084.04.01 в НИИ детской гематологии Минздрава РФ по адресу 117513, Москва, Ленинский проспект, 117.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ детской гематологии Минздрава РФ.
Автореферат разослан // » /а г? 1998 Г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук
С.Г.Осипов
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Традиционным методом обнаружения хромосомных аберраций при лейкозах является цитогенетический метод дифференциальной G-окраски хромосом в метафазных пластинках [Seabright М., 1971]. Данный метод стал широко применяться в мировой практике с 70-х годов и в настоящее время продолжает играть ведущую роль в генетическом анализе опухолевых клеток. Наличие той или иной аномалии кариотипа позволяет судить о степени злокачественности опухоли (низкая, средняя, высокая) и, в соответствии с этим, назначать адекватное лечение и прогнозировать эффективность терапии [Румянцев А.Г., Самочатова Е.В., 1995; Walker Н. et al.,1994; Martinez-Climent J.A., 1997]. Однако эффективность цитогенетического метода ограничена возможностями светового микроскопа. Кроме того, в некоторых случаях по ряду причин не удается получить качественных препаратов метафазных пластинок [Roony E.D., Czepulkowski В.Н., 1986].
Успехи в области лечения лейкозов во многом обусловлены бурным развитием молекулярной генетики. Классический цитогенетический метод подготовил почву для расшифровки молекулярной структуры генной патологии опухолевых клеток, а изобретение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) K.Mullis в 1986 году открыло перспективу широкого внедрения методов молекулярной диагностики в различные отрасли медицины. Область применения методов молекулярно-генетического анализа постоянно расширялась и охватывает в настоящее время диагностику ряда наиболее актуальных бактериальных и вирусных инфекций, идентификацию личности в судебной медицине, генную инженерию, HLA-типирование, молекулярную диагностику наследственных заболеваний, а также повреждений генома, приводящих к злокачественной трансформации клеток [McPherson M.J. et al., 1992].
С изобретением ПЦР онкогематологи получили возможность пользоваться высокочувствительной молекулярно-генетической технологией для скринингового обследования больших групп больных на наличие генетических аномалий в опухолевых клетках. Однако, до недавнего времени возможности применения ПЦР в этой области ограничивались выявлением нескольких, относительно редко встречающихся хромосомных аберраций. В последнее время, в связи с расшифровкой молекулярных механизмов большинства часто встречающихся хромосомных аберраций и открытием криптической транслокации t(12;21), диагностический потенциал молекулярно-генетических методов существенно возрос [Shurtleff S.A. et al., 1995]. В
течение 10 лет область применения молекулярных методов диагностики в онкогематологии расширилась от единичных исследовательских работ до образования отдельного научного направления и, с другой стороны, до признания необходимости скорейшего их внедрения в практику [Meló J. et al., 1996].
Принцип ПЦР-диагностики хромосомных аберраций заключается в использовании праймеров (олигонуклеотидных затравок), комплементарных нуклеотидным последовательностям, которые в норме располагаются на различных хромосомах, а в результате транслокации формируют единый гибридный (химерный) ген. Разрывы генов при транслокациях происходят в интронах, причем локализация точек разрыва может варьировать. Область гена, в которой наиболее часто обнаруживаются разрывы при транслокациях, называют "кластером точек разрыва". После вырезания интронов в продуктах транскрипции химерных генов стыкуются экзон, расположенный перед кластером разрывов на одной хромосоме, и первый экзон, расположенный в 3' направлении от точки разрыва на другой хромосоме. Непостоянство локализации точек разрыва внутри одного интрона не влияет на структуру продукта транскрипции, поэтому объектом исследования для ПЦР-диагностики транслокаций служит кДНК, полученная с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ) химерной мРНК [Yamamoto К. et al., 1994].
В настоящее время описаны хромосомные аберрации, в которые вовлекаются практически все хромосомы. Из них 5 встречаются наиболее часто при остром лимфобластном лейкозе у детей (ОЛЛ): t(9;22), t(4;ll), t(l;19), t(8;14) и t(12;21) [Kobayashi H„ 1994]. Четыре аберрации с высокой частотой обнаруживаются при остром нелимфобластном лейкозе (ОНЛЛ): t(8;21), t(15;17), inv(16) и t(9;ll). Транслокация t(9;22) является генетическим маркером хронического миелолейкоза (XMJI) [Rowley J.D., 1973].
При наличии в лаборатории полного набора праймеров, с помощью ПЦР в настоящее время можно обнаруживать хромосомные аберрации более чем у 30% больных с острым лейкозом, а также у подавляющего большинства больных XMJI.
При этом, однако, неизбежно возникает вопрос об экономической целесообразности и практической значимости внедрения методов молекулярной диагностики хромосомных аберраций в клиническую онкогематологию на современном этапе. Следует учитывать тот факт, что доля большинства из известных в настоящее время аберраций в общей структуре хромосомной патологии при лейкозах составляет 1 -2%, и их изучение остается предметом академической науки. В то же время, круг аберраций, действительно актуальных для решения практических задач, связанных с диагностикой, лечением и прогнозом течения лейкоза у детей, может быть ограничен следующими:
1) t(9;22)(q34;qll) - показание к назначению лечения по протоколу высокого риска и трансплантации костного мозга при OJIJI; дифференциальная диагностика ХМЛ [Schlieben S. et al., 1996];
2)t(4;ll)(q21;q23) - низкий индекс выживаемости пациентов (0,2-0,3), и, следовательно, показание к назначению лечения по протоколу высокого риска и трансплантации костного мозга [Heerema N.A. et al., 1994];
3) t(12;21)(pl3;q22) - самая часто встречающаяся транслокация при В-линейном OJIJI у детей (20%); хороший ответ на терапию, 100% выход больных в ремиссию, благоприятный прогноз [Shurtleff S.A. et al., 1995];
4) t(15;17)(q22;q21) - около 100% случаев острого промиелоцитарного лейкоза (ОПМЛ), хороший ответ на лечение транс-ретиноевой кислотой [Huang М-Е. et al., 1988].
Следует отметить, что несмотря на большое количество работ, посвященных использованию методов молекулярной диагностики хромосомных аберраций у больных лейкозом, прикладные аспекты их использования для комплексной диагностики актуальных хромосомных аберраций в клинической практике до настоящего времени не получили должного освещения.
Цель работы
Разработка и внедрение в практику новых методов молекулярной диагностики и прогноза течения лейкозов у детей на основе анализа цитогенетических и молекулярно-генетических особенностей опухолевых клеток.
Основные задачи исследования
1. Анализ частоты встречаемости, оценка диагностической, прогностической значимости и особенностей аномалий кариотипа у детей, больных лейкозом, из Уральского региона России.
2.0тработка и внедрение в практику полимеразной цепной реакции для выявления наличия актуальных транслокаций t(4;ll), t(9;22), t(12;22) и t(15;17) в образцах костного мозга и крови у больных лейкозом и анализ клинико-лабораторных и молекулярных изменений у пациентов с выявленными хромосомными аберрациями для установления прогноза течения заболевания.
З.Оптимизация протоколов постановки ПЦР для обнаружения химерных продуктов опухолевых клонов при хроническом миелолейкозе.
4. Разработка и внедрение в практику метода количественного ПЦР-мониторинга концентрации химерных транскриптов у больных
хроническим миелолейкозом, получающих поддерживающую терапию, для ранней диагностики бластного криза.
Научная новизна
• Впервые проведен анализ аномалий кариотипа опухолевых клеток и выявлены некоторые особенности в распределении хромосомных аберраций у детей, больных лейкозом, из центрального и южного регионов Урала России.
• Впервые выявлено 3 случая острого лимфобластного лейкоза у детей, ассоциированного с делецией длинного плеча 4 хромосомы.
• Впервые установлена высокая частота развития поздних рецидивов у больных с В-линейным 1(12;21) - позитивным острым лимфобластным лейкозом.
• Впервые описан случай Т-линейного острого лимфобластного лейкоза, ассоциированного с транслокацией 1(12;21).
• Впервые описан случай РЬ-позитивного ВСЯ/АВЬ-негативного периода у ребенка с хроническим миелолейкозом.
• Впервые обнаружены волнообразные колебания уровня экспрессии химерного ВСЯ/АВЬ гена у детей, больных хроническим миелолейкозом, на фоне лечения интерфероном.
• Показана необходимость использования для ПЦР-диагностики минимальной резидуальной болезни специфического 3' праймера на стадии обратной транскрипции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Выявлены некоторые особенности патологии кариотипа опухолевых клеток у детей, больных острым лейкозом, из Уральского региона России. В группе больных острым лимфобластным лейкозом преобладают пациенты (63%) с кариотипом, ассоциированным с очень хорошим и относительно благоприятным прогнозом (гипердиплоидный п>50 и диплоидный набор хромосом, соответственно), в то время как частота встречаемости аберраций, связанных с высокой степенью злокачественности опухолевых клеток -1(4; 11), 1(9;22), <1ег(11)(я23) - оказалась достаточно низкой (11,6%). У больных с острым нелимфобластным лейкозом отмечена высокая частота (21%) обнаружения 1(15;17).
