Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидантного действия лекарственных препаратов

На правах рукописи

ЗАЙЦЕВ Валерий Геннадьевич

МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ

ЛИПИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

ПРЕПАРАТОВ

14.00.25 - фармакология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Волгоград — 2001

Работа выполнена в Волгоградской медицинской академии МЗ РФ

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук, профессор Закревский В.И. доктор медицинских наук, профессор Островский О.В.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Защита состоится «_»_2001 г. в_часов на заседании

Специализированного совета Д 208.008.02 при Волгоградской медицинской академии (400066, Волгоград, пл. Павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградской медицинской библиотеки.

Автореферат разослан «_»_2001 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

доктор медицинских наук, профессор А.Р. Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Существование живых организмов на Земле (за исключением некоторого количества облигатных анаэробных микроорганизмов) невозможно себе представить в отсутствии кислорода, являющегося неотъемлемым компонентом метаболических процессов в живых клетках. Однако существование организмов в богатой кислородом окружающей среде несет в себе и постоянную угрозу для их существования (K.J. Davies, 1995; J.S. Valentine e.a., 1998).

При включении кислорода в процессы жизнедеятельности организмов постоянно в существенном количестве образуются различные активные формы кислорода (АФК) (Ю.А. Владимиров, 1998; J.S. Valentine e.a., 1998). Одновременно, биомолекулы могут легко подвергаться окислению и разрушению под действием АФК (Е.Е. Дубинина, И.В. Шугалей, 1993; А.В. Пескин, 1997; R.T. Dean e.a., 1997; I. Fridovich, 1998; B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999). Соответственно, выживание организмов в кислородной среде весьма сильно зависит от предотвращения и репарации окислительных повреждений в организме (K.J. Davies, 1995).

Для ограничения интенсивности свободнорадикальных процессов и уровня окислительных повреждений в живых организмах в ходе эволюции возникла особая антиокси-дантная система (АОС), состоящая из большого числа согласованно работающих специфических ферментов и группы низкомолекулярных природных антиоксидантов (АО) (Ю.А. Владимиров, 1998; I. Fridovich, 1997; B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999; C.E. Pip-penger e.a., 1998). При различных отклонениях от нормального функционирования организма может развиться дисбаланс между интенсивностью продукции АФК и свободнора-дикального окисления (СРО) и уровнем функциональной активности АОС. Это, в свою очередь, вызывает усиление окислительных повреждений биомолекул, развитие дисфункции клеток и тканей и, в конечном итоге, гибель организма (В.З. Ланкин и др., 2000;

B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999). При патологических состояниях у человека рассмотренный дисбаланс может быть полностью или частично скорректирован применением в качестве лекарственных средств природных или синтетических АО (O.I. Aruoma, 1998;

C.A. Rice-Evans, A T. Diplock, 1993).

К настоящему времени накоплен обширный материал о многих тонких механизмах протекания процессов СРО и предложено для медицинского применения значительное число антиоксидантных препаратов. Выяснены некоторые механизмы действия отдельных групп химических соединений, проявляющих антиоксидантные свойства

(Е.Б.Бурлакова и др., 1998; Ю.А.Владимиров, 1998; О.В. Васильева и др., 1998; M. Patel, B.J. Day, 1999). Выявлены структурные компоненты, наличие которых в молекуле вещества является необходимым или существенным фактором для проявления антиоксидант-ных свойств. Однако использование разными исследовательскими группами отличающихся подходов для выявления антиоксидантных свойств у химических соединений создает определенные сложности в сравнении результатов (L.L. De Zwart e.a., 1999; H. Esterbauer, 1996; B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1995). Важнейшей методологической проблемой является отсутствие детально разработанного комплекса систем моделирования СРО in vitro, позволяющего унифицированным образом осуществлять скрининг новых АО с требуемыми свойствами. Важной в этом плане представляется разработка модельных систем перекисного окисления липидов (ПОЛ), с помощью которых можно не только выявлять наличие антиоксидантных свойств у химических соединений в ходе систематических скрининговых исследований, но и изучать одновременно механизм и особенности действия этих веществ в различных условиях протекания процессов ПОЛ.

Применение в таких исследованиях тест-систем с длительным протеканием ПОЛ может позволить выявить отдаленные эффекты АО в условиях, когда с течением времени концентрация АО уменьшается, а интенсивность ПОЛ возрастает. Указанный подход может оказаться полезным для моделирования in vitro поведения АО при длительном окислительном стрессе организма, когда повышенная интенсивность ПОЛ наблюдается на фоне истощения пула АО (B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999; J.G. Scandalios, 1997).

Важно также отметить, что АО способны проявлять прооксидантные свойства (М. Девис и др., 1999; В.З. Ланкин и др., 1998; H. Ohshima e.a., 1998). Условия и химико-структурные основы стимуляции СРО под действием АО изучены недостаточно. Основными выявленными на сегодняшний день факторами, определяющими возможность инверсии антиоксидантных свойств, являются концентрация самого АО, концентрация и химическая структура субстрата окисления и наличие в реакционной среде катионов металлов переходной валентности (В.З. Ланкин и др., 1998; G.R. Buettner, L. Milne, 1996; M.J. Burkitt e.a., 1996; A. Kontush e.a., 1996). В то же время вопрос о влиянии продолжительности протекания процесса ПОЛ на возможность возможности проявления проокси-дантного действия АО остается открытым.

Понимание взаимосвязи между структурой АО и изменением их свойств в зависимости от временного этапа процесса СРО позволит приблизиться к возможности синтеза и выявления химических соединений с максимально предсказуемыми особенностями антиоксидантных свойств, на основе которых могли бы быть созданы новые лекарственные препараты с антиоксидантным действием.

Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы Волгоградской медицинской академии и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградской медицинской академии (протокол № 4 от 8 декабря 1999 г.).

Цель исследования:

Разработка модельных тест-систем для скрининга и первичной оценки мишеней и особенностей действия антиоксидантов, а также оценка антиоксидантных и прооксидант-ных свойств биологически активных веществ различной химической природы.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение и выбрать оптимальный метод оценки интенсивности перекисного окисления липидов в суспензии липосом.

2. Определить условия применения модельных систем перекисного окисления липидов на основе липосом для скрининга лекарственных препаратов антиоксидантного действия, выявления мишеней и условий проявления антиоксидантной активности.

3. Установить особенности антиоксидантного действия химических соединений в зависимости от природы и свойств функциональных групп, определяющих антиоксидант-ную активность соединений, на различных временных этапах перекисного окисления липидов.

4. Выявить у антиоксидантов различной химической природы возможность и условия потери антиоксидантных свойств и их трансформации (инверсии) в прооксидантные.

Научная новизна работы

Доказано, что изменение концентрации карбонильных соединений, реагирующих с N (2,4-динитрофенил)гидразином (ДНФГ), может быть использовано для оценки интенсивности ПОЛ в липосомальных модельных системах, в том числе при инициации ПОЛ металлами переходной валентности.

Показано, что использование тиобарбитуровой кислоты (ТБК) для определения продуктов ПОЛ в целях оценки интенсивности ПОЛ может приводить к неадекватным результатам в случае металлозависимой индукции ПОЛ.

Впервые обнаружено, что эффективность действия АО изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах. Выявлено, что на отсроченных этапах ПОЛ (длительность окисления 24 ч и более) антиоксидантная активность химических соединений может усиливаться, пропадать или инвертироваться в прооксидантную активность.

Впервые установлены характерные особенности динамики изменения эффективности антиоксидантного действия АО различной химической природы в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомальной модельной системе.

Практическая ценность работы

Разработанные подходы к построению липосомальных модельных систем ПОЛ и способ оценки интенсивности ПОЛ в липосомах могут послужить основой для создания унифицированного комплекса методов выявления и оценки особенностей антиоксидантного действия веществ различной химической природы в ходе скрининговых испытаний. Описанная нами модельная система ПОЛ в условиях длительно протекающего окисления липосом позволяет выявлять наличие у конкретных АО зависимой от длительности периода протекания ПОЛ трансформации (инверсии) антиоксидантных свойств в проокси-дантные.

Реализация результатов исследования

Разработанная модельная система используется в исследованиях веществ с антиокси-дантной активностью на кафедре фармакологии и в изучении процессов перекисного окисления липидов на кафедре биологической химии Волгоградской медицинской академии. Методика определения карбонильных продуктов ПОЛ с использованием ДНФГ применяется в учебном процессе на кафедре биологической химии Волгоградской медицинской академии.

Разработанный нами подход к оценке интенсивности ПОЛ в модельных системах оформлен рационализаторским предложением («Способ оценки интенсивности перекис-ного окисления липидов в липосомах по содержанию карбонильных соединений», удостоверение № 10-2001 от 6 февраля 2001 г., выданное Волгоградской медицинской академией). Разработаны методические рекомендации «Выявление и оценка особенностей антиоксидантного действия химических соединений в модельной системе на основе ли-посом» (утверждены 5 июля 2001 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модельная система длительно протекающего процесса ПОЛ на основе суспензии фосфатидилхолиновых липосом с использованием различных инициаторов окисления и оценкой уровня ПОЛ по содержанию карбонильных соединений, реагирующих с ДНФГ, может служить тест-системой для скринингового выявления антиоксидантных свойств у веществ различной химической природы.

