Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Модуляция контактного взаимодействия лимфоцитов и фибробластов альфа2-макроглобулином

: I

и (Ж - ' .'1 АКТ

На правах рукописи

Яровинский Тимур Олегович

Модуляция контактного взаимодействия лимфоцитов и фибробластов (Х2-макроглобулином

' 14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена в отделе клинической и экспериментальной иммунологии Российского Государственного Медицинского Университета.

Научный руководитель Научный консультант Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение

д.м.н. Н.К. Горлина д.б.н. Н.А. Зорин академик РАЕН, доктор биологических наук, профессор Арион Виталий Яковлевич академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович

Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских препаратов им. Л.А. Тарасевича МЗМП РФ

Защита диссертации состоится "_"_ 1996 г. на заседании специализированного совета Д.084.14.06 при Российском Государственном Медицинском Университете (117869, г. Москва, ул. Островитянова 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, к.м.н., доцент

Т.Е. Кузнецова

Актуальность проблемы

Изучение контактных взаимодействий между иммунокомпетентными клетками и фибробластами приобрело актуальность в связи с тем, что была установлена их ключевая роль в регуляции физиологических (созревание и дифферен-цировка клеток иммунной системы, осуществление иммунного надзора, репарация) и патологических (воспаление, новообразования, аутоиммунные заболевания) процессов (Мишин 1982, Krzesicki 1991, Springer 1994, Thiele 1989). К настоящему времени накопилось достаточное количество данных, позволяющих утверждать, что результатом контактных взаимодействий являются функциональные изменения в клетках обеих контактирующих сторон. В различных экспериментальных моделях показано изменение синтеза коллагена (Hibbs 1981), пролиферации (Горлина 1992), экспрессии антигенов главного комплекса гисго-совместимости (Watson 1995) и ряда генов (Werb 1989), а также некоторых морфологических характеристик фибробластов (Maminishkis 1996).

Разнообразный функциональный спектр результатов межклеточного контакта предполагает модуляцию межклеточного взаимодействия различными факторами. Основные пути модуляции контактных взаимодействий иммуно-компетентных клеток и фибробластов основаны на регуляции рецепторного аппарата клеток. Среди факторов, оказывающих влияние на процессы контактного взаимодействия, большое значение имеют цитокины и фактора роста (Piela-Smith 1992). При изучении межклеточных взаимодействий необходимо учитывать, что эти взаимодействия происходят in vivo в условиях постоянного контакта с экстраклеточным матриксом (ЭКМ), что также вносит существенные регуляторные изменения в этот процесс (Akiyama 1990). В связи с этим, представляет большой интерес возможность участия аг-макроглобулина (агМ) в модуляции контактного взаимодействия лимфоцитов и фибробластов. Этот гликопротеин ингибирует протеиназы, переходя при этом из нативной в трансформированную форму (Gonias 1982). Особый интерес иммунологов агМ привлекает благодаря своей уникальной способности связывать ряд цитокинов и факторов роста, изменяя их свойства и функции (Borth 1992). Помимо этого,

агМ способен связываться с основным компонентом экстраклеточного матрик-са, коллагеном (Зорин 1995). Избирательность коллагена по отношению к на-тивной и трансформированной формам агМ свидетельствует в пользу функциональной важности этого процесса. Уникальность и многообразие свойств агМ связано с присутствием в его молекуле нескольких активных центров, каждый из которых может выполнять различные функции (ЬаМагге 1991), с наличием нескольких типов клеточных рецепторов к молекуле агМ (М^га 1994), взаимодействие с которыми может приводить к функционально различным результатам, и с широким распространением в экстравазальных компартментах клеток, секре-тирующих агМ и несущих рецептор к нему (Моез^ир 1990, МозЬег 1986). Все это позволяет предположить важное значение агМ как регулятора различных клеточных функций и эффектов микроокружения на клетку и свидетельствует об актуальности задач, связанных с изучением свойств, метаболизма и функций агМ, которые до сих пор во многом остаются неясными, в частности, совершенно неизвестна возможность участия агМ в адгезии клеток и межклеточных взаимодействиях.

Цель и задачи работы

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния а:-макроглобулина на процесс и функциональные последствия контактного взаимодействия лимфоцитов и фибробластов. В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать возможность и условия адгезии фибробластов к агМ.

2. Изучить влияние агМ на количественные показатели адгезии лимфоцитов периферической крови человека к монослою фибробластов на модели алло-геннмх фибробластов линии М-19 и ксеногенных фибробластов линии Ь929.

3. Изучить влияние агМ на популяционный состав лимфоцитов, адгезирую-щих к монослою аллогенных и ксеногенных фибробластов.

4. Разработать компьютерную систему анализа изображений для количественной оценки морфологии культуры фибробластов.

5. Исследовать морфологические изменения фибробластов вследствие контактного взаимодействия с лимфоцитами и модуляцию этого взаимодействия (Х2М.

Научная новизна

Впервые показано, что 02М обладает некоторыми свойствами, сходными с имеющимися у белков ЭКМ, в частности, иммобилизованный агМ вызывает адгезию и распластывание фибробластов. Описаны условия, необходимые для адгезии фибробластов к иммобилизованному агМ. Процесс адгезии фибробластов являлся активным, зависящим от дыхательного метаболизма и присутствия в среде двухвалентных ионов. Для успешной адгезии клеток была необходима иммобилизация агМ-плазмнна, поскольку присутствие солюбилизированного агМ-плазмина в среде не вызывало адгезии клеток. Адгезия фибробластов наблюдалась только к трансформированной форме агМ, нативный агМ, так же как и плазмин, не проявляли эффекта.

