Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Модификация методики хемилюминесцентного анализа для оценки эффекта специфической гипосенсибилизации на экспериментальной модели

На правах рукописи

Митерева Дарья Евгеньевна

МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДИКИ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ГИПОСЕНСИБИЛИЗАЦИИ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ.

(14.00.36. -Аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва- 2004

сА:

Работа выполнена в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук В.Е. Агафонов

Официальные оппоненты:

1. заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор В.Б. Гервазиева

2. доктор медицинских наук, профессор А.В. Резайкина

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится 10 июня 2004 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 001.035.01. в государственном учреждении научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: г. Москва, Малый казенный переулок, д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

На сегодняшний день специфическая иммунотерапия (СИТ) является наиболее эффективным методом лечения аллергических заболеваний. В отличие от фармакотерапии СИТ действует на все патогенетически значимые звенья аллергического процесса, обеспечивая более длительную клиническую ремиссию заболевания (Гущин И.С. 1997).

Метод СИТ проводится путем введения в организм больного малых доз аллергена, к которому установлена повышенная чувствительность, и концентрацию которого постепенно увеличивают в процессе лечения.

В настоящее время применяют различные схемы проведения СИТ, адекватность выбора которых оценивают преимущественно по наличию отрицательной динамики клинической картины аллергического заболевания. В качестве объективного критерия оценки эффекта СИТ в современной аллергологической практике используется ряд иммунологических тестов in vitro: ИФА; RAST; методы, основанные на исследовании ферментативной активности клеток — определение активности хлорацетат-АБ-Б-эстеразы, миелопероксидазы (по Сато), щелочной фосфатазы (по Шубичу); реакция гистаминочувствительности нейтрофилов; реакция бактериального фагоцитоза; НСТ-тест и др. Однако многие из них не получили широкого применения в клинической практике, т.к. либо не дают четкой корреляции с клиникой, либо достаточно трудоемки. Кроме того, ряд тестов, как например, реакция дегрануляции тучных клеток, базофилов используется только в экспериментальной аллергологии в связи со сложностью их применения в условиях широкой клинической практики. Очевидно, что необходим поиск более информативных, и в тоже время простых и доступных диагностических тестов, использование которых сделает возможным не только адекватную оценку эффективности проведения СИТ, но и осуществлять своевременную коррекцию СИТ, и тем самым, снизить риск развития осложнений и повысить ее I

> I sFzhrA

В этой связи, на наш взгляд, интерес представляет хемилюминесцентный (ХЛ) метод, который позволяет определять изменения функциональной активности клеток, в частности, гранулоцитов, в процессе их взаимодействия с различными агентами, в том числе и аллергенами.

Суть метода заключается в том, что под действием стимулирующего агента фагоцитирующая клетка - полиморфно-ядерный лейкоцит (ПМЛ) -переходит в состояние активации. При этом в ней происходит резкое усиление метаболических процессов, в частности, окисление глюкозы и последующий запуск всего гексозомонофосфатного цикла превращения углеводов. В результате генерируются активные формы кислорода (АФК), при взаимодействии которых выделяются кванты света -хемилюминесценция (ХЛ), причем интенсивность ХЛ коррелирует со способностью клетки вырабатывать АФК.

Как известно, максимальной светимостью среди всех фагоцитирующих клеток, способных при активации генерировать АФК, обладают полиморфно-ядерные нейтрофилы (ГОШ), и именно эти клетки вносят основной вклад в хемилюминесценцию клеток крови.

При аллергической реакции активация ПЯН происходит под воздействием комплекса медиаторов и биологически активных веществ, высвобождающихся из клеток-мишеней в ответ на действие специфического аллергена. Кроме того, согласно современным данным, существует возможность активации ПЯН и через IgE-зависимый механизм, поскольку на этих клетках у человека была выявлена экспрессия высокоаффинного рецептора для IgE (Gounni А S., Lamkhioued В., 2001). Таким образом, хемилюминесценция ПЯН наиболее полно отражает весь сложный каскад иммунных взаимодействий, развивающихся в процессе аллергической реакции. По изменению свечения ПЯН после воздействия того или иного аллергена можно судить как о наличии соответствующей сенсибилизации, так и об её уменьшении в процессе СИТ.

В ряде работ есть данные об использовании ХЛ метода в иммунологической и аллергологической практике. Так, с помощью ХЛ некоторые исследователи определяли наличие и степень сенсибилизации организма к тому или иному аллергену (Вознесенский Н.К., Манеркина Н.С., 1999). Однако разные авторы значительно расходятся в методологии проведения ХЛ анализа (Москаленко Е.П. 1999, Вознесенский Н.К. 1999, Дорохина Н.А., Савченко А.А. 2001), применяя различный компонентный состав исследуемой пробы, в частности, разные образцы (цельная кровь, лейкомасса), стимуляторы (зимозан, латекс, продигиозан, BaSO4 и др.) и усилители ХЛ (люминол, люцигенин). Достаточно противоречивы данные по продолжительности регистрации ХЛ и ряду других параметров, что, возможно, связано с использованием различных приборов, каждый из которых обладал своей чувствительностью. При этом не во всех работах приводятся данные о калибровке прибора с помощью стандартного эталонного источника. Регистрируемые результаты ХЛ одни исследователи выражают в виде графиков, другие - в виде аналоговых значений, которые невозможно сравнить между собой.

В связи с этим целью исследования явилась адаптация метода ХЛ анализа гранулоцитов цельной крови для оценки in vitro эффекта специфической гипосенсибилизации экспериментальных животных.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать экспериментальную модель воспроизведения процессов сенсибилизации и гипосенсибилизации.

2. Отработать параметры метода детекции ХЛ гранулоцитов цельной крови экспериментальных животных.

3. Провести сравнительное динамическое исследование показателей ХЛ гранулоцитов цельной крови у интактных, сенсибилизированных и гипосенсибилизированных животных.

4. Оценить эффект гипосенсибилизации белком нормальной сыворотки свиньи (БСНС) экспериментальных животных по уровню специфических IgG антител и морфометрическим показателям тучных клеток.

5. Оценить диагностическую значимость разработанной методики детекции ХЛ в сравнении с методом фагоцитарной активности лейкоцитов.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований получены следующие новые данные:

1. Разработана модификация методики детекции ХЛ гранулоцитов цельной крови морских свинок с введением дополнительного стимулятора ХЛ аэросила.

2. Показано, что предварительная инкубация аллергена с аэросилом повышает ХЛ гранулоцитов цельной крови, сенсибилизированных морских свинок.