2. Эффективность действия антиоксидантов изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах. Особенности антиоксидантного действия в зависимости от длительности периода окисления определяются химической природой антиокси-данта.

3. Антиоксиданты различной химической природы и различного механизма действия обладают способностью к трансформации (инверсии) антиоксидантной активности в прооксидантную.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии», посвященной 100-летию кафедры биохимии Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 15 - 17 октября 1998 г.); на Российской национальной конференции с международным участием «Свободные радикалы и болезни человека» (Смоленск, 19 - 22 сентября 1999 г.); на научной сессии сотрудников Волгоградской медицинской академии (Волгоград, 5 - 9 октября 1999 г.); на научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения А.А. Ухтомского (Волгоград, 16 - 17 января 2001 г.); на 5-й Пущинской открытой конференции молодых ученых «Биология — наука 21-го века» (Пущино, 16 - 20 апреля 2001 г.); на конференции «Проблемы медицины и биологии» Кемеровской государственной медицинской академии (Кемерово, 19-20 апреля 2001 г.); на 66-й Республиканской конференции студентов и молодых ученых Башкортостана (Уфа, 26 апреля 2001 г.); на заседаниях Волгоградского отделения Биохимического общества РАН в 1999 - 2001 гг.

Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр фармакологии и биологической химии Волгоградской медицинской академии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 195 источника, из них 39 отечественных и 156 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 21 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение антиоксидантной активности химических соединений проводили в экспериментах in vitro с использованием в качестве субстрата ПОЛ мелких моноламеллярных липосом, полученных из яичного фосфатидилхолина методом инжекции этанольного раствора липида в водную фазу (S. Batzri, E.D. Korn, 1973). Липосомы подвергали спонтанному и индуцированному окислению при 37 °С. Индукцию ПОЛ липосом вызывали добавлением сульфата или ацетата меди (II) (конечная концентрация 2,5 мМ в инкубационной среде) в отсутствие или при добавлении H2O2 (конечная концентрация 0,8 мМ в инкубационной среде).

Уровень ПОЛ в суспензии липосом оценивали по концентрации карбонильных соединений (КС), которую определяли оригинальным методом. Для этого к 0,05 мл суспензии липосом добавляли 0,2 мл реактива, представляющего собой 5 мМ раствор (ДНФГ) в 1,9 М HCl. Через 10 мин к реакционной смеси прибавляли 1 мл 0,75 М NaOH. Еще через 10 мин оптическую плотность реакционной смеси измеряли при длине волны 460 нм против соответствующим образом обработанной контрольной пробы (вода). Эталон — пиру-ват натрия.

В качестве методов сравнения при оценке интенсивности ПОЛ в препаратах липосом использовали определение концентрации веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ВР-ТБК), в присутствии трихлоруксусной кислоты (H. Esterbauer, K.H. Cheeseman, 1990) или фосфорной кислоты (Л.И. Андреева и др., 1988) и спектрофотомет-рическое определение концентрации конъюгированных диенов (В.Н. Ушкалова и др., 1993) и кротонового альдегида (Р.Г. Примак, О.И. Лебедь, 1986).

В работе было исследовано влияние на процесс ПОЛ в модельной системе 7 химических соединений, входящих в состав лекарственных препаратов (2,3-димеркаптопропансульфоната натрия [унитиола], 2,6-ди-дареда-бутил-4-метилфенола [ио-нола], кверцетина, пробукола, ретинола ацетата, таурина и эргокальциферола), важного природного АО глутатиона (восстановленный) и трех комплексообразующих карбоновых кислот: янтарной, лимонной и винной.

Эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) исследуемого химического соединения в каждой серии опытов и для каждой длительности периода окисления липосом рассчитывали по формуле:

[ (C0 - C1) / C0 ] х 100 %,

где Со - концентрация КС в суспензии липосом, не содержащей исследуемого соединения (контроль), Ci - концентрация КС в суспензии липосом, содержащей исследуемое соединение (опыт).

Если значение показателя ЭАД было положительным, считали, что тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; если значение показателя ЭАД было отрицательным,. считали, что тестируемое вещество проявляет прооксидантное действие.

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с рекомендациями К. Дёрффеля (1994) и фирмы StatSoft, Inc. (США) (1999). Статистически обработанные данные представлены в виде M ± SD, где M - среднее арифметическое, SD - стандартное отклонение. Достоверность отличий между средними в различных группах опытов устанавливали с помощью с помощью дисперсионного анализа ANOVA. При значении p < 0,001 мы полагали результаты статистического анализа высоко значимыми; при 0,001 < p < 0,01 — значимыми (достоверными); при 0,01 <p < 0,05 — сомнительными (спорными); а приp > 0,05 — незначимыми.

Для оценочного выявления вида взаимосвязи между двумя показателями использовали построение диаграмм рассеяния; количественную меру степени взаимосвязи определяли с помощью численных методов (расчет коэффициента линейной корреляции Пирсона r). Для оценки линейности зависимости одного показателя от другого вычисляли уравнение линейной регрессии.

Все статистические расчеты проводили с применением пакета прикладных программ Statistica for Windows, Kernel Release 5.5 A фирмы StatSoft, Inc. (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Применимость метода определения веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, для оценки уровня ПОЛ в модельной системе

Хотя определение ВР-ТБК широко используется для оценки уровня ПОЛ в модельных системах, данному методу присущи определенные недостатки (L.L. De Zwart e.a., 1999; H. Esterbauer, 1996; B. Halliwell, S. Chirico, 1993). Нами была изучена возможность применения метода определения ВР-ТБК для оценки уровня ПОЛ в суспензии липосом в присутствии катионов металлов переходной валентности (Fe2+ и Cu2+), широко используемых для металлозависимой индукции ПОЛ.

Было обнаружено, что добавление солей Fe2+ или Cu2+ к реакционной смеси, содержащей ТБК и аутоокисленные липосомы, вызывает существенное усиление образования ВР-ТБК, поглощающих при длинах волн 452 и 532 нм (Рис. 1).

1,2 1,1 1,0 ш 0,9

0

л" 0,8

° 0,7

1 0,6

£ 0,4

ГГ

н 0,3 ° 0,2 0,1 0,0

Рис. 1. Поглощение при длинах волн 452 нм (А) и 532 нм (Б) хромогенов, образующихся при взаимодействии карбонильных соединений суспензии липосом (2,38 мг липида/мл

суспензии), подвергнутых автоокислению при 37 °С, и ТБК в среде трихлоруксусной ки-

2+

слоты: 1 - в отсутствие катионов металлов; 2 - в присутствии 0,625 мМ Бе ; 3 - в присутствии

0,625 мМ Си2+; 4

- в присутствии 0,625 мМ Бе2+ и 0,625 мМ Си2+. Усреднение результатов 4 экспериментов.

В последующих опытах было установлено, что катионы Си2+ способны непосредственно взаимодействовать с ТБК в отсутствие липосом и значительно влиять на спектр поглощения ВР-ТБК в суспензии липосом (Рис. 2).

0.7 г-о.е ■

£ I-

о

£ 0,4 •

о с:

ее 0.3 •

Я О

и

£ 0.2 ■ I—

с

О

0.1 ■

0.0 -

420

Длина волны,нм

Рис. 2. Спектры поглощения веществ, образующихся при взаимодействии ТБК, продуктов ПОЛ фосфатидилхолиновых липосом (2,38 мг липида/мл суспензии) и сульфата меди (II) в среде трихлоруксусной кислоты (спектры сняты относительно раствора ТБК): 1 - ТБК + 0,625 мМ Си2+; 2 - ТБК + липосомы после 18-часового автоокисления; 3 - ТБК + липосомы после 18-часового автоокисления + 0,625 мМ Си2+.

Полученные результаты свидетельствуют, что содержание ВР-ТБК не может быть достоверным показателем содержания продуктов ПОЛ в анализируемом образце, если в нем присутствуют катионы Бе2+ или Си2+, поскольку, с одной стороны, катионы металлов переходной валентности стимулируют образование в ходе анализа дополнительных коли-

честв ВР-ТБК, а с другой стороны, катионы Cu2+ способны непосредственно взаимодействовать с ТБК.

Применимость метода определения карбонильных соединений с использованием ДНФГ для оценки уровня ПОЛ в модельной системе

ДНФГ, в отличие от ТБК, не реагирует как с различными солями Cu2+ (сульфат, хлорид, ацетат), так и с продуктами их реакции с H2O2.

