Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Молекулярно-биологические факторы прогноза терапии ювенильного идиопатического артрита у детей

Рохлина Фаина Валерьевна

На правах рукописи

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА ТЕРАПИИ ЮВЕНИЛЬНОГО ИДИОПАТИЧЕСКОГО АРТРИТА У ДЕТЕЙ

14.01.08 - Педиатрия 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

23 ОКТ 2014

Санкт-Петербург 2014 005553576

005553576

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре педиатрии имени профессора И.М.Воронцова ФП и ДПО.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Новик Геннадий Айзикович доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталия Михайловна

Официальные оппоненты:

Эрман Михаил Владимирович доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», кафедра педиатрии, заведующий. Тотолян Арег Артемович доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека; заместитель директора по научной работе, лаборатория молекулярной иммунологии и сероэпидемиологии, заведующий; Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «10» ноября 2014 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 208.087.03 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России по адресу: Санкт-Петербург, ул. Кантемировская, 16 ^

Автореферат разослан «_

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.087.03

д. м. н., профессор Чухловина M.JI.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) - определяют, как воспалительное заболевание суставов, неустановленной причины, которое охватывает все формы артрита, начинающиеся до 16-летнего возраста, и продолжающиеся более, чем 6 недель, а также имеющие неизвестное происхождение [A.Ravelli, A.Martini, 2007; Е.И.Алексеева, 2011; И.П.Никишина, Н.Н.Кузьмина, 2008]. ЮИА одно из самых распространенных хронических ревматических заболеваний у детей [N.T.Ilowite, 2008] и является одной из основных причин долгосрочной инвалидности [J.E.Weiss, N.T.Ilowite, 2007]. Частота ЮИА среди детей 1:1000 [T.Beukelman, 2011].

Часто в терапии хронических заболеваний встречается феномен лекарственной устойчивости. Одним из важнейших механизмов химиорезистентности клетки является невозможность индуцировать ее апоптоз. Это может быть связано как с гиперэкспрессией генов, ответственных за выведение лекарственных препаратов из клетки, так и с мутациями генов, ответственных за апоптоз [А.Н.Кожевников, Г.А.Новик, В.И.Ларионова, 2013].

Семейство генов MDR (ген множественной лекарственной устойчивости) включает в себя MDR1 и MDR2 гены. MDR1-ген - отвечает за устойчивость к различным цитотоксическим препаратам, функции MDR2-гена остаются неизвестными [J.E.Chin et al, 1989]. Полиморфизм в гене MDRI, может влиять на фармакокинетику многих лекарственных средств, например, цитостатиков, включая противоопухолевые препараты [S.V.Ambudkar et al., 2003].

Продукт MDRI-гена - Р-гликопротеин (P-gp), этот белок действует как трансмембранный насос, и влияет на действие многих лекарств [Ж.А.Миронова, В.И.Трофимов, М.А.Симакова и др., 2010; V.Annese, M.R.Valvano, O.Palmieri et al., 2006]. P-gp, локализован на хромосоме 7q21. P-gp действует как энергозависимый насос, выкачивая из клетки против концентрационного градиента разнообразные цитотоксические соединения. Р-gp — типичный белок транспортера АТФ-связывающей кассеты, составленный из двух половин, каждая из которых содержит трансмембранную область и нуклеотид связывающую область, отделенный гибким пространством [L.Cantarini, G.Simonini, B.Frediani et al., 2012; Z.E.Sauna, I.-W.Kim, S.V.Ambudkar, 2007].

Мембранные транспортеры, такие как P-gp, играют существенную роль в развитии множественной лекарственной устойчивости [M.M.Gottesman, V.Ling, 2006]. Известно, что полиморфизм С3435Ткоррелирует с активностью P-gp.

В клинических исследованиях установлено, что уровень экспрессии P-gp достоверно коррелирует с активностью ревматических заболеваний, таких как ревматоидный артрит [Y.Tanaka, S.Tsujimura, 2006].

«Золотой» стандарт для лечения ЮИА — метотрексат (MTX) [T.Niehues, Р.Lankisch, 2006] — цитостатический препарат из группы антиметаболитов, антагонистов фолиевой кислоты. По данным различных авторов около 70%

пациентов получающих терапию МТХ, входят в ремиссию по заболеванию [ГРоеМуап, А^егк, 2010].

Оценка полиморфизма С3435Т гена МОЮ у детей с ЮИА является актуальным вопросом, в детской ревматологии, так как неизвестны частота распределения данного полиморфизма у детей, степень влияния на эффективность терапии и прогноза течения ЮИА. Изучение экспрессии гена МЭШ (Р-§р), отражающее функциональное состояние данного гена, может быть важным звеном в оценке эффективности терапии артрита.

Цель исследования

Изучить структурные (полиморфизм С3435Т) и функциональные (Р-гликопротеин) особенности МОЮ гена у детей с ЮИА для разработки рекомендаций по оценке прогноза течения болезни и оптимизации терапевтической тактики.

Задачи исследования

1. Выявить особенности течения и оценить эффективность терапии у детей с различными вариантами ювенильного идиопатического артрита.

2. Изучить характер распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма С3435Т гена МОЮ у детей с различными вариантами ювенильного идиопатического артрита.

3. Оценить характер экспрессии гена МОЮ у детей с ювенильным идиопатическим артритом в зависимости от активности артрита, пола ребёнка и характера суставного поражения.

4. Выявить зависимость уровня метотрексата в сыворотке крови у больных с ювенильным идиопатическим артритом от варианта течения заболевания, носительства аллелей и генотипов полиморфизма С3435Т гена МОЮ и экспрессии Р- гликопротеина.

5. Определить уровень основных провоспалительных цитокинов (ТЫРа, 1Ыр, 1Ь6) в сыворотке крови в зависимости от носительства аллелей и генотипов полиморфизма С3435Т, экспрессии Р-гликопротеина и уровней метотрексата в сыворотке крови.

6. На основании результатов клинико-лабораторных и молекулярно-генетических данных разработать факторы прогноза перехода больных с ювенильным идиопатическим артритом из «активной» болезни в «неактивную».

Научная новизна исследования

1. Впервые в исследовании проведена оценка характера распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма С3435Т гена МОЮ у детей с различными вариантами ювенильного идиопатического артрита в зависимости от активности артрита, пола и характера суставного поражения.