3. Установлено, что процесс гипосенсибилизации морских свинок сопровождается динамическим снижением ХЛ гранулоцитов в ответ на аллерген.

Практическая значимость работы.

Модифицированный метод детекции ХЛ гранулоцитов цельной крови может быть использован для оценки динамики специфической гипосенсибилизации у экспериментальных животных (морские свинки) при создании и определении эффективности новых аллергенных препаратов на доклиническом этапе разработки.

Основные положения, выносимые на защиту-

1. Разработанная схема проведения ХЛ анализа с использованием дополнительного стимулятора ХЛ гранулоцитов аэросила позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты, и может быть

использована для оценки функциональной активности гранулоцитов под влиянием аллергена в эксперименте на морских свинках.

2. Изменение ХЛ гранулоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок в процессе гипосенсибилизации отражает снижение реактивности организма в ответ на воздействие специфического аллергена, что подтверждается уменьшением индекса дегрануляции ТК у гипосенсибилизированных морских свинок, а также нарастанием уровня специфических IgG антител в сыворотке этих животных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 июня 2003 г.

Публикации. По результатам исследования опубликовано 3 работы в центральной печати.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав результатов исследования, заключения и списка литературы, включающего 175 отечественных и зарубежных источников. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 13 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Воспроизведение экспериментального аллергического процесса проводили на 93 беспородных мышах массой 20-30 г, 93 беспородных крысах массой 200-300 г, 80 морских свинках альбиносах массой 400-500 г. Эффект сенсибилизации оценивали по. проценту гибели животных на введение разрешающей дозы аллергена через три недели после сенсибилизирующей инъекции, продолжительность сохранения сенсибилизации определяли по анафилактическому индексу (William О. Weigle, 1960).

В качестве специфического аллергена использовали лиофилизированный белок нормальной сыворотки свиньи (БСНС).

Материалом для проведения ХЛ анализа служила цельная кровь интактных и сенсибилизированных морских свинок.

Определение функциональной активности гранулоцитов цельной крови проводили на хемилюминометре ХЛ-003.

Фагоцитарную активность лейкоцитов интактных,

сенсибилизированных и гипосенсибилизированных морских свинок оценивали в реакции бактериального фагоцитоза с S. enteritidis штамм 921 (Лабинская А.С., 1968)

Определение уровня специфических IgG антител к БСНС в сыворотках контрольных, сенсибилизированных и гипосенсибилизированных морских свинок осуществляли методом ИФА с использованием диагностических антител против IgG (H+L) морской свинки, меченых пероксидазой (НИИ им. Н.Ф. Гамалеи), совместно с лабораторией иммуногистохимии НИИВС им. И.И. Мечникова (зав. лаб. к.б.н. Н.Е. Ястребова).

Тучные клетки в коже и воздухоносных путях у морских свинок выявляли при окраске 1% толуидиновым синим (рН 0,5) (T.D. Lee и соавт., 1985) Индекс дегрануляции тучных клеток определяли по Д. П. Линднер и соавт. (1980). Исследование проведено в лаборатории иммуноморфологии воспаления ГУ НИИ морфологии человека РАМН (зав. лаб. д.м.н., профессор О.В. Макарова).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе мы апробировали несколько схем сенсибилизации БСНС, варьируя дозы и кратность введения аллергена, на мышах, крысах и морских свинках. Оптимальной моделью оказалось воспроизведение процесса сенсибилизации на морских свинках, которым вводили БСНС, сорбированный на геле гидроокиси алюминия, в дозе 7 мг, однократно внутрибрюшинно. У морских свинок внутривенная инъекция разрешающей

дозы аллергена (10мг) через три недели после сенсибилизации вызывала максимальную в сравнении с мышами (80 %) и крысами (73 %) гибель животных (90 %) и более длительное сохранение сенсибилизации, оцениваемой по анафилактическому индексу (в течение 3 месяцев). Последнее было необходимо для динамической оценки функционального состояния гранулоцитов в процессе гипосенсибилизации (рис. 1).

4.5

0.5 •

О -,-----

3 недели 7 недель 11 недель 15 недель

♦ Мыши —Крысы —А—Морские свинки

Рис. 1. Продолжительность сохранения сенсибилизации у мышей, крыс, морских свинок

Учитывая эти данные, а также возможность осуществлять многократно забор большего, чем у мышей и крыс объема крови, в дальнейших исследованиях использовали именно морских свинок в качестве модели.

Исследование индуцированной ХЛ помимо биологического образца, предполагает использование среды для поддержания жизнедеятельности биообразца, усилителя ХЛ (как правило, это люминол) и стимулятора ХЛ.

При анализе вариантов ХЛ метода, описанных в литературе, мы остановили свой выбор на методике Пирязева А.П. (1991), согласно которой в качестве образца предложено применение цельной крови. Это упрощает

метод, а также позволяет избегать потери клеток крови, при выделении отдельных фракций лейкоцитов и искажения результатов исследования вследствие неспецифического воздействия на клетки сред выделения. Кроме того, исследование цельной крови отражает активацию нейтрофилов в условиях их кооперированного взаимодействия с другими клетками крови и выделяемыми ими медиаторами под действием специфического аллергена.

Отработку параметров методики ХЛ анализа проводили на образцах цельной крови от интактных морских свинок.

При проведении исследований по схеме прототипа значения показателей ХЛ цельной крови интактных морских свинок находились в пределах фона, что, по-видимому, связано с разной чувствительностью используемых приборов. Увеличение объёма исследуемого образца крови, количества усилителя ХЛ (люминола), концентрации стимулятора не привело к значимым отличиям от фоновых показателей. Поэтому мы использовали дополнительный стимулятор аэросил, представляющий собой гидрофильный высокодисперсный порошок двуокиси кремния, с однородными частицами размером 20 ммк, но не отказались от ВаБО,), поскольку он снижает экранирующий эффект эритроцитов.

При отработке оптимальных условий реакции с аэросилом мы апробировали два варианта взаимодействия гранулоцитов с частицами стимуляторов. В одном варианте мы добавляли в кювету прибора одновременно оба стимулятора и образец крови, а в другом предварительно инкубировали образец крови с аэросилом и средой Хенкса бесцветного в лунке иммунологического планшета при 37° С, а затем добавляли проинкубированную смесь в кювету ХЛ-003 с сульфатом бария (табл. 1).

Таблица 1

Влияние предварительной инкубации образца крови с аэросилом на

показатели ХЛ

Средние значения показателей ХЛ (М±ш)

Состав пробы светосумма, максимальная

у.е./мин светимость, у.е.

