Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медико-биологических исследований

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

ХАИДУКОВ Сергей Валерьевич

На правах рукописи

МНОГОЦВЕТНЫЙ АНАЛИЗ В ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика, 14.00.36 - аллергология и иммунология

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2008

003456601

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Тотолян Арег Артемович

доктор биологических наук профессор Полевщиков Александр Витальевич

доктор биологических наук профессор Зыбина Наталья Николаевна

Ведущая организация:

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «25» декабря 2008 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 2005.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

Диссертация в виде научного доклада разослана « » 2008 г.

М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. За последние годы проточная цитометрия становится одним из наиболее востребованных методов, как для фундаментальных исследований, так и для диагностики в клинико-иммунологической практике. Расширилась приборная база, и значительно увеличились возможности анализа клеток иммунной системы, позволяющие охарактеризовать не только качественные и количественные параметры основных популяций клеток, но и их более широкий субпопулядионный состав. Используя различные методологические подходы и новую реагентную базу, при помощи проточной цитометрии стало возможным оценивать функциональные свойства популяций и субпопуляций клеток иммунной системы. Значительно расширились возможности для диагностики иммунодисфункций, аллергии, специфических Т-эффекторов и многое другое (Mandy F.F. et al, 2003; Boumiza R. et al., 2005; He X.H. et ai., 2006).

Логика развития современной технической, методологической и идеологической базы проточной цитометрии формируется на основе очень широких возможностей современных приборов. Оснащенные гибким программным обеспечением, они способны одновременно анализировать колоссальное количество клеток, идентифицировать отдельные их группы, классы, популяции, субклассы, субпопуляции и т.д., измерять их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивать их функциональное состояние (Shapiro Н.М. 2003).

Развитие современных клеточных технологий и разнообразие новых методологических подходов к исследованиям, связанным с использованием проточной цитометрии в биологии и медицине, поставило целый ряд вопросов о стандартизации данного метода. Эти вопросы особенно важны как для врачей лабораторной диагностики, так и для ученых и специалистов (Луговская С.А. и др., 2005; Gallego A. et al., 2003; Luider J. et al., 2004).

Столь высоко информативный инструмент анализа создает предпосылки для появления множества новых методологических подходов для диагностики различных клеточных дисфункций. Например, уже сейчас 4-5 параметрический анализ позволяет выявить не только ту или иную субпопуляцию клеток, но и ее функциональную активацию или депрессию. В то же время, если увеличить анализ до 9-15 параметровой системы оценки рецепторов клеток, появляется возможность значительно более углубленного анализа, который оправдан для научных исследований, но с точки зрения практической медицины такой подход навряд ли применим, поскольку связан со значительными методологическими трудностями. Именно поэтому возникла необходимость остановиться на тех методологических подходах, которые позволяют по-новому взглянуть на динамическую систему взаимодействия клеток иммунной системы во всем ее разнообразии с четкой характеристикой субпопуляций клеток.

Цель работы. Обосновать методологию, критерии и направления применения многоцветного цитометрического анализа субпопуляций лимфоцитов в медико-биологических исследованиях и оценить их эффективность.

•s

■J Ч

Задачи исследований:

1. Разработать критерии применения многоцветных параметров для иммунофено-типирования клеток на основе стандартизации протоколов исследований в проточной цитометрии.

2. Экспериментально обосновать возможные пути применения и расширения спектра исследований с использованием многоцветного анализа в проточной цитометрии.

3. Обосновать и оценить эффективность применения многоцветного анализа при изучении фенотипа лимфоцитов для лабораторной диагностики нарушений иммунного статуса человека.

4. На основе применения цитометрического анализа разработать алгоритм использования панели для скрининговых исследований и расширенной панели для более углубленного анализа при выявлении отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры которых не попадают в референтные значения.

5. Обосновать методологию использования многоцветного анализа для проведения углубленных научных исследований активности субпопуляций лимфоцитов.

Научная новизна исследований.

Впервые предложен алгоритм оптимизации работы на проточных цитометрах от пре-аналитического, аналитического до пост-аналитического этапов исследований, позволивший разработать критерии стандартизации методов исследований. На их основе разработаны критерии включения тех или иных параметров исследований клеток для практического использования.

Экспериментально обоснованы современные подходы к расширению спектра исследований с учетом использования многоцветного анализа в клинической и научно-исследовательской практике.

Обоснована возможность оценки функциональной активности клеток иммунной системы в процессе их дифференцировки при воздействии различных химических соединений (например, к действию кальциевых ионофоров).