Новыми являются данные о том, что обработка монослоя фибробластов сиМ приводит к увеличению адгезивности монослоя для лимфоцитов. Число прикрепившихся к монослою лимфоцитов возрастает в 2-2,5 раза. Необходимо отметить, что эффект агМ не зависит от конформационного состояния молекулы: и нативный, и трансформированный метиламином агМ увеличивают адге-зивность как аллогенных, так и ксеногенных фибробластов по отношению к лимфоцитам примерло в той же мере, что и агМ-плазмин. Впервые охарактеризован популяционный состав лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов линий Ь929 и М-19. Если монослой фибробластов не обрабатывали агМ, то среди адгезирующих к фибробластам лимфоцитов значительную долю составляли В-лимфоциты. После обработки монослоя агМ существенно возрастал процент прикрепившихся Т-лимфоцитов. Как показал субпопуляционный анализ, предобработка фибробластов апМ приводила не к избирательному увеличению адгезии СЭ4+ или СБ8+ Т-лимфоцитов, а увеличивала адгезивность фибробластов для обеих субпопуляций Т-лимфоцитов.

Получены новые сведения об изменении функционального состояния фиб-робластов при модуляции агМ их контактного взаимодействия с лимфоцитами. В качестве функциональной характеристики были использованы морфологические параметры фибробластов. Для оценки морфологических изменений в мо-нослойной культуре фибробластов разработана оригинальная компьютерная система обработки изображений. Было обнаружено, что агМ вносит существенные коррективы в результат контактного взаимодействия фибробластов с лимфоцитами, причем направленность эффекта агМ строго зависит от использованной концентрации. Краткосрочное уменьшение степени распластанности фибробластов вследствие контакта с лимфоцитами было предотвращено предобработкой фибробластов агМ-плазмином в низких концентрациях. Предобработка фибробластов агМ в высоких концентрациях не предотвращала краткосрочный эффект лимфоцитов, но к 24 ч культивирования приводила к проявлению совершенно новых последствий контактного взаимодействия с лимфоцитами, заключающихся в увеличении площади клеток, ядерно-цитоплазматического (Я/Ц) отношения и интегрального показателя плотности, что может характеризовать повышение уровня метаболизма фибробластов. Полученные в нашей работе результаты демонстрируют, что агМ способен не только участвовать в процессах адгезии фибробластов, но и модифицировать их свойства при контактном взаимодействии с лимфоцитами и влиять на функциональные последствия контактного взаимодействия. Обнаруженные новые функции агМ позволяют высказать предположение о том, что агМ, секрегируемый в тканях, является одним из морфогенеггических компонентов экстраклеточного матрикса, участвуя в регуляции межклеточных контактов и модулируя функции клеток за счет передачи сигнала через специфические рецепторы.

Практическая значимость

Разработанная система компьютерного анализа изображений отличается относительной простотой, экономичностью и возможностью модификации, что делает возможным ее широкое применение в научной практике и клинических

исследованиях для изучения морфологических характеристик клеток. Программа для оценки морфологии клеток в культуре внедрена в практику для изучения цитоморфологии иммунного ответа в норме и при патологических процессах в лаборатории клинической иммуногенетики Института Клинической Иммунологии СО РАМН. Результатом проведенных исследований явилась разработка проходящих стадию внедрения в научно-исследовательскую практику методов изучения контактного взаимодействия клеток, включающих оценку количественных и функциональных параметров контактного взаимодействия и их модуляции различными агентами. Полученные данные об индукции адгезии и распластывания фибробластов иммобилизованным а:М создают предпосылки для разработки методов выделения и культивирования клеток, несущих специфический рецептор к агМ.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции отдела клинической и экспериментальной иммунологии РГМУ, на 9-ом международном конгрессе иммунологов (Сан-Франциско. 1995)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 103 машинописных страницах и состоит из введения, четырех глав: "Обзор литературы", "Объекты и методы исследования", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов" и выводов. Список использованной литературы содержит 152 ссылки. Диссертация содержит 6 таблиц и 24 рисунка.

Характеристика объектов и методов исследования

Препараты нативного агМ, ссгМ-метиламина, азМ-плазмина, плазмина и антител против агМ человека были любезно предоставлены сотрудниками ла-

боратории иммунохимии (зав. лаб. H.A. Зорин) Государственного института усовершенствования врачей (г. Новокузнецк). Концентрацию всех форм а2М определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, используя аффинно очищенные антитела против а2М и коньюгат антител против ctjM с пероксидазой хрена.

Использовали линии трансформированных мышиных фибробластов линии L929 (L-клетки) и диплоидных эмбриональных фибробластов человека линии М-19, полученной в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

Для исследования адгезии фибробластов к иммобилизованному агМ белки сорбировали в лунках планшетов для микротитрования в концентрации от 10 до 640 мкг/мл (от 1 до 64 мкг на лунку) в течение 16-18 ч при 4°С, в качестве контроля использовали ЗФР. По окончании сорбции сайты неспецифического связывания блокировали 1% раствором БСА в ЗФР в течение 1 ч при 25°С. Эффективность сорбции агМ проверяли в предварительных экспериментах методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа. Фибробласты вносили по 30 тыс. клеток на лунку в среде 199 с 0,2% БСА, инкубировали 1 ч при 37°С, после чего лунки и фиксировали прилипшие клетки 4% раствором формалина в ЗФР. Адгезию фибробластов определяли, подсчитывая клетки в поле зрения площадью 1 мм2 в центральной части лунки, используя компьютерную систему обработки изображений. Результаты выражали как количество клеток в поле зрения. Фоновая адгезия фибробластов в контрольных лунках не превышала 2-7 клеток на 1 мм2.