Кровь + аэросил + ВаБС^ 12,68 ± 0,83 1,09 ±0,05

(Кровь + аэросил) + Ва804 156,91 ±2,84* 20,46 ±2,13*

инкубация 15 мин, 37°С

Контрольные

исследования:

1.Пустая юоветная 11,04 ±0,34 1,13±0,05

камера прибора 2.Ингридиенты без 12,51+0,41 1,05±0,05

крови 3.Спонтанная ХЛ 13,21 ±0,51 2,05±0,09

Примечание:* различия достоверны (р < 0,001) по сравнению со значениями контрольных исследований

Именно во втором варианте получили резкое увеличение регистрируемых показателей ХЛ, а в первом варианте достоверных отличий от фоновых значений не было. Таким образом, оптимальные условия для активации гранулоцитов и усиления ХЛ создаются в среде с однородными, а не с гетерогенными частицами-стимулами.

При варьировании концентрации аэросила оптимальной для достижения этого эффекта оказалась концентрация 0,5 М/мл.

Значения ХЛ гранулоцитов цельной крови зависели также от времени предварительной инкубации крови с аэросилом и максимальными они оказались при инкубации в течение 25 мин (рис. 2).

Рис. 2. Влияние времени предварительной инкубации крови с аэросилом на показатели ХЛ

Динамика индуцированного стимуляторами свечения (рис.3) характеризовалась подъёмом в течение 10 мин, фазой плато в течение 15 мин и постепенным снижением интенсивности свечения.

О) 7

>ч

О 10 20 30 40 50 60

время, мин

Рис. 3. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от времени

Выбор времени регистрации ХЛ основывали на учете показателей до фазы снижения свечения, которое составило 25мин.

Мы установили, кроме того, что интенсивность свечения не зависела от количества лейкоцитов в исследуемом образце. О чем свидетельствует характер распределения показателей ХЛ образцов крови с разным числом лейкоцитов, представленный на рис. 4.

Рис.4. Распределение показателя светосуммы образцов крови с разным

1 3

содержанием лейкоцитов в 1 мм .

По-видимому, интенсивность ХЛ определяется в большей степени их функциональным состоянием, что соотносится с данными, полученными другими авторами (Галеева К.Р., Филатов О.Ю. 1992). В связи с этим, мы не стандартизовали пробу по числу лейкоцитов, что упрощает метод.

Поскольку при исследовании индуцированной ХЛ образцов крови у интактных морских свинок показатели широко варьировали от животного к животному, для оценки ХЛ гранулоцитов цельной крови под действием аллергена результаты выражали в виде индекса перевеса (ИП), который отражал отношение результатов ХЛ опытной пробы с аллергеном к результатам контрольной пробы без аллергена, и рассчитывали по формуле: ИП = В/А, где

А - значения ХЛ показателей без добавления специфического аллергена - контрольная проба;

В - значения показателей ХЛ при добавлении специфического аллергена - опытная проба.

Исследования влияния различных доз аллергена на ХЛ гранулоцитов интактных и сенсибилизированных морских свинок представлено на рис. 5.

2.5 1

о-,-,-,---

10 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

дозы аллергена

Интаетые "в—Сенсибилизированные I

Рис. 5. ХЛ крови интактных и сенсибилизированных морских свинок при различных концентрациях специфического аллергена

У интактных морских свинок аллерген в больших дозах 10 мг и 1 мг вызывал угнетение ХЛ (т.е. оказывал токсический эффект на клетки), в дозах от 10'2до 10"6 мг не оказывал влияния на ХЛ. А у сенсибилизированных животных аллерген в диапазоне доз Ю"3до 10"5, напротив, вызывал дозозависимое усиление ХЛ, что, по-видимому, свидетельствует о специфическом влиянии аллергена на клетки сенсибилизированного животного. Основываясь на этом, мы определили оптимальную рабочую дозу аллергена, которая составила

Кроме того, мы установили, что предварительная инкубация аэросила с аллергеном в течение 6 и 24 часов оказывала выраженное усиливающее влияние на регистрируемые показатели ХЛ. Так, ИП в пробах с предварительной инкубацией 6 и 24 часа был существенно выше, чем в

пробах, приготовленных ех 1ешрого и с предварительной инкубацией аэросила с аллергеном, в течение 1 и 4 часов (рис. 6).

Рис. 6. Влияние предварительной сорбции аэросила с аллергеном на показатели ХЛ образцов цельной крови сенсибилизированных морских свинок.

Таким образом, нами отработана схема проведения ХЛ анализа для оценки специфической активации гранулоцитов цельной крови под влиянием аллергена, в которой подобраны оптимальные соотношения компонентов реакционной среды, определены временные параметры инкубации образца цельной крови со специфическим аллергеном и продолжительность регистрации ХЛ.

Отработанная схема проведения ХЛ.

Контрольная проба Опытная проба

1 .В лунку стандартного иммунологического планшета вносят 0,1 мл цельной крови, 0,1 мл бесцветного раствора Хенкса и 0,1 мл взвеси аэросила. Полученную смесь инкубируют 25 мин при 37'С. & 2. По окончании инкубации 0,3 мл смеси переносят в кювету для учета ХЛ. В эту же кювету добавляют 2мл раствора люминола (1,1хЮ^М) и 1мл стандартной среды с Ва304 (25 мМ). Полученную рабочую смесь помещают в камеру хемилюминометра. £ 3. Регистрируют интенсивность ХЛ рабочей смеси в течение 25мин. I .В лунку стандартного | иммунологического планшета вносят 0,1 мл цельной крови, 0,1 мл бесцветного раствора Хенкса и 0,1 мл приготовленной предварительно взвеси аэросила с аллергеном. Полученную смесь инкубируют 25 мин при 37°С. д 2,По окончании инкубации 0,3 мл смеси переносят в кювету для учета ХЛ. В эту же кювету добавляют 2мл раствора люминола (1,1x1 О^М) и 1 мл суспензии Ва804 (25 мМ). Полученную рабочую смесь помещают в камеру хемилюминометра. д 3.Регистрируют интенсивность ХЛ рабочей смеси в течение 25мин.

*Смесь аэросила со специфическим аллергеном готовили следующим образом: к 0,5М взвеси аэросила добавляется аллерген, в дозе 1х10'5 мг, взвесь инкубируется 6 часов, при 20° С и перемешивании.

Для проведения сравнительного динамического исследования показателей хемилюминесценции гранулоцитов цельной крови у сенсибилизированных и гипосенсибилизированных морских свинок использовали 3 группы животных. Первую (контрольную) группу составили интактные морские свинки. Животным двух других групп одновременно была проведена сенсибилизация БСНС. Через три недели после этого исследовали исходные показатели ХЛ образцов цельной крови у животных всех групп.