Предложена и внедрена многопараметрическая панель моноклональных антител к различным кластерам дифференцировки, которая охватывает большинство лимфоцитов периферической крови и включает степень активации различных субпопуляций Т-клеток, В-клеток и Ж-клеток, что позволяет более точно диагностировать наиболее часто встречающиеся нарушения иммунной системы. Данная панель включает: 1§0/^0/1§0/СВ45 - изотипический контроль С019/СВ5/С027/С045 - В1, В2, В-клетки памяти СШ6/С056/СБЗ/СВ45 - субпопуляции Ж-клеток СП8/ТЮ4/СОЗ/СБ45 - субпопуляции Т-клеток

СВ8/С038/СБЗ/СВ45 - активированные Т-цитотоксические и ЫК-клетки СБ4/С025/НЬА-0К/СВ45 - активированные Т хелперы СВ45КА/СВ45К0/СВ4/СБ45 - активированные Т хелперы и Т-клетки памяти ТСЯ-а|3/ТС11-у5/СВЗ/СП45 - а(3- и у5-Т-клетки СБ4/С025/С0127/СВ45 - регуляторные Т-клетки.

Предложенные подходы позволили повысить качество диагностики нарушений иммунного статуса и значительно расширили возможности исследования клеток иммунной системы в норме и патологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Разработанный алгоритм оптимизации настройки приборов и создания протоколов для многопараметрического анализа применим при работе на большинстве проточных питометров ведущих фирм производителей, и может быть использован для стандартизации исследований и разработки критериев включения новых параметров для исследования клеток иммунной системы.

2) Среднестатистические значения параметров иммунного статуса условно здоровых лиц в различных регионах России сопоставимы со среднестатистическими значениями параметров иммунного статуса человека, опубликованными в литературе.

3) Введение в первичную панель скринигового исследования иммунной системы антител для выявления аутореакгивных клонов В-клеток (С019,С05) улучшает диагностику и мониторинг за пациентами с аутоиммунными заболеваниями.

4) При наличии отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры которых не попадают в референтные значения в ходе скрининговых исследований иммунной системы человека, необходимо проведение дополнительных исследований с оценкой некоторых минорных субпопуляций лимфоцитов и анализа функциональных характеристик клеток.

5) В клинико-диагностической практике наиболее предпочтителен четырехцветный цитометрический анализ по сравнению с двух- и трехцветным, что дает возможность получать достоверные данные, характеризующие как субпопуляционный состав, так и ряд функциональных параметров иммунокомпетентных клеток при уменьшении количества образцов и времени, затраченного на получение конечного результата.

6) Изменение репертуара поверхностных рецепторов СБ4+ Т лимфоцитов в процессе активации и дифференцировки сопровождается резистентностью их к действию кальциевых ионофоров.

Практическая значимость работы. Разработанные подходы, предложенные в работе, предназначены и используются для стандартизации исследований в проточной цито-метрии, в качестве алгоритмов оптимизации исследований отдельных субпопуляций и комплексной оценки клеток иммунной системы в повседневной практике клинико-диагностических и научно-исследовательских лабораторий, оснащенных современными приборами.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс обучения врачей на курсе клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии Росздрава, Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. академика И.П. Павлова; в работу научно-исследовательских лабораторий Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва), ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова (Москва), ФГУЗ «Всероссий-

сюм цетр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России (Санкт-Петербург), ММА им. И.М. Сеченова (Москва), Пятигорского ГНИИ курортологии, и ряде других.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы апробированы как на отечественных, так и на международных симпозиумах и конференциях: Первый Всесоюзный иммунологический съезд (Сочи, 1989); 11th Meeting of European Federation of Immunological societies. (Espoo, Finland. 1991); 8Ih International Congress of Immunology, (Budapest, Hungary, 1992); 5th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens (Boston, USA, 1993); 6th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens, (Kobe, Japan, 1996); Fourth International Symposium on Clinical Immunology (Amsterdam, Holland 1997); 10 International Congress of Immunology (New Delhi, India, 1998); John HUMPHRY Advanced Summer Program in Immunology (Pushchino, 1998, 2000, 2002, 2004); The 8th Annual Meeting of Tissue Engineering Society International, (Shanghai International Conventional, P.R. China, 2005); "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2007); 2-я конференция "Иммунология репродукции" (Сочи, 2007); Симпозиум "Иммунология слизистых оболочек и аллергология: теория и практика" (Анталия, Турция, 2007); XX Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2008).

Личный вклад автора в работу. Диссертационная работа является результатом многолетних (1986-2008 гг.) исследований но изучению механизма функционирования иммунной системы человека и животных при помощи метода проточной цитометрии и различных флуоресцентных зондов. Все результаты получены лично автором или при его непосредственном участии. Доля личного участия в совместных публикациях пропорциональна числу соавторов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 89 работ, в том числе 3 монографии, 82 работы опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Пациенты. При скрининговом исследовании использовали для анализа периферическую кровь 356 условно здоровых лиц.