2. Использование, наряду с цитогенетическим методом, молекулярно-генетического анализа позволяет существенно повысить эффективность диагностики. Панель праймеров должна быть
рассчитана на обнаружение с помощью ПЦР по крайней мере четырех аберраций, наличие которых может помочь клиницисту в выборе стратегии лечения и определении прогноза течения заболевания: К4;11), К9;22), К12;21) и 1(15;17).
3. Наличие в опухолевых клетках при В-линейном остром лимфобластном лейкозе криптической транслокации 1(12;21) ассоциировано с хорошим ответом на химиотерапию и быстрым выходом больных в стойкую ремиссию. Однако для этой группы пациентов существует высокая вероятность развития позднего рецидива заболевания, что служит основанием для увеличения срока мониторинга минимальной резидуальной болезни с 2 - 3 до 5 - 6 лет.
4. У детей, больных хроническим миелолейкозом, на фоне лечения интерфероном наблюдаются волнообразные изменения концентрации ВСЯ/АВЬ транскриптов в костном мозге и крови, что связано, по-видимому, с изменением уровня экспрессии химерного гена. Наличие ВСЛ/АВЬ-негативного периода в хронической фазе заболевания не может быть интерпретировано как однозначно позитивный прогностический фактор.
5. При диагностике минимальной резидуальной болезни следует учитывать вероятность крайне малого числа опухолевых клеток в исследуемом образце костного мозга и низкого уровня экспрессии химерного гена в период ремиссии. В этих условиях необходимо использование максимально чувствительного варианта ОТ-ПЦР, что достигается применением на стадии обратной транскрипции специфического внешнего 3' праймера. Данная модификация протокола ОТ-ПЦР позволяет на порядок повысить чувствительность реакции и эффективность диагностики минимальной резидуальной болезни.
Практическая значимость работы
• Применение ПЦР повышает эффективность лабораторных методов обследования при лейкозах у детей, позволяет осуществлять раннее выявление актуальных хромосомных аберраций и диагностику минимальной резидуальной болезни.
• Рекомендована оптимальная схема работы клинической лаборатории молекулярной диагностики в структуре детского онкогематологического центра, включающая в себя скрининговое обследование всех первичных больных острым лимфобластным лейкозом на наличие транслокаций 1(9;22) и 1(12;21) и выборочное обследование на наличие транслокации 1(4; 11). У пациентов с острым промиелоцитарным лейкозом (МЗ) необходимо определять наличие РМЬ/11А11А транскриптов до начала и после окончания протокола
лечения. Больные, поступающие с диагнозом хронический миелолейкоз, нуждаются в обследовании на наличие BCR/ABL транскриптов с разрывом в области M-bcr.
• Разработанный метод количественного ПЦР-анализа химерных BCR/ABL транскриптов позволяет осуществлять раннюю диагностику бластного криза у больных хроническим миелолейкозом.
• Проведенные исследования позволяют рекомендовать для использования отечественное оборудование и реактивы для проведения ПЦР, что существенно снижает стоимость анализов, не отражаясь на качестве получаемых результатов.
Практическое внедрение полученных результатов
ПЦР-диагностика актуальных транслокаций при лейкозах внедрена в работу Межрегионального детского онкогематологического центра Областной детской клинической больницы №1, отделений гематологии Областной клинической больницы №1 и Городской больницы №7 г.Екатеринбурга.
Апробация работы
Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики Межрегионального детского онкогематологического центра Областной детской клинической больницы №1 г.Екатеринбурга.
Основные материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Уральской государственной медицинской академии (1995,1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), на научно-практических конференции специалистов Детских онкогематологи-ческих центров России и стран СНГ (Ростов, 1996, Москва, 1997, Екатеринбург, 1998), на 1-м Международном конгрессе по молекулярной медицине (Берлин, 1997), на 2-й Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения заболеваний" (Москва, 1998), на Уральской региональной конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных и онкологических заболеваний" (Екатеринбург, 1998), на международном семинаре "Диагностика и лечение лейкозов у детей" (Гиссен, 1998).
Публикации
Основное содержание работы отражено в 18 публикациях.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 214 страницах, иллюстрирована 33 таблицами и 23 рисунками. Библиографический список содержит 474 источника литературы.
Материалы и методы исследования
Были исследованы образцы костного мозга и периферической крови от 146 пациентов (77 мальчиков и 69 девочек) в возрасте от 1,5 месяцев до 15 лет с диагнозами ОЛЛ, ОНЛЛ и ХМЛ (табл. 1).
Таблица 1
Количество обследованных пациентов
Диагноз Метод исследования
Иммунофеноти-пирование Цитогенетика ПЦР
ОЛЛ 107 96 110
ОНЛЛ 20 22 23
ХМЛ 4 11 13
Всего 131 129 146
Методом ОТ - ПЦР был исследован 221 образец костного мозга и крови от пациентов (табл. 2).
Таблица 2
Количество образцов костного мозга и крови, исследованных с помощью полимеразной цепной реакции
1 Диагноз ОЛЛ Первичный 1 Ремиссия Рецидив | Всего
98 31 19 148
ОНЛЛ 23 12 0 35
! хмл 13 24 1 38
Всего 134 67 20 221
Выделение опухолевых клеток из костного мозга и крови проводили центрифугированием в градиенте плотности раствора Фиколл-верографина. Клетки суспендировали в растворе Эрла, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре минус 20° С.
Суммарную РНК из 106-107 клеток выделяли методом фенол-хлороформенной экстракции [Chomczynski P., Sacchi N., 1987]. Проведение ОТ-ПЦР для диагностики транслокаций осуществляли по модифицированным протоколам, описанным ранее [Borkhardt et al., 1994; Koller E. et al., 1995; Schlieben S. et al., 1996; Borkhardt A. et al., 1997]. В работе использовали праймеры и наборы для ОТ-ПЦР фирм "Bioteck" (Германия), "Perkin-Elmer" (США) и НПФ "Литех" (Москва). Амплификацию ДНК осуществляли в термоциклерах "GenAmp 9600 Perkin-Elmer" (США), "Циклотемп-2", "Циклотемп- 6" (СТМ, Москва)," Терцик" (АООТ ДНК-технология, Москва). Для оценки качества выделения РНК проводили амплификацию участка транскриптов нормальных генов ABL или AF4. В качестве положительного контроля использовали мРНК, выделенную из клеточных культур, несущих соответствующие транслокации: К-562, BV-173 и SUP В15 - t(9;22); MV411 и RS 411 -t(4;ll); REH -1(12;21); NB 4 -1(15;17).
Для учета результатов реакции продукты ПЦР-2 разделяли путем электрофореза в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия и фотографированием на ультрафиолетовом трансиллюминаторе.
Цитогенетический анализ проводили с использованием общепринятого метода краткосрочного культивирования клеток костного мозга с последующей дифференциальной G-окраской метафазных хромосом [Seabright М., 1971]. Хромосомные аберрации описывали по международной номенклатуре [ISCN, 1991].
Иммунофенотипирование бластных клеток костного мозга проводили до начала лечения на проточном цитометре "FACscan" с использованием панели из 17 моноклональных антител (Becton Dickinson), специфичных для ранних предшественников гемопоэза (CD34), пан-В (CD19, CD22) и пан-Т (CD3, CD7) антигенов лимфоцитов, активационных (CD38, HLA-DR), миелоидных (CD13, CD33) и дифференцировочных антигенов (CD4, CD8, CD 10, CD 14, CD 15, CD20, CD61, CD71). Опухолевый клон считали экспрессирующим тот или иной антиген при обнаружении его в более чем 20% клеточной популяции. Иммунофенотип опухолевых клеток определяли в соответствии с рекомендациями Европейской группы иммунологической классификации лейкемии (EGIL) [Rothe G. et al., 1996]. В случае коэкспрессии двух миелоидных антигенов при B-линейном OJ1JI, иммунофенотип бластов
обозначали как смешанный или гибридный (AHL) [ Гейл Р.П., Буттурини А., 1994; Азовская Т.Ю., 1998].
Показатели выживаемости пациентов оценивали с помощью актуариального метода [Kaplan-Meier, 1958].
Статистический анализ результатов исследований проводили с использованием общепринятых методов [Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962].
Результаты исследования
Цитогенетический анализ кариотипа опухолевых клеток в обследованной группе больных
Проведен анализ образцов костного мозга от 129 пациентов с OJIJI, OHJIJI и XMJI (96, 22 и 11 человек соответственно). В целом, эффективность цитогенетического анализа составила 68,2% (табл. 3).