Таблица 2

Показатели ХЛ цельной крови у интактных и сенсибилизированных морских

свинок

№ группы Исследуемые группы Число животных Значения индекса перевеса (М±т) по показателям

светосуммы максимальной светимости

1 Интактные 12 1,08 ±0,03 1,05 ±0,02

2 Сенсибилизированные 12 3,00 ±0,11* 2,95 ±0,15*

3 Сенсибилизированные 12 3,03 ±0,10** 2,99 ±0,08**

Примечания: * различия достоверны (р< 0,001) по сравнению с интактными

** различия достоверны (р< 0,001) по сравнению с интактными

Исходные значения ХЛ по обоим показателям у сенсибилизированных свинок были достоверно выше, чем у интактных.

Далее морских свинок 3-й группы подвергли специфической гипосенсибилизации возрастающими дозами аллергена, ежедневно в течение 54 дней, подкожно, начиная с 0,1 мл в разведении 10"6 и заканчивая 0,9 мл в разведении В течение периода гипосенсибилизации неоднократно

осуществляли забор крови у всех трех групп морских свинок.

Результаты исследования показали, что у сенсибилизированных морских свинок средние значения ИП по обоим показателям ХЛ оставались выше, чем у интактных, в течение всего периода наблюдения (рис. 7).

0,5-

(

0 4-------,-.-■-,-.-1

0-я 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 7-я 8-я 9-я Недели

|—^-Сенсибилизироапннве —Интактные]

Рис. 7. Динамика изменения ИП по показателю светосуммы у интактных и сенсибилизированных морских свинок в течение двух месяцев

У гипосенсибилизированных наблюдалось резкое снижение показателей ХЛ в течение первого месяца терапии (рис. 8) и более постепенное - в течение второго. На 9-ой неделе гипосенсибилизации значения показателей ХЛ были достоверно ниже исходных.

3,5

0-я 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 7-я 8-я 9-я недели

Рис. 8. Динамика изменения ИП по показателю светосуммы у гипосенсибилизированных морских свинок в течение двух месяцев

Эффект гипосенсибилизации был подтвержден данными морфометрического анализа популяции тучных клеток (ТК) при исследовании гистологических срезов органов, полученных от животных всех трех групп после эвтаназирования (табл. 3).

Таблица 3

Влияние специфической гипосенсибилизации на функциональную

характеристику тучных клеток морских свинок

Исследуемые группы Индекс дегрануляции тучных клеток, М±т

кожи трахеи бронхов

Опытные 1 Гипосенсибилизи-рованные, классический метод 1,70 ±0,04 1,90 ±0,15 2,00 ±0,06

Контроль- 2 Интактные 1,53 ±0,04 1,58 + 0,06 1,62 ±0,06

ные 3 Сенсибилизированные 2,75 ±0,08 2,80 ±0,24 3,14 ± 0,11

Достоверность различий между группами Р (2-з)<0,001 Р (1-3) <0,05 р Г1-2)<0,05 Р (2-з)<0,001 р (,.3) <0,01 р м.2)>0,05 р (2.з,<0,001 р (1-3)<0,01 Р ,|.2)<0,01

Из таблицы видно, что индекс дегрануляции ТК как в коже, так и воздухоносных путях у гипосенсибилизированных животных был достоверно ниже, чем у сенсибилизированных морских свинок, однако по сравнению с интактными оставался более высоким.

Кроме того, эффект гипосенсибилизации оценили по уровню специфических 1§0 антител к белку свиной сыворотки (табл. 4) в сыворотках от сенсибилизированных и гипосенсибилизированных морских свинок в конце девятой недели эксперимента. В качестве контрольных использовали сыворотки интактных и гипериммунизированных морских свинок.

Таблица 4

Уровень специфических антител в исследуемых сыворотках морских свинок

Группы животных ДО-АТ, ед. опт. пл. (М±ш)

1. Сенсибилизированные 0,295 ±0,017*

2. Гипосенсибилизированные 0,728 ±0,091*

3. "-"контроль (интактные) 0,203 ±0,018

4."+" контроль (гипериммунные) 0,675 ±0,031

Примечание: *Р(1-2)< 0,01

Уровень специфических антител (по показателю оптической

плотности) у гипосенсибилизированных свинок был достоверно выше, чем у сенсибилизированных, и сопоставим с таковым у гипериммунных.

Для изучения влияния сенсибилизации и гипосенсибилизации на фагоцитарную способность лейкоцитов у морских свинок в динамике, использовали метод определения бактериального (культуры еМепййя штамм 921) фагоцитоза. Образцы крови у трех групп морских свинок получали одновременно с образцами крови для ХЛ анализа.

Фагоцитарные индексы лейкоцитов в течение всего периода наблюдения достоверно не различались у животных всех трех групп морских свинок (рис. 9), то есть для оценки эффекта гипосенсибилизации у морских свинок данный метод оказался не информативным.

10 п

5 4

31---,---.-,-.-,-,-,

0-я 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 7-я 8-я 9-я _Недели_

|—♦— Гипосенсибилизироваиные —А—Сенсибилизированные —Ж—Интагеные

Рис. 8. Реакция бактериального фагоцитоза лейкоцитов морских свинок (ФИ) в течение двух месяцев

Таким образом, изменение хемилюминесценции гранулоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок в процессе гипосенсибилизации отражает снижение реактивности организма в ответ на воздействие специфического аллергена, что подтверждается уменьшением индекса дегрануляции ТК у гипосенсибилизированных морских свинок, а также нарастанием уровня специфических IgG антител в сыворотке этих животных.

ВЫВОДЫ

1. Однократное внутрибрюшинное введение морским свинкам белка нормальной свиной сыворотки в дозе 7 мг вызывает стойкую сенсибилизацию в течение трех месяцев (в отличие от других экспериментальных животных) и позволяет воспроизвести у них классическую схему парентерального метода гипосенсибилизации.

2. Разработана модификация метода хемилюминесцентного анализа гранулоцитов цельной крови, заключающаяся в использовании аэросила в качестве дополнительного стимулятора хемилюминесценции.

3. Хемилюминесценция гранулоцитов сенсибилизированных морских свинок под влиянием аллергена в дозах от мг увеличивается в два и более раза, в сравнении с интактными животными (р < 0,05).

4. Введение в течение двух месяцев морским свинкам возрастающих доз белка свиной сыворотки при проведении специфической гипосенсибилизации приводит к значимому (в два и более раза) снижению показателей хемилюминесценции гранулоцитов к концу первого месяца и соответствует таковым у интактных животных.