МНК выделяли из периферической крови доноров по методу Воуиш. Прилипающие клетки удаляли путем адгезии на стекле. Чистоту выделения лимфоцитов определяли методом проточной цитофлюориметрии, окрашивая клетки по стандартной методике для выявления популяций лимфоцитов.

Для изучения влияния с«М на количество лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов, клетки линий L929 и М-19 засевали в 96-луночные планшеты по 15 и 20 тыс. клеток на лунку соответственно и культивировали в тече-

ние 48 ч до образования раннего монослоя. Затем в культуры добавляли агМ в конечной концентрации от 2 до 250 мкг и культивировали в течение 4 ч. После отмывки вносили лимфоциты (150 тыс. клеток на лунку) и культивировали в течение 1,5 ч. Путем отмьлания удаляли неприлипшие лимфоциты и подсчитывали их количество в камере Горяева, определяя таким образом процент прилипших клеток.

Для определения фенотипа лимфоцитов, адгезирующих к монослою фиб-робластов, фибробласты засевали в сосуд Карреля (28 см2,1,1х106 клеток линии L929 и 1,5x10s клеток линии М-19) и культивировали в течение 48 ч. Затем к культуре добавляли б мл среды, содержащей агМ-плазмин в концентрации 10 мкг/мл или 6 мл среды без агМ и культивировали в течение 4 ч. Затем вносили лимфоциты (10x10е клеток) и культивировали в течение 1,5 ч. В качестве контроля культивировали лимфоциты в стеклянной пробирке в течение 1.5 ч. Путем отмывания удаляли неприлипшие лимфоциты, а прилипшие клетки собирали после 3-5 мин инкубации в смеси раствора Версена и 0,25% раствора трипсина, инактивированнон добавлением среды. Для оценки популяций и субпопуляций адгезирующих лимфоцитов применяли прямую двухцветную иммунофлооорес-ценцию, используя моноклональные антитела фирмы Becton Dickinson против маркеров CD3 (Leu-4), CD4 (Leu-За) и CD56 (Leu-19), конъюгированные с фико-эритрином и против маркеров CD20 (Leu-16), CDS (Leu-2a), CD16 (Leu-Па), конъюгированные с ФИТЦ. В предварительных экспериментах мы показали, что эти антитела не связываются с фибробласта.мп. Процентное содержание популяций лимфоцитов и субпопуляций Т-лимфоцитов определяли используя проточный цитофлюориметр FACScan фирмы Becton Dickinson совместно с сотрудником каф. иммунологии РГМУ к.м.н. A.B. Веселовой.

Для изучения морфологии и быстрого автоматизированного подсчета адгезирующих фибробластов нами совместно с каф. морфологии МБФ РГМУ (зав. кафедрой проф. A.C. Пылаев) была разработана эффективная система компьютерного анализа изображений. Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопа ШОМАМ в видимом свете. Регистрацию изображений

осуществляли с помощью черно-белой ПЗС видеокамеры Mintron MTV-1801, соединенной с платой ввода видеоизображения в компьютер Video Blaster или Video Spigot, и программного обеспечения Microsoft Video for Windows. Для обработки и анализа изображений нами было разработано оригинальное программное обеспечение, которое предоставляет стандартные средства предварительной обработки изображений.

Для подсчета и анализа морфологии фибробластов изображение клеток контрастировали, инвертировали, сглаживали, выставляли пороговые значения, соответствующие переходу от фона к цитоплазме клеток и от цитоплазмы к ядру. Далее изображение сегментировали с помощью цепного кода Фримена с последующим количественным определением основных параметров клеток или анализировали суммарно клетки монослоя, вычисляя средние показатели для клеток в поле зрения. Морфологию клеток характеризовали, вычисляя следующие параметры: периметр, площадь, фактор формы, Я/Ц отношение, интегральный показатель плотности. Фактор формы вычисляли путем деления квадрата периметра на площадь. Эта характеристика удобна тем, что она совершенно не зависит от размеров клеток и отражает лишь их форму. Интегральный показатель плотности характеризовал сумму значений пикселов, лежащих в пределах клетки. Таким образом, периметр, площадь и интегральный показатель плотности клетки характеризуют ее размер, фактор формы характеризует степень рас-пластанности, а Я/Ц отношение и интегральный показатель плотности - состояние метаболизма клетки.

Для изучения модуляции агМ контактного воздействия лимфоцитов на морфологию фибробластов засевали клетки линии L929 в 96-луночные планшеты по 15 тыс. клеток на лунку, культивировали в течение 48 ч до образования раннего монослоя. После 3-кратной отмывки средой к культуре добавляли агМ-плазмин в конечной концентрации от 2 до 250 мкг или среду в качестве контроля и культивировали в течение 4 ч. Затем трижды отмывали клетки средой, вносили лимфоциты (150 тыс. клеток на лунку) и культивировали в течение 4 и 24 ч Проводили окрашивание клеток кристаллическим фиолетовым и анализировал*

морфологию клеток. Морфологические параметры фибробластов выражали не в абсолютных величинах, а в процентах по отношению к контрольным значениям.

Результаты выражали как среднее арифметическое для анализируемой группы показателей ± стандартное отклонение. Оценку достоверности различий между исследуемыми группами проводили по критерию Стьюдента, различие средних показателей считали достоверными при уровне значимости менее 0,05.