В ходе оптимизации метода количественного анализа карбонильных продуктов ПОЛ с использованием ДНФГ были изучены спектры поглощения динитрофенилгидразонов КС, образующихся при спонтанном и Си2+-индуцированном ПОЛ липосом. Было установлено, что образующиеся хромогены имеют широкую полосу поглощения. В большинстве случаев спектры образующихся продуктов имели широкий пик при 450-470 нм с максимумом при 460 нм, что близко к максимуму поглощения динитрофенилгидразона 4-гидроксиноненаля (456 нм), являющегося одним из основных продуктов ПОЛ in vivo и в модельных системах. Область линейной зависимости оптической плотности образующихся хромогенов от концентрации карбонильных групп — от 0,1 до 2 мМ.

Для сравнения результатов оценки уровня ПОЛ методом с использованием ДНФГ с основными распространенными методами определения продуктов ПОЛ было проведено

определение содержания различных продуктов ПОЛ в липосомах, подвергнутым авто-

2+

окислению и CUT + H2O2 -индуцированному ПОЛ. Динамика накопления в липосомах КС, реагирующих с ДНФГ, в ходе спонтанного и индуцированного окисления качественно сходна с динамикой накопления других продуктов ПОЛ, определяемых с использованием общепринятых методов. В то же время, количественно накопление КС в период между 3-м и 24-м часами окисления (и при автоокислении, и при индуцированном ПОЛ) было наиболее выраженным (Рис. 3).

Важно отметить, что метод с использованием ДНФГ позволяет наиболее полно определять количество КС, образующихся в ходе ПОЛ, что согласуется с литературными данными (В.Н.Ушкалова и др., 1993; H.H.Draper e.a., 1993; H.Esterbauer e.a., 1991; B.Halliwell, J.M.C.Gutteridge, 1990; Y.Yamamoto e.a., 1984). В то же время, метод определения ДНФГ-реактивных продуктов ПОЛ отличается простотой и низкой трудоемкостью выполнения в сравнении с общепринятыми методами определения продуктов ПОЛ нерадикальной природы.

700

** 600

0

С

S 500

■=1

О. 400

S

¡ 300

Q.

tú

<=£

1 200

S

Г

<D

I 100 0

Рис. 3. Изменение содержания различных продуктов ПОЛ в суспензии липосом (2,38 мг липида/мл) в период с 3 к 24 ч автоокисления (А) и ПОЛ, индуцированного 2,5 мМ Cu(CH3COO)2 и 0,8 мМ H2O2 (Б). За 100 % принято значение соответствующего показателя после 3 ч окисления. Продукты ПОЛ: конъюгированные диены (1); кротоновый альдегид (2); карбонильные соединения, взаимодействующие с ДНФГ (3); ВР-ТБК, определявшиеся по методу Андреевой с соавт. (1988): в отсутствие Fe2+ (4а), в присутствии Fe2+ (46); ВР-ТБК, определявшиеся по методу Esterbauer, Cheeseman (1990): в отсутствие Fe2+ (5а), в присутствии Fe2+ (56). Усреднение данных 7 экспериментов.

Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют возможность использования определения ДНФГ-реактивных КС для адекватной оценки интенсивности ПОЛ в опытах in vitro независимо от способа инициации окисления.

Зависимость накопления карбонильных соединений в липосомах от длительности периода окисления и особенностей инициации процесса ПОЛ

Была изучена динамика накопления КС в ходе ПОЛ липосом в зависимости от длительности периода окисления и вида используемой системы инициации ПОЛ (табл. 1). Установлено, что динамика изменения концентрации КС в липосомах в процессе их окисления существенно зависит от того, какое именно вещество (смесь веществ) было использовано для инициации ПОЛ. В течение первых 24-48 часов окисления скорость накопления карбонильных соединений непостоянна и существенно зависит от способа инициации ПОЛ.

При автоокислении существенное возрастание содержания КС происходит только к 24-му часу. При автоокислении в течение 48 ч и дольше содержание КС практически не изменяется (p>0,5). Добавление к инкубационной среде H2O2 несколько ускоряет накопление КС в первые часы процесса ПОЛ в сравнении с автоокислением (p<0,01), однако на отсроченных этапах окисления (24 ч и дольше) содержание КС в суспензиях липосом, подвергнутых автоокислению и Н^^индуцированному окислению, значимо не отличается (p>0,2).

& 600

Таблица 1.

Содержание карбонильных соединений в суспензии липосом, подвергнутых спонтанному

и индуцированному окислению при 37 оС

Период окисления, ч Индукция ПОЛ*

А НР С8 С8НР СА САНР

1 0,113 ± 0,038 0,169 ± 0,047 0,107 ± 0,028 0,169 ± 0,054 0,157 ± 0,056 0,308 ± 0,109

3 0,141 ± 0,049 0,219 ± 0,057 0,175 ± 0,043 0,270 ± 0,103 0,300 ± 0,072 0,560 ± 0,111

6 0,189 ± 0,065 0,357 ± 0,079 0,303 ± 0,113 0,417 ± 0,186 0,560 ± 0,103 0,777 ± 0,106

24 0,908 ± 0,200 0,988 ± 0,177 1,214 ± 0,141 1,270 ± 0,139 1,238 ± 0,148 1,268 ± 0,154

48 1,228 ± 0,296 1,184 ± 0,164 1,387 ± 0,160 1,392 ± 0,158 1,259 ± 0,150 1,298 ± 0,246

72 1,486 ± 0,061 1,437 ± 0,028 1,386 ± 0,044 1,376 ± 0,048 1,201 ± 0,033 1,160 ± 0,101

96 1,296 ± 0,209 1,422 ± 0,072 1,373 ± 0,032 1,373 ± 0,022 1,212 ± 0,039 0,961 ± 0,165

Усреднение результатов 15-22 экспериментов в группе. * Условные обозначения видов индукции: А - автоокисление; НР - Н202; С8 - СиБ04; С8ИР -СиБ04 + Н202; СА - Си(СН3С00)2; САНР - Си(СН3С00)2 + Н202. Конечная концентрация Н202 в инкубационной среде 0,8 мМ, солей Си2+ - 2,5 мМ.

Индукция ПОЛ СиБ04 приводит к достоверному повышению уровня карбонильных продуктов ПОЛ при средних сроках окисления (6 и 24 ч) (р<0,006), но не на начальных или отсроченных этапах ПОЛ. Различия в накоплении КС при индукции ПОЛ СиБ04 или Н202 + СиБ04 статистически сомнительны (0,016<р<0,042) на начальных этапах окисления (1 и 3 ч) и недостоверны (р>0,175) при большей длительности окисления. При сроках окисления 1-24 ч концентрация КС в суспензии липосом, подвергнутых СиБ04 + Н202-индуцированному окислению достоверно выше, чем в суспензии автоокисленных липо-сом (р<0,003).

Индукция ПОЛ Си(СН3С00)2 вызывает усиление ПОЛ в сравнении с СиБ04 на начальных этапах окисления (различия высоко значимы через 3 и 6 ч, р<0,0004). При инициации ПОЛ Си(СН3С00)2 + Н202 накопление КС в липосомах в первые 6 часов инкубации было наиболее интенсивным по сравнению со всеми перечисленными выше случаями (р<0,0001).

Влияние аниона уксусной кислоты на накопление карбонильных соединений

Поскольку инициация окисления липосом ацетатом меди (II) приводит к более выраженному накопление КС, чем инициация ПОЛ СиБ04, было изучено влияние ацетат-аниона на интенсивность ПОЛ в липосомах. Было обнаружено, что добавление ацетата натрия к инкубационной среде (индукция окисления СиБ04 или СиБ04 + Н202) приводит к возрастанию содержания КС в липосомах при длительности окисления 1-24 ч концен-

трационно-зависимым образом (Рис. 4). Этот факт говорит о способности ацетат-аниона

2+

стимулировать накопление КС при Си -зависимом окислении липосом.

1.е-1 1.6

Длительность периода окисления, ч Длительность периода окисления, ч

Рис. 4. Концентрация карбонильных соединений в липосомах, подвергнутых индуцированному ПОЛ в присутствии различных концентраций ацетата натрия. Окисление липосом инициировали добавлением 2,5 мМ СиБ04 в отсутствие (А) или при одновременном добавлении 0,8 мМ Н202 (Б). Усреднение данных 4 экспериментов.

Влияние концентрации фосфатидилхолина на накопление карбонильных соединений в липосомах

Показано, что от концентрации фосфолипида в суспензии липосом существенно зависит концентрация КС в липосомах в ходе их длительного окисления. Анализ зависимости концентрации КС от концентрации липида в суспензии липосом при различной длительности периода окисления демонстрирует наличие очень жесткой прямой взаимосвязи между указанными показателями (значения коэффициента Пирсона г от 0,959 до 0,996, р<0,041)

Возможность использования буферных растворов в модельной системе на основе

2+

липосом при Си -зависимой индукции ПОЛ

При окислении суспензии фосфатидилхолиновых липосом происходит постепенное закисление инкубационной смеси. Скорость закисления при Си2-индуцированном ПОЛ относительно медленная, а при автоокислении закисление среды существенно ускоряется длительности окисления больше 24 ч (табл. 2).

Таблица 2.