5. Специфическая гипосенсибилизация морских свинок, проводимая по классической схеме возрастающими дозами белка свиной сыворотки в течение двух месяцев, сопровождается увеличением уровня специфических антител, который сопоставим с таковым у гипериммунных животных.

6. Индекс дегрануляции тучных клеток в коже и слизистых оболочках воздухопроводящих путей у гипосенсибилизированных морских свинок (1,70+0,04) достоверно ниже, чем у сенсибилизированных (2,75+0,08; р<0,05), но выше, чем у интактных животных (1,53+0,04; р<0,05).

7. Фагоцитарная активность лейкоцитов не изменяется в процессе проведения гипосенсибилизации и не отличается от таковой у сенсибилизированных и интактных морских свинок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Модификация метода хемилюминесцентного анализа для оценки активности фагоцитов цельной крови в эксперименте. Клиническая лабораторная диагностика. 2004, №3, с. 47-50 /Митерева Д.Е., Агафонов В.Е./

2. Использование аэросила как носителя специфического аллергена в хемилюминесцентном анализе. ЖМЭИ, №5, с. 67-70 /Митерева Д.Е., Агафонов В.Е./

3. Исследование функциональной активности фагоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок с помощью модифицированного метода хемилюминесцентного анализа. Материалы VII Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 июня 2003 г., Т. 5, № 3-4, с. 207 /Митерева Д.Е., Агафонов В.Е./

Типография «ЮСК-ПОЛИГРАФИЯ» Подписано в печать 29.04.2004г. Усл.печ.л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ 556. Тел.: 963-41-11,964-31-39 107258, Москва, ул.Краснобогатырская, 90

•12133

На сегодняшний день специфическая иммунотерапия (СИТ) является наиболее эффективным методом лечения аллергических заболеваний. В отличие от фармакотерапии СИТ действует на все патогенетически значимые звенья аллергического процесса, обеспечивая более длительную клиническую ремиссию заболевания.

СИТ проводится путем введения в организм больного малых доз аллергена, к которому установлена повышенная чувствительность, и концентрацию которого постепенно увеличивают в процессе лечения [24].

В настоящее время применяют различные схемы проведения СИТ, адекватность выбора которых оценивают преимущественно по наличию отрицательной динамики клинической картины аллергического заболевания. В качестве объективного критерия оценки эффекта СИТ в современной аллергологической практике используется ряд иммунологических тестов in vitro: ИФА; RAST; методы, основанные на исследовании ферментативной активности клеток - определение активности хлорацетат-АБ-О-эстеразы, миелопероксидазы (по Сато), щелочной фосфатазы (по Шубичу); реакция гистаминочувствительности нейтрофилов; реакция бактериального фагоцитоза; НСТ-тест и др. Однако многие из них не получили широкого применения в клинической практике, так как либо не дают четкой корреляции с клиникой, либо достаточно трудоемки. Кроме того, ряд тестов, как например, реакция дегрануляции тучных клеток, базофилов используется только в экспериментальной аллергологии в связи со сложностью их применения в условиях широкой клинической практики. Очевидно, что необходим поиск более информативных, и в тоже время простых и доступных диагностических тестов, использование которых сделает возможным не только адекватную оценку эффективности проведения СИТ, но и осуществлять своевременную коррекцию СИТ, и тем самым, снизить риск развития осложнений и повысить ее эффективность.

В этой связи, на наш взгляд, интерес представляет хемидюминесцентный (ХЛ) метод, который позволяет определять изменения функциональной активности клеток, в частности, гранулоцитов, в процессе их взаимодействия с различными агентами, в том числе и аллергенами [17].

Суть метода заключается в том, что под действием стимулирующего агента фагоцитирующая клетка - полиморфно-ядерный лейкоцит (ПМЛ) -переходит в состояние активации. При этом в ней происходит резкое усиление метаболических процессов, в частности, окисление глюкозы и последующий запуск всего гексозомонофосфатного цикла превращения углеводов. В результате генерируются активные формы кислорода (АФК), при взаимодействии которых выделяются кванты света -хемилюминесценция (ХЛ), причем интенсивность ХЛ коррелирует со способностью клетки вырабатывать АФК [22].

Как известно, максимальной светимостью среди всех фагоцитирующих клеток, способных при активации генерировать АФК, обладают полиморфно-ядерные нейтрофилы (ПЯН), и именно эти клетки вносят основной вклад в хемилюминесценцию клеток крови [10].

При аллергической реакции активация ПЯН происходит под воздействием комплекса медиаторов и биологически активных веществ [24], высвобождающихся из клеток-мишеней в ответ на действие специфического аллергена. Кроме того, согласно современным данным, существует возможность активации ПЯН и через ^-зависимый механизм, поскольку на этих клетках у человека была выявлена экспрессия высокоаффинного рецептора для 1{*Е (БсеЫ) [122]. Таким образом, хемилюминесценция ПЯН наиболее полно, отражает весь сложный каскад иммунных взаимодействий, развивающихся в процессе аллергической реакции. По изменению свечения ПЯН после воздействия того или иного аллергена можно судить как о наличии соответствующей сенсибилизации, так и об её уменьшении в процессе СИТ.

В ряде работ есть данные об использовании XJI метода в иммунологической и аллергологической практике. Так, с помощью XJI некоторые исследователи определяли наличие и степень сенсибилизации организма к тому или иному аллергену [17,71]. Однако разные авторы значительно расходятся в методологии проведения XJI анализа [4,5,17,19,33,44], применяя различный компонентный состав исследуемой пробы, в частности разные образцы (цельная кровь, лейкомасса), стимуляторы (зимозан, латекс, продигиозан, BaS04 и др.) и усилители XJI (люминол, люцигенин). Достаточно противоречивы данные по продолжительности регистрации XJI и ряду других параметров, что возможно связано с использованием различных приборов, каждый из которых обладал своей чувствительностью. При этом не во всех работах приводятся данные о калибровке прибора с помощью стандартного эталонного источника. Регистрируемые результаты XJI одни исследователи выражают в виде графиков, другие - в виде аналоговых значений, которые невозможно сравнить между собой.

В связи с этим целью исследования явилась адаптация метода XJI анализа гранулоцитов цельной крови для оценки in vitro эффекта специфической гипосенсибилизации экспериментальных животных.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Выбрать экспериментальную модель воспроизведения процессов сенсибилизации и гипосенсибилизации.

2. Отработать параметры метода детекции XJI гранулоцитов цельной крови экспериментальных животных.