Таблица 3
Эффективность цитогенетического анализа клеток костного мозга у больных лейкозом
Диагноз Количество обследованных Количество кариотипирован-ных Эффективность цитогенетическо го анализа (%) |
ОЛЛ 96 60 62,5
онлл 22 19 86
хмл 11 9 81,8
Всего 129 88 68,2 J
Из 96 пациентов с диагнозом ОЛЛ кариотип опухолевых клеток был определен у 60 человек. Диплоидный и аберрантные кариотипы обнаружены у 35% и 65% больных соответственно. В 28% случаев имели место лишь количественные изменения, в то время как у остальных наблюдались либо только структурные аберрации, либо структурные перестройки наряду с изменением числа хромосом (рис. 1). Гипердиплоидия более 50 хромосом, 47-50 хромосом, гиподиплоидия и псевдодиплоидия выявлены в 28%, 5%, 2% и 30% случаев соответственно (рис. 2).
Диплоидный кариотип 35%
Только изменения числа хромосом 28%
Специфические аберрации 20%
Случайные аберрации 17%
Рис. 1. Аномалии кариотипа опухолевых клеток у больных острым лимфобластным лейкозом
Псевдодиплоидный 30%
Диплоидный 35%
Гипердиплоидный п=47*50
5%
Гипердиплоидный п>50 28%
Гиподиплоидный 2%
Рис. 2. Плоидность опухолевых клеток у больных острым лимфобластным лейкозом.
Наиболее часто в анеуплоидных клонах обнаруживались дополнительные 21 и 22 хромосомы (рис. 3).
Исследование иммунофенотипа опухолевых клеток показало, что в подавляющем большинстве случаев диплоидный и гипердиплоидный (п>50) кариотипы были ассоциированы с иммунофенотипом рге-B/common (табл. 4). Наибольшее разнообразие иммунофенотипов отмечалось в группе пациентов с псевдодиплоидным кариотипом опухолевых клеток.
Таблица 4
Плоидность и иммунофенотип опухолевых клеток у больных острым лимфобластным лейкозом
Плоидность Число Иммунофенотип
наблю I Рге_ ! pre-В/ I рге-Т/Т AHL
-дении 1 рге-В common |
гиподиплоидия 1 1 0 1 0 0
псевдодиплоидия 18 ! 4 8 3 3
диплоидия 21 0 18 0 3
гипердиплоидия п=47-50 3 0 1 1 1
гипердиплоидия п>50 17 2 11 1 3
Всего: 60 6 39 | 5 10
Специфические и неслучайные структурные аберрации были найдены в 12 случаях (табл. 5).
Частота встречаемости случайных аберраций составила 16,6% (табл. 6). Среди них в трех случаях обнаружена del(4q), у двух пациентов -dup(l)(q25;q42). Следует отметить, что сведений о первой из указанных аберраций при ОЛЛ у детей в доступной литературе нами не обнаружено. Дупликация dup(l)(q25;q42) описана, как часто встречающаяся у больных при зрелом В-клеточном ОЛЛ и неходжкинской лимфоме [Nishida et al., 1995]. В обследованной группе данная патология была выявлена у пациентов с гибридным (common +CD13, +CD33) и рге-рге-В иммунофенотипами.
ч
и с л о
с
л
У ч а е в
2 Т
1
0
1 2
3
4
5
6
о<
с2 о 88
.О'
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 X У
Рис. 3. Участие хромосом в количественных и структурных перестройках кариотипа у больных острым лимфобластным лейкозом.
Обозначения: р - короткое плечо хромосомы д - длинное плечо хромосомы ЛООЗВОЧНЗЯ НРХВЯТКЯ
• хромосома О хромосомы □ ^ансаокация В делеция р дупликация д дериват
Таблица 5
Структурные аберрации и иммунофенотип опухолевых клеток у больных острым лимфобластным лейкозом
Аберрация Число Иммунофенотип
наблюдений рге-ргеВ рге-В/сош-топ рге-Т/Т 1 АНЬ
1(9;22)(ч34л11) 1 0 0 0 1
1(4;11)(Ч21л23) 2 2 0 0 0
другие аберрации 11ч23 4 1 2 0 1
ёе1(6<1) 1 0 0 0 1
с1ег(9р) 2 0 1 1 0
КИ;14)(р13;Ч11) 1 0 0 1 0
deг(12p) 1 0 1 0 0
случайные аберрации 10 2 3 3 2 |
Всего: 22 5 7 5 5
Таблица 6
Случайные хромосомные аберрации у пациентов с острым лимфобластным
лейкозом
| Пациент | Аберрация Карнотпп Иммунофенотип
| Н.Т. с1ир(1)№5я42) 46, ХХ/56,ХХ,<1ир(1)(Ч25я42)> +4,+5,+8,+ 10,+13,+21,+21+22,+22, +таг АНЬ
С.А. с!ир(1)(я25д42) 46, ХХ/46, XX, ¿ир(1)(я25я42), -20, +таг рге-рге-В
Ш.В. с!е1(1)(р36) 46, XX/46, XX, del(l)(p36) АНЬ
с.м. 1(2;7)(Ч37;Ч36) 46, XV, t(2;7)(q37;q36) / >50, ХУ, 1(2;7)(р37;д36) Т
А.М. К2;14Кр13м32) 46, XX / 46, XX, Ц2;14)(р13;ч32) Т
с.н. 1(3;17)(Ч13;р13), с1е1(16)(ч21) 46, XX / 46, XX, КЗ; 17)(ч 13 ;р 13), ёег(11Хч23>, ае](16)№1) рге-рге-В
Г.Д. 6е!(4)(д13) 46,ХУ / 46,ХУ, <1е1(4)(я 13) соттоп
М.Д. с1е!(4)(д13) 46,XX/ 46 XX, ёе1(4)(ч13) соттоп
м.с. ае1(4)(ч21) ; 46, ХУ / 52, ХУ, +3, с1е[(4)(Ч21), +9, + 10,+11, +21, +22 соттоп
| т.н. К7;19)(д34;р13) 46,ХХ/46,ХХ,К7;19)(ч34;р13) рге-Т
При сопоставлении данных, представленных в таблицах 5 и 6, видно что структурные хромосомные аберрации реже всего (18% обнаруживались в опухолевых клонах, имеющих иммунофенотш рге-В/соттоп.
Из 22 случаев ОНЛЛ удалось кариотипировать опухолевые клетки 19 пациентов. В 17 случаях были обнаружены клоны с хромосомными аномалиями, характерными для ОНЛЛ (табл. 7), в 2 случаях определялся диплоидный кариотип.
Таблица 7
Хромосомные аберрации, выявленные в опухолевых клетках больных
ОНЛЛ
Аберрация Число случаев FAB-подкласс Частота встречаемости (%) [Martinez J., 1997]
4 М4 5-10
t(15;17) 4 мз 8-15
del(7q),-7 4 | M2, M7 5-7
del(5q) 1 I атипичный I <2
der(ll)(q23) 1 2 М2, М4 | 8-10
inv(16) 1 М4 1 6-11
1 t(l;22) 1 1 М7 J 2-3
Таким образом, в обследованной группе больных с ОНЛЛ были выявлены почти все типичные для данного заболевания хромосомные аберрации, за исключением наиболее часто встречающейся, по данным литературы, транслокации t(8;21) [Walker et al., 1994]. Обращает на себя внимание также высокая частота (21%) встречаемости t(15;17), являющейся специфическим маркером острого промиелоцитарного лейкоза.
Из 11 обследованных пациентов с предварительным диагнозом ХМЛ опухолевые клетки удалось кариотипировать у 9 человек. При этом в 6 случаях была обнаружена транслокация t(9;22)(q34;qll). У 3 пациентов имел место диплоидный кариотип. Дополнительные хромосомные аномалии - гипотетраплоидия и del(6)(ql5) - были выявлены в двух и одном случаях, соответственно.
Данное исследование явилось первым опытом цитогенетического анализа кариотипа опухолевых клеток у детей, больных лейкозом, из Уральского региона России. Несмотря на сравнительно небольшой
объем выборки, полученные результаты, в основном, согласуются с данными отечественных авторов (Синелыцикова О.С. и соавт., 1994; Чирков A.A. и соавт., 1994), однако позволяют выделить некоторые особенности патологии кариотипа в обследованной группе пациентов. Обращает на себя внимание высокий процент больных, имеющих гипердиплоидный (п>50) и диплоидный кариотипы опухолевых клеток (65% случаев), ассоциированные с очень хорошим и относительно благоприятным прогнозом, соответственно. Доля больных, имеющих хромосомные аномалии, связанные с относительно неблагоприятным и крайне неблагоприятным прогнозами, составила 5% и 16,6%, соответственно. Наиболее часто в структурные перестройки вовлекались сегмент llq23 и длинное плечо хромосомы 4. Среди случайных аберраций, обнаруженных в группе больных OJIJ1, особый интерес представляют del(4q) и dup(l)(q25q42), выявленные у трех и двух пациентов, соответственно. Примечательно, что разрыв длинного плеча 4-й хромосомы в двух случаях локализовался выше, а в одном - совпадал с сегментом, в котором происходит разрыв при транслокации t(4;l I)(q21;q23). Для решения вопроса о неслучайном характере данных хромосомных аномалий при ОЛЛ у детей необходимо обследование большей группы пациентов.