Изменение значения рН незабуференной суспензии фосфатидилхолиновых липосом в

процессе длительного окисления

Длительность окисления, ч Автоокисление Индукция ПОЛ Cu(CH3COO)2 Индукция ПОЛ Cu(CH3COO)2+H2O2

0 5,99 ± 0,11 5,90 ± 0,14 5,89 ± 0,12

24 5,83 ± 0,14 5,54 ± 0,08 5,49 ± 0,12

48 5,04 ± 0,09 5,19 ± 0,10 5,19 ± 0,16

72 4,45 ± 0,19 5,08 ± 0,13 5,10 ± 0,11

Усреднение результатов 5 экспериментов.

Для выяснения вопроса о возможности применения буферных растворов при моделировании Си2-индуцированного ПОЛ в липосомах нами был проведен анализ данных литературы и ряд собственных экспериментов. По литературным данным применение фосфатных буферных растворов невозможно из-за образования плохо растворимых фосфатов меди, а широко применяемые в биохимии буферообразующие вещества трис, трицин, глицилглицин, BES и TES образуют прочные комплексы с Си (Р.Досон и др., 1991; B.Halliwell, J.M.C.Gutteridge, 1990).

Было изучено влияние буферных растворов на основе солей уксусной, янтарной, лимонной и 2-морфолиноэтансульфоновой (MES) кислот на накопление КС в липосомах. Было выявлено, что MES способен существенно усиливать накопление КС в ходе как Си2-индуцированного, так и спонтанного окисления липосом: прооксидантное действие MES не наблюдалось лишь при индукции ПОЛ Cu(CH3COO)2 + H2O2 (Рис. 5).

Также было обнаружено, что ацетатные буферные растворы стимулируют накопление КС в ходе ^^-индуцированного ПОЛ липосом, сукцинатные могут проявлять как про-, так и антиоксидантное действие в зависимости от вида индукции, а цитратные в большинстве случаев подавляют накопление КС в липосомах (Рис. 6). Следовательно, буферные растворы на основе органических соединений способны оказывать существенное влияние на процесс накопления в липосомах КС как при спонтанном, так и при индуцированном окислении. Поэтому для целей скрининговой оценки антиоксидантных свойств веществ представляется допустимым применение незабуференной суспензии липосом в экспериментах длительностью до 24 ч.

О 1 ЕЭ 2

1 3 В 24

Длительность периода окисления, ч

Рис. 5. Влияние 20 мМ МЕ8-Ыа0Н буферного раствора (рН 6,8) на содержание карбонильных соединений в липосомах в ходе автоокисления (1) и окисления, индуцированного: 2,5 мМ СиБ04 (2), 2,5 мМ СиБ04 + 0,8 мМ Н202 (3), 2,5 мМ Си(СН3С00)2 (4), 2,5 мМ Си(СН3С00)2 + 0,8 мМ Н202 (5). За 100 % принимали значение показателя на соответствующий момент времени в контрольном незабуференном препарате липосом. Усреднение результатов 4 экспериментов.

Рис. 6. Влияние буферных растворов (рН 6,0) на основе карбоновых кислот на содержание КС в липосомах. Окисление инициировали 2,5 мМ СиБ04 (А, Б) или Си(СН3С00)2 (В, Г) в присутствии 0,8 мМ Н202. 1 - ацетатный буфер, 2 - сукцинатный буфер, 3 - цит-ратный буфер. Концентрация буферообразующих веществ 2 мМ (А, В) и 10 мМ (Б, Г). За 100 % принимали содержание карбонильных соединений в липосомах после соответствующего периода окисления в отсутствие карбоновых кислот (пунктирная линия). Усреднение результатов 4 экспериментов.

Изучение эффективности липофильных антиоксидантов

Была изучена зависимость ЭАД липофильных фенольных (ионол, пробукол, кверце-тин) и полиеновых (ретинола ацетат, эргокальциферол) АО в зависимости от длительности окисления липосом при различных способах его иницииации (табл. 3). Изученные концентрации АО: 5 мкМ и 100 мкМ.

Таблица 3.

ЭАД липофильных антиоксидантов (%) в ходе длительного окисления липосом

АО (концен- Индук Длительность периода окисления, ч

трация, мкМ) ция* 1 3 6 24 48

Ионол (5) А 11,94+16,05 9,96+12,28 8,81+3,08 82,17+3,71 89,35+5,51

СА 8,58+15,82 35,15+7,86 62,70+16,05 4,76+3,98 -2,07+4,11

САНР 2,81+2,40 9,09+7,24 11,43+6,92 -5,11+3,01 -7,24+5,13

Ионол (100) А 7,24+29,26 31,43+13,57 39,35+5,43 83,36+4,70 82,41+7,93

СА 24,60+26,47 39,20+4,67 72,67+1,43 83,78+4,33 84,37+3,07

САНР 21,38+7,69 47,06+3,30 67,99+3,59 81,49+3,62 81,95+5,84

Пробукол (5) А 28,23+6,46 11,58+10,34 43,78+7,39 82,98+4,12 91,95+4,56

СА 16,11+12,28 38,14+7,62 70,49+7,00 83,47+4,94 83,83+5,22

САНР 45,59+6,23 35,95+4,38 25,73+8,99 3,72+3,49 -28,18+10,41

Пробукол А 34,68+6,99 46,76+12,40 22,05+5,87 80,47+3,29 85,75+6,08

(100) СА 18,60+3,18 52,26+1,73 70,81+2,84 78,25+3,68 81,12+4,27

САНР 44,02+11,02 57,13+10,07 67,54+1,51 84,10+2,56 88,12+4,46

Кверцетин А 20,78+10,14 27,90+7,68 30,76+6,11 51,24+5,84 60,05+6,65

(5) САНР 14,42+4,65 -9,76+6,22 -5,52+3,91 -7,94+5,07 -11,76+4,99

Кверцетин А 34,93+4,79 13,35+5,34 33,14+4,68 67,79+8,11 72,09+5,13

(100) САНР 16,83+6,54 35,50+5,92 51,36+8,39 -0,42+5,18 -9,35+8,06

Ретинола А 13,10+8,83 4,66+7,26 7,89+7,86 -6,31+5,23 -12,39+7,06

ацетат (5) САНР 40,91+4,92 24,25+5,40 12,78+3,97 -6,01+4,29 -21,64+6,83

Эргокальци- А 4,37+6,89 4,35+5,91 -38,66+9,28 -239,60+12,56 -315,70+9,45

ферол (5) САНР 23,69+5,78 12,42+10,20 5,42+4,66 -15,50+7,62 -52,00+11,44

Усреднение результатов 5 - 9 экспериментов в группе. * Способы индукции ПОЛ: А - автоокисление; СА - Си(СН3СОО)2; САНР - Си(СН3СОО)2 + Н2О2.

Ионол и пробукол значимо подавляли накопление КС в липосомах в случае автоокисления, причем наибольшая ЭАД наблюдалась на отдаленных этапах ПОЛ (24 и 48 ч). При этом только до 6 ч окисления наблюдалась зависимость ЭАД от концентрации АО, в эти же сроки пробукол был несколько более эффективен как АО в сравнении с ионолом. На отдаленных этапах ПОЛ ионол и пробукол в обоих изученных концентрациях были примерно равноэффективны.

При индукции окисления липосом ацетатом меди заметное антиоксидантное действие на всех этапах ПОЛ было обнаружено у пробукола (в обоих концентрациях) и ионола (в концентрации 100 мкМ), причем ЭАД возрастала с увеличением длительности периода окисления. В концентрации 5 мкМ ионол оказался неэффективен на отдаленных этапах ПОЛ.

При индукции ПОЛ Си(СН3СОО)2 + Н2О2 (то есть, при наибольшей начальной интенсивности накопления КС) высокая ЭАД наблюдалась у пробукола и ионола только в концентрации 100 мкМ. В концентрации 100 мкМ антиоксидантное действие ионола и про-букола при длительном протекании ПОЛ инвертировалось в прооксидантное, причем пробукол, более эффективный как АО на начальных этапах ПОЛ, оказался на отдаленных этапах ПОЛ более сильным прооксидантом.

ЭАД кверцетина при автоокислении оказалась несколько выше, чем у ионола, на начальных этапах ПОЛ и ниже — на отдаленных. При индукции ПОЛ Н2О2 +Си(СН3СОО)2 кверцетин в концентрации 5 мкМ был неэффективен, а в концентрации 5 мкМ сохранял заметную ЭАД только на начальных этапах окисления (подобно низким концентрациям ионола и пробукола).