3. Провести сравнительное динамическое исследование показателей ХЛ гранулоцитов цельной крови у интактных, сенсибилизированных и гипосенсибилизированных животных.

4. Оценить эффект гипосенсибилизации белком нормальной сыворотки свиньи (БСНС) экспериментальных животных по уровню специфических 1^0 антител и морфометрическим показателям тучных клеток.

5. Оценить диагностическую значимость разработанной методики детекции ХЛ в сравнении с методом фагоцитарной активности лейкоцитов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В результате проведенных исследований получены следующие новые данные:

1. Разработана модификация методики детекции хемилюминесценции гранулоцитов цельной крови с введением дополнительного стимулятора ХЛ аэросила.

2. Показано, что предварительная инкубация аллергена с аэросилом повышает хемилюминесценцию гранулоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок.

3. Установлено, что процесс гипосенсибилизации морских свинок сопровождается динамическим снижением ХЛ гранулоцитов в ответ на аллерген.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Модифицированный метод детекции ХЛ гранулоцитов цельной крови может быть использован для оценки динамики специфической гипосенсибилизации у экспериментальных животных (морские свинки) при создании и определении эффективности новых аллергенных препаратов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Разработанная схема проведения хемилюминесцентного анализа с использованием дополнительного стимулятора хемилюминесценции гранулоцитов аэросила, позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты, и может быть использована для оценки функциональной активности гранулоцитов под влиянием аллергена в эксперименте на морских свинках.

2. Изменение хемилюминесценции гранулоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок в процессе гипосенсибилизации отражает снижение реактивности организма в ответ на воздействие специфического аллергена, что подтверждается уменьшением индекса дегрануляции ТК у гипосенсибилизированных морских свинок, а также нарастанием уровня специфических З^в антител в сыворотке этих животных.

ВЫВОДЫ

1. Однократное внутрибрюшинное введение морским свинкам белка нормальной свиной сыворотки в дозе 7 мг вызывает стойкую сенсибилизацию в течение трех месяцев (в отличие от других экспериментальных животных) и позволяет воспроизвести у них классическую схему парентерального метода гипосенсибилизации.

2. Разработана модификация метода хемилюминесцентного анализа гранулоцитов цельной крови, заключающаяся в использовании аэросила в качестве дополнительного стимулятора хемилюминесценции.

3. Хемилюминесценция гранулоцитов сенсибилизированных морских свинок под влиянием аллергена в дозах от 10"4 до 10"6 мг увеличивается в два и более раза, в сравнении с интактными животными (р < 0,05).

4. Введение в течение двух месяцев морским свинкам возрастающих доз белка свиной сыворотки при проведении специфической гипосенсибилизации приводит к значимому (в два и более раза) снижению показателей хемилюминесценции гранулоцитов к концу первого месяца и соответствует таковым у интактных животных.

5. Специфическая гипосенсибилизация морских свинок, проводимая по классической схеме возрастающими дозами белка свиной сыворотки в течение двух месяцев, сопровождается увеличением уровня специфических антител, который сопоставим с таковым у гипериммунных животных.

6. Индекс дегрануляции тучных клеток в коже и слизистых оболочках воздухопроводящих путей у гипосенсибилизированных морских свинок (1,70±0,04) достоверно ниже, чем у сенсибилизированных (2,75±0,08; р<0,05), но выше, чем у интактных животных (1,53±0,04; р<0,05).

7. Фагоцитарная активность лейкоцитов не изменяется в процессе проведения гипосенсибилизации и не отличается от таковой у сенсибилизированных и интактных морских свинок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Одним из наиболее перспективных направлений лечения аллергических заболеваний является специфическая иммунотерапия (СИТ). СИТ обладает таким терапевтическим эффектом, который распространяется на все этапы аллергического ответа и который отсутствует у известных фармакологических препаратов, в том числе и имеющих полифункциональную активность. Действие СИТ охватывает собственно иммунологическую фазу и приводит к переключению иммунного ответа с Th2-THna на Thl-тип, тормозит как раннюю, так и позднюю фазы немедленной (IgE-опосредованной) аллергической реакции, угнетает клеточную картину аллергического воспаления и неспецифическую тканевую гиперреактивность, обеспечивая длительную ремиссию заболевания [24,59].

В настоящее время используют различные схемы и способы введения лечебных аллергенов в организм. Но в то же время эффект СИТ в современной аллергологической практике оценивают преимущественно по наличию отрицательной динамики клинической картины аллергического заболевания. Несмотря на существование большого числа аллергологических тестов, таких как прямой и непрямой тесты дегрануляции тучных клеток, базофилов (ТДТК, НТДТК, ПБТ, НБТ Шелли), лейкопенический, тесты по определению уровня биологически активных веществ (гистамин, серотонин) и другие, ни один из них не позволяет достоверно in vitro оценить эффект СИТ. Следует отметить, что многие из тестов (ТДТК, НТДТК, ПБТ и др.) могут проводиться только на базе научно-исследовательских центров, ввиду сложности их применения в широкой клинической практике. Таким образом, возникает необходимость поиска новых информативных, но в то же время простых и доступных методов, позволяющих отслеживать динамику изменений, происходящих в организме при проведении СИТ, и своевременно вносить коррективы в лечение.

Кроме того, за время использования СИТ были разработаны различные ее модификации, связанные как со способами введения лечебных аллергенов, так и с использованием новых, в том числе и рекомбинантных форм этих препаратов [26,73,25]. Необходимым этапом внедрения последних является глубокое доклиническое изучение на адекватной экспериментальной модели.

В этой связи, на наш взгляд, интерес представляет хемилюминесцентный (ХЛ) метод, который позволяет определять изменения функциональной активности клеток в процессе их взаимодействия с различными агентами, в том числе и аллергенами [17]. Суть метода заключается в том, что под действием стимулирующего агента, [22,48] фагоцитирующая клетка - полиморфо-ядерный лейкоцит (ПЯЛ), переходит в состояние активации. Т.е., происходит резкое усиление в ней метаболических процессов, в частности окисление глюкозы и последующий запуск всего гексозомонофосфатного цикла превращения углеводов, в результате чего генерируются активные формы кислорода (АФК), взаимодействие которых сопровождается хемилюминесценцией. При этом интенсивность ХЛ коррелирует со способностью клетки вырабатывать АФК.

Таким образом, ХЛ метод позволяет объективно оценивать и изучать ранние стадии метаболических изменений, развивающихся в гранулоцитах при их активации, и количественно оценивать их активность. В ряде работ есть данные об использовании ХЛ метода в иммунологической и аллергологической практике. Так, с помощью ХЛ некоторые исследователи определяли наличие и степень сенсибилизации организма к тому или иному аллергену [17,71], что позволяет предположить возможность использования ХЛ метода для изучения и оценки течения аллергического процесса на фоне проведения специфической гипосенсибилизации.