2. Впервые проведено изучение функционального состояния гена множественной лекарственной устойчивости по уровню Р-гликопротеина на

лимфоцитах в периферической крови (базального и стимулированного IL2) у детей с ювенильным идиопатическим артритом.

3. Впервые изучена концентрация метотрексата в сыворотке крови у детей с различными вариантами течения ювенильного идиопатического артрита, возрастом дебюта и активностью заболевания.

4. Впервые разработана бальная шкала оценки вероятности перехода больного с ЮИА из «активной» болезни в «неактивную», с учётом иммунологических показателей.

Практическая значимость

Полученные результаты следует использовать для оценки эффективности базисной терапии ювенильного идиопатического артрита (определение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, до и после стимуляции IL2, в периферической крови).

С целью оптимизации терапии рекомендовано использование бальной шкалы прогнозирования перехода больного из «активной» болезни в «неактивную».

Положения, выносимые на защиту

1. Пациенты с генотипом TT полиморфизма С3435Т гена MDR1 характеризуются более высокой клинико-лабораторной активностью заболевания, на фоне низкой активности гена множественной лекарственной устойчивости, с отсутствием прироста относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, после стимуляции IL2 (in vitro).

2. Пациенты с «активным» ЮИА имеют более высокое относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (как до стимуляции IL2 in vitro, так и после), что не сопровождается ожидаемым увеличением концентрации MTX в сыворотке крови. Увеличение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин в сочетании с низкой концентрацией MTX в сыворотке крови свидетельствует о существовании независимого от MDR1 гена механизма регуляции внутри- и внеклеточной концентрации цитостатиков.

3. У больных с системным вариантом ЮИА, в отличие от других вариантов артрита, отмечается достоверное повышение IL6 как в состоянии «активной», так и «неактивной» болезни, что подтверждает ведущее значение данного цитокина в формировании заболевания. Больные ЮИА несмотря на применение генно-инженерных биологических препаратов (TNFa), имеют более высокий уровень TNFa в сыворотке крови, чем у больных получающих только базисную терапию, что характеризует данную группу, как более тяжёлую.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на школе молодых учёных, организованной PRES (Анталия, Турция 2011 г.); в рамках 18-го

Европейского конгресса детских ревматологов Р11Е8-2011 (Брюгге, Бельгия, 2011 г.); на XI Северо-Западной научно-практической конференции по ревматологии (Санкт-Петербург, 2011 г); на V Региональной научно-практической конференции «Воронцовские чтения-2012» (Санкт-Петербург, 2012г.); на IV Российской научно-практической конференции «Аллергологические и иммунопатологические заболевания — проблема XXI века» (Санкт-Петербург, 2012г.); на VI Съезде ревматологов России (Москва, 2013г); на I Международном Форуме «Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование» (Санкт-Петербург, 2013г); на 20-м Европейском конгрессе детских ревматологов Р11Е8-2013 (Любляна, Словения, 2013 г.); на V Российской научно-практической конференции «Аллергологические и иммунопатологические заболевания - проблема XXI века» (Санкт-Петербург, 2013 г.); на VII научно-практической конференции с международным участием «Воронцовские чтения. Санкт-Петербург-2014»; на Конференции молодых ученых «Перспективы развития медицинской науки и практики», 22 мая 2014, Санкт-Петербург.

Работа выполнена при поддержке Правительства Санкт-Петербурга, с использованием гранта для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук-2012.

Подана заявка на получение патента «Способ определения активности МЭШ гена», приоритетная справка №2013134902 от 23.07.2013

Внедрение полученных результатов

Полученные результаты исследования применяются в работе педиатрического отделения №3 клиники ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России (г. Санкт-Петербург) и кардиоревматологического отделения СПб ГБУЗ «Детская больница №2 Святой Марии Магдалины». Материалы проведённого исследования используются в учебном процессе на кафедре педиатрии имени профессора И.М.Воронцова ФП и ДПО, кафедре госпитальной педиатрии ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России.

Личное участие автора

Автором был проведен анализ литературных данных, посвященных влиянию полиморфизма С3435Т гена МИЮ и продукта этого гена (Р-гликопротеина) на эффективность базисной терапии ЮИА. Совместно с научными руководителями была сформулирована цель исследования, определены задачи, выбраны оптимальные методы исследования для проведения научной работы (клинико-биохимический, иммунологический, генетический). Был разработан план исследования. Автор осуществляла набор, клинический осмотр и динамическое наблюдение за пациентами в соответствии с планом исследования. Освоила современный генетический метод ПЦР-ПДРФ анализ (выделение ДНК, амплификация, электрофорез в геле). Была разработана специальная электронная база для хранения и статистической

обработки данных. Полученные данные были обобщены, проанализированы и обсуждены. Сформулированы выводы и практические рекомендации.

Заключение этической комиссии

Методы одобрены этическим комитетом государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол №7/15 от 17 января 2010).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением общей характеристики пациентов, используемых методов исследования, собственных результатов исследования и их обсуждения, выводов, указателя литературы. Диссертация содержит 31 отечественных и 126 зарубежных источников литературы, проиллюстрирована 32 таблицами, 35 рисунками. Представлены клинические примеры.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы

Клинико-лабораторная характеристика детей с ЮИА

В исследование были включены дети, больные различными вариантами ювенильного идиопатического артрита (ЮНА). Критерии отбора были следующие: 1. возраст дебюта заболевания до 17 лет; 2. стаж болезни более 3 месяцев; 3. терапия включала использование внутримышечного (в/м) метотрексата в дозе 15 мг/м2, в течение 3-х месяцев и более, вне зависимости от эффекта.

В нашем исследовании участвовали 103 ребенка, больных ЮИА. Все дети находились на стационарном лечении в ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский Государственный Педиатрический Медицинский Университет (педиатрическое отделение №3) или в ЛОГУЗ «Детская клиническая больница» (педиатрическое отделение). Для проведения исследования было получено разрешение этического комитета и информированное согласие родителей.

В основную группу исследования вошло 38 мальчиков и 65 девочек, возраст детей на момент включения от 2 до 17 лет 11 месяцев. (Рисунок 1)

Все пациенты по клинико-лабораторной картине отвечали критериям ЮИА Международного Конгресса Ассоциации Ревматологов, ILAR (Durban, 1997). По числу поражённых суставов и характеру течения заболевания все дети были разделены на 4 основные группы: «полиартрит», «олигоартрит», «системный артрит», «энтезитассоциированный артрит». (Таблица 1)

Детке хроническими артритами от 2 до 17.ЖГ, получающие ыетотргкеат :

Св/м), как базисный препарат в течении 3 месяцев и более. ;

!