Результаты собственных исследований

Адгезия фибробластов к иммобилизованному аг-макроглобулину

На первом этапе нашего исследования мы предполагали решить вопрос о том, может ли агМ участвовать в адгезионных процессах фибробластов, поскольку было известно, что агМ связывается с основным компонентом экстраклеточного матрикса- коллагеном (Зорин 1995), и что на фибробластах имеются специфические рецепторы к азМ (Ney 19S4). Для этого мы использовали модель адгезии фибробластов линий L929 и М-19 к иммобилизованному агМ. Исследования показали, что фибробласты обеих линий не адгезируют ни к необработанному пластику для ПФА, ни к пластику для ПФА. предварительно покрытому БСА. Только наличие иммобилизованного на том же пластике агМ-плазмина вызывало адгезию фибробластов. Оказалось, что количество адгези-руюицих фибробластов линии L929 зависит от концентрации агМ-плазмина и достигает максимума при концентрации 8-16 мкг/лунку (Рис. 1). При этих концентрациях агМ-плазмина количество адгезируюшмх клеток соответствует 37% от общего количества внесенных в лунку клеток. Дальнейшее увеличение концентрации агМ-плазмина не приводило к увеличению количества адгезирующих фибробластов.

Аналогичные результаты были получены при изучении адгезии фибробластов линии М-19 к иммобилизованному агМ-плазмину. Максимальная адгезия

была выявлена при тех же концентрациях осгМ-плазмина (8-16 мкг/лунку). Особенность фибробластов линии М-19 проявилась в относительно низком проценте клеток, адгезирующих к иммобилизованному а2М-плазмину в тех же условиях (около 20%). Морфологическое изучение адгезировавших к иммобилизованному агМ фибробластов показало, что большая часть клеток распластывается на подложке. Полученные результаты доказывают, что агМ принимает участие в адгезионных процессах фибробластов, индуцируя адгезию и распластывание клеток.

Количество адгезирующих клеток (кл/мм2)

Концентрация агМ-плазмина (мкг/лунку) Рис. 1. Адгезия фибробластов линии Ь929 к иммобилизованному агМ-ппазмину.

Исследовали зависимость адгезии Ь-клеток к иммобилизованному агМ от метаболизма клетки и присутствия двухвалентных ионов. Количество адгезирующих клеток определяли в присутствии азида натрия, при 4°С, в среде бе: ионов кальция и магния. Азид натрия, ингибитор дыхательного метаболизма, 1

концентрации 0,2% блокировал адгезию L-клеток к иммобилизованному агМ-плазмину. Адгезия L-клеток к иммобилизованному а:М-плазмину при 4°С не была обнаружена. Удаление ионов кальция и магния с помощью хелатора двухвалентных ионов ЭДТА привело к практически полному блокированию адгезии L-клеток к иммобилизованному агМ-плазмину. Таким образом, адгезия L-клеток к иммобилизованному агМ-плазмину является активным процессом, зависящим от дыхательного метаболизма и присутствия двухвалентных ионов.

С целью определить, необходима ли иммобилизация агМ для адгезии фиб-робластов, сравнивали адгезию L-клеток к пластику в присутствии солюбилизи-рованного аг-макроглобулина-плазмина и к иммобилизованному агМ. И в том и в другом случае использовали концентрацию а:М-плазмина 160 мкг/мл. Оказалось, что солюбилизированный агМ-плазмин не вызывает адгезии фибробла-стов к пластику. Исследование влияния солюбплизпроианного агМ-плазмина на процесс адгезии фибробластов к иммобилизованному озМ-плазмину показало, что присутствие солюбилизированного а:М-плазмпна не изменяет количество фибробластов, адгезирующих к иммобилизованному а:М-плазмину.

Таким образом, наличие агМ-плазмина в жидкой фазе само по себе недостаточно для адгезии L-клеток к пластику. Кроме того, наличие солюбилизированного агМ-плазмина не инглбирует адгезию фибробластов к иммобилизованному агМ-плазмину, что можно было бы ожидать прм блокировании рецепторов к агМ. Этот факт согласуется с данными литературы о быстрой интернали-зации комплекса азМ с его рецептором, за которой следует диссоциация этого комплекса и ре-экстернализация свободного рецептора (Kaplan 1983).

С целью определить зависимость адгезии фибробластов от конформацион-ного состояния молекулы агМ изучали адгезию фибробластов к нативному и трансформированному с^М. Для этого сорбировали а:М-плазмин в концентрации 160 мкг/мл (0,2x10-'М), нативный агМ в концентрации 140 мкг/мл (0,2х10-*М), плазмин в концентрации 18 мкг/мл (0,2х10-6М) и 36 мкг/мл

(0,4х10 6М). Оказалось, что только агМ-плазмин вызывает адгезию фибробла-стов, осуществляемую именно за счет агМ, так как адгезия к плазмину не отмечалась.

Таким образом, на первом этапе исследования мы решили вопрос о возможности участия агМ в адгезионных процессах мышиных трансформированных фибробластов линии Ь929 и эмбриональных фибробластов человека линии М-19, т.к. иммобилизация агМ на пластике в некоторой степени моделирует его взаимодействие с экстраклеточным матриксом.

Влияние аг-макроглобулина на количественные показатели адгезии лимфоцитов к монослою фибробластов

Исследовали количественные параметры адгезии лимфоцитов к фибробла-стам и влияние агМ на этот процесс. Лимфоциты добавляли к монослою фибробластов линий Ь929 или М-19 в соотношении 5:1. Такое соотношение было выбрано на основе многочисленных предварительных экспериментов, показавших максимальные функциональные эффекты контактного взаимодействия при отсутствии цитотоксичности. Процент адгезирующих лимфоцитов подсчитывали через 1,5 часа, так как в серии предварительных экспериментов было установлено, что к этому времени процент лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов, достигает первого максимума, и колеблется в течение следующих 2 часов. Обнаружили, что в этих условиях 11,8±7,7% лимфоцитов адгезировало к фибробластам линии Ь929 и 12,6±10,2% лимфоцитов - к фибробластам М-19. Различий в проценте лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов линии Ь929 и к монослою фибробластов пинии М-19 не обнаружено. Таким образом, модели с использованием ксеногенных и аллогенных клеток по количественным показателям адгезии лимфоцитов не различались.