Поскольку липофильные фенольные АО эффективно перехватывают карбо- и перок-си-радикалы, обрывая цепные свободнорадикальные реакции в липидной фазе (Е.Б. Бур-лакова и др., 1998; Б. Воппе1Ъп1;-Кои88е1о1 е.а., 1999), антиоксидантное действие таких соединений будет наиболее выраженным при интенсивной пропагации ПОЛ, то есть на отсроченных этапах ПОЛ. В ситуации же, когда эффективная концентрация АО мала относительно концентрации зарождающихся свободных радикалов (исходно низкая концентрация АО или низкая остаточная концентрация АО на отдаленных этапах ПОЛ при высокой скорости зарождения радикалов), большая часть молекул АО быстро превращается в феноксильные радикалы, которые способны с относительно высокой скоростью включаться в продолжение цепей реакций ПОЛ (Е.Б. Бурлакова и др., 1998). В этом случае АО будет выступать не как ингибитор, а как субстрат реакций СРО, что мы и наблюдаем при длительном Си(СН3СОО)2 + Н2О2-индуцированном ПОЛ липосом.

Зависимость ЭАД ретинола ацетата и эргокальциферола от длительности периода окисления липосом существенно отличаются от таковой для фенольных АО (см. табл. 3). Ретинола ацетата не оказывал достоверного влияния на образование КС при автоокислении липосом, проявляя, однако, тенденцию к незначительной стимуляции ПОЛ. Эрго-кальциферол, не изменяя уровень ПОЛ в течение первых 3 часов автоокисления, на более поздних временных этапах демонстрировал значительную прооксидантную активность.

Выраженность прооксндантного эффекта эргокальцнферола усиливалась с увеличением длительности периода окисления. В случае индукции ПОЛ Си(СН3СОО)2 + Н2О2 ретинола ацетата и эргокальциферол заметно снижали содержание КС в липосомах в течение первых 3-6 часов окисления, но при большей длительности ПОЛ оба соединения проявляли прооксидантное действие, более выраженное у эргокальциферола. Интересно, что прооксидантный эффект эргокальциферола при индуцированном ПОЛ липосом была существенно ниже, чем при автоокислении.

Обнаруженная динамика ЭАД ретинола ацетата, возможно, связана с тем, что ретинола ацетат способен эффективно перехватывать радикальные инициаторы реакций ПОЛ (Б.С. ЫеЫег, Т.Б. МсС1иге, 1996) лишь до тех пор, пока содержание ретинола ацетата достаточно для перехвата основного количества образующихся в ходе СРО радикалов (С.А.Шсе-ЕуапБ, А.Т.Б1р1оск, 1993). После истощения пула АО с ненасыщенными связями скорость СРО существенно возрастает, тем более, что продукты окисления ретинола ацетата могут вовлекаться в дальнейшее развитие реакций СРО (ТА.О^оп, 1996). По-видимому, аналогичным образом можно объяснить и анти/прооксидантные эффекты эр-гокальциферола.

Изучение эффективности гидрофильных серосодержащих антиоксидантов

Было обнаружено, что тиоловые АО глутатион (восстановленная форма) и унитиол (100 мкМ) проявляют заметное антиоксидантное действие только на начальном этапе ПОЛ (1 ч окисления) (табл. 4). При более длительных сроках окисления ЭАД унитиола снижается до незначительной, а глутатион полностью теряет способность подавлять накопление КС в липосомах и становится способным проявлять прооксидантное действие.

Таблица 4.

ЭАД серосодержащих антиоксидантов (%) при длительном окислении липосом

АО (концентрация, мкМ) Индук ция* Длительность периода окисления, ч

1 3 6 24 48

Глутатион (100) А 18,34+3,57 -68,63+9,12 -37,81+6,94 -43,09+5,88 -74,57+7,42

САНР 21,15+9,32 -3,96+7,46 1,16+8,15 4,75+7,44 -36,17+5,88

Унитиол (100) А 34,50+3,85 -1,24+5,25 10,60+5,35 16,38+8,75 7,89+7,66

САНР 24,04+4,88 10,75+5,32 9,79+4,57 8,01+5,76 5,85+6,75

Таурин (100) А 18,78+6,65 16,46+7,84 5,64+6,81 -7,32+9,12 -6,78+8,06

САНР 24,52+4,44 2,55+6,89 8,53+7,54 17,87+10,35 9,80+7,23

Усреднение результатов 4 экспериментов в группе. * Способы индукции ПОЛ: А - автоокисление; САНР - Си(СН3СОО)2 + Н2О2.

Подобная динамика ЭАД, вероятно, определяется механизмом антиоксидантного действия тиолов, связанным как с окислением БН-групп под действием кислородных радикалов, так и с хелатированием катионов металлов переходной валентности (В. НаШ-well, 1.М.С. Оийепё§е, 1990). При взаимодействии с радикалами тиол превращается в соответствующий тиильный радикал, степенью реакционноспособности которого определяется его способность вовлекаться в дальнейшее развитие ПОЛ. Образующиеся при окислении глутатиона тиильные радикалы обладают высокой реакционноспособностью, что, можно предположить, приводит к инверсии антиоксидантного действия глутатиона в прооксидантное.

У природной аминосульфокислоты таурина было обнаружено слабое антиоксидант-ное действие, исчезающее на отдаленных этапах ПОЛ (см. табл. 4).

Изучение антиоксидантной эффективности солей комплексообразующих карбоно-вых кислот

Было изучено влияние солей янтарной (натрия сукцинат), винной (калия-натрия тар-трат) и лимонной (натрия цитрат) кислот (2 и 10 мМ) на накопление КС в липосомах при индукции ПОЛ сульфатом или ацетатом меди в присутствии Н202 (табл. 5).

Таблица 5.

ЭАД антиоксидантов - комплексообразующих карбоновых кислот (%) в ходе длительно-

го окисления липосом

АО (концентрация, мМ) Индук ция* Длительность периода окисления, ч

1 3 6 24

Сукцинат натрия (2) СБНР -13,04 ± 17,86 -43,87 ± 30,60 10,71 ± 17,67 13,63 ± 6,33

САНР 10,88 ± 9,15 59,63 ± 17,17 63,31 ± 11,70 -3,57 ± 3,96

Сукцинат натрия (10) СБНР -12,75 ± 11,52 -22,67 ± 6,64 3,55 ± 8,13 23,75 ± 8,01

САНР 3,57 ± 2,25 44,61 ± 6,59 61,15 ± 4,33 11,64 ± 8,31

Тартрат калия-натрия (2) СБНР -11,67 ± 22,75 -39,52 ± 28,61 1,10 ± 21,15 -6,86 ± 3,07

САНР 17,37 ± 17,52 51,86 ± 19,78 37,63 ± 14,37 -10,97 ± 1,06

Тартрат калия-натрия (10) СБНР -0,98 ± 8,68 -48,00 ± 11,32 -23,40 ± 7,76 -18,60 ± 7,24

САНР 15,01 ± 9,00 30,81 ± 5,20 37,12 ± 10,14 -13,65 ± 6,60

Цитрат натрия (2) СБНР -6,22 ± 17,09 -18,98 ± 19,86 19,25 ± 6,34 15,80 ± 6,29

САНР 24,10 ± 11,19 55,51 ± 22,10 63,92 ± 13,92 8,83 ± 24,35

Цитрат натрия (10) СБНР 29,41 ± 11,05 14,67 ± 7,60 36,17 ± 5,87 88,13 ± 6,04

САНР 13,28 ± 5,57 67,51 ± 6,40 78,89 ± 10,21 86,19 ± 5,09

Усреднение результатов 4 * Способы индукции ПО. экспериментов в группе. I: СБНР - СиБ04 + Н2О2; САНР - Си(СН3С00)2 + Н2О2.

Было обнаружено, что при индукции ПОЛ СиБО4 + Н2О2 сукцинат и тартрат проявляют в основном прооксидантные свойства, а при индукции ПОЛ Си(СН3СОО)2 + Н2О2 они продемонстрировали выраженное антиоксидантное действие (при длительности окисления до 6 ч). Цитрат, образующий более прочные комплексы с металлами, чем сукцинат и тартрат (Р. Досон и др., 1991), оказался и наиболее эффективным АО среди изученных комплексообразователей. При этом у цитрата ни в одном случае не было обнаружено значимого прооксидантного действия.

По всей видимости, связывание в комплекс с анионами карбоновых кислот лишь час-

2+

тично препятствует вовлечению Си в реакцию Фентона с продукцией гидроксил-радикала, инициирующего реакции ПОЛ в мембране липосом.

В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что использование предложенной модельной системы позволяет выявить у АО различной химической структуры особенности их антиоксидантного действия в зависимости от интенсивности и длительности протекания реакций ПОЛ. Было установлено, что веществам с определенным механизмом действия свойственна и определенная зависимость ЭАД от длительности и интенсивности окисления липосом.

Было обнаружено явление трансформации (инверсии) антиоксидантного действия веществ в прооксидантное в зависимости от длительности периода протекания процесса ПОЛ. Важно отметить, что инверсия антиоксидантных свойств в прооксидантные оказалась свойственной антиоксидантам различной химической природы и различного механизма действия. Такая инверсия была выявлена нами у фенольных соединений, веществ с ненасыщенными С=С-связями, тиолов и карбоновых кислот, способных образовывать комплексы с катионами металлов переходной валентности.

