Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Роль полиморфизма гена апоптоза Р53 у больных ювенильным идиопатическим артритом

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДИАТРИЧЕСКИЙ

МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04°01 451927 На правах рукописи

/

Кожевников Алексей Николаевич

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА АПОПТОЗА Р53 У БОЛЬНЫХ ЮВЕНИЛЬНЫМ ИДИОПАТИЧЕСКИМ АРТРИТОМ

14.01.08 - педиатрия 03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Г.А. Новик доктор медицинских наук, профессор В.И. Ларионова

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений................................................3

ВВЕДЕНИЕ................................................................................4

Глава I: Обзор литературы .........................................................11

1.1. Ювенильный идиопатический артрит - определение, классификация, морфология, патогенез и принципы терапии у детей.............................11

1.2. Ген Р53 и апоптоз...................................................................33

1.3. Нарушение апоптоза при ЮИА..................................................49

Глава II: Общая характеристика больных и методов исследования....54

2.1. Общая характеристика больных ................................................54

2.2. Общие и специальные методы исследования ...............................56

Глава III: Результаты исследования.............................................66

3.1. Клинико-лабораторная характеристика детей с ЮИА........................66

3.2. Полиморфизмы гена Р53 у детей с ЮИА........................................79

3.2.1. Распределение частот генотипов у детей с различными вариантами ЮИА....................................................................................79

3.2.2. Полиморфизм Arg72Pro и клинико-лабораторные показатели активности и характер течения ЮИА............................................85

3.2.3. Анализ медикаментозной терапии ЮИА у детей.........................90

3.2.4. Влияние полиморфизма Arg72Pro на формирование «активного» артрита и клинико-медикаментозной ремиссии ЮИА......................90

3.2.5. Распределения частот генотипов полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp и G13964C гена Р53 у детей с ЮИА..............................99

Глава IV: Обсуждение...............................................................108

Выводы....................................................................................115

Список литературы ..................................................................118

Приложение...............................................................................140

Список используемых сокращений:

ACR - Ассоциация Коллегии Ревматологов

ACRpedi 30,50,70,90 - критерий эффективности терапии у детей с ЮИА DAS - Шкала активности заболевания

EULAR - Европейская Лига Ассоциации Ревматологов против Ревматизма

JADAS - Критерий активности артрита у детей с ЮИА

ILAR - Международная антиревматическая лига

Arg (А) - аргинин

С - цитозин

G - гуанин

Pro (Р) - пролин

Ехоп - экзон, участок гена содержащий информацию Intron - интрон, участок гена не содержащий информации bp (нп) - нуклеотидная пара del (d) - делеция ins (i) - инсерция

CD - рецепторы на поверхности клетки IL - интерлейкин

RASF - синовиальный фибробласт при РА

TNF - фактор некроза опухоли

СО - синовиальная оболочка

MTX - метотрексат

SSA - сульфасалазин

БПВП - базисная противовоспалительная терапия

ГКС - глюкокортикостероидный препарат.

НПВС - нестероидный противовоспалительный препарат

РФ - ревматоидный фактор

ЮИА - Ювенильный идиопатический артрит

ЮРА - Ювенильный ревматоидный артрит

ЮХА - Ювенильный хронический артрит

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) - это часто встречаемое хроническое воспалительное заболевание суставов у детей, мультифакторной природы, которое характеризуется длительным прогрессирующим течением, приводящее к развитию контрактур и потери функции суставов. В основе заболевания лежит хронический прогрессирующий воспалительный процесс внутренней оболочки капсулы сустава, проявляющийся синовиальной гиперплазией с клеточной инфильтрацией тканей, который приводит к деструкции хряща и костной ткани [4,62,119,171]. Распространенность заболевания в различных странах составляет от 16 до 150 случаев на 100000 населения. ЮИА достоверно встречается чаще таких известных заболеваний как лейкемия, сахарный диабет и воспалительные заболевания кишечника [61]. Смертность детей от осложнений артрита в некоторых регионах достигает 2%. Двигательные нарушения вследствие воспалительных контрактур имеют от 30 до 40% детей на первом году заболевания, а стойкая инвалидность в отдельных группах достигает 10% несмотря на применение современной антицитокиновой терапии и других лекарственных средств [7,8,106,209].