Вместе с тем приводимые разными авторами данные значительно расходятся как в методологии проведения ХЛ анализа, так и в представлении получаемых результатов, что затрудняет их оценку.

В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования явилась адаптация метода ХЛ для исследования функциональной активности гранулоцитов цельной крови у сенсибилизированных и гипосенсибилизированных животных.

Для воспроизведения процессов сенсибилизации мы использовали мышей, крыс и морских свинок. У последних мы получили самую высокую летальность (90%) на введение разрешающей дозы причинного аллергена, в отличие от мышей и крыс, у которых наряду с гибелью (80 % и 73 %) наблюдали тяжелое (20 % и 33 %) и легкое течение (6,6 % и 20%) аллергической реакции на введение разрешающей дозы аллергена. Кроме того, у морских свинок не происходит значительного спонтанного снижения степени сенсибилизации через три месяца после сенсибилизирующей инъекции. Так, анафилактический индекс у свинок через 15 недель после сенсибилизации составил 3,6, а у мышей и крыс анафилактический индекс к этому времени составил 1,4 и 1,2 соответственно. К тому же, у свинок возможен забор большего объема крови, чем у мышей и крыс за счет их большей массы. Таким образом, для отработки методики ХЛ и изучения процессов сенсибилизации и гипосенсибилизации морские свинки оказались оптимальной моделью.

При анализе вариантов ХЛ метода, описанных в литературе [70,33,50], мы остановили свой выбор на методике, предложенной Пирязевым А.П. [55], по ряду причин. Во-первых, в данной методике предполагается использование цельной крови, что упрощает метод, а также позволяет избегать потери клеток крови, возникающей при выделении отдельных фракций лейкоцитов и искажения результатов исследования вследствие неспецифического воздействия на клетки сред выделения [15]. Кроме того, исследование дельной крови отражает активацию нейтрофилов в условиях их кооперированного взаимодействия с другими клетками крови и выделяемыми ими медиаторами под действием специфического аллергена [2]. Во-вторых, автор предлагает использовать для стимуляции фагоцитов цельной крови сульфат бария. Суспензия трудно-растворимой соли сульфата бария (ВаЭ04) отличается большим постоянством физико-химических свойств в сравнении с другими известными по литературе стимуляторами (опсонизированный зимозан, опсонизированный латекс, бактерии, изолированные оболочки дрожжевых клеток и другие) [55]. Его преимущество заключается в том, что лейкоциты с частицами ВаБС^ быстро оседают на дно кюветы, приближаясь к фотокатоду фотоумножителя, что приводит к резкому снижению экранирующего эффекта эритроцитов, вызванного их способностью поглощать кванты света. Учитывая вышеизложенное мы использовали эту методику в качестве прототипа.

При проведении исследований по схеме прототипа значения показателей ХЛ цельной крови интактных морских свинок находились в пределах фоновых значений, что, по-видимому, связано с различиями в конструкции используемых приборов. Увеличение объёма исследуемого образца крови, количества усилителя ХЛ (люминола), концентрации стимулятора (ВаЗС^) не привело к значимым отличиям от фоновых показателей. Возможным объяснением этого является неодинаковый размер частиц ВаЭ04, и за счет высокой скорости их осаждения, вероятно, не все клетки в исследуемом образце цельной крови успевают фагоцитировать эти частицы и активироваться. Однако, Ва804 снижает экранирующий эффект эритроцитов [15] при исследовании цельной крови как раз за счет своей высокой скорости осаждения, поэтому мы не отказались от него, но сочли необходимым использовать дополнительный стимулятор аэросил, представляющий собой гидрофильный высокодисперсный порошок двуокиси кремния, с однородными частицами размером 20 мкм.

В литературе имеются данные о применении производных кремния в качестве стимулятора «дыхательного взрыва» лейкоцитов. В частности, использовали пылевые частицы, приготовленные путем растирания и фракционирования кусков скального материала цеолита (алюмосиликата сложного состава) клиноптиолита [9]. Была зарегистрирована ХЛ крови, стимулированная пылевыми частицами кремнезема, которые в своем составе, в основном содержат двуокись кремния (БЮг) [36]. Полагают, что частицы кремния связываются с клетками посредством образования множественных водородных связей, вызывая активацию ферментных систем лейкоцита с последующим дыхательным взрывом. Важно использование для индукции ХЛ оптимальной концентрации частиц, так как лишь при ней практически все фагоциты контактируют с частицами одновременно, что обусловливает явление синхронного фагоцитоза и стабильность этого показателя [81].

В этой связи при отработке оптимальных условий реакции мы апробировали два варианта взаимодействия фагоцитирующих клеток с частицами стимуляторов. В одном варианте мы добавляли в кювету ХЛ одновременно оба стимулятора и образец крови, а в другом предварительно инкубировали образец крови с аэросилом и средой Хенкса бесцветного в лунке иммунологического планшета при 37°С, а затем добавляли проинкубированную смесь в кювету ХЛ с сульфатом бария. При этом во втором варианте было получено резкое (в 12 раз) увеличение регистрируемых показателей ХЛ, а в первом варианте достоверных отличий от значений фоновых показателей не было. Таким образом, мы пришли к заключению, что оптимальные условия для активации гранулоцитов и, соответственно, усиления ХЛ, создаются в среде с однородными, а не с гетерогенными частицами-стимулами.

При дальнейшей отработке параметров реакции наименьшая концентрация аэросила, позволяющая получать достоверные отличия от фоновых значений оказалась 0,5 М/мл.

Значения ХЛ гранулоцитов цельной крови зависели также от времени предварительной инкубации крови с аэросилом и максимальными они оказались при инкубации в течение 25 мин.

Динамика индуцированного стимуляторами свечения характеризовалась подъёмом в течение 10 мин, фазой плато в течение 15 мин и постепенным снижением интенсивности свечения. Выбор времени регистрации ХЛ основывали на учете показателей до фазы снижения свечения, которое составило 25мин.

Большинство авторов используют процедуру стандартизации исследуемого образца по количеству лейкоцитов, [28,33,44,82]. Мы установили, что интенсивность свечения не зависела от количества лейкоцитов в исследуемом образце. Об этом свидетельствовал характер распределения показателей ХЛ образцов крови с разным числом лейкоцитов. По-видимому, интенсивность ХЛ определяется в большей степени их функциональным состоянием, что соотносится с данными, полученными другими авторами [19,56]. В связи с этим, мы не стандартизовали пробу по числу лейкоцитов, что упрощает метод.