................~"'Г"

Юаенильный идиопатический артрит

♦пациенты, исключённые из исследования

** «активная» болезнь - проявления активного артрита/|СРБ/|СОЭ/активный увеит (Carol Wallace год)

***пациенты без проявлепий «активной» болезни, продолжающие получать терапию

MTX

Рисунок 1. Дизайн исследования

Таблица 1

Распределение детей с ЮИА согласно классификации ILAR (Durban, 1997)

"\Вид ЮИА Пол Олигоартрит Полиартрит Системный артрит Энтезитассоц. артрит Все больные

Девочки 18 (72,00%) 37 (80,43%) 7 (50,00%) 3 (16,67%) 65

Мальчики 7 (28,00%) 9(19,57%) 7 (50,00%) 15 (83,33%) 38

Все больные 25 46 14 18 103

В качестве группы сравнения в исследование были включены условно-здоровые дети без признаков воспалительной активности и с неотягощённым

семейным анамнезом по воспалительным артропатиям. Забор крови и осмотр пациентов производился в рамках ГБОУ ВПО СПбГПМУ педиатрических отделений №№ 3 и 4, а также в ЛОГУЗ «Детская клиническая больница» педиатрическое отделение.

Методы оценки активности заболевания («активная»/«неактивная»

болезнь)

Активность заболевания оценивалась на основании, разработанных Carol A. Wallace с соавторами, критериев «активной» и «неактивной» болезни. «Неактивная» болезнь — это отсутствие проявлений активного артрита, лихорадки, сыпи, серозита, спленомегалии или генерализованной лимфоаденопатии, связанной с ЮИА, а также отсутствие обострения увеита, нормальное СОЭ и СРБ [C.A.Wallace, 2006].

Выделение MDRl-гена, определение полиморфизма С3435Т Амплификация проводилась на приборе "ICycler (BioRad, США) по стандартной двухпраймерной схеме. Каждая проба амплифицировалась в двух раздельных пробирках содержащих так же по 3 мкл исследуемой ДНК и пару праймеров, специфичных различным вариантам гена MDR1. Последовательности используемых праймеров: обратный праймер (общий для обоих аллелей гена MDR1) 5'-actataggccagagaggctgc-3' и два прямых праймера, раздельно для обоих аллельных вариантов гена MDR1: 5'-gtggtgtcacaggaagaggtC-З' и 5'-gtggtgtcacaggaagaggtT-3'.

Программа амплификации состояла из начальной денатурации (95 °С, 3 мин) и 40 циклов, включавших денатурацию (94 °С, 20 с) и отжиг праймеров + элонгация (61°С, 40 с).

На каждом последнем шаге амплификационного цикла проводился учет накопления сигнала от интеркалирующего красителя в режиме реального времени. Типирование генотипа пробы проводилось по соотношению сигналов в обеих пробирках.

Амплификация каждой пробы проводилась в двух микропробирках, содержащих праймеры для Т и С аллеля. Амплификация проводилась в присутствии интеркалирующего красителя EVAGreen Идентификация аллелей выполнялась с помощью полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом по описанным методам [Fleury I. et.al., 2003; van Rossum EFC. et al„ 2004].

Определение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих

на своей мембране MDR-рецептор (Р-гликопротеин) Для определения относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране MDR-рецептор (являющийся Р-гликопротеином). Для этого кровь забирали из локтевой вены и помещали в вакуумные пробирки Vacuette, содержащие литий гепарин, 1 мл цельной периферической крови инкубировали в условиях 37°С в атмосфере 5% ССЬ в

течение 3-х часов в отсутствии и присутствии 5 мкл IL2 (ронколейкин -интерлейкин-2 человека рекомбинантный, 1000000МЕ, ООО «БИОТЕХ», Россия). Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин в образцах крови до и после стимуляции IL2, было исследовано методом проточной цитометрии (FC500, Beckman Coulter) с использованием моноклональных антител к CD 243 (CD243-PE Beckman Coulter), по безотмывочной технологии с применением для лизиса эритроцитов OptiLyse С (Beckman Coulter, США). Оценку относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин проводили с использованием программного обеспечения СХР (Cytomics FC500, Beckman-Coulter, США). В лимфоцитарном гейте, выделенном на основании параметров прямого и бокового светорассеяния, анализировали 5000 событий.

Определение концентрации МТХ в сыворотке крови Определение концентрации метотрексата в сыворотке крови проводилось на анализаторе TDxFLx фирмы Abbott, методом флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа.

Определение содержания цитокинов (JLIfi, IL6, TNFa) в сыворотке больных ЮИА

Определение содержания IL-ip, IL-6 и TNF-a в сыворотке крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием Тест-систем для определения TNF-a человека, IL-ip человека, IL-6 человека (ООО "Цитокин", Россия), в условиях лаборатории клинической иммунологии ФГБУ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова МЧС России.

Методы статистической обработки результатов исследования Обработка полученных данных проводилась при помощи пакета программ для персонального компьютера Microsoft Excel и пакета программ «Statistica 6.0». Методы описательной статистики включали оценку среднего арифметического (М), ошибки среднего значения (т) и среднеквадратичного отклонения (а) для признаков, имеющих нормальное распределение.

В диссертации использованы расчеты с целью статистической проверки достоверности различий полученных нами результатов. Для этой проверки использованы непараметрический U-критерий Манна-Уитни, параметрический критерий t Стьюдента.

Для оценки взаимозависимости величин использованы методы корреляционного анализа. Для анализа корреляционных взаимосвязей между рассматриваемыми признаками применялся метод ранговой корреляции Спирмена. Достоверными считали различия сравниваемых показателей (Р<0,05), если вероятность их отсутствия была меньше 0,05.

Для формирования балльной шкалы, был использован метод построения классификационных деревьев.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение полиморфизма С3435Т MDR1 гена Был проведён сравнительный анализ распределения генотипов полиморфизма С3435Т гена MDR1. Полученные нами результаты распределения частот аллелей по изученному полиморфизму С3435Т гена MDR1 соответствуют равновесию Харди-Вайнберга и совпадают с частотами, полученными исследователями западноевропейских стран [M.Cizmarikova, M.Wagnerova, L.Schonova et al, 2010; G.J.Sills, R.Mohanraj, E.Butler, 2005].