Представленные данные демонстрируют возможность использования предложенной модельной системы для выявления наличия и особенностей антиоксидантных свойств химических соединений. Такой комплексный скрининг может иметь важное значение для целенаправленного создания высокоэффективных лекарственных препаратов с конкретными особенностями антиоксидантного действия.

выводы

1. Разработана простая и доступная химическая модельная система для скринингового выявления антиоксидантной активности и первичной оценки особенностей антиокси-дантного действия химических соединений различного строения в зависимости от длительности периода окисления в экспериментах in vitro.

2. Определение концентрации карбонильных соединений, реагирующих с 2,4-динитрофенилгидразином, является простым и воспроизводимым способом оценки интенсивности ПОЛ в липосомальных модельных системах, в том числе при инициации ПОЛ металлами переходной валентности. Использование тиобарбитуровой кислоты для определения продуктов ПОЛ в присутствии металлов переменной валентности приводит к неадекватной оценке интенсивности ПОЛ.

3. Разработан метод скрининга веществ различной химической природы с целью выявления антиоксидантных свойств и уточнения особенностей антиоксидантного действия с использованием модельной системы на основе суспензии фосфатидилхолиновых липосом при различной длительности окисления липосом. Продолжительное окисление липосом (24 ч и более) позволяет обнаружить особенности антиоксидантного действия веществ, не выявляющиеся при малой длительности протекания процессов ПОЛ.

4. Эффективность действия изученных фармакологически активных веществ с антиок-сидантным действием существенно изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах и зависит от химической природы антиоксиданта, его концентрации и интенсивности ПОЛ, задаваемой способом инициации окисления липосом.

5. Липофильные антиоксиданты фенольной природы более эффективно подавляли накопление карбонильных продуктов ПОЛ при автоокислении липосом, чем при Cu-индуцированном окислении. Эффективность антиоксидантного действия фенольных липофильных антиоксидантов достигает максимума на поздних (24 ч) этапах окисления.

6. Липофильные вещества, содержащие ненасыщенные связи, проявляют максимальную эффективность на раннем этапе ПОЛ (1 ч окисления), и их антиоксидантное действие при Cu-индуцированном окислении более выраженно, чем при автоокислении.

7. Содержащие серу гидрофильные антиоксиданты наиболее эффективно подавляют ПОЛ на раннем этапе процесса (1 ч окисления). На более поздних этапах антиокси-дантное действие таких веществ исчезает.

8. Карбоновые кислоты, способные образовывать комплексы с катионами металлов, в зависимости от их концентрации и от условий протекания процесса ПОЛ проявляют как анти-, так и прооксидантное действие. Наибольшая эффективность антиоксидант-ного действия комплексообразующих карбоновых кислот наблюдается при средней длительности окисления (3 и 6 ч).

9. Трансформация (инверсия) антиоксидантного действия химических соединений в прооксидантное действие наблюдается на отсроченных этапах ПОЛ (длительность окисления 3 часа и более с момента инициации окисления). Проявление инверсии зависит от химической природы и концентрации антиоксиданта, интенсивности протекания реакций ПОЛ и способа инициации окисления липосом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка критериев отбора антиоксидантных средств // Российск. национальная на-учно-практ. конф. «Свободные радикалы и болезни человека», Смоленск, 19-22 сентября 1999 г. Сб. трудов.- Смоленск, 1999.- С.74-75 (соавт. Островский О.В., Закрев-ский В.И., Косолапов В. А., Дегтярев А.Н.)

2. Моделирование перекисного окисления липидов in vitro. Применение динитрофенил-гидразина для оценки интенсивности перекисного окисления фосфатидилхолиновых липосом // Вестник Волгоградской медицинской академии. № 6: Сб. науч. тр.- Т.56, вып.6.- Волгоград: Волгоградская медицинская академия, 2000.- С. 130-133 (соавт. Закревский В.И.)

3. Влияние компонентов буферных растворов на перекисное окисление липидов в фосфатидилхолиновых липосомах // Материалы научн. конф., посвященной 125-летию со дня рождения А.А.Ухтомского: Тез. докл.- Волгоград, 2001.- С.30

4. Эффективность действия антиоксидантов и инверсия их антиоксидантного действия в прооксидантное в зависимости от длительности протекания процесса перекисного окисления липидов // Биология — наука 21го века. 5м Пущинская конф. молодых ученых. 16-20 апреля 2001 года. Сб. тезисов.- Пущино, 2001.- С.21-22

5. Антиоксидантные и прооксидантные свойства пробукола в модельной системе. // Вопросы теоретической и практической медицины. Мат. 66-й Республиканской научн. конф. студентов и молодых ученых Башкортостана. Т.2.- Уфа: Здравоохранение Башкортостана, 2001.- С.31

6. Ацетат и лактат усиливают медь-индуцированное перекисное окисление липидов в липосомах // Проблемы медицины и биологии. Часть 3: Сб. научн. работ.- Кемерово, 2001.- С.115

Актуальность работы

Существование живых организмов на Земле (за исключением некоторого количества облигатных анаэробных микроорганизмов) невозможно себе представить в отсутствии кислорода, являющегося неотъемлемым компонентом метаболических процессов в живых клетках. Однако существование организмов в богатой кислородом окружающей среде несет в себе и постоянную угрозу для их существования.

При включении кислорода в процессы жизнедеятельности организмов постоянно в существенном количестве образуются различные активированные производные молекулярного кислорода — активные формы кислорода (АФК). Одновременно, биомолекулы могут легко подвергаться окислению и разрушению под действием АФК. Соответственно, выживание организмов в кислородной среде весьма сильно зависит от предотвращения и репарации окислительных повреждений в организме.

Для ограничения интенсивности свободнорадикальных процессов и уровня окислительных повреждений в живых организмах в ходе эволюции возникла особая анти-оксидантная система (АОС), состоящая из большого числа согласованно работающих специфических ферментов и группы низкомолекулярных природных антиоксидантов. При различных отклонениях от нормального функционирования организма может развиться дисбаланс между интенсивностью продукции АФК и свободнорадикально-го окисления (СРО) и уровнем функциональной активности АОС. Это, в свою очередь, вызывает усиление окислительных повреждений биомолекул, развитие дисфункции клеток и тканей и, в конечном итоге, гибель организма. При патологических состояниях у человека рассмотренный дисбаланс может быть полностью или частично скорректирован применением в качестве лекарственных средств природных или синтетических антиоксидантов.

К настоящему времени накоплен обширный материал о многих тонких механизмах протекания процессов СРО и предложено для медицинского применения значительное число антиоксидантных препаратов. Выяснены некоторые механизмы действия отдельных групп химических соединений, проявляющих антиоксидантные свойства. Выявлены структурные компоненты, наличие которых в молекуле вещества является необходимым или существенным фактором для проявления антиоксидантных свойств. Однако использование разными исследовательскими группами отличающихся подходов для выявления антиоксидантных свойств у химических соединений создает определенные сложности в сравнении результатов. Важнейшей методологической проблемой является отсутствие детально разработанного комплекса систем моделирования СРО in vitro, позволяющего унифицированным образом осуществлять скрининг новых АО с требуемыми свойствами. Важной в этом плане представляется разработка модельных систем перекисного окисления липидов (ПОЛ), с помощью которых можно не только выявлять наличие антиоксидантных свойств у химических соединений в ходе систематических скрининговых исследований, но и изучать одновременно механизм и особенности действия этих веществ в различных условиях протекания процессов ПОЛ.

Применение в таких исследованиях тест-систем с длительным протеканием ПОЛ может позволить выявить отдаленные эффекты АО в условиях, когда с течением времени концентрация АО уменьшается, а интенсивность ПОЛ возрастает. Указанный подход может оказаться полезным для моделирования in vitro поведения АО при длительном окислительном стрессе организма, когда повышенная интенсивность ПОЛ наблюдается на фоне истощения пула АО.

Важно также отметить, что АО способны проявлять прооксидантные свойства. Условия и химико-структурные основы стимуляции СРО под действием АО изучены недостаточно. Основными выявленными на сегодняшний день факторами, определяющими возможность инверсии антиоксидантных свойств, являются концентрация самого АО, концентрация и химическая структура субстрата окисления и наличие в реакционной среде катионов металлов переходной валентности. В то же время вопрос о влиянии продолжительности протекания процесса ПОЛ на возможность возможности проявления прооксидантного действия АО остается открытым.

Понимание взаимосвязи между структурой АО и изменением их свойств в зависимости от временного этапа процесса СРО позволит приблизиться к возможности синтеза и выявления химических соединений с максимально предсказуемыми особенностями антиоксидантных свойств, на основе которых могли бы быть созданы новые лекарственные препараты с антиоксидантным действием.

Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы Волгоградской государственной медицинской академии и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградской государственной медицинской академии (протокол № 4 от 8 декабря 1999 г.).

Цель исследования:

Разработка модельных тест-систем для скрининга и первичной оценки мишеней и особенностей действия антиоксидантов, а также оценка антиоксидантных и проокси-дантных свойств биологически активных веществ различной химической природы.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение и выбрать оптимальный метод оценки интенсивности перекисного окисления липидов в суспензии липосом.