В литературе [17,71] описан эффект угнетения ХЛ под действием высоких доз специфического аллергена и обратный - усиление ХЛ при малых дозах. Причем было установлено, что сам аллерген не является стимулятором, т.е. не активирует клетки с последующей вспышкой ХЛ, но препятствует её развитию при больших дозах аллергена и способствует увеличению амплитуды вспышки при малых дозах. Мы также показали, что аллерген оказывает как угнетающий, так и усиливающий эффект на ХЛ гранулоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок. Причем в нашем исследовании усиливающий эффект был обнаружен в диапазоне доз 10"3 - 10"6 мг. В том же диапазоне доз у интактных животных изменения ХЛ гранулоцитов цельной крови не происходило. Это, по-видимому, свидетельствует о специфическом влиянии аллергена на клетки сенсибилизированного животного.

При этом мы установили, что предварительная инкубация аэросила с аллергеном, в течение 6 и 24 часов оказывала более выраженное усиливающее влияние на регистрируемые показатели ХЛ.

Таким образом, мы отработали схему проведения ХЛ анализа для оценки специфической активации гранулоцитов цельной крови под влиянием аллергена, в которой подобраны оптимальные соотношения компонентов реакционной среды, определены временные параметры инкубации образца цельной крови со специфическим аллергеном и продолжительность регистрации ХЛ.

Результаты использования модифицированного метода хемилюминесценции цельной крови для оценки сенсибилизации и гипосенсибилизации на морских свинках показали, что динамика изменения ХЛ гранулоцитов цельной крови морских свинок в процессе гипосенсибилизации в течение двух месяцев принципиально отличается от динамики изменения ХЛ сенсибилизированных животных и характеризуется резким снижением показателей ХЛ в течение первого месяца терапии, причем достоверные различия по сравнению с исходными наблюдали уже через две недели от начала терапии. В течение второго месяца изменение показателей ХЛ характеризовалось более постепенным снижением, в отличие от сенсибилизированных морских свинок, у которых значительного изменения показателей ХЛ в конце исследования по сравнению с исходными не было. Таким образом, уменьшение ХЛ гранулоцитов цельной крови у гипосенсибилизированных морских свинок произошло под влиянием терапии, поскольку в группе сравнения (у сенсибилизированных морских свинок) этого же эффекта не наблюдали. В этой связи можно заключить, что снижение ХЛ клеток в ответ на воздействие специфического аллергена отражает снижение степени сенсибилизации организма.

Эффект гипосенеибилизации был подтвержден данными морфометрического анализа популяции тучных клеток (ТК) при исследовании гистологических срезов органов, полученных от животных всех трех групп после эвтаназии. При этом установили, что воздействие специфического аллергена у сенсибилизированных морских свинок вызывает генерализованную и в равной мере выраженную дегрануляцию популяции тучных клеток как в стенке воздухопроводящих путей, так и в коже. Показатели индекса дегрануляции ТК как в коже, так и воздухопроводящих путях в группе животных со специфической гипосенсибилизацией были ниже, чем у сенсибилизированных морских свинок, однако по сравнению с интактными оставались более высокими. При этом абсолютное количество тучных клеток в коже, бронхах и трахее в исследуемых группах не различалось. Таким образом, определено влияние гипосенсибилизации на морфофункциональные характеристики ТК сенсибилизированных морских свинок. Уже на ранней стадии лечения - сразу после проведения первичного курса аппликации специфического аллергена отмечалось изменение индекса дегрануляции, тогда как количественные изменения ТК в наших экспериментах на этой стадии еще не наступали.

Результаты этих экспериментов, свидетельствующих о том, что число ТК в коже, бронхах и трахее морских свинок при гипосенсибилизации остается на уровне сенсибилизированных животных, соотносятся с данными, полученными другими авторами [151], согласно которым через месяц после начала иммунотерапии достоверного изменения числа ТК в соскобах слизистой оболочки носовых раковин больных аллергическим ринитом не было обнаружено. В этой же работе показано, что иммунотерапия аллергенами в течение последующих трех и шести месяцев сопровождается достоверным снижением числа ТК и уменьшением симптомов аллергического ринита.

Кроме того, эффект гипосенсибилизации оценили по уровню специфических антител к белку свиной сыворотки в сыворотках от сенсибилизированных и гипосенсибилизированных морских свинок в конце девятой недели эксперимента. Показали, что гипосенсибилизация сопровождается существенным (в 2,5 раза) увеличением уровня специфических антител к аллергену по сравнению с сенсибилизированными морскими свинками. Причем у гипосенсибилизированных свинок уровень специфических 1^0 антител был сопоставим с таковым у гипериммунных морских свинок. Полученные в этом исследовании результаты, согласуются с данными литературы [24,59], согласно которым, одним из вероятных механизмов СИТ является образование «блокирующих антител», принадлежащих к классу 1^0 антител. Большое число сведений, полученных путем определения «блокирующей» активности сыворотки крови больных, прошедших повторные курсы СИТ, подтверждают предположение о том, что продукция ^О-блокирующих антител является важной составляющей противоаллергического действия СИТ. [73,26].

Для изучения влияния сенсибилизации и гипосенсибилизации на фагоцитарную способность лейкоцитов у морских свинок в динамике, использовали метод определения бактериального (культуры <5. еМегШсИя штамм 921) фагоцитоза. Однако фагоцитарные индексы лейкоцитов в течение всего периода наблюдения достоверно не различались у животных всех трех групп морских свинок, то есть для оценки эффекта гипосенсибилизации у морских свинок данный метод оказался не информативным. В то же время данные литературы свидетельствуют о том, у людей, страдающих аллергическими заболеваниями, происходит изменение фагоцитарной активности нейтрофилов [170]. Так, показатели фагоцитоза у детей с атопической бронхиальной астмой были ниже, чем у здоровых, причем адгезивные свойства нейтрофилов четко коррелировали с тяжестью и продолжительностью бронхоспастического синдрома [97].

Таким образом, разработанная схема проведения ХЛ анализа с применением дополнительного стимулятора ХЛ гранулоцитов аэросила может быть использована для оценки функциональной активности гранулоцитов под влиянием аллергена в эксперименте на морских свинках.

Изменение ХЛ гранулоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок в процессе гипосенсибилизации отражает снижение реактивности клеток в ответ на воздействие специфического аллергена, что подтверждается уменьшением индекса дегрануляции ТК у гипосенсибилизированных морских свинок, а также нарастанием уровня специфических антител в сыворотке этих животных.