Молёкулярная диагностика актуальных транслокаций у больных с острым лейкозом
Острый лимфобластный лейкоз, ассоциированный с криптической транслокацией t(12;21)(p13;q22)
Редкое обнаружение t(l2;2l) цитогенетическим методом (0,05% случаев ОЛЛ) связано с чрезвычайной схожестью переносимых при этой транслокации участков 12-й и 21-й хромосом [Romana S.P. et al., 1995]. На молекулярном уровне данная транслокация приводит к слиянию начальной части генов TEL и AML1, кодирующих факторы транскрипции. Применение методов ДНК-гибридизации in situ и ПЦР позволило обнаружить необычайно высокую частоту (19-27%) встречаемости этого химерного гена при ОЛЛ у детей. Показано, что данная аберрация ассоциирована с В-линейным иммунофенотипом и негипердиплоидным кариотипом опухолевых клеток. Первые результаты однозначно свидетельствовали об исключительно благоприятном прогнозе TEL/AML1 - позитивного ОЛЛ: 100% выход больных в ремиссию и 90-100% пятилетняя безрецидивная выживаемость [Rubnitz J.E. et al., 1996; Romana S.P. et al., 1996; Borkhardt A. et al., 1997]. В связи с этим, было предложено выделение больных с транслокацией t(12;21) в отдельную группу минимального риска с щадящим режимом
химиотерапии. Однако вопрос о целесообразности модификации протокола лечения для данных больных остается спорным в связи с сообщением о выявлении транслокации 1(12;21) у ряда пациентов с рецидивом ОЛЛ [НагЬоП е1 а]., 1997].
Было проведено исследование клеток костного мозга 98 пациентов в возрасте от 3 месяцев до 12 лет (86 больных с впервые выявленным и 12 с рецидивом ОЛЛ). Наличие химерных ТБЬ/АМЫ транскриптов определяли с помощью "гнездной" ОТ-ПЦР по описанному методу [ВогкЬаг<И А. е1 а1., 1997].
Транслокация 1(12;21) была обнаружена в 14,3% случаев (8 больных с первично выявленным и 6 - с рецидивом ОЛЛ). В 13 случаях выявлены транскрипты типа е5е2, в одном случае - типа е5'еЗ (рис. 4).
ТЕЬ/АМЫ - позитивные пациенты имели возраст от 2 до 10 лет, мальчиков было в 2,5 раза больше, чем девочек (10 : 4). В большинстве случаев обнаруживалась умеренная гепатоспленомегалия. В первичной гемограмме, как правило, отмечался умеренный лейкоцитоз (средний показатель - 12,8 109/л) с содержанием бластных клеток от 2% до 86% (средний показатель - 36,5%) . В костном мозге обнаруживалось от 44% до 98% бластов. Средняя величина фактора риска в данной группе больных составила 0,83.
Кариотипирование опухолевых клеток удалось провести у 9 больных. В двух случаях выявлен диплоидный кариотип, у остальных пациентов обнаружены хромосомные аберрации: гипердиплоидия п>50 и п=47-50, с!е1(1)(р36), <1е1(6)^13), 1(11;14)(я23;я24) и с1ег(12р). У 13 больных опухолевые клетки имели В - линейный иммунофенотип (в 10 случаях наблюдалась коэкспрессия одного или двух миелоидных антигенов), у одного пациента выявлен иммунофенотип рге-Т (табл. 8).
Таким образом, частота встречаемости криптической транслокации 1(12;21) в обследованной группе больных с острым лимфобластным лейкозом (13,4%) оказалась существенно ниже таковой по данным зарубежных авторов (р<0,01). Коэкспрессия миелоидных антигенов среди 1(12;21) - позитивных пациентов определялась достоверно чаще, чем в группе детей с острым лимфобластным лейкозом (р<0,05).
TEL
el е2 еЗ е4 е5 . сЗ
AML-1
12 3 4 5 ( I 7 « 9 10 I I 12 13 14 15 H) 17
ABL
( «ИМЯШЁк-ШМШК ^ниц^ш^шм г wKr 4H39SF щшяя* щвщдш щд^вр
*тт шш
TEL/AML-1 яят е5е2 тш е5еЗ
Рис. 4. Структура мРНК гена TEL/AML-1, локализация праймеров и электрофореграмма результатов ПЦР-диагностики транслокации t(12;21) у больных острым лимфобластным лейкозом.
В треках: 1-8 - контроль выделения РНК (нормальный ген ABL); 10-17 - индикация транскриптов TEL/AML-1-, 1-6, 10-15 - пробы от пациентов; 7,16 - положительный контроль (клетки REH); 8,17 - отрицательный контроль (вода); 9 - ДНК-маркер VI (2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453, 394, 234, 154 п.н.).
■са -в». . локализация праймеров
Таблица 8
Выявление транслокации 1(12;21) в группах больных острым лимфобластным лейкозом с различным иммунофенотипом опухолевых
клеток
рге-В/соттоп
В том числе с коэкспрессией СБ13 или СШЗ
17
рге-ТУТ АНЬ
12
15
Группа обследованных с диагнозом
ОЛЛ
ТЕЬ/АМЫ -позитивный ОЛЛ
У всех больных к 33 дню терапии наблюдался выход в клинико-гематологическую ремиссию. Два ребенка, у которых лечение было прервано, погибли от раннего рецидива. Индекс четырехлетней безрецидивной выживаемости пациентов с В-линейным ОЛЛ, получивших полный курс химиотерапии (п=11), был равен 0,82 (продолжительность первой ремиссии составляла от 15 до 75 месяцев). Однако в данной группе больных наблюдалась высокая частота поздних рецидивов (у 4 из 6 человек после 4 - 6 - летней ремиссии). Два пациента погибли от второго и третьего рецидива ОЛЛ через 35 и 140 месяцев от начала заболевания, соответственно. Период времени, в течение которого у ТЕЬ/АМЫ - позитивных пациентов был впервые установлен диагноз ОЛЛ, составлял 14 лет (с 1984 по 1998 год). Вследствие этого они получали лечение по разным схемам и протоколам (табл. 9).
Как видно из представленных данных, рецидивы ОЛЛ имели место как у пациентов, получавших в первом остром периоде непрограммную терапию, так и в случаях лечения по протоколам ШСАЬЬ и ВРМ-90. Обращает на себя внимание тот факт, что наибольшая продолжительность первой ремиссии (67 и 75 месяцев) наблюдалась у двух больных, получивших непрограммную терапию.
Таблица 9
Эффективность терапии у больных с В-линейным острым лимфобластным лейкозом, ассоциированным с транслокацией 1(12;21)
№ Паци Протокол лечения Продолжитель- Количество Исход 1
п/п -ент ность 1-й ремиссии (мес.) рецидивов
1 К.С. АЬЬ-ВРМ-90 49+ 0 СС11
2 Б.В. АЬЬ-ВБМ-90 31 + 0 сся
3 З.В. АЬЬ-ВРМ-90 28+ 0 СС11
4 А.З. А1Х-ВРМ-90 51 + 0 сск
1 5 А. С. А1Х-ВРМ-90 32 1 сся
6 М.А. А1Х-ВРМ-90 15 2 -г
7 с.ж иКАЬЪ 58 1 сси
8 К.Ж. иКАЫ 50 1 сся
9 К.Я. МВ-91 4+ 0 сся
10 ш.в УРЯ 75 3
! и с.н. УРЯ 67 1 ссл
Обозначения:
СС!3. - полная продолжительная ремиссия t - смерть от основного заболевания
Особый интерес представляет ранее не описанный в литературе случай обнаружения транслокации 1(12;21) у ребенка (мальчик, 6 лет) с Т-линейным ОЛЛ. Клинико-лабораторные показатели при поступлении были следующими:
- лейкоцитоз - 50 300/мкл (60% бластов);
- миелограмма - 90% бластов;
- печень - +10см;
- селезенка - +5 см;
- увеличение медиастинальных лимфоузлов;
- фактор риска = 1,62;
- иммунофенотип бластных клеток: СБ2-90,1%; ССЗ-41%; СБ5-88,3%; СБ7-88,7%; С04/СБ8 -84,6%; СБЮ -77,8%; СБ19 - 44,6%; СБ38-96,4%; СБ45 - 96,8%.
Кариотип опухолевых клеток определить не удалось. Методом ОТ-ПЦР у данного пациента (единственного из всей группы) определялся короткий тип (е5еЗ) ТЕЬ/АМЫ транскриптов (рис 4). Больному было проведено лечение по протоколу АЬЬ-ВРМ-90, плечо высокого риска. К 33 дню он вышел в клинико - гематологическую ремиссию и после окончания курса был переведен на поддерживающую химиотерапию. Через 12 месяцев после начала заболевания был диагностирован очень
ранний изолированный костномозговой рецидив, от которого больной погиб.