В группе с генотипом СТ было 60 детей, среди которых 23 (38,33%) мальчика и 37 (61,67%) девочек. Группа пациентов с более редким генотипом ТТ представлена 15 (60%) девочками и 10 (40%) мальчиками. Группа из 18 больных с генотипом СС состоит из 13 (72,22%) девочек и 5 (27,78%) мальчиков. (Таблица 2)

Таблица 2

Распределение генотипов полиморфизма С3435ТMDR1 гена у больных с

ЮИА

Генотип Больные СТ ТТ СС N Р

Девочки 37 (61.67%) 15 (60,00%) 13 (72,22%) 65 (63,11%) Р > 0.05

Мальчики 23 (38,33%) 10 (40.00%) 5 (27,78%) 38 (36,89%)

Общее кол-во 60 (58,25%) 25 (24,27%) 18 (17,48%) 103 (100%)

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по исследованному полиморфизму гена МОЯ1 в группе мальчиков и девочек статистически значимых различий не выявил.

Распределение генотипов полиморфизма С3435Т гена А/О/?/ в группе сравнения и среди детей с ЮИА не имеет статистически значимых различий. В обеих группах преобладает число пациентов с генотипом СТ, а самой малочисленной является группа детей с генотипом СС. (Рисунок 2)

58,25

50 Ш 30 20 10 О

34,62

I

больные ЮИА

группа сравнения

1С Г «СС ЯП

Рисунок 2. Сравнение распределения генотипов полиморфизма С3435Т гена МОЯ1 среди детей с ЮИА и группы сравнения

Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (LymP-gp) (продукт гена MDR1) после стимуляции IL2 (in vitro) у мальчиков с генотипом ТТ достоверно ниже, чем у мальчиков с генотипом СС. Нами выявлены тенденции к повышению относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин после стимуляции IL2 у мальчиков с генотипом СТ, в сравнении с больными имеющими генотип ТТ. (Таблица 3)

Таблица 3

Относительное количество ЬутР-§р (после стимуляции 1Ь2) у детей с ЮИА в зависимости от генотипа

Показатель Генотип LymP-gp после стимуляции IL2

Мальчики Девочки

Генотип СТ 1 85,19 ± 1,18 83,88 ±0,87

Генотип ТТ 2 81,09 ± 1.85 82,07 ± 3,3

Генотип СС 3 88,9 ± 0,93 83,81 ± 1,05

1> р 1-2 = 0,054 р2-3 = 0,013 р > 0,05

Известен факт повышения гаммаглобулиновой фракции белка у больных с аутоиммунными заболеваниями. В группе девочек с ЮИА уровень гаммаглобулиновой фракции общего белка среди пациенток с генотипом СТ, выше, чем у пациенток с генотипом ТТ и ниже, чем у девочек с генотипом СС. (Таблица 4)

Все обследованные дети были разделены на больных с «активной» болезнью и «неактивной» болезнью, согласно критериям Carol A. Wallace (2006) с соавторами.

Таблица 4

Уровень гаммаглобулина у детей с ЮИА в зависимости от генотипа и пола

Пациенты Показатель Гаммаглобулиновая фракция общего белка (%)

Девочки Мальчики

Генотип СС 22,55 ± 1,23 19,34 ± 1,38

Генотип СТ 21,59 ±0,69 20.82 ± 0,99

Генотип ТТ 19,04 ±0,9 20,62 ± 1,03

Р р i-2 = 0,040 р 2-з = 0,023 р > 0.05

Среди больных с «активной» болезнью - 44 (73,33%) ребенка с генотипом СТ, 18 (72%) с генотипом ТТ, а с генотипом СС всего 14 (77,78%) детей. В группе «неактивной» болезни всего 27 детей, из них с генотипом СТ - 16 (26,67%), с генотипом ТТ - 7 (28%), а с генотипом СС - 4 (22,22%). (Рисунок 3)

ш генотип СГ яг генотип ТТ ^ генотип СС.

"АКТИВНАЯ"БОЛЕЗНЬ "НЕАКТИВНАЯ" БОЛЕЗНЬ

Рисунок 3. Распределение генотипов СТ, ТТ и СС полиморфизма С3435Т гена множественной лекарственной устойчивости в группах пациентов с «активной» и «неактивной» болезнью

Все дети в нашем исследовании, на момент включения получали терапию МТХ, но 35 (33,98%) больным в дополнение к базисной терапии были назначены генно-инженерные биологические препараты (ГИБП). В группе в генотипом СТ 17 (28,33%) детей получали ГИБП, в группе с генотипом ТТ -всего 9 пациентов (36%) имели показания к назначению дополнительной терапии. Среди детей с генотипом СС - 9 (50%) требовали назначения ГИБП. (Рисунок 4)

100 90 КЗ I 70 60 50 40 30 20 10 О

получали Г ИБП ш не получали ГИЬП

Рисунок 4. Распределение больных ЮИА по генотипам в зависимости от факта получения генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП)

При сравнении групп пациентов по генотипам было отмечено, что в группе ТТ уровень СОЭ статистически значимо выше, чем в других группах. (Рисунок 5)

20 18,72 ±3,«!

18 111111Ю1И1

14

10 8

4 ..................|||||а ^^^В^^В ^ДШДС

2 ................................: шШШШ1Ш1 ШШШШш

о .............. ЖИЯЮИК: л и- вМИ

СОЭ мм/час

■ СС(1) «СОСТ (2| ИСТ(З) ЯП'¡4)

р 3-4 = 0,026 0,046

Рисунок 5. Средний уровень СОЭ у детей больных ЮИА в зависимости от генотипа С3435Т гена МБЯ1

При этом уровень прироста относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, после стимуляции 1Ь2 в группе ТТ статистически значимо ниже, чем в группе с генотипом СТ и СТ+СС. (Таблица

5)

Таблица 5

Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (Ьут Р-§р) у детей больных ЮИА в зависимости от генотипа С3435Т гена МОЮ

Показатель СС(п=18) СС+СТ (п=78) СТ (п=60) ТТ (п=25) Р

1 2 3 4

Ьут Р^р, % 83,05 ± 1,04 81,3 ±0,86 80,78 ± 1,07 81,46 ± 1,25 р > 0,05

Ьут Р-§р после стимуляции 1Ь2, % 85,22 ± 0,96 84,57 ± 0,58 84,38 ± 0,7 81,68 ±2,06 р > 0,05

Д Ьут Р^р, % 2,17 ± 1,04 3,27 ±0,71 3,6 ±0,87 0,22 ± 1,51 р 2-4 = 0,047 р зч = 0,045

Проведение статистического анализа данных выявило, что в группе детей больных ЮИА с генотипом ТТ достоверно выше уровень СОЭ,

свидетельствующий о более высокой активности основного заболевания в этой группе детей. В тоже время дельта относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин у детей с тем же генотипом была достоверно ниже.