2. Определить условия применения модельных систем перекисного окисления липидов на основе липосом для скрининга лекарственных препаратов антиокси-дантного действия, выявления мишеней и условий проявления антиоксидантной активности.

3. Установить особенности антиоксидантного действия химических соединений в зависимости от природы и свойств функциональных групп, определяющих анти-оксидантную активность соединений, на различных временных этапах перекисного окисления липидов.

4. Выявить у антиоксидантов различной химической природы возможность и условия потери антиоксидантных свойств и их трансформации (инверсии) в проокси-дантные.

Научная новизна работы

Доказано, что изменение концентрации карбонильных соединений, реагирующих с 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ), может быть использовано для оценки интенсивности ПОЛ в липосомальных модельных системах, в том числе при инициации ПОЛ металлами переходной валентности.

Показано, что использование тиобарбитуровой кислоты для определения карбонильных продуктов ПОЛ в целях оценки интенсивности ПОЛ может приводить к неадекватным результатам в случае металло-зависимой индукции ПОЛ.

Впервые обнаружено, что эффективность действия антиоксидантов изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах. Выявлено, что на отсроченных этапах ПОЛ (длительность окисления 24 ч и более) антиоксидантная активность химических соединений может усиливаться, пропадать или инвертироваться в прооксидантную активность.

Впервые установлены характерные особенности динамики изменения эффективности антиоксидантного действия антиоксидантов различной химической природы в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомальной модельной системе.

Практическая ценность работы

Разработанные подходы к построению липосомальных модельных систем ПОЛ и способ оценки интенсивности ПОЛ в липосомах могут послужить основой для создания унифицированного комплекса методов выявления и оценки особенностей антиоксидантного действия веществ различной химической природы в ходе скрининговых испытаний. Описанная нами модельная система ПОЛ в условиях длительно протекающего окисления липосом позволяет выявлять наличие у конкретных антиоксидантов зависимой от длительности периода протекания ПОЛ трансформации (инверсии) антиоксидантных свойств в прооксидантные.

Реализация результатов исследования

Разработанная модельная система используется в исследованиях веществ с анти-оксидантной активностью на кафедре фармакологии и в изучении процессов перекисного окисления липидов на кафедре биологической химии Волгоградской медицинской академии. Методика определения карбонильных продуктов ПОЛ с использованием ДНФГ применяется в учебном процессе на кафедре биологической химии Волгоградской медицинской академии.

Разработанный нами подход к оценке интенсивности ПОЛ в модельных системах оформлен рационализаторским предложением («Способ оценки интенсивности перекисного окисления липидов в липосомах по содержанию карбонильных соединений», удостоверение № 10-2001 от 6 февраля 2001 г., выданное Волгоградской медицинской академией). Разработаны методические рекомендации «Выявление и оценка особенностей антиоксидантного действия химических соединений в модельной системе на основе липосом» (утверждены 5 июля 2001 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модельная система длительно протекающего процесса ПОЛ на основе суспензии фосфатидилхолиновых липосом с использованием различных инициаторов окисления и оценкой уровня ПОЛ по содержанию карбонильных соединений, реагирующих с ДНФГ, может служить тест-системой для скринингового выявления ан-тиоксидантных свойств у лекарственных препаратов различной химической природы.

2. Эффективность действия антиоксидантных препаратов изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах. Особенности антиоксидантного действия в зависимости от длительности периода окисления определяются химической природой вещества.

3. Антиоксиданты различной химической природы и различного механизма действия обладают способностью к трансформации (инверсии) антиоксидантной активности в прооксидантную.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии», посвященной 100-летию кафедры биохимии Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 15 - 17 октября 1998 г.); на Российской национальной конференции с международным участием «Свободные радикалы и болезни человека» (Смоленск, 19 - 22 сентября 1999 г.); на научной сессии сотрудников Волгоградской медицинской академии (Волгоград, 5 - 9 октября 1999 г.); на научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения А.А. Ухтомского (Волгоград, 16 - 17 января 2001 г.); на 5-й Пущинской открытой конференции молодых ученых «Биология — наука 21-го века» (Пущино, 16 - 20 апреля 2001 г.); на конференции «Проблемы медицины и биологии» Кемеровской государственной медицинской академии (Кемерово, 19-20 апреля 2001 г.); на 66-й Республиканской конференции студентов и молодых ученых Башкортостана (Уфа, 26 апреля 2001 г.); на заседаниях Волгоградского отделения Биохимического общества РАН в 1999 - 2001 гг.

Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр фармакологии и биологической химии Волгоградской государственной медицинской академии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, главы обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 195 источника, из них 39 отечественных и 156 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 21 рисунком.

Выводы

1. Разработана простая и доступная химическая модельная система для выявления антиоксидантной активности и первичной оценки особенностей антиоксидантного действия лекарственных препаратов различной химической природы в зависимости от длительности периода окисления в экспериментах in vitro.

2. Определение концентрации карбонильных соединений, реагирующих с 2,4-динитрофенилгидразином, является простым и воспроизводимым способом оценки интенсивности ПОЛ в липосомальных модельных системах, в том числе при инициации ПОЛ металлами переходной валентности. Использование тиобарбитуровой кислоты для определения продуктов ПОЛ в присутствии металлов переменной валентности приводит к неадекватной оценке интенсивности ПОЛ.

3. Разработан метод скрининга веществ различной химической природы с целью выявления антиоксидантных свойств и уточнения особенностей антиоксидантного действия с использованием модельной системы на основе суспензии фосфатидил-холиновых липосом при различной длительности окисления липосом. Продолжительное окисление липосом (24 ч и более) позволяет обнаружить особенности антиоксидантного действия веществ, не выявляющиеся при малой длительности протекания процессов ПОЛ.

4. Эффективность действия изученных фармакологически активных веществ с анти-оксидантным действием существенно изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах и зависит от химической природы антиоксиданта, его концентрации и интенсивности ПОЛ, задаваемой способом инициации окисления липосом.

5. Липофильные антиоксиданты фенольной природы более эффективно подавляли накопление карбонильных продуктов ПОЛ при автоокислении липосом, чем при Cu-индуцированном окислении. Эффективность антиоксидантного действия фе-нольных липофильных антиоксидантов достигает максимума на поздних (24 ч) этапах окисления.

6. Липофильные вещества, содержащие ненасыщенные связи, проявляют максимальную эффективность на раннем этапе ПОЛ (1 ч окисления), и их антиоксидантное действие при Cu-индуцированном окислении более выраженно, чем при автоокислении.

7. Содержащие серу гидрофильные антиоксиданты наиболее эффективно подавляют ПОЛ на раннем этапе процесса (1 ч окисления). На более поздних этапах антиок-сидантное действие таких веществ исчезает.

8. Карбоновые кислоты, способные образовывать комплексы с катионами металлов, в зависимости от их концентрации и от условий протекания процесса ПОЛ проявляют как анти-, так и прооксидантное действие. Наибольшая эффективность антиоксидантного действия комплексообразующих карбоновых кислот наблюдается при средней длительности окисления (3 и 6 ч).

9. Трансформация (инверсия) антиоксидантного действия химических соединений в прооксидантное действие наблюдается на отсроченных этапах ПОЛ (длительность окисления 3 часа и более с момента инициации окисления). Проявление инверсии зависит от химической природы и концентрации антиоксиданта, интенсивности протекания реакций ПОЛ и способа инициации окисления липосом.

Заключение

Первичный скрининг АО, перспективных для использования в качестве лекарственных средств, является достаточно актуальной и важной проблемой. Это связано, в частности, с тем, что окислительный стресс (а точнее, нарушение окислительно-антиоксидантного баланса в организме), наблюдается практически при всех заболеваниях человека и, соответственно, рассматривается сегодня в качестве неспецифического патологического процесса. Однако отсутствие унифицированного подхода к первичному анализу антиоксидантных свойств химических соединений заметно затрудняет сравнение полученных в различных экспериментах результатов. Важным аспектом проблемы является и тот факт, что эффективность действия одного и того же АО существенно различается в зависимости от выбора субстрата окисления и способа инициации ПОЛ. Более того, появление экспериментальных данных о возможности в определенных условиях прооксидантного действия АО подразумевает необходимость еще при скрининге попытаться выявить наличие и условия трансформации (инверсии) антиоксидантных свойств вещества в прооксидантные.

Одним из решений данной проблемы было бы использование унифицированной МС ПОЛ строго контролируемого и регулируемого состава, что позволило бы при незначительных вариациях аналитической процедуры использовать широкий спектр субстратов окисления и способов индукции ПОЛ. На основе анализа большого количества опубликованных данных, мы предложили использовать в качестве основы такой МС фосфатидилхолиновые липосомы, полученные методом инжекции, инициируя окисление липосом термически или солями меди, а интенсивность протекания процесса ПОЛ оценивать по накоплению карбонильных продуктов ПОЛ.