Результаты настоящего исследования позволяют сделать вывод о преждевременности выделения пациентов с OJIJ1, ассоциированным с t(12;21), в группу минимального риска. Выявление данной транслокации позволяет прогнозировать хороший ответ на терапию и быстрый выход больных в длительную ремиссию. Однако, ввиду высокой вероятности развития позднего рецидива заболевания, пациенты с t(12;21) нуждаются в ПЦР-мониторинге минимальной резидуальной болезни на протяжении, по крайней мере, 5 лет для раннего обнаружения возможной экспансии опухолевого клона.
Молекулярная диагностика транслокаций, ассоциированных с неблагоприятным прогнозом острого лейкоза
Транслокация t(9;22). Специфическая транслокация t(9;22)(q34;qll) у детей с QJIJI обнаруживается в 2,5-5% случаев, является крайне неблагоприятным прогностическим признаком (средняя пятилетняя выживаемость менее 30%) и служит показанием для лечения по протоколу высокого риска с последующей трансплантацией костного мозга [Crist W.M. et al., 1990; Ribeiro R.C. et al., 1987; Fletcher J.A. et al., 1991].
На молекулярном уровне результатом данной аберрации является образование химерного гена BCR/ABL, с функцией которого связана злокачественная трансформация клетки [Heisterkamp N. et al., 1985; Kurzrock R. et al., 1988]. Молекулярная диагностика t(9;22) основана на выявлении транскриптов гена BCR/ABL [Kawasaki E.S. et al., 1987; Dobrovic A. et al., 1988; Lee M.-S. et al., 1988].
В группу обследованных вошли 98 больных с первичным диагнозом OJÏJT. Клетки костного мозга исследовали с помощью ОТ-ПЦР на наличие двух вариантов BCR/ABL транскриптов с разрывами гена BCR в большом (M-bcr) и малом (m-bcr) кластерах.
Транскрипты типа ela2 (разрыв в области m-bcr) были выявлены у одного пациента (рис. 5). При этом, клетки опухолевого клона имели смешанный иммунофенотип (common с коэкспрессией миелоидных антигенов CD 13 и CD33). Аналогичное сочетание Ph хромосомы с гибридным иммунофенотипом у детей встречается достаточно редко [Schlieben S. et al., 1996; Carbonell F. et al., 1996]. С помощью ПЦР-мониторинга было показано, что BCR/ABL транскрипты обнаруживались у данного больного на протяжении всего заболевания в клетках крови и костного мозга как в стадии ремиссии, так и во время двух рецидивов. Больной погиб через 2 года после начала заболевания. Наличие Ph хромосомы было подтверждено цитогенетическим методом во время первого рецидива. В данном случае применение молекулярно-
BCR
el >3 ; о *
ABL
ela2
12 3-1 5 (i 7 8 9 10 II 12 13 U 15 Ш 17
-K3»w .
^csur
Фнтш «fr-*»' вя» ^
Рис. 5. Структура BCR/ABL мРНК и электрофореграмма результатов ПЦР-диагностики транслокации t(9;22) с разрывом гена BCR в области m-bcr.
В треках: 1-8 - контроль выделенияРНК (нормальный ген ABL); 10-17 - индикация транскриитов BCR/ABL; 1-6 и 10-15 - пробы от пациентов; 7,16 - положительный контроль (клетки SUP В15); 8,17 - отрицательный контроль (вода); 9 - ДНК-маркер VI (2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453.394. 234. 154п.нЛ.
-=3= -«в"" . локализация праймеров
генетического анализа позволило обнаружить транслокацию раньше, чем она была выявлена цитогенетическим методом, а также диагностировать минимальную резидуальную болезнь в период ремиссии.
Транслокация t(4;ll). Специфическая транслокация t(4;ll), в результате которой образуется химерный ген MLL1/AF-4, ассоциирована с самым неблагоприятным прогнозом при OJIJI у детей (индекс выживаемости 0,2-0,3). Эта аберрация встречается у 50% больных с врожденным pre-pre-B OJIJI и, реже, в сочетании с гибридным иммунофенотипом опухолевых клеток [Heerema N.A. et al., 1994]. Применение ПЦР позволило выявить новую форму скрытой, или криптической t(4;ll) в группе больных старше одного года с pre-pre-B и недифференцированным ОЛЛ [Griesinger F. et al., 1994]. По данным ряда авторов [Borowitz M.J. et al., 1993; Ludwig W.D. et al., 1993], t(4;l 1) также с достаточно высокой частотой обнаруживается в опухолевых клетках, имеющих иммунофенотип common с коэкспрессией CD 15 и\или CDw65. Таким образом, для эффективной молекулярной диагностики t(4;ll) достаточным является проведение выборочного обследования пациентов.
Из 98 больных с диагнозом ОЛЛ в группу обследованных вошли 10 человек. Подбор группы осуществлялся по следующим признакам:
1. Возраст - до 1 года;
2. Иммунофенотип бластных клеток pre-pre-B или common с коэкспрессией CD 15;
3. Наличие морфологических изменений 4 или 11 хромосом в кариотипе.
Химерные транскрипты MLL1/AF-4 с разрывом гена MLL1 в седьмом интроне (тип е7/Ь) были обнаружены в двух случаях у больных в возрасте 3 и 8 месяцев с pre-pre-B иммунофенотипом опухолевых клеток (рис. 6). Цитогенетический анализ подтвердил наличие t(4;ll) в обоих случаях. Обе больные погибли: одна - не достигнув ремиссии, другая - от рецидива через 6 месяцев после начала заболевания.
В одном случае пациенту с рге-ргеВ ОЛЛ (возраст 1 год) был поставлен цитогенетический диагноз t(4;ll) который, оставался сомнительным, вследствие низкого качества препарата метафазных пластин. Многократное исследование четырех проб костного мозга с помощью ОТ-ПЦР, показало отсутствие у ребенка химерных MLL1/AF-4 транскриптов, следовательно, и транслокации t(4;l 1). После проведенного лечения данный пациент находится в стойкой ремиссии в течение 4 лет (срок наблюдения).
Таким образом, использование ПЦР в клинике является эффективным как для обнаружения t(4;ll), так и для решения сложных задач диагностики и прогноза течения заболевания.
мРНК гена М1Ь
\
е5
еб
е7
с8
е9
5'
мРНК гена А¥4
Ь » »
кодоны: 348/351 362
391
1 2 3 4 5 <> 7 8 <> Ш И 12 13
3'
е7/Ь еб/с
АР4
Рис. 6. Структура мРНК генов МЬЬ и АР4, локализация точек разрыва и электрофоре-грамма результатов ПЦР-диагностики 1(4;11) у пациентов с острым лимфобластным лейкозом.
В треках: 1-6 - контроль выделения РНК (нормальный ген АР4); 8-13 -индикация транскриптов МЬЬ/АР4; 1-3, 8-10 - пробы от пациентов; 4,11 и 5,12 - положительные контроли (клетки 118411 и МУ411 соответственно); 6,13 - отрицательный контроль (вода); 7 - ДНК-маркер VI (2176, 1766, 1230, 1033,653, 517, 453, 394, 234, 154 п.н.).
1 - точка разрыва в гене.
ПЦР-диагностика транслокации t(15;17)(q22;q21) у больных с острым промиелоцитарным лейкозом
Частота встречаемости острого ггромиелоцитарного лейкоза (OHJIJT МЗ) у детей с ОНЛЛ составляет, по данным литературы, 3-8% случаев [Raimondi S.C. et al., 1989; Carter M. et al., 1989]. Эта форма лейкемии строго ассоциирована с транслокацией t(15;17), при которой образуется химерный ген PML/RARA. При этом происходит перестройка гена рецептора а11-транс-ретиноевой кислоты (ATRA) [Huang М.Е. et al., 1988]. Было показано, что ATRA индуцирует дифференцировку промиелоцитов, и в ее присутствии пролиферация опухолевого клона прекращается [Huang М.Е. et al., 1988; Chomienne С. et al., 1990]. Применение ATRA в комбинации со стандартной химиотерапией существенно улучшило результаты лечения больных, которые раньше погибали от тяжелого ДВС-синдрома [Castaigne S. et al., 1990].
По данным Seale J.R. et al.[1996], у большинства пациентов химерные PML/RARA транскрипты перестают обнаруживаться в костном мозге ко времени окончания протокола интенсивной химиотерапии. Однако, в части случаев они не исчезают в течение продолжительного времени с момента выхода больного в ремиссию. При этом, как правило, возникает рецидив заболевания. В связи с изложенным, очевидна необходимость молекулярной диагностики t(15;17) и последующего мониторинга PML/RARA транскриптов у пациентов с ОПМЛ, находящихся в ремиссии.