Определение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (продукта MDR1 гена) до и после стимуляции IL2 in vitro

Всем пациентам, в том числе детям из группы сравнения, в ходе нашего исследования, был определено относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих, Р-гликопротеин, который является продуктом гена MDR1. Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (LymP-gp) определялось до и после стимуляции IL2. А также был высчитан прирост (5 дельта) относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин.

Как видно из таблицы, нами была определена статистически значимая разница между относительным количеством лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин после стимуляции среди детей с ЮИА и в группе сравнения. (Таблица 6)

В группе детей, имевших прирост относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин после стимуляции IL2 in vitro - 32 пациента, среди которых 8 (25,00%) больных олигоартритической формой ЮИА, 14 (43,75%) детей имели полиартрит, 7 (21,88%) пациентов было с системной формой ЮИА и только 3 (9,38%) ребенка страдали энтезитассоциированным артритом.

Таблица 6

Значение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-

Пациенты Показатель Больные ЮИА Группа сравнения Р

LymP-gp, % 81,34 ±0,71 80,42 ± 1,3 0,570

LymP-gp после стимуляции IL2, % 83,87 ± 0,67 79,28 ±2,3 0,011

Д LymP-gp, % 2,53 ± 0,66 -1 ± 2,2 0,044

Среди детей с ЮИА, у которых прирост относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин после стимуляции 1Ь2 не определялся - 17 (23,94%) пациентов были с олигоартритом, 32 (45,07%) ребенка с полиартритической формой ЮИА, 7 (9,86%) детей с системной формой артрита и 15 (21,13%) с энтезитассоциированным ЮИА. (Таблица 7)

Таблица 7

Распределение больных ЮИА согласно классификации учитывая наличие прироста относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих

Р-гликопротеин (LymP-gp) после стимуляции IL2

Показатель Вид ЮИА Прирост LymP-gp после стимуляции IL2 Р

ЕСТЬ НЕТ

Олигоартрит 8 (25,00%) 17 (23,94%) р > 0,05

Полиартрит 14 (43,75%) 32 (45,07%)

Системный артрит 7(21,88%) 7 (9,86%)

Энтезитассоциированный артрит 3 (9,38%) 15 (21,13%)

Уровень концентрации MTX в сыворотке крови больных ЮИА, имеющих прирост относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин после стимуляции IL2, был достоверно ниже, чем у тех пациентов у которых прирост не определялся. Аналогичным образом распределялись и уровни альфа1 и альфа2 фракций глобулинов - они были достоверно выше в группе детей, у которых не отмечался прирост относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин после его стимуляции IL-2. (Таблица 8)

Таблица 8

Уровни al- и а2-глобулинов и концентрации MTX в сыворотке крови у больных ЮИА, в зависимости от уровня LymP-gp после стимуляции IL2

LymP-gp Показатель Прирост LymP-gp после стимуляции IL2 Р

Есть Нет

Концентрация метотрексата 1,69 ±0,076 2,13 ±0,275 0,044

Альфа 1 глобулины 4,46 ±0,13 5,09 ± 0,25 0,015

Альфа 2 глобулины 14,09 ± 0,27 15,58 ±0,67 0,015

Нами установлено, что дети с «активной» болезнью имели достоверно более высокий средний уровень ЬутР^р (как до, так и после стимуляции 1Ь2, р=0,002), чем пациенты с «неактивной» болезнью. Данная динамика уровня ЬутР^р свидетельствует о том, что больные с «активной» болезнью имели более высокую активность МОЯ 1 гена, который отвечает за концентрацию цитостатического препарата в клетке. (Рисунок 6)

Не активная

■ без стимуляции & стимуляция рои копейки ном

Болезнь

Рисунок 6. Зависимости относительного количества LymP-gp от стимуляции IL2 у больных с ЮИА в состояние «активной» и «неактивной» болезни

Определение концентрации метотрексата в сыворотке крови Всем больным была определена концентрация MTX в сыворотке крови. При выделении групп с низкой (0-1), средней (1-2) и высокой (выше 2) концентрацией MTX в сыворотке крови тендерных различий получено не было. (Рисунок 7)

70 № 50 «! J0 20 10

57,89

7,89

концентрация MTX 0-1. адкмоль/л

концентрация MTX 1-2

МКМОЛЬ/Л

в мальчики »девочки

34,22 35,38

концентраций MTX выше 2 мимо ль/«

Рисунок 7. Распределение детей с ЮИА в зависимости от концентрации MTX в сыворотке крови

При таком разделении на группы мы получили статистически значимое снижение у-глобулиновой фракции у детей с более высокой концентрацией MTX в сыворотке крови. (Таблица 9)

Таблица 9

Показатели крови у детей с ЮИА, в группах с различной концентрацией

MTX

Показатель Концентрация MTX в сыворотке крови Р

0-1 мкмоль/л 1-2 мкмоль/л | 2 мкмоль/л

1 2 3

Гемоглобин 123,7 ±5,8 126,7 ± 1,4 121,2 ±2,2 р 2-з = 0,025

Общий белок 73 ±2 74,4 ± 0,6 72,3 ± 1,2 р 2-з = 0,077

Альбумины 42,8 ± 2 45 ± 0,7 45,1 ±1 р > 0,05

al-глобуины 4,9 ±0,5 4,5 ± 0,2 4,8 ± 0,2 р > 0,05

а2-глобулины 14,5 ± 1,1 14,2 ± 0,3 15 ±0,6 р > 0,05

ß-глобулины 15,3 ±0,3 14,6 ±0,2 14,5 ±0,3 р > 0,05

•у-глобулины 22,3 ± 2 21,5 ±0,5 19,8 ±0,7 р 2-з = 0,037

С-реактивный белок 13,7 ± 8,9 8,5 ±2 12,2 ±4,1 р > 0,05

Затем все пациенты были разделены на группы по уровню концентрации метотрексата в сыворотке крови, используя медиану, равную 1,57 мкмоль/л.