С целью изучения влияния агМ на процесс адгезии лимфоцитов к фибробластам проводили предварительную обработку монослоя фибробластов Ь929 и М-19 различными дозами агМ-плазмина в течение 4 часов, после чего добавляли лимфоциты и подсчитывали количество прилипших клеток.

Обнаружили значительное, в 2-2,5 раза, увеличение процента лимфоцитов, адгезирующих к фибробластам Ь929, предварительно обработанным всеми использованными концентрациями агМ-плазмина (Рис. 2). Аналогичные результаты были обнаружены при предобработке фибробластов линии М-19. Таким образом, в ксеногенной и аллогенной модели взаимодействующих лимфоцитов и фибробластов, агМ повышает адгезивность фибробластов для лимфоцитов.

Количество адгезирующих лимфоцитов (%) 80

70 —

60 —

50 —

40 —

30 —

20

10 —

О 2 10 50 250

Концентрация агМ-плазмина (мкг/мл) Рис. 2. Влияние предобработки фибробластов агМ-плазмином на количество лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов Ь929. Достоверное отличие по сравнению с контролем: * - Р<0,05, ** - Р<0,0!

С целью определить, определяет ли конформационное состояние агМ количественные параметры адгезии лимфоцитов к обработанным фибробластам, помимо сиМ-плазмина (Ю мкг/мл) использовали для предобработки С12М-метиламин (8,75 мкг/мл) и нативный схзМ (8,75 мкг/мл) в эквимолярной концен-

о

трации 1,2x1 (ИМ. Использование данной концентрации аргументировалось ее эффективностью при оценке влияния как на адгезивность фибробластов, так и на другие их свойства. Обнаружили, что также как предобработка фибробластов Ь929 агМ-плазмином, так и предобработка сиМ-метиламином и нативным агМ значительно увеличивала процент адгезирующих к фибробластам лимфоцитов. Аналогичные результаты были получены при предобработке фибробластов линии М-19 различными формами <Х2М.

Таким образом, обработка фибробластов <«М значительно увеличивает количество лимфоцитов, адгезирующих к фибробластам обеих использованных линий. Необходимо отметить, что эффект агМ не зависел от конформационного состояния молекулы. Еще раз подчеркнем, что все наблюдаемые эффекты агМ на контактное взаимодействие лимфоцитов с фибробластами обеих использованных линий был примерно одинаков.

Таким образом, нами не было выявлено существенных различий не только в количественных параметрах адгезии лимфоцитов, но и в модуляции контактного взаимодействия лимфоцитов как с аллогенными, так и с сингенными фибробластами. Наблюдаемый феномен сходен с теми эффектами, которые обнаруживаются при обработке фибробластов и эндотелиальных клеток ПФН-у, ФНО-а, ПЛ-1Р и ИЛ-4 (КггезшЫ 1991, ПеЬ-БтМ 1992). К сожалению, остается невыясненным возможный механизм увеличения адгезивности фибробластов по отношению к лимфоцитам. Однако, можно предположить, что в этом случае происходит увеличение экспрессии молекул адгезии фибробластами, как это показано при активации эндотелия и фибробластов рядом цитокинов (Вапеу 1993, Така-ЬазЫ 1994).

Популяционная характеристика лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов и ее изменения при обработке фибробластов аг-макроглобулином

Провели фенотипическую характеристику лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов. Лимфоциты добавляли к монослою фибробластов

линий L929 и М-19 в соотношении 5:1. Через 1,5 часа удаляли неадгезирующие лимфоциты и с помощью иммунофлюоресцентного анализа исследовали попу-ляционный состав клеток, адгезирующих к монослою фибробластов. Оказалось, что среди клеток, клеток, адгезирующих к монослою фибробластов линии L-929 преобладают В-лимфоциты (67,9±16,3%). Содержание Т-лимфоцитов (13.7±7,6%) и естественных киллеров (6,9±4,2%) среди этих клеток достоверно снижено по сравнению с их содержанием среди контрольных лимфоцитов (Таблица 1). Лимфоциты, адгезирующие к монослою фибробластов линии М-19 примерно в равной степени представлены Т-клетками и В-клетками (35,4±0,9% и 37,8±2,0% соответственно) и, в меньшей степени, естественными киллерами (17,9±3,1%). Содержание Т-лимфоцитов среди адгезирующих клеток достоверно ниже их содержания в контрольных пробах, а содержание В-лимфоцитов - достоверно выше (Таблица 1). Таким образом, при адгезии лимфоцитов к монослою как аллогенных, так и ксеногенных фибробластов адгезивные способности В-клеток более выражены, чем Т-клеток.

С целью изучения влияния агМ на процесс адгезии лимфоцитов к фиброб-ластам проводили предварительную обработку монослоя фибробластов агМ-плазмином в концентрации 10 мкг/мл в течение 4 ч, после чего добавляли лимфоциты и через 1,5 ч анализировали адгезирующие клетки. Обнаружили, что предобработка агМ-плазмином приводит к достоверному увеличению в 1,5 раза относительного содержания Т-лимфоцнтов среди клеток, адгезирующих к монослою фибробластов L929. Содержание В-лимфоцитов среди клеток, адгезирующих к предобработанным схгМ-плазмином фибробластам, было достоверно снижено (Таблица 1). Сходные результаты были получены при предобработке агМ фибробластов линии М-19 (Таблица 1).