В обследованной нами группе из 23 пациентов с ОНЛЛ диагноз ОПМЛ (M3h) был установлен у 4-х человек. В трех случаях (все мальчики) наблюдалась классическая картина ОПМЛ: коагулопатия с геморрагическим синдромом, панцитопения, отсутствие органомегалии. У одного пациента (девочка) на фоне тромбоцитопении определялся гиперлейкоцитоз (27-109/л). При цитогенетическом анализе клеток костного мозга t(15;17) была обнаружена у трех больных. В одном случае цитогенетический диагноз оставался сомнительным. С помощью ОТ-ПЦР по модифицированному методу [Koller Е. et al., 1995] в "полугнездном" варианте транскрипты гена PML/RARA были обнаружены у всех больных в остром периоде ОПМЛ. В трех случаях разрывы гена PML локализовались в области bcrl- bcr 2, у одного пациента - в области bcr -3 (рис. 7).
Все больные получали лечение по пилотируемому европейскому протоколу PML-93: индукция - ATRA (45 мг/м2/день до достижения полной гематологической ремиссии)+цитозар+ рубомицин (цикл 7+3) и 2 консолидирующих цикла 7+3 с последующим переходом на поддерживающую терапию (6-меркаптопурин+метотрексат). Для диагностики минимальной резидуальной болезни методом ОТ-ПЦР
Б-тип РМЬ/НАИА мРНК Р2 РЗ Р4 ИЗ 114
Ь-тип РМЬ/КАИА мРНК РЗ Р4 . Р5 Р6 ИЗ 114
Р2 РЗ КЗ К4
РЗ Р4 Р5 Р6 ИЗ Ы4
ПЦР на ген АР-4
ПЦР на в-тап РМЬ/ЖАИА мРНК ПЦР на Ь-тип РМЬ/ЛАКА мРНК
I 2 Л 15 И 7
8 ¡) 10 Л 12 1.5 I I 15 Ш 17 18 1«) 20 21 22 23
Рис. 7. Структура мРНК гена РМЬ/КАИА и электрофореграмма результатов ПЦР-диагностики транслокации 1(15;17).
В треках: 1-5, 9-13, 17-21 - пробы от пациентов; 6,14,22 - положительный контроль (клетки ВУ); 7,15,23 - отрицательный контроль (вода); 8,16 - ДНК-маркер VI (2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453, 394.234. 154 п.н.).
- локализация праймеров
И К1 К 2
АТЯА - 45 дней
' I I О
1. Пацнент Б.П.
Рецидив
I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 22 23 24 25 26 27 28 29
_I1-'
АРЬ-93
ЛИх + б-Мр
И К1 К 2 АТНА - 56 дней
I-1
2. Пациент Т.В.
IX
123456789 II-
14 15 16 17 18 19 20 21
АРЬ-93
1Шх + б-Мр
И
АТИА - 45 дней
К1
3. Пациент Н.А. К 2
И Ш
АТЯА - 21 день
Г
п
АРЬ-93
К1
4. Пациент М.Д.
К 2
О О (Р
3 4
Срок после начала ■ лечения, мес.
АРЬ-93
Рис. 8. Результаты ПЦР-мониторинга транслокации г(15; 17).
Условные обозначения: И - блок химиотерапии (И - индукция, К1 - 1-я консолидация, К2 - 2-я консолидация); ф - положительный результат ПЦР; ф - отрицательный результат ПЦР;
1
2
пробы костного мозга отбирали на 15-30-й день от начала терапии и далее с различными интервалами (рис. 8).
Применение АТ11А во всех случаях позволило купировать геморрагический синдром. Сроки достижения гематологической ремиссии варьировали от 15 до 56 дней. У одного пациента (М.Л.) молекулярная ремиссия была зарегистрирована через 15 дней после начала терапии и наблюдалась в течение последующих трех месяцев после начала лечения. В данном случае можно сделать заключение о высокой чувствительности опухоли к комбинированной АТИА -химиотерапии и низкой вероятности развития в последующем рецидива заболевания. У остальных пациентов отмечался поздний выход в гематологическую ремиссию. При этом химерные РМЬ/ЯАЯА транскрипты обнаруживались на фоне применения АТ11А. Как показали результаты наблюдения, однократно полученный отрицательный результат ПЦР как после первой, так и после второй консолидации, не может свидетельствовать об элиминации опухолевого клона. Данное обстоятельство диктует необходимость периодического обследования пациентов, получающих поддерживающую терапию.
Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза и ПЦР-мониторинг минимальной резидуальной болезни
Хронический миелолейкоз у детей является относительно редким миелопролиферативным заболеванием с неблагоприятным прогнозом. Диагностика ХМЛ у детей связана с определенными затруднениями, поскольку далеко не всегда данные цитологии и цитохимии могут однозначно подтвердить или отвергнуть диагноз. Заболеваниями, имеющими сходные с ХМЛ клинико-лабораторные признаки, являются ювенильный ХМЛ, ряд патологий, сопровождающихся лейкемоидными реакциями, а также отдельные случаи миелодиспластического синдрома, в том числе хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ). Важнейшим дифференциально-диагностическим признаком ХМЛ у детей является наличие в опухолевых клетках транслокации К9;22) и, соответственно, химерных ВСЛ/АВЬ транскриптов с разрывом гена ВСЛ в большом кластере [АКтап А.1., 1993].
С помощью ОТ-ПЦР было обследовано 15 пациентов в возрасте от 1 года до 11 лет, поступивших с диагнозом ХМЛ. ВСЛ-АВЬ транскрипты с характерной локализацией разрыва в кластере М-Ьсг были выявлены в 7 случаях. У 6 пациентов опухолевые клетки экспрессировали транскрипты типа Ь3а2, у одного - транскрипты Ь2а2 и Ь3а2 типов одновременно (рис. 9). РЬ-хромосома была обнаружена цитогенетическим методом у 6 ВСЯ/АВЬ-положительных пациентов, в одном случае кариотипирование провести не удалось. В группе из 8 ВСЛ/АВЬ-негативных пациентов результат цитогенетического анализа удалось получить лишь в 3 случаях (нормальный кариотип). При
вся
• •• р11 ы Ь2 ЬЗ
... Р11 Ь1 Ь2
АВЬ
1 2 а 4 5 (» 7 8 9 И) II 12 13 I I 15 1«
АВЬ
Ь3а2 Ъ2а2
Рис. 9. Структура химерной ВСЯ/АВЬ мРНК и электрофореграмма результатов ПЦР-диагностики транслокации 1(9;22) с разрывом гена ВСЯ в области М-Ьсг. А- контроль выделения РНК; Б- индикация ВСЯ/АВЬ транскриптов. В треках: 1-13 - пробы от пациентов; 14 - положительный контроль (клетки К-562); 15 - отрицательный контроль (вода); 16 - ДНК-маркер VI (2176, 1766,1230, 1033. 653. 517. 453. 394.234.154 п.нЛ
а™ - локализация праймеров
углубленном цитоморфологическом исследовании у 2 из 8 BCR/ABL-негативных пациентов был установлен диагноз ХММЛ, у шести остальных диагноз ХМЛ был снят.
Образцы крови и костного мозга от пяти BCR/ABL - позитивных пациентов периодически исследовали в ПЦР во время хронической фазы заболевания. Положительный результат ПЦР повторялся на протяжении всего срока наблюдения (1,5 и 2 года) у двух пациентов, тогда как у остальных на фоне проводимой терапии химерные транскрипты в клетках костного мозга и/или крови с помощью обычного варианта ОТ-ПЦР в части случаев выявить не удавалось. В то же время, при цитогенетическом анализе Ph хромосома у данных пациентов обнаруживалась постоянно. В связи с этим, было высказано предположение о том, что уровень экспрессии гена BCR/ABL на фоне лечения в хронической фазе заболевания может быть существенно снижен, вследствие чего проведение обратной транскрипции в традиционном варианте с использованием "random" праймера не позволяет определить минимальные концентрации его продукта в исследуемых образцах.
Нами был проведен сравнительный анализ чувствительности ОТ-ПЦР с использованием "random" и специфического внешнего 3' праймера для индикации малых количеств BCR/ABL транскриптов. В качестве образцов, содержащих разное количество продуктов химерного гена, использовали серийные разведения контрольной клеточной культуры К-562, несущей транслокацию t(9;22). Клетки К-562 смешивали с лейкоцитами здорового донора в соотношениях от 1:10 до 1:107. Из каждого образца выделяли суммарную мРНК, половину объема которой использовали в качестве матрицы для ОТ с "random" праймером, а другую половину - для ОТ со специфическим 3' праймером. Было показано, что использование специфического праймера в ОТ позволяет на порядок повысить чувствительность реакции и обнаруживать присутствие одной опухолевой клетки среди 106 нормальных лейкоцитов.