Наиболее широко используемым методом анализа карбонильных продуктов ПОЛ является определение содержания веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ВР-ТБК). Однако проведенные нами эксперименты продемонстрировали, что количество определяемых ВР-ТБК существенно зависит от наличия в среде катионов переходных металлов, а сама ТБК в ходе анализа может непосредственно взаимодействовать с катионами меди. Соответственно, результаты, получаемые данным методом, могут привести к неадекватной оценке уровня ПОЛ в присутствии катионов переходных металлов. Следовательно, при использовании МС ПОЛ с металлоиндуцированным окислением (а это один из наиболее распространенных способов инициации окисления в МС) применение для оценки уровня ПОЛ определения ВР-ТБК нецелесообразно.

В последующих экспериментах мы показали, что для оценки ПОЛ при различных условиях инициации может быть применен другой реактив на карбонильные соединения — 2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ). Наши данные показали, что, в отличие от ТБК, ДНФГ не взаимодействует с катионами переходных металлов, карбонильные соединения, реагирующие с ДНФГ, присутствуют в окисленных липосомах в достаточных количествах, а динамика накопления ДНФГ-реактивных веществ в липосомах качественно сходна с таковой для других продуктов ПОЛ (ВР-ТБК, кротоновый альдегид, конъюгированные диены), то есть адекватно отражает ход окисления липидов. Учитывая специфичность ДНФГ-метода и полноту обнаружения карбонильных продуктов окисления различных видов липидов с его использованием, а также простоту и малую трудоемкость выполнения анализа и доступность реактивов, мы рекомендуем применять метод определения ДНФГ-реактивных карбонильных соединений для оценки ПОЛ в МС.

Изменение концентрации карбонильных соединений в ходе окисления в суспензии липосом было различным в зависимости от использованного способа инициации ПОЛ. Так, при автоокислении концентрация карбонильных соединений незначительно изменялась в первые часы процесса, существенно возрастая к 24-му часу инкубации и достигая максимального значения после 72 ч окисления. Добавление к инкубационной среде солей меди значительно усиливало накопление карбонильных соединений в течение первых 24 ч. При использовании для инициации окисления системы 2+

Cu + H2O2 мы наблюдали еще более интенсивное накопление карбонильных соединений в первые часы инкубации, а максимум их концентрации достигался уже после 24-часового окисления. Дальнейшие наши опыты показали, что интенсификация образования карбонильных продуктов ПОЛ вызывалась наличием ацетат-аниона. Концентрация образующихся карбонильных продуктов ПОЛ, кроме того, линейно зависела от концентрации фосфолипида в суспензии липосом до концентрации 2,38 мг липи да/мл суспензии.

Определенной проблемой оказалось закисление суспензии липосом в ходе длительного окисления, наиболее выраженное в условиях автоокисления, поскольку нам не удалось подобрать вещества, которое могло бы служить основой буферного раствора и при этом не влияло бы на интенсивность ПОЛ. Однако, на основании полу-ченныгх нами данных, мы считаем, что незабуференная суспензия фосфатидилхоли-новых липосом может служить основой МС для изучения ПОЛ в ходе длительного окисления (до 24 ч при автоокислении и до 48 ч при медь-зависимой индукции ПОЛ).

Используя предложенную МС ПОЛ (незабуференная суспензия липосом, подвергнутая автоокислению или медь-индуцированному окислению в течение 24 ч, интенсивность ПОЛ в которой определяли по содержанию карбонильных соединений, реагирующих с ДНФГ) мы изучили особенности влияния на интенсивность ПОЛ нескольких веществ различной химической природы с антиоксидантными свойствами, входящих в состав лекарственных средств.

Результаты наших экспериментов вымвили две существенный особенности действия АО в предложенной нами МС ПОЛ.

Во-первыгх, у большинства из изученных АО мы обнаружили неизвестное ранее явление трансформации (инверсии) антиоксидантных свойств в прооксидантные в условиях длительного окисления липосом (3 часа и более). Проявление такой инверсии зависело как от концентрации самого АО, так и от интенсивности процесса ПОЛ. По нашему мнению, вероятность возникновения инверсии действия АО может определяться соотношением концентраций неизмененного АО, промежуточных и конечный продуктов окисления АО, реакционноспособностью радикальных продуктов окисления АО и скоростью зарождения новых цепей окисления липидов, однако выяснение тонких механизмов и закономерностей описанного явления требует проведения специальных углубленных исследований. Явление инверсии антиоксидантного действия было выявлено нами у АО различной химической природы — фенолов ионола и пробукола, флавоноида кверцетина, полиненасыщенных витаминов ретинола ацетата и эргокальциферола, тиола глутатиона и карбоновых винной и янтарной кислот.

Другой важной особенностью влияния АО на интенсивность ПОЛ в нашей МС оказался тот факт, что для АО различной химической природы была показана различная зависимость эффективности антиоксидантного действия от длительности окисления липосом, причем эта зависимость существенно отличалась при конкретных способах инициации ПОЛ.

Так, липофильные АО фенольной природы (ионол, пробукол, кверцетин) в общем случае более эффективно подавляли накопление карбонильных продуктов ПОЛ при автоокислении липосом, чем при их медь-индуцированном окислении. Если концентрация этих АО была достаточной для эффективного подавления ПОЛ, то степень их антиоксидантного эффекта постепенно возрастала, достигая максимальных значений на наиболее отсроченных этапах окисления. В противном случае эффективность фенольных АО возрастала лишь до определенного момента, после чего их антиокси-дантные свойства полностью исчезали или трансформировались в прооксидантные.

Липофильные вещества, содержащие несколько ненасыщенных связей (ретинола ацетат, эргокальциферол), были наиболее эффективны на раннем этапе ПОЛ (после 1-часового окисления липосом), причем их ингибирующее действие в отношении накопления карбонильных соединений было сильнее при медь-индуцированном окислении липосом, чем при автоокислении. При дальнейшем развитии процесса ПОЛ такие вещества постепенно теряли антиоксидантные свойства, а впоследствии начинали стимулировать накопление карбонильных продуктов ПОЛ в липосомах.

Тиолы глутатион и унитиол также наиболее эффективно подавляли накопление карбонильных продуктов ПОЛ после 1-го часа окисления. На более поздних этапах ПОЛ тиолы практически полностью теряли антиоксидантную активность либо начинали проявлять прооксидантные свойства. Сходная с тиолами динамика эффективности антиоксидантного действия была обнаружена у аминосульфокислоты таурина, механизм антиоксидантного эффекта которой к настоящему моменту еще не выяснен.

Характерные особенности антиоксидантного эффекта на различных временных этапах ПОЛ были обнаружены у карбоновых кислот, способных образовывать комплексные соединения с медью. В общем случае, комплексообразующие карбоновые кислоты (янтарная, винная, лимонная) были более эффективны при стимуляции ПОЛ липосом ацетатом меди в сравнении с инициацией ПОЛ сульфатом меди. Эффективность действия изученных кислот повышалась с увеличением их концентрации. Двухосновные кислоты (винная и янтарная) во многих случаях проявляли прооксидантное действие, а наибольшая антиоксидантная активность была обнаружена у них при индукции ПОЛ ацетатом меди в присутствии H2O2 на промежуточных этапах окисления (после 3 и 6 ч инкубации). Трехосновная лимонная кислота, имеющая существенно более высокую константу устойчивости комплекса с медью, существеннее подавляла накопление карбонильных продуктов ПОЛ в липосомах и ни в одном случае не продемонстрировала прооксидантного действия.

Говоря о влиянии карбоновых кислот на процессы ПОЛ нельзя обойти вниманием тот факт, что янтарная и лимонная кислоты в организме человека и животных вовлечены в функционирование цикла Кребса и обнаруживаются в клетках в относительно выскоих концентрациях. Обнаруженные нами про- и антиоксидантные эффекты, а также данные о прооксидантном действии аниона уксусной кислоты могут в определенной степени стимулирувать пересмотр взглядов об участии тех или иных клеточных метаболитов в усилении и подавлении реакций ПОЛ in vivo.

Таким образом, полученные нами данные позволили показать возможность применения разработанной нами МС ПОЛ для выявления и оценки особенностей действия как липофильных, так и гидрофильных АО, на длительно протекающий процесс ПОЛ и расширить представления об особенностях влияния на интенсивность ПОЛ АО различной химической природы.

Основываясь на результатах проведенных нами экспериментов, мы рекомендуем использовать МС на основе фосфатидилхолиновых липосом с инициированием окисления температурным воздействием и добавлением солей меди в присутствии H2O2 и с оценкой интенсивности ПОЛ по содержанию карбонильных соединений, взаимодействующих с ДНФГ, для скрининговых исследований по выявлению антиокси-дантных свойств у веществ различной химической природы. При этом для адекватного заключения о наличии у вещества антиоксидантных свойств, выявления возможной инверсии антиоксидантных свойств и предварительного заключения об отдаленных эффектах АО эксперименты должны проводиться при длительности окисления липосом не менее 24 ч с измерением содержания карбонильных соединений в липосомах через 1, 3, 6 и 24 ч от момента инициации окисления.