С целью определить, связано ли увеличение доли Т-лимфоцитов с преимущественной адгезией какой-либо из популяций Т-лимфоцитов, провели анализ содержания CD4+ и CD8+ Т-клеток среди адгезирующих лимфоцитов. Предоб-

работка фибробластов Ь929 и М-19 о^М-плазмином не изменяла соотношения С04+-клеток к С08+-клеткам среди адгезирующих Т-лимфоцитов.

Таблица 1. Анализ популяций лимфоцитов, адгезирующих к нативным фиброб-ластам и предобработанным аг-макроглобулином-плазмином.

Группа Линия Т-лимфоциты в- N К-клетки Другие

фибробласт лимфоциты клетки

ов

Контроль 1329 74,8+4,1 10,2±3,1 12,9±4,2 2,1 ±4,1

М-19 63,6±5,7 9,0±2,7 17,0±6,6 10,4±3

Необработан- 1329 13,7±7,6** 67,9±16,3" 11,4±7,5

ные

фибробласты М-19 35,4±0,9»» 37,8±2,0** 17,9±3,| 8,9±5

Фибробласты, 1.929 18,3±7,8**## 59,4±16,8*# 9,0+9,2 13,3110,0*

предобрабо-

танные

азМ- М-19 42.0±3.|**# 32,5±3,6**# 15,3±5,| 10.2+7

плазмином

Достоверное отличие от контрольной пробы: * — Р<0,05, ** — Р<0,01. Достоверное отличие от пробы с необработанными аг-макроглобулином фибро-бластами: # — Р<0,05, ## — Р<0,01.

Таким образом, количественные параметры адгезии лимфоцитов к монослою фибробластов соотносимы сданными литературы по адгезии лимфоцитов к нелимфоидным клеткам (МазеШз-БтиЬ 1994). Однако, мы обнаружили, что В-лимфоциты обладают более высокими адгезивными способностями. Предобработка фибробластов агМ приводит к увеличению количества адгезирующих лимфоцитов за счет популяции Т-лимфоцитов. Количественные параметры адгезии, популяционный состав клеток и характер их изменений вследствие обработки фибробластов агМ был схожим в случае использования как аллогенных, так и ксеногенных по отношению к лимфоцитам фибробластов. Это позволяет предположить наличие общих механизмом влияния агМ на адгезивность фиб-

робластов различного происхождения, возможно, основанных на увеличении экспрессии молекул адгезии.

Контактное воздействие лимфоцитов на морфологию фиброб-ластов и его модуляция а2-макроглобулином

Целью исследования этого этапа работы было изучение функциональных изменений фибробластов в результате контактного взаимодействия с лимфоцитами и способности агМ влиять на эти процессы. Под функциональными изменениями мы подразумеваем изменения морфологических параметров фибробластов. Оценивали морфологические параметры фибробластов L929 в монослой-ной культуре: периметр, площадь, фактор формы, Я/Ц отношение, интегральный показатель плотности. Влияние контактного воздействия лимфоцитов на морфологию фибробластов изучали после их совместного культивирования в течение 4 и 24 ч. Соотношение лимфоцитов и фибробластов составляло 5:1. Оказалось, что через 4 ч совместного культивирования под влиянием лимфоцитов происходит изменение морфологии фибробластов, что выражается в уменьшении периметра и фактора формы (Рис. 3). Через 24 ч совместного культивирования 1^клеток и лимфоцитов не наблюдали статистически достоверных изменений в морфологии фибробластов. Таким образом, существенные функциональные изменения монослойной культуры фибробластов обнаружены только на ранние сроки совместного культивирования с лимфоцитами.

Прежде чем приступить к изучению влияния ссзМ на контактное взаимодействие фибробластов и лимфоцитов, необходимо было исследовать влияние самой предобработки агМ на морфологические параметры фибробластов. Предварительная обработка заключалась в культивировании L-клеток в присутствии сиМ-плазмина в концентрациях от 2 до 250 мкг/мл в течение 4 ч. Оказалось, что обработка агМ-плазмином в концентрациях 10, 50 и 250 мкг/мл через 4 ч после обработки приводит к достоверному снижению периметра п фактора формы L-клеток, а в концентрациях 50 и 250 мкг/мл - к достоверному увеличению Я/Ц отношения, что характеризует уменьшение степени распластанности клеток

(Рис. 3). Сходные изменения наблюдались через 24 ч культивирования фиброб-ластов, предобработанных агМ-плазмином только в наиболее высокой концентрации 250 мкг/мл. Л

Л

„■iS-J / * | i

^f^sr

I -

с

As.

>f - - m- f ^

Рис. 3. Предварительная обработка фибробластов агМ-плазмином в низкой концентрации блокирует краткосрочные эффекты лимфоцитов на морфологию L-клеток. Представлены типичные контуры изображений L-клеток: из контрольной пробы (А), совместно культивированных с лимфоцитами 4 ч (В), предобработанных азМ-плазмином (С), предобработанных азМ и совместно культивированных с лимфоцитами 4 ч (D).

Таким образом, сама предобработка агМ изменяет функциональные параметры фибробластов. Эти изменения наиболее выражены через 4 ч после воздействия схгМ-плазмина в концентрациях от 10 до 250 мкг/мл. Характер изменений морфологии фибробластов сходен с теми, которые были вызваны контактным воздействием лимфоцитов.

Для оценки влияния с«М на контактное воздействие лимфоцитов монослой фибробластов обрабатывали агМ в различных концентрациях в течение 4 ч. После удаления агМ-плазмина из культуры, добавляли лимфоциты и исследова-

ли морфологию фибробластов согласно приведенной выше модели изучения контактного взаимодействия. После 4 ч совместного культивирования лимфоциты, добавленные к фибробластам линии L929, предобработанным агМ-плазмином в концентрациях 2 и 10 мкг/мл, не вызывали снижения периметра и фактора формы фибробластов.