Для исследования гомеостаза ионов кальция у CD4+ Т лимфоцитов в процессе их активации и дифференцировки in vivo использовали кровь лиц, показатели иммунного статуса которых соответствовали нормам для здоровых людей. Было обследовано 112 человек.

Для оценки активности и количества, различных субпопуляций клеток иммунной системы было обследовано 214 человек с заболеваниями, в основе которых лежат иммунные механизмы (аутоиммунный тиреоидит, ревматоидный артрит и др.).

Выделение клеточных популяций и реагенты для исследования. Фракцию мо-нонуклеаров выделяли из венозной крови доноров центрифугированием на Ficoll-Paque. Клетки инкубировали с иономицином при 37° в течение 10 мин в среде Хенкса с 1% ФСК. После инкубации с иономицином клетки промывали ФСБ с 5% ФСК для удаления Са2+-ионофора. Чувствительные и резистентные к иономицину Т-клеткн разделяли на Ficoll-Paque (d = 1,077 г/смЗ). Чувствительные к иономицину клетки не сохраняли жизнеспособность после обработки иопофором. Фракцию иономицин-резистентных (ИР-фракция) клеток собирали с поверхности Ficoll-Paque, окрашивали МЛ.

В работе использовали среду Хенкса, брефелдин А, ФСК, ФСБ, ДМСО, ФМА, СопА, ФГА и культуральный пластик фирмы ICN (США), иономицин и гепарин (Calbiochem, Швейцария), Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция). Все используемые в работе моноклональные антитела (МА) получены от фирмы Beckman Coulter (США).

Проточная цитофлуориметрия. Для разработки алгоритма настройки цитомет-ров, создания протоколов и последующего анализа были использованы контрольный материал ImmunoTrol, ImmunoTrol Low (Beckman-Coultcr, США) и цельная периферическая кровь, полученная от условно здоровых лиц. Для окрашивания клеток использовали следующую панель МА меченых FITC (изотиоцианат флуоресцеина), РЕ (фикоэритрин), РС5 (комплекс РЕ с цианином-5), ECD (комплекс РЕ с техасским красным) или РС5 (комплекс РЕ с цианином-7): CD4, CD5, CD8, CD 14, CD 19, CD25, CD26, CD27, CD29, CD38, CD45, CD45RA, CD45R0, CD62L, CD69, CD95 CD 127, CD234, CD294, yS-TCR, otß-TCR, Vßl-TCR, Vß2-TCR, VßI4-TCR и HLA-DR (Beckman Coulter, США). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили по безотмы-вочной технологии с использованием следующих лизирующих растворов: OptiLyse С, OptiLyse В, LmmunoPrep и Whole Blood Lysing Reagents (Beckman Coulter, CILIA).

Для анализа окрашенных клеток и настройки были использованы следующие проточные цитометры: EPICS XL, EPICS XL-MCL, EPICS "Elite", EPICS "Altra", Cytomics FC500, Cytomics FC500 MPL (Beckman Coulter, США), FACSCalibur (Becton-Dickinson, США) и PAS-III (Partee GmbH, Германия).

Дтя корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности живым лимфоцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию и CD45. Математическую обработку цитометрических данных проводили при помощи программ ЕХРО-32 и СХР v. 2.2 (Beckman Coulter, США). В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Абсолютные значения получены как в одноплатформенной (с помощью реагента Flow Count (Beckman Coulter, США)), так и в двухплатформенной (с использованием результатов гематологического анализа) системах.

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием стандартного пакета прикладных программ «Statistic for Windows 6.0». Полученные данные обрабатывали дискриптивными методами и представляли в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (М±т).

Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине.

Проточная цитометрия как современная технология быстрого измерения характеристик клеток появилась в результате естественного развития традиционных гистохимических и цитохимических методов анатиза. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т д.

Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики:

- во-первых, этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитометрии связано в первую очередь с анализами по фенотипу;

- во-вторых, это способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10'5-10"7, что возможно благодаря огромной производительности. Так, современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 100000 клеток в секунду.

Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволила исследователям судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). В свою очередь, это привело к возможности типировать клетки без применения флуоресцентных красителей, что особенно ценно при работе с периферической кровью. Данный подход позволяет разделить и расположить в виде гистограммы лейкоциты периферической крови на три группы клеток - лимфоциты, моноциты и гранулоциты (Bossuyt X. et al., 1997).

Развитие гибридомной технологии привело к тому, что у исследователей появился в руках такой инструмент, как моноклональные антитела. MA предоставили возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных клеток и их функционального состояния (Leucocyte typing VI., 1997). В настоящее время известно 339 кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation, CD) клеток человека (Zola H., et al., 2005).

Использование MA, напрямую меченых различными флуорохромами, позволило значительно повысить информативность цитометрического анализа за счет много-цветности. Поскольку современные цитометры, как правило, оборудованы более чем тремя фотоэлектронными умножителями (от 3 до 12 ФЭУ), это позволяет на одном образце периферической крови анализировать практически все основные субпопуляции клеток.