Пробы костного мозга пациентов с ХМЛ, у которых в хронической фазе при наличии цитогенетически обнаруживаемой Ph хромосомы результат ПЦР был отрицательным, повторно исследовали в ОТ-ПЦР с применением на этапе обратной транскрипции специфического 3' внешнего праймера. При этом во всех 3 случаях были обнаружены химерные BCR/ABL транскрипты.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в хронической фазе ХМЛ у детей может наблюдаться крайне низкий уровень экспрессии BCR/ABL гена. Поэтому для диагностики минимальной резидуальной болезни необходимо использование наиболее чувствительного варианта ОТ-ПЦР, что может быть достигнуто применением на стадии обратной транскрипции специфического
внешнего 3' праймера как альтернативы использования "random" праймера.
Количественный анализ BCR-ABL транскриптов в клетках костного мозга и периферической крови у больных хроническим миелолейкозом
Особый практический интерес представляет изучение возможности использования ПЦР для количественного определения изменения концентрации химерных транскриптов в костном мозге и периферической крови у пациентов в динамике заболевания.
Нами был разработан метод количественного анализа BCR/ABL транскриптов Ь3а2 типа, базирующийся на принципе конкурентной ПЦР [Cross N.C.P. et al., 1993]. В качестве конкурирующей матрицы (компетитора) использовали фрагмент кДНК химерного BCR/ABL гена, полученной из клеточной культуры BV-173. При амплификации данного фрагмента, содержащего стык между экзонами Ь2 и а2, происходит образование продукта, отличающегося по длине от амплификата анализируемой матрицы на 75 нуклеотидов. При одновременном внесении в реакционную смесь исследуемой кДНК и известных концентраций конкурирующей матрицы определяли десятичный логарифм разведения компетитора, при котором наблюдалась одинаковая концентрация продуктов амплификации исследуемой и конкурирующей матриц (точка эквивалентности). Для определения концентрации химерных транскриптов в исследуемом образце вычисляли отношение точек эквивалентности культуры клеток К-562 и исследуемого образца. За единицу принимали уровень экспрессии BCR/ABL гена в культуре клеток К-562. Поправку на различие концентраций суммарной мРНК в образцах рассчитывали исходя из титра транскриптов нормального гена ABL. Вычисления производили по эмпирической формуле lgC = IgEs - IgEK + IgS - lgK, где С - отношение концентраций BCR/ABL транскриптов в культуре клеток К-562 и исследуемом образце; Es - разведение кДНК исследуемого образца в точке эквивалентности; Ек - разведение кДНК из клеток К-562 в точке эквивалентности; S - титр транскриптов гена ABL в исследуемом образце; К - титр транскриптов гена ABL в клетках К-562.
Количественный ПЦР-мониторинг проводили у трех больных. Исследовали пробы костного мозга и периферической крови с периодичностью 3-6 месяцев (рис. 10). У двух пациентов, наблюдаемых в течение двух лет, на фоне лечения интерфероном определялись волнообразные 50-кратные колебания уровня BCR/ABL транскриптов при отсутствии существенных изменений в гемо- и миелограммах. В третьем случае удалось выявить 1000-кратное повышение концентрации химерных транскриптов в костном мозге и периферической крови
Уровень экспрессии 100
Властный криз
1/100
0
8
12
16 21 26
Срок наблюдения, мес.
Рис. 10. Результаты ПЦР-мониторинга экспрессии химерного BCR/ABL гена у трех больных
хроническим миелолейкозом Примечание: за единицу принят уровень экспрессии гена BCR/ABL клетками культуры К-562. Обозначения: - пациент P.C., ша^ш a^as, а . пациент Б.Н.,
■на ш tmiwnffli - пациент З.А.
Разведение компетитора
—Проба
Компе-титор
Рис 11. Электрофореграмма количественного ПЦР-анализа ВСК/АВЬ транскриптов у больного хроническим миелолейкозом.
А, Б - пробы костного мозга за 8 и 4 месяцев до развития властного криза соответственно.
Точки эквивалентности: А-10-7; Б-КН
пациента за 4 месяца до развития бластного криза, в результате которого он погиб (рис. 11).
Проведенные исследования показали, что разработанный метод количественного ПЦР-мониторинга у детей, больных ХМЛ, является эффективным средством обнаружения экспансии опухолевого клона.
Методические особенности постановки ПЦР для диагностики актуальных транслокаций у больных лейкозом
Необходимым этапом внедрения достижений молекулярной генетики в практическую медицину является адаптация методик к реальным условиям клинических лабораторий. При этом большое значение имеет решение прикладных вопросов, не получивших пока должного освещения в литературе: стандартизация материалов и оборудования, сокращение затрат времени и материалов при выполнении анализа. Следует отметить и тот факт, что до настоящего времени коммерческие наборы для ПЦР-диагностики транслокаций не выпускаются, а международных или национальных стандартов чувствительности и специфичности реакции не существует.
Накопленный опыт позволил выбрать наиболее важные правила и разработать конкретные рекомендации по работе с исследуемым материалом при постановке "гнездной" ОТ - ПЦР, выполнение которых позволяет свести к минимуму риск получения ложноположительных результатов при диагностике транслокаций. Отработан максимально упрощенный протокол пробоподготовки, позволяющий в два раза сократить время выделения мРНК.
В результате проведенных исследований по оптимизации протоколов, унифицирован температурный режим амплификации для 3 транслокаций -1(4;11>, 1{9\22) и 1(12;21).
Высокая стоимость импортного оборудования, реактивов и расходных материалов, является фактором, безусловно сдерживающим внедрение методов молекулярно - генетического анализа в практику онкогематологии.
Нами проведена сравнительная оценка качества импортной и отечественной техники и реактивов для ПЦР-диагностики. Имеющийся опыт 5-летнего применения наряду с импортной техникой амплификаторов и реагентов российского производства позволяет сделать вывод о достаточно высоком качестве отечественной продукции, использование которой существенно (более чем в 10 раз) снижает себестоимость ПЦР-анализа. Это делает метод ПЦР-диагностики транслокаций приемлемым для внедрения в практику.
С целью стандартизации чувствительности и специфичности ПЦР -анализа, были скомпонованы и апробированы диагностические наборы для выявления комплекса актуальных транслокаций с минимальным числом компонентов на основе отечественных реагентов, выпускаемых
НПФ "Литех" ( Институт физико-химической медицины МЗ РФ, Москва).
Таким образом, для организации базовых клинических лабораторий молекулярной диагностики хромосомных аберраций в России в настоящее время имеются все необходимые предпосылки: теоретическая база, практический опыт и техническое обеспечение.
Выводы
1. Выявлены некоторые особенности частоты встречаемости нормального и измененного кариотипа опухолевых клеток у детей из Уральского региона, больных острым лейкозом. В группе больных острым лимфобластным лейкозом обнаружен высокий процент пациентов (63%), имеющих гипердиплоидный (п>50) и диплоидный наборы хромосом, ассоциированные с очень хорошим и относительно благоприятным прогнозом, соответственно. В то же время выявлена низкая частота встречаемости (11,6%) аберраций, связанных с высокой степенью злокачественности опухолевых клеток: t(4;ll), t(9;22), der(l 1 )(q23). Обнаружена высокая частота вовлечения в хромосомные перестройки длинного плеча 4-й хромосомы (8,3%). У больных с острым нелимфобластным лейкозом отмечена высокая частота обнаружения t(15;17).
2. Частота встречаемости криптической транслокации t(12;21) в обследованной группе больных с острым лимфобластным лейкозом (13,4%) оказалась существенно ниже таковой по данным зарубежных авторов (р<0,01).
3. В опухолевых клетках больных с В-линейным острым лимфобластным лейкозом, ассоциированным с транслокацией t(12;21), обнаружена высокая частота коэкспрессии одного или двух миелоидных антигенов (76,9%), которая является самостоятельным неблагоприятным прогностическим фактором. Частота коэкспрессии миелоидных антигенов среди t(12;21) - позитивных пациентов оказалась достоверно выше, чем в группе детей с острым лимфобластным лейкозом (р<0,05).
4. Группа TEL/AML1 - позитивных пациентов имеет хороший ответ на химиотерапию с выходом в длительную стойкую ремиссию. Однако при этом у них существует высокая вероятность развития позднего рецидива заболевания. В связи с этим, пациенты с хранслокацией t(l 2;21) нуждаются не менее, чем в 5 - летнем ПЦР-мониторинге минимальной резидуальной болезни для ранней диагностики экспансии опухолевого клона.
5. Транслокация t(12;21) у детей в редких случаях может быть ассоциирована с Т-линейным иммунофенотипом опухолевых клеток. При этом прогноз заболевания остается неблагоприятным.