Таким образом, предобработка фибробластов агМ-плазмином в указанных концентрациях блокировала эффект лимфоцитов, предотвращая уменьшение степени распластанности фибробластов (Рис. 3). С другой стороны, в случае предобработки фибробластов агМ-плазмшюм в высокой концентрации эффект лимфоцитов на морфологию фибробластов сохранялся. После 24 часов совместного культивирования лимфоциты, добавленные к фибробластам линии L929, предобработанным агМ-плазмином в концентрации 250 мкг/мл вьпывали увеличение площади, Я/Ц отношения и ИПП фибробластов (Рис. 4). При концентрации агМ-плазмина 10 и 50 мкг/мл лимфоциты вызывали достоверные изменения только некоторых их этих параметров, а концентрация 2 мкг/мл оказалась неэффективной.

Таким образом, лимфоциты периферической крови человека вызывают уменьшение степени распластанности монослойной культуры фибробластов линии L929 на ранние сроки совместного культивирования. Обработка фибробластов агМ-плазмином также приводит к уменьшению степени распластанности на ранние сроки культивирования в широком диапазоне концентраций и на длительной время при самой высокой концентрации азМ-плазмина. Предобработка фибробластов агМ-плазмином в низких концентрациях блокировала краткосрочные эффекты лимфоцитов на морфологические параметры монослойной. культуры фибробластов, а в высоких концентрациях - не изменяла краткосрочные эффекты лимфоцитов, но приводила к проявлению новых эффектов через 24 часа совместного культивирования, характеризующих увеличение степени распластанности и уровня метаболизма фибробластов. Исходя из результатов, полученных в процессе работы, можно заключить, что обработка фибробластов

а:М не только увеличивает адгезивность к ним лимфоцитов, но и разнонаправленно (в зависимости от дозы) изменяет функциональные последствия контактов лимфоцитов и фибробласгов.

А В

Рис. 4. Изменения морфологии L-клеток, предобработанных агМ-плазмином (250 мкг/мл) и совместно культивированных с лимфоцитами в течение 24 ч. Представлены типичные контуры изображений L-клеток: из контрольной пробы (А), совместно культивированных с лимфоцитами в течение 24 часов (В), предобработанных агМ-плазмином (250 мкг/мл) и культивированных в течение последующих 24 ч (С), предобработанных агМ-плазмином (250 мкг/мл) и совместно культивированных с лимфоцитами в течение 24 ч (D).

Суммируя полученные результаты, мы заключаем, что предобработка фибробласгов а:М модулирует контактное взаимодействие фибробластов с лимфоцитами, изменяя его последствия в зависимости от концентрации сиМ и срока

совместного культивирования клеток. Разнонаправленность эффектов агМ в зависимости от его концентрации наводит на мысль о возможности существования различных механизмов, опосредующих эти эффекты. Действительно, в литературе имеются сведения, что концентрация агМ в значительной мере определяет его функциональные эффекты. Возможно, в основе этого лежит существование двух рецепторов к С12М, имеющих различные функции и свойства (Мкга 1994). Один из этих рецепторов охарактеризован биохимически (ОНешапп 1989), обнаружено, что он идентичен рецептору к липопротеинам низкой плотности и выполняет роль scavenger-peцeптopa. Хотя до настоящего времени второй, так называемый сигнальный, тип рецептора выявлен только функционально, но не охарактеризован биохимически, есть сведения, что он взаимодействует с агМ по механизму, отличному от эсауе^ег-рецептора (М^эга 1994).

Полученные в нашей работе результаты демонстрируют, что агМ способен не только участвовать в процессах адгезии фибробластов, но и модифицировать их свойства при контактном взаимодействии с лимфоцитами и влиять на функциональные последствия контактного взаимодействия. Обнаруженные новые функции агМ позволяют высказать предположение о том, что агМ, секретируе-мый в тканях, является одним из морфогенетических компонентов экстраклеточного матрикса, участвуя в регуляции межклеточных контактов и модулируя функции клеток.

Практические рекомендации

Разработанная программа анализа морфологии клеток может бьпъ использована в практике научно-исследовательских и диагностических лабораторий. Применение иммобилизированного на пластике агМ может быть целесообразным для выделения и культивирования клеток, несущих рецепторы к агМ. Представляется перспективным возможность использования агМ как агента, модулирующего контактные взаимодействия клеток, несущих рецепторы к агМ, с иммунокомпетентными клетками.

Выводы

1. Иммобилизованный на пластике агМ-плазмин в дозозависимой манере вызывает адгезию и распластывание фибробластов линий L929 и М-19. Процесс адгезии фибробластов является активным, зависящим от дыхательного метаболизма и присутствия в среде двухвалентных ионов.

2. Предобработка фибробластов агМ в течение 4 часов вне зависимости от конформационного состояния молекулы приводит к достоверному увеличению процента лимфоцитов периферической крови, адгезирующих к монослою фибробластов. При сравнении адгезии лимфоцитов к аллогенным или ксеногенным фибробластам не было выявлено достоверных различий ни в количественных показателях адгезии лимфоцитов, ни в модуляции этого процесса агМ.

3. При адгезии лимфоцитов периферической крови к фибробластам как алло-генной, так и ксеногенной линий, В-лимфоциты обладают более выраженными адгезивными способностями. Предобработка фибробластов агМ в течение 4 часов приводит к увеличению адгезии CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов к фибробластам как аллогенной, так и ксеногенной линий.