В группу с низкой концентрацией MTX в сыворотке крови вошли 32 (61,54%) девочки и 20 (38,46%) мальчиков. В группе с уровнем концентрации больше медианы 33 (64,71%) девочки и 18 (35,29%) мальчиков. (Таблица 10)

Таблица 10

Распределение больных ЮИА по полу в зависимости от концентрации __метотрексата___

Показатель Пол концентрация MTX в сыворотке крови общее кол-во Р

Никзий уровень (до 1,57 мкмоль/л) Высокий уровень (выше 1,57 мкмоль/л)

Девочки 32 (61,54%) 33 (64,71%) 65 (63,11%) р>0,05

Мальчики 20 (38,46%) 18 (35,29%) 38 (36,89%)

Всего 52 51 103

Среди пациентов с концентрацией MTX ниже 1,57 мкмоль/л только 16 (30,77%) детей получали генно-инженерные биологические препараты (ГИБП), а в группе с концентрацией MTX выше медианы, 19 (37,25%) пациентов получали ГИБП в дополнение к базисной терапии. (Таблица 11)

Таблица 11

Распределение концентрации MTX в зависимости от использования генно-

Показатель ГИБП Концентрация MTX ниже 1,57 мкмоль/л Концентрация MTX выше 1,57 мкмоль/л Общее количество Р

Пациенты не получавшие ГИБП 36 (69,23%) 32 (62,75%) 68 (66,02%) р>0,05

Пациенты получающие ГИБП 16 (30,77%) 19 (37,25%) 35 (33,98%) р>0,05

Общее кол-во 52 51 103

Группа детей с концентрацией МТХ ниже 1,57 мкмоль/л представлена 31 (59,62%) ребенком с генотипом СТ, 11 (21,15%) пациентами с генотипом ТТ и 10 (19,23%) детьми с генотипом СС. В группе пациентов с концентрацией МТХ выше медианы: 29 (56,86%) детей имеют генотип СТ, 14 (27,45%) больных с генотипом ТТ, и только у 8 (15,69%) пациентов определяется генотип СС. Выявленные различия статистически незначимы.

Выделение групп больных с ЮИА используя медиану не выявило статистически значимых различий.

Определение содержания цитокинов (7/,/Д 1Ь6, ТЫРа) в сыворотке крови

Для анализа результатов, полученных при изучении уровня цитокинов (1Ыр, 1Ь6, ЮТа) в сыворотке крови все обследованные больные были разделены на больных с «активной» болезнью и «неактивной», получающих и не получающих генно-инженерные биологические препараты, вариантов артритов.

После проведенного анализа данных, значимых различий между уровнем 1Ыр, 1Ь6 и ТЫ-а, в зависимости от активности заболевания, получено не было. (Таблица 12)

Таблица 12

Распределение содержания цитокинов (1Ыр, 1Ь6, ТЫ Ра) в сыворотке крови больных ЮИА в зависимости от активности заболевания

Больные «Активная» «Неактивная» Р

Цитокины болезнь болезнь

Интерлейкин-1р (11.-1 Р) 23,86 ±6,14 43,99 ± 18,52 0,701

Интерлейкин-6 (1Ь-6) 41,14 ±5,78 43,51 ± 12,12 0,543

Фактор некроза опухоли-а (ТЫИ-а) 14,23 ± 2,63 9,72 ± 2,61 0,066

Нами был выявлен достоверно более высокий уровень 1Ь-6 в сыворотке крови, в группах больных с олигоартикулярным и системным вариантами

ЮИА, по сравнению с уровнем 1Ь-6 в сыворотке крови у энтезитассоциированным артритом. (Таблица 13)

больных с

Таблица 13

Уровень 1Ь-6 (интерлейкина-6) в сыворотке крови больных ЮИА в

Показатель Вариант ЮИА 1Ь-6 (интерлейкин -6) Р

Олигоартикулярный 1 52,99 ± 12,03 рм= 0,015 рз-4= 0,005 р2-з= 0,062

Полиартикулярный 2 38,28 ± 7,9

Системный вариант 3 68,76 ± 14,7

Энтезитассоциированный 4 15,53 ±4,63

При сравнении уровня цитокинов у больных с «активной» и «неактивной» болезнью в зависимости от варианта артрита, были выявлены следующие закономерности — у больных с системным вариантом ЮИА в стадии «неактивной» болезни, уровень 1Ь6 достоверно выше, чем у таких же больных с полиартикулярным и энтезитассоциированным артритом. Также уровень 1Ь6 достоверно выше у пациентов с системным вариантом артрита в «активной» стадии по сравнению с такими же пациентами с энтезитассоциированной формой ЮИА. (Таблица 14)

Таблица 14

Уровень 1Ь-6 (интерлейкина-6) в сыворотке крови больных ЮИА в

Вариант ЮИА Активность 11,-6 Р

Олигоартикулярный «активный» 1 50,83 ± 13,8 р 4-е = 0,029 р 5-7 = 0,040 р 1-7 = 0,055 р з-7 = 0,083 р 6-8 = 0,070

«неактивный» 2 56,85 ±23,86

Полиартикулярный «активный» 3 43,29 ± 9,27

«неактивный» 4 14,65 ± 6,64

Системный вариант «активный» 5 61,46 ±18,39

«неактивный» 6 83,36 ± 26,29

Энтезитассоциированный «активный» 7 16,86 ±5,13

«неактивный» 8 4,86 ± 1,44

Обращает на себя внимание обнаружение статистически достоверного более высокого уровня ТОТа у больных получающих генно-инженерные биологические препараты (ГИБП), преимущественно ингибиторами ЮТ-а. По-видимому, сохраняющийся высокий уровень ТЫР-а, несмотря на использование ингибиторов, характеризует данную группу больных, как наиболее тяжёлую. (Таблица 15)

Таблица 15

Содержание цитокинов в сыворотке крови пациентов с ЮИА, получающих

ГИБП Цитокины Пациенты получающие ГИБП Пациенты без ГИБП Р

1ЫР 17,63 ±7,76 33,8 ± 8.66 0,342

1Ь-6 48,86 ± 11,11 38,22 ±5,61 0,237

ШР-а 21,3 ±6,02 9,25 ± 0,89 0,007

Проведенный статистический анализ показал наличие прямой (положительной) корреляционной связи про-воспалительного цитокина ЮТ-а с у-глобулиновой белковой фракцией (р=0,014; г=0,265) среди всех больных детей с ЮИА. Обратная корреляционная связь провоспалительного цитокина ЮТ-а и концентрации метотрексата в сыворотке крови обследуемых пациентов, отмечается среди всех пациентов с ЮИА, в группе пациентов с «активной» болезнью и среди больных, не получающих терапию ГИБП.