Следовательно, необходимость прогнозирования характера течения ЮИА и его осложнений, выбор адекватной противоревматической терапии у ребенка на раннем этапе заболевания является актуальной задачей современного здравоохранения [44,51,58,201,207].

ЮИА включает несколько клинических форм артритов, объединенных между собой в группы на основании характера и исхода клинического течения, инструментальных и лабораторных признаков, имеющих различные патогенетические механизмы развития (ILAR 2001, 2004). Клиническая гетерогенность ЮИА определяется мультифакторной природой заболевания и развивается на основе генетической предрасположенности под

воздействием внешних факторов среды. За последнее десятилетие расшифрован ряд генов провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-la, IL-6, IL2RA/CD25, IL12A), внутриклеточных белков и их рецепторов (CTLA-4, PTPN22, SLC11A1, IRF-J, COG6, LPP, ATXN2), а также антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA), ассоциированных со степенью риска возникновения ЮИА в различных популяциях и этнических группах [72,101,103,144,176,185].

В настоящее время активно изучаются молекулярные основы развития и поддержания хронического воспаления в суставе. Снижение чувствительности клеток к Р53-зависимому пути апоптоза возможно является одним из ключевых механизмов, нарушения которых приводят к поддержанию хронического воспаления [131,170,187,196]. Рядом исследователей получены данные о некоторых полиморфных вариантах гена Р53, связанных с изменением экспрессии гена и функциональной активности белка. Известно три основных полиморфных варианта гена Р53: Arg72Pro 4 exon, ins/del 16bp intron 3, G13964C intron 6. В экспериментальных условиях было выявлено, что линии клеток с белком p53Arg в отличие от р53Рго обладают более быстрым эффекторным проапоптотическим действием. Сочетанное влияние нескольких полиморфных локусов гена Р53 в определенных условиях значительно изменяют чувствительность клеток к /\53-зависимому апоптозу [59,73,182,211,214].

К настоящему времени не известна частота распределения полиморфных вариантов гена Р53 у детей с ЮИА и их связь с различными вариантами клинического течения заболевания и полом.

Проведение исследования, позволяющего выявить клинико-инструментальные, лабораторные показатели и молекулярно-генетические маркеры прогнозирования характера клинического течения и исходов ЮИА у детей с различными вариантами заболевания представляется своевременным и актуальным на сегодняшний день.

Цель исследования

Выявить факторы прогнозирования характера течения и исходов различных вариантов ювенильного идиопатического артрита у детей на основе комплексного анализа результатов клинико-инструментального, лабораторного и молекулярно-генетического обследования.

Задачи исследования

1. Изучить клинические, инструментальные, лабораторные показатели характера течения ювенильного идиопатического артрита у обследованных детей и выделить различные группы на основании международных критериев ILAR.

2. Провести молекулярно-генетическое тестирование полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 у детей с ювенильным идиопатическим артритом и у детей группы сравнения и изучить характер распределения их частот.

3. Провести сравнительный анализ распределения полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 и их генотипов в группах детей с различными вариантами течения ювенильного идиопатического артрита в зависимости от пола, показателей активности артрита, характера суставного поражения и наследственной отягощенности по ревматологическим заболеваниям.

4. Провести анализ клинико-инструментальных и лабораторных показателей активности ювенильного идиопатического артрита у детей в зависимости от результатов молекулярно-генетического тестирования гена Р53 и выявить группы риска по наиболее тяжелому варианту течения ювенильного идиопатического артрита с исходом в артроз.