4. Разработанная нами система компьютерного анализа изображений для изучения морфологии клеток, регистрируемой с помощью световой микроскопии явилась эффективным инструментом для количественной оценки морфологических параметров клеток в монослойной культуре фибробластов.

5. Совместное культивирование монослоя фибробластов линии L929 с лимфоцитами периферической крови человека приводит к краткосрочному уменьшению периметра и фактора формы фибробластов, характеризующее снижение их степени распластанности.

6. Обработка монослоя фибробластов линии L929 агМ-плазмином приводит к снижению степени распластанности фибробластов. Максимальные концентрации агМ-плазмина приводят не только к увеличению продолжительности эффекта, но и к увеличению ядерно-цитоплазмэтического отношения.

7. Предобработка фибробластов линии L929 агМ в низких концентрациях предотвращала краткосрочное снижение степени распластанности фибробластов вследствие контакта с лимфоцитами.

8. Предобработка фибробластов агМ в высоких концентрациях не предотвращала краткосрочный эффект лимфоцитов, но к 24 ч совместного культи-

вирования приводила к проявлению совершенно новых последствий контактного взаимодействия с лимфоцитами, заключающихся в увеличении площади клеток, ядерно-цитоплазматического соотношения и интегрального показателя плотности, что может характеризовать повышение уровня метаболизма фибробластов.

9. Предобработка фибробластов линии L929 а2М-плазмином приводит к модуляции морфологических изменений вследствие контактного взаимодействия фибробластов с лимфоцитами периферической крови человека, причем направленность эффекта строго зависит от использованной концентрации а2М.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Горлина U.K., Зорин Н.А., Чередеев А.П.. Козлов П.Г., Зорина P.M., Жа-бин С.Г., Лыкова О.Ф., Маминишкис Л.А., Яровинский Т.О., Емельянов А.Ю. Мононуклеарные клетки периферической крови человека секретиру-ют факторы, модулирующие трансформированный фенотип фибробластов линии L929. Иммунология, 1995.- N1.- С.38-41

2. Зорин II.А., Жабин С.Г., Козлов II.Г.. Горлина Н.К., Яровинский Т.О., Емельянов А.Ю., Семеньков II.Н. Изучение реакций между ингибиторами протеиназ плазмы крови и коллагеном. Вопросы меО. химии, 1995.-№6. С. 5355

3. Yarovinskv Т.О., Gorlina N.K., Zorin N.A.. Zliabin S.G. Alfa 2-macroglobuiin secretion by mouse fibroblasts L929 and its modulation. 12th European Immunology Meeting, June 14-17, 1994, Barcelona, Spain, p. 20S

4. Cheredeev A.N., Gorlina N.K., Kozlov I.G., Yarovinsky Т.О., Yemelyanov A.Yu. Contact interaction of lymphocytes with fibroblasts as prognostic test for pneumonia patients. 12th European Immunology Meeting, June 14-17. 1994, Barcelona, Spain, p. 207

5. Yarovinsky T., Konstantinova N.. Gorlina N.K., Cheredeev A.N., Kozlov I.G.. Maminishkis A. Alfa 2-macroglobulin secretion by mononuclear cells from patients with atopic dermatitis and sclerodermia. XV International Congress of Allergology and Clinical Immunology, June 26-July 1, Stockholm, Sweden N. 1479. p.410.

6. Cheredeev A.N., Gorlina N.K., Kozlov I.G., Yarovinsky Т.О.. Yemeljanov A.Yu., Filkin E.A., Larin S.S. Contact interactions of lymphocytes with fibroblasts in patients with pneumonia. Eighth International Congress of Mucosal Im-

munology, July 16-July 20, San Diego, California, USA N. 348 In: Clin. Immunol, and Immunopathol., 1995. - V.76. - N1. - S60.

7. Gorlina N.K., Cheredeev A.N., Zorina R.M., Kozlov I.G., Yarovinsky T.O., Yemeljanov A.Yu. Immunoregulation changes of fibroblast migration in pneumonia patients. Eighth International Congress of Mucosal Immunology, July 16-July 20, San Diego, California, USA N. 349 In: Clin. Immunol, and Immunopathol., 1995.- V.76.-N1.-S60.

8. Yarovinsky T.O., Gorlina N.K., Cheredeev A.N., Zhabin S.G., Zorin N.A. Receptor-recognized c*2-macrogIobulin enhances the chemiluminescence of peptone-stimulated peritoneal macrophages. 9th International Congress Immunology, July 23-Jtily 29, San Francisco, California, USA N1650

9. Gorlina N.K., Yarovinsky T.O., Veselova A., Pavlyuk A.S., Kozlov I.G., Yemelyanov A.Yu., Larin S.S., Cheredeev A.N. Small T cell subset contacts with fibroblasts in suspension model. IV Latin American Congress of Immunology, XI Mexican Congress of Immunology, March 3-71996, Zacatecas, Mexico P.

10. Maminishkis A., Gorlina N.K., Cheredeev A.N., Pavliuk A.S., Tamosiunas V., Yarovinsky T.O. Contact effects of mononuclear cells on L929 fibroblast morphological phenotype. Russian Journal of Immunology 1996; 1(1): 41-48

Список сокращений

агМ - а2-макроглобулин

БСА - бычий сывороточный альбумин

ЗФР - забуференный фосфатный раствор

ИЛ - интерлейкин

ИПП - интегральный показатель плотности

ИФА - иммуноферментный анализ

НФН - интерферон

ПЗС - прибор с зарядовой связью

МНК - мононуклеарные клетки

ФИО - фактор некроза опухоли

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭКМ - экстраклеточный матрикс

Я/Ц - ядерно-цитоплазматическое (отношение)

24