Выявлена прямая корреляционная связь провоспалительного цитокина 1Ь-6 с уровнем СОЭ у больных не получающих биологическую терапию. В группе больных с «активной» болезнью отмечается обратная корреляционная связь между уровнем 1Ь-6 и относительным количеством лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, после стимуляции 1Ь2. Полученные результаты подтверждают связь уровня 1Ь-6 с активностью заболевания и эффективностью получаемого лечения.

Прогнозирование перехода из «активной» болезни в «неактивную» у больных с ЮИА

По результатам анализа связей всего комплекса исследуемых показателей с активностью заболевания, и построения классификационных деревьев было выделено 6 факторов влияющих на активность заболевания (Таблица 16):

Таблица 16

Факторы, влияющие на активность заболевания, выделенные с

№ п/п Показатель Материал для исследования

1 шве Лейкоциты В крови

т АЬВиМ Альбумины В сыворотке крови

3 В ОШВ Бэта-глобулины В сыворотке крови

4 У сшв Гамма-глобулины В сыворотке крови

5 Р Р110ТЕ1 Р-гликопротеин На лимфоцитах

6 Р РЯ ЯОЫ Р-гликопротеин после стимуляции 1Ь2 На лимфоцитах

Для этих показателей с помощью классификационных деревьев определены пороговые значения, определяющие увеличение вероятности перехода пациентов из «активной» болезни в «неактивную». (Таблица 17)

Таблица 17

Пороговые значения факторов и балльной оценки изменения порогов

Показатель Пороговое значение Баллы

Лейкоциты ниже 7 * 10'2 1 балл

Альбумины 43-51%% 1 балл

Выше 51% 2 балла

Бета глобулины Ниже 12,5% 1 балл

Гамма глобулины Ниже 20% 1 балл

Р-гликопротеин Ниже 75 1 балл

Р-гликопротеин после стимуляции 1Ь2 Ниже 82 1 балл

Для определения вероятности перехода из «активной» болезни в «неактивную» следует суммировать полученные баллы по выделенным пороговым значениям.

Средние значения суммы баллов при «активной» болезни - 1,8 ± 0,2, а для «неактивной» болезни: 3,8 ± 0,3 (р<0,001). (Рисунок 8)

Вех 8 УЛшкег Р1Ы: БУМ 7; =¥?8+¥?3+¥?9+¥75+«76+»Д7

г

2 Э £Я

~Т~ £Э(|1 Оеу. □ Еп. а Меап

Рисунок 8. Средние значения суммы баллов у больных с ЮИА с «активной» и «неактивной» болезнью

Для удобства практического применения мы перешли к интервальной оценке суммы баллов. (Таблица 18)

Таблица 18

_ Интервальная оценка суммы баллов_

INACTIVE INACTIVE Row Отношение шансов

Акти He акти Total

L SUM 6 : Обалло 13 0 13 OR

Row Percent 100,00% 0,00%

L SUM 6 : 1-2бал 35 3 38 *** . . 2,661972

Row Percent 92,11% 7,89% Rg-+0,83

L SUM 6 : Збалла 16 8 24 8

Row Percent 66,67% 33,33%

L SUM 6 : 4ибол 6 13 19 12.60606 itf

Row Percent 31,58% 68,42%

L SUM 6 : Total 70 24 94

Table Percent 74,47% 25,53% 100,00%

Шанс перехода из «активной» болезни в «неактивную» у больных с ЮИА повышается почти в 3 раза при сумме от 1 до 2 баллов, при сумме 3 балла, шансы повышаются в 8 раз, а при сумме 4 и более баллов вероятность увеличивается в 13 раз.

ВЫВОДЫ

1. Результаты исследования выявляют у 73,8% обследованных пациентов, больных ювенильным идиопатическим артритом, «активную» болезнь, а у 26,2% «неактивную», на фоне базисной терапии метотрексатом. Среди пациентов в состоянии «активной» болезни генно-инженерные препараты получали 39,5%, а с «неактивной» болезнью — 18,5%.

2. Результаты исследования распределения аллелей и генотипов полиморфизма С3435Т гена MDR1 в общей группе детей с ювенильным идиопатическим артритом и в группе сравнения не выявили достоверных различий. В группе больных ювенильным идиопатическим артритом генотип СТ был выявлен у 58,25%, генотип СС - у 17,48% и генотип ТТ - у 24,27%, а в группе сравнения соответственно - СТ - 57,69%, СС - 7,69% и ТТ — 34,62%.

3. У больных ювенильным идиопатическим артритом с «активной» болезнью относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (до стимуляции IL2), был 82,8±0,64, а у больных с «неактивной» болезнью - 77,1±1,84 (Р<0,01). Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, после стимуляции IL2 in vitro у больных с «активной» болезнью 85,1±0,57, а в группе больных с «неактивной» болезнью — 80,4±1,85 (Р<0,01). Выявление более высокого относительного количества

лимфоцитов, экспрессирующих на мембране Р-гликопротеин (как до, так и после стимуляции IL-2), у больных ювенильным идиопатическим артритом в состоянии «активной» болезни, свидетельствует о высокой активности MDR1 гена.

4. В группе больных ювенильным идиопатическим артритом, у которых не отмечалось прироста относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, после стимуляции IL2 in vitro концентрация метотрексата (2,13±0,17 мкмоль/л) была достоверно выше, чем в группе с приростом после стимуляции IL2 (1,69±0,07 мкмоль/л (Р=0,044). Более низкая концентрация метотрексата в сыворотке крови у больных с приростом относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, свидетельствующего о наличии активности MDR1 гена, указывает на наличие независимых от гена множественной лекарственной устойчивости механизмов регуляции внутри- и внеклеточной концентрации метотрексата.