5. Провести комплексный анализ результатов клинико-инструментального, лабораторного и молекулярно-генетического обследования детей с ювенильным идиопатическим артритом и разработать способы

прогнозирования «активного» артрита и клинико-медикаментозной ремиссии заболевания.

Научная новизна исследования

1. Впервые в России проведено исследование полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 у детей с различными формами ювенильного идиопатического артрита. Получено распределение частот изученных полиморфных вариантов и генотипов гена Р53 в зависимости от клинико-рентгенологических, инструментальных и лабораторных показателей активности артрита, пола.

2. Впервые у девочек с ювенильным идиопатическим артритом выявлен различный характер клинического течения и исходы заболевания в зависимости от носительства изученных аллелей гена Р53 и их сочетания.

3. Впервые на основании комплексного анализа результатов клинико-инструментального, лабораторного и молекулярно-генетического обследования выявлены группы риска детей по наиболее неблагоприятному варианту течения ювенильного идиопатического артрита с исходом в артроз.

Практическая значимость

1. Молекулярно-генетическое тестирование гена Р53 наряду с клинико-инструментальными и лабораторными методами обследования больных ЮИА может быть рекомендовано в качестве метода для практического применения с целью прогнозирования характера клинического течения и исходов заболевания.

2. Предложенный метод молекулярно-генетического тестирования полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 наряду с анализом ряда других «генов-кандидатов» в будущем может быть использован для разработки тест-систем медико-генетического консультирования больных ЮИА.

Положения, выносимые на защиту

1. Дети с ювенильным идиопатическим артритом имеют различный характер клинического течения и исходы заболевания в зависимости от носительства полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp и G13964C и их сочетаний гена Р53 и пола.

2. Оценка риска формирования «активного» артрита и неблагоприятного исхода у детей с ювенильным идиопатическим артритом на фоне проводимой терапии должна проводиться на основании комплексного анализа результатов клинико-инструментального, лабораторного, молекулярно-генетического обследования и с учетом половых различий.

3. Выход в клинико-медикаментозную ремиссию ювенильного идиопатического артрита зависит от времени начала противоревматической терапии, характера суставного поражения и носительства полиморфного варианта аллеля Arg72 в гомозиготном состоянии гена Р53 и пола.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на XI Северо-Западной научно-практической конференции по ревматологии (С-Петербург, 2011 г.), V Региональной научно-практической конференции «Воронцовские чтения-2012» (С-Петербург, 2012г.), IV Российской научно-практической конференции «Аллергологические и иммунопатологические заболевания -проблема XXI века» (С-Петербург, 2012г.), VI Съезде ревматологов России (Москва, 2013 г), I Международном Форуме «Молекулярная медицина -новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование» (С-Петербург, 2013 г), XVIII Европейском конгрессе детских ревматологов под эгидой PRES - 2011 (Брюгге - 2011 г), Международном конгрессе Европейского общества генетики человека ESHG-2013 (Париж -2013г).

Конкретное участие автора в получении научных результатов

Автором был проведен анализ литературных данных, посвященный роли влияния нарушения апоптоза в патогенезе ЮИА, механизмах хронического воспаления. Сформулирована цель исследования, определены задачи, выбраны оптимальные методы исследования для проведения научной работы (клинико-биохимический, рентгенологический, иммунологический, генетический). Был разработан план исследования. Автор осуществлял набор, клинический осмотр и динамическое наблюдение за пациентами в соответствии с планом исследования. Освоил молекулярно - генетические методы (выделение ДНК, амплификация, ПДРФ-анализ, электрофорез в геле) и самостоятельно выполнил все исследования полиморфизма Arg72Pro 4 exon, ins/del 16bp intron 3 и G13964C intron 6 гена Р53. Была разработана электронная база для статистической обработки данных и последующего анализа. На основании полученных результатов и их анализа были сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением общей характеристики пациентов, используемых методов исследования, собственных результатов исследования и их обсуждения, выводов, указателя литературы и приложения. Диссертация содержит 41 отечественных и 177 зарубежных источников литературы, проиллюстрирована 38 таблицами, 43 рисунками. Работа дополнена фотографиями суставов детей, изображениями результатов рентгенографии, компьютерной и магнитно-резонансной томографии суставов, документированными данными артроскопии и морфологического обследования. Представлен клинический пример.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, 3 из которых, работы в ведущих рецензируемых научных журналах,