6. В части случаев у детей с хроническим миелолейкозом после курса интенсивной химиотерапии при обнаруживаемой цитогенетическим методом в клетках костного мозга Ph-хромосоме наблюдается низкий уровень экспрессии BCR/ABL гена. Однако наличие BCR/ABL-негативного периода не может быть интерпретировано как однозначно позитивный прогностический фактор при данном заболевании.
7. При хроническом миелолейкозе у детей на фоне лечения препаратами интерферона зарегистрированы волнообразные изменения концентрации BCR/ABL транскриптов в крови и костном мозге, что связано, по-видимому, с периодическим изменением уровня экспрессии химерного гена в опухолевых клетках.
8. Для диагностики минимальной резидуальной болезни при хроническом миелолейкозе необходимо использование наиболее чувствительного варианта ОТ-ПЦР с применением на стадии обратной транскрипции специфического внешнего 3' праймера вместо "random" праймера.
Практические рекомендации
1.Для проведения эффективной молекулярной диагностики транслокаций у детей, больных лейкозом, панель праймеров должна быть рассчитана на обнаружение, по крайней мере, четырех аберраций, наличие которых может помочь клиницисту в выборе стратегии лечения и определении прогноза течения заболевания: t(4;ll), t(9;22), t(12;21) и t(15;17)
2. Целесообразно проведение оперативного скринингового обследования всех первичных больных острым лимфобластным лейкозом на наличие транслокаций t(9;22) и t(12;21), обнаружение первой из которых является показанием к выбору протокола лечения высокого риска, а выявление второй позволяет прогнозировать хороший ответ на терапию по протоколу лечения стандартного риска. Контингент пациентов, обследуемых методом ПЦР на наличие транслокации t(4;ll), может быть ограничен возрастной группой до 1 года или, при возможности иммунофенотипирования, группой больных с pre-pre-В ОЛЛ.
3. При хроническом миелолейкозе у детей единственной аберрацией, для обнаружения которой методом ПЦР оправдано скрининговое обследование пациентов, является транслокация t(9;22). При этом, в отличие от группы больных с Ph-позитивным острым лимфобластным лейкозом, у которых возможно обнаружение химерных транскриптов, различающихся по области разрыва в гене BCR, для пациентов с хроническом миелолейкозом достаточно определения одного класса химерных транскриптов (Ь2а2 и Ь3а2).
4. У больных острым промиелоцитарным лейкозом (OHJIJI МЗ) необходимо проводить ПЦР-диагностику транслокации t(15;17) в остром периоде, а затем с интервалом 2-3 месяца для выявления минимальной резидуальной болезни.
5. Обязательным условием получения достоверного положительного результата является повторное исследование в ПЦР образца кДНК, а затем дубликата пробы костного мозга от больного.
6. При диагностике минимальной резидуальной болезни следует учитывать вероятность крайне малого числа опухолевых клеток в исследуемом образце и низкого уровня экспрессии химерного гена. В этих условиях необходимо использование на стадии обратной транскрипции специфического внешнего 3' праймера. Данная модификация протокола ОТ-ПЦР позволяет на порядок повысить чувствительность реакции.
7. У пациентов с хроническим миелолейкозом, получающих лечение препаратами интерферона, необходимо проведение количественного ПЦР-мониторинга концентрации BCR7ABL транскриптов в костном мозге для ранней диагностики развития бластного криза.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Сергеев А.Г., Фечина Л.Г., Иванов P.A., Вострова Т.П. Редкий вариант молекулярной перестройки BCR-ABL гена, ассоциированной с Филадельфийской хромосомой II Вестник Уральской государственной медицинской академии. - 1995. - № 1. -С. 20-25.
2. Сергеев А.Г., Фечина Л.Г., Ковалев С.Ю., Иванов P.A. Опыт и перспективы использования ПЦР в детской онкогематологии // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. - III Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов. - Санкт-Петербург, 1996. - С. 121.
3. Стригалева М.В., Сергеев А.Г., Фечина Л.Г. Результаты цитогенетических исследований у больных с острым лейкозом II Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. - III Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов. - Санкт-Петербург, 1996. - С. 122.
4. Сергеев А.Г., Фечина Л.Г., Иванов P.A., Ковалев С.Ю. Опыт и перспективы использования полимеразной цепной реакции для диагностики хромосомных аберраций при лейкозах // Уральское медицинское обозрение. -1997. - № 2. - С. 46-48.
5. Sergeev A.G., Strigalyova M.V., Ivanov R.A., Fechina L.G., Kovalyov S.U. Discordance between cytogenetics and PCR results in some cases of "adult" type CML in childhood // Journal of Molecular Medicine. - 1997. -V. 75, N. 5. -B122.
6. Сергеев А.Г., Иванов P.A. Молекулярно-генетическая характеристика Ph-негативных BCR-ABL-позитивных лейкозов // Деп. в ВИНИТИ № Д-25.681 от 4.08.97 г. - 17 с.
7. Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Стригалева М.В., Фечина Л.Г. Выявление минимального уровня экспрессии BCR/ABL гена при "adult" типе ХМЛ у детей // Вестник Уральской государственной медицинской академии. - 1997. - № 5. - С. 89-91.
8. Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Стригалева М.В., Фечина Л.Г. Опыт применения ПЦР для выявления хромосомных аберраций в детской онкогематологии // II Всероссийская конференция "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. - М„ 1998. - С. 131-132.
9. Сергеев А.Г. Высокая частота обнаружения криптической транслокации t(12;21) у детей с рецидивом ОЛЛ // Современные проблемы педиатрии. - VIII съезд педиатров России. - М., 1988. - С. 373.
Ю.Сергеев А.Г. Разный уровень экспрессии BCR/ABL гена у детей с Ph-позитивным ХМЛ // Современные проблемы педиатрии. - VIII съезд педиатров России. - М., 1988. - С. 385.
П.Сергеев А.Г., Стригалева М.В., Иванов Р.А., Фечина Л.Г. Особенности ПЦР-диагностики минимальной резидуальной болезни при "adult" типе ХМЛ у детей // Педиатрия. - 1998. - № 6. - С.
12.Сергеев А.Г., Иванов Р.А. Генодиагностика лейкозов. Екатеринбург, 1998. - 40 с.
1 З.Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Стригалева М.В., Азовская Т.Ю., Фечина Л.Г. ПЦР-диагностика криптической транслокации t(12;21) при ОЛЛ у детей // Вестник Уральской государственной медицинской академии.- 1998. - № 7. - С.
14.Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Фечина Л.Г. Опыт использования полимеразной цепной реакции для выявления хромосомных аберраций в детской онкогематологии // Гематология и трансфузиология. - 1998. - № 6. - С.
15.Сергеев А.Г. Применение метода конкурентной ОТ-ПЦР для определения уровня экспрессии BCR/ABL транскриптов у детей с Ph-позитивным ХМЛ // Мат. Юбилейной конф. педиатров. -Екатеринбург, 1998. - С.
16.Сергеев А.Г. ПЦР-диагностика актуальных аберраций у детей, больных лейкозом // Деп. в ВИНИТИ № Д-26.003 от 24.08.98 г. -49 с.
17.Сергеев А.Г., Иванов P.A., Стригалева М.В., Фечина Л.Г. Применение метода полимеразной цепной реакции для дифференциальной диагностики хронического миелолейкоза у детей // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - № 8. - С. 32.
18.Сергеев А.Г., Стригалева М.В., Иванов P.A., Фечина Л.Г., Азовская Т.Ю. Результаты кариотипирования опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом II Педиатрия. - 1999. - № 2. - С.
Список используемых сокращений
ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого
свертывания ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - комплементарная ДНК МДС - миелодиспластический синдром МРБ - минимальная резидуальная болезнь мРНК - матричная (информационная) РНК ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз ОНЛЛ - острый нелимфобластный лейкоз ОПМЛ - острый промиеяоцитарный лейкоз ОТ - обратная транскрипция п.н. - пар нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ХМЛ - хронический миелолейкоз ХММЛ - хронический миеломоноцитарный лейкоз AHL - острый гибридный лейкоз
ALL-BFM-90 - протокол лечения острого лимфобластного лейкоза
Берлин-Франкфурт-Мюнстер ANLL-BFM-87 - протокол лечения острого нелимфобластного
лейкоза Берлин-Франкфурт-Мюнстер APL-93 - европейский протокол лечения острого
промиелоцитарного лейкоза ATRA - а11-транс-ретиноевая кислота CCR - полная продолжительная ремиссия
FAB - франко-американо-британская морфо-цитохимическая
классификация острых лейкозов МВ-91 - протокол лечения острого лимфобластного лейкоза
Москва -Берлин M-bcr - большой кластер точек разрыва m-bcr - малый кластер точек разрыва Ph- хромосома - Филадельфийская хромосома Taq-полимераза - ДНК-полимераза бактерии Thermus aquaticus
иКА1Х - английский протокол лечения острого лимфобластного лейкоза
УРЯ - непрограммная терапия острого лимфобластного лейкоза с индукцией: винкристин + рубомицин + преднизолон.