5. У больных с ювенильным идиопатическим артритом выявлено повышение уровня основных про-воспалительных цитокинов (IL-ip, IL-6, TNF-а) в состоянии «активной» болезни. Системный вариант ювенильного идиопатического артрита характеризовался достоверным повышением уровня IL6, как в состоянии «активной», так и «неактивной» болезни. У больных, получавших генно-инженерные биологические препараты, сохранялся высокий уровень TNF-a в сыворотке крови, несмотря на проводимую анти-TNF терапию.

6. Разработанная бальная шкала прогнозирования перехода больных ювенильным идиопатическим артритом из «активной» болезни в «неактивную», учитывающая основные клинико-лабораторные показатели и относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, позволяет оценить эффективность проводимой терапии. При сумме баллов от 12 шанс перехода повышается в 3 раза, при сумме 3 балла - вероятность увеличивается в 8 раз, а при сумме баллов 4 и более шанс увеличивается в 13 раз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве критерия для оценки риска перехода из состояния «активной» болезни в «неактивную», необходимо определение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (как до, так и после стимуляции IL-2) с использованием разработанной бальной шкалы.

2. Для выделения пациентов из группы риска по «активной» болезни следует проводить молекулярно-генетическое исследование полиморфизма С3435Т гена множественной лекарственной устойчивости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Определение концентрации метотрексата в сыворотке крови у детей с ювенильным идиопатическим артритом / Рохлина Ф.В., Новик Г.А.,

Калинина Н.М., Бычкова Н.В., Дубко М.Ф. // XI Региональная СевероЗападная конференция ревматологов 2011 — С.58-59

2. Рохлина Ф.В. Метод эффективного прогнозирования чувствительности к цитостатической терапии у детей с ювенильным идиопатическим артритом. // Семнадцатая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов. Сборник тезисов — СПб.: Издательство РГГМУ, 2012 — С.212

3. Рохлина Ф.В., Новик Г.А. «Золотой стандарт» в лечении ювенильного идиопатического артрита // Лечащий врач —2013 №4 — С.22-26

4. Влияние полиморфизма С3435Т гена МОЯ 1 на эффективность терапии ювенильного идиопатического артрита / Рохлина Ф.В., Новик Г.А., Калинина Н.М., Бычкова Н.В., Филиппова Ю.Н., Зарайский М.И. // Педиатрическая фармакология - 2013 №10(5) - С.46-51

5. Рохлина Ф.В., Новик Г.А., Калинина Н.М. Определение полиморфизма С3435Т гена МОШ у детей с ювенильным идиопатическим артритом // «Актуальные вопросы педиатрии» Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 90-летию ГБУЗ ПК «Детская городская клиническая больница №3». Пермь, 9 апреля 2013 года —С.181-186

6. Опыт определения полиморфизма С3435Т ген МБЯ1 у детей с ювенильным идиопатическим артритом, получающих базисную терапию метотрексатом / Рохлина Ф.В., Новик Г.А., Калинина Н.М., Бычкова Н.В., Зарайский М.И. // 14-17 мая 2013 —VI Всероссийский съезд ревматологов «Ревматология XXI века» Москва, Россия - С. 134

7. Рохлина Ф.В., Новик Г.А. Опыт определения концентрации метотрексата в сыворотке крови, у детей больных ювенильным идиопатическим артритом // Сборник материалов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации», Санкт-Петербург, 20 ноября 2013 г. СПб.: Изд-во СПХФА, 2013 -С.62-63

8. Влияние Р-гликопротеина, продукта гена МОЯ, на оценку эффективности терапии ювенильного идиопатического артрита у детей / Рохлина Ф.В., Новик Г.А., Бычкова Н.В., Калинина Н.М. // Материалы V российской научно-практической конференции «Аллергические и иммунопатологические заболевания — проблема XXI века. Санкт-Петербург-2013» 13-14 декабря 2013 г. - СПб., 2013. - С. 38-40

9. Рохлина Ф.В., Новик Г.А. Опыт определения полиморфизма С3435Т гена МОШ у больных ювенильным идиопатическим артритом // Перспективы развития медицинской науки и практики. Конференция молодых ученых. Издание СПбГПМУ, 2014. - С. 111

Ю.Рохлина Ф.В., Новик Г.А. Опыт определения концентрации метотрексата в сыворотке крови у детей, больных ювенильным идиопатическим

артритом // Научно-практическая ревматология, 2014; 52; (прил. 1) -С. 106-107

11.Фенотипы ювенильного идиопатического артрита / Рохлина Ф.В., Новик Г.А., Калинина Н.М., Бычкова Н.В. // Лечащий врач— 2014 №8 — С.51-56

12.Rokhlina F.V., Novik G.A., Dubko M.F. Experience of the concentration of methotrexate evaluation in children with juvenile idiopathic arthritis // 18-th Pediatric Rheumatology European Society (PReS) Congress (Bruges, Belgium. 14-18 September 2011) Pediatric Rheumatology 2011, 9 (Suppl 1) - P. 187

13.Rokhlina F., Novik G. Definition of polymorphism C3435T MDR1 gene in JIA // 7th Congress of ISSAID, International Society of Systemic Auto-Inflammatory Diseases to be held in Lausanne, Switzerland, 22-26 May 2013

14. Rokhlina F., Novik G. Determination of the concentration of methotrexate in the blood serum of patients with JIA // European Pediatric Rheumatology 20th Congress Ljubljana, Slovenia, 25-29 September 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IL - интерлейкин

ILAR - Международная Лига Ассоциации Ревматологов

LymP-gp — относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин

MDR — множественная лекарственная устойчивость МТХ - метотрексат

PRES - Европейское общество детских ревматологов

P-gp — Р-гликопротеин

TNFa — фактор некроза опухоли-а

ГИБП — генно-инженерные биологические препараты

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР — полимеразноцепная реакция

ПДРФ - анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов

СОЭ — скорость оседания эритроцитов

СРБ — С-реактивный белок

ЮИА — ювенильный идиопатический артрит

Подписано в печать 08.09.2014г. Формат 60x84/16 У.п.л. 1,0 Уч.-изд.л 1,0 Тир. ЮОэкз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. Юго^еКЭтаИ. Зак. № 13552 от 08.09.2014г.