рекомендованных для основных результатов диссертационных исследований, 9 статей и тезисов, 3 из которых в иностранной печати.

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ювенильный идиопатический артрит.

1.1.1. Определение

Слово "rheuma" греческого происхождения, и буквально обозначает: "вещество, которое течет", то есть, жидкость, вызывающая различные болезни. Guillaume Baillou утверждал, что "артрит в суставе - это ревматизм во всем организме", давая тем самым понять, что всего лишь проявление системного процесса. Первое клиническое описание ревматоидного артрита относится к 1800 году, когда A.J.Landre-Beauvais описал картину ревматоидного артрита, но назвал болезнь вариантом подагры — "простая астеническая подагра" (goutte asthenique primitif). В последующем B.Brodie описал медленное прогрессирование синовита путем вовлечения суставной сумки и влагалища сухожилия, a A.B.Garrod в 1858 году предложил термин "ревматоидный артрит" [13]. Первое подробное клиническое описание полиартикулярного варианта ювенильного артрита было представлено M.V.Cornil в 1861 году на примере 29-летней женщины с дебютом заболевания в 12-летнем возрасте. В 1880 году M.S.Diamant-Berger представил первый клинический обзор 35 случаев ювенильного артрита с подробным описанием дебюта, характера течения и исхода заболевания. Ювенильный артрит, как «особую форму болезни суставов, встречающуюся у детей», впервые описал George Frederick Still в 1897 году. А термин «ювенильный ревматоидный артрит» впервые был введен в практику J.A.Coss и R.H.Boots в 1946 году [130]. Этот термин стал основным для обозначения хронических воспалительных заболеваний суставов у детей вплоть до 90-х годов XX столетия, и рассматривался как самостоятельная нозологическая форма неизвестной этиологии со сложными аутоиммунными процессами патогенеза, начинающаяся до 16-летнего возраста.

Ювенильный артрит (ЮА) - это гетерогенная группа заболеваний, неуточненной этиологии, которая характеризуется прогрессирующим поражением суставов, приводящее к инвалидности, значительно влияющие

на образ жизни ребенка, на состояние его здоровья, адаптацию в семье и в кругу здоровых сверстников, снижающие качество его жизни. В понятие ювенильный артрит вкладывается хронический воспалительный процесс суставов, неустановленной причины, длительностью более 6 недель, развивающийся у детей в возрасте не старше 16 лет, при исключении иной суставной патологии. Группа ЮА считаются наиболее частыми хроническими инвалидизирующими заболеваниями у детей ревматического профиля, которые могут приводить к значительным функциональным нарушениям и слепоте [4,18,28,31,38,70,108]. По данным зарубежных исследователей распространенность ювенильных артритов составляет от 3,8 до 165,1 на 100000 детей в возрасте 0-16 лет [58]. Распространенность ЮА у детей до 18 лет на территории РФ достигает 62,3 на 100000, первичная заболеваемость составляет 16,2 на 100000. У детей старше 14 лет показатели распространенности и первичной заболеваемости составляют соответственно 116,4 и 28,3, а у детей до 14 лет — 45,8 и 12,6 на 100000 детей [3,21,30]. Соотношение по полу варьирует в зависимости от подтипа заболевания. Пик заболеваемости олиго и полиартикулярным вариантом приходится на возраст 2-6 лет, где превалируют девочки в соотношении 3:1. Пик распространенности энтезит-ассо