Высокий уровень автоматизации, простота в эксплуатации, небольшие размеры современных приборов, их высокая точность, специфичность и воспроизводимость

результатов позволяют использовать их не только как исследовательские, но и как клинико-диагностические.

Перечисленные возможности метода проточной цитометрии определяют клинические и общебиологические области его применения. К первой относятся - иммунология, онкология, онкогематология (включая диагностику, оценку эффективности лечения и мониторинг пациентов, входящих в группу риска), трансплантология, общая гематология и др. Ко второй - клеточная кинетика, клеточная энзимология, клеточная физиология, генетика и др.

Процесс развития иммунного ответа организма на проникновение инфекции или какие-либо другие воздействия сопровождается значительными изменениями субпо-пуляционного состава иммунокомпетентных клеток. Это относится как к изменению абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, их субпопуляционного состава, так и к появлению на клеточной поверхности определенных функциональных молекул. Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров. Таким образом, одним из эффективных механизмов иммунорегуляции является модуляция экспрессии функционально значимых молекул. В свою очередь, не менее важным является и изменение абсолютных количеств иммунокомпетентных клеток в периферической крови.

Определение субпопуляционного состава или фенотипа лимфоцитов в настоящее время является важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении процессов, происходящих в организме. Под фенотипом следует понимать совокупность функционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий дифференцировки, пролиферации, активации или программируемой клеточной гибели (апоптоза). Относительное и абсолютное количество клеток, имеющих тот или иной фенотип, как раз и является конечным результатом иммунофенотипирования.

При подтвержденной ВИЧ инфекции на «абсолютном содержании СБ4+ Т-клеток в единице объема» построена система стадирования течения заболевания, что является одним из основных критериев назначения антиретровирусной терапии.

Иммунофенотипирование позволяет судить о типе клеток и их функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров. В отличие от флуоресцентной микроскопии, метод проточной цитометрии позволяет наиболее полно и наиболее корректно оценить иммунофенотип пациентов. Иммунофенотипирование с использованием многоцветного анализа особенно важно для характеристики высоко специализированных субпопуляций лимфоцитов, таких как клетки иммунологической памяти, антиген-специфические, регуляторные Т клетки и субтипы КК-клеток.

Очень важным разделом для биологии и медицины при появлении новых методик исследования является формирование нормативных показателей. Не является исключением и проточная цитометрия. Проведенные исследования условно здоровых лиц в различных регионах России с использованием скрининговой панели позволили определить среднестатистические значения параметров иммунного статуса человека. Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о близости среднестатистических пара-

метров иммунного статуса условно здоровых лиц к данным в отечественной и зарубежной литературе (Zidovec Lepej S., et al., 2003, Pope V., et al., 1994, Comans-Bitter W.M., et al„ 1997).

Таблица 1. Среднестатистическое содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови взрослых условно здоровых лиц полученное в результате скринингового исследования ^ = 362).

Субпопуляции лимфоцитов Относительные количества Абсолютные количества (кл./л)

Лимфоциты (CD45bl1ght) 32 ±4%* 1,363-2,808 x 10"

Т-клетки (CD3+,CD19-) 73 ± 12% 0,946-2,079 x lO5

Тхелперы(С03+,С04+) 45 ± 10% 0,576-1,336x 10"

Т хелперы активированные/памяти (CD3+, CD4+, CD45R0+, CD29") 15 ± 10% 0,068-0,702 x 10°

Т хелперы наивные (CD3+,CD4+,CD45RA+) 30 ± 10% 0,272-1,123 x 10'

Т цитотоксические (CD3+,CD8*) 27 ± 8% 0,372-0,974x 10"

Т-клетки активированные (CD3+, HLA-DR+, CD25+, CD38~) 3 ± 3% 0,007-0,165x 10'

T-NK клетки (CD3T, CD 16", CD56+) 3 ± 3% 0,007-0,165 x 10s

В-клегки (CD3\ CD19+, CD20+, HLA-DR^ 12 ±5% 0,111-0,376 x 10"

NK-клетки (LGL) (CD3", CD16+, CD56+,CD38±, CDS') 13 ±5% 0,123-0,369x 10'

Индекс соотношения CD4+/CD8+ 1,5-2,6

* Относительные и абсолютные количества лимфоцитов определяли от общего количества лейкоцитов. Относительные и абсолютные количества субпопуляций Т-, В-, и Ж-клеток определяли от общего количества лимфоцитов.

Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофено-типирования. Оптимизация настройки цитометров и подготовка протоколов для анализа.

Иммунофенотипирование позволяет охарактеризовать клетки при помощи МА и дает возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того иди иного набора клеточных маркеров. Однако следует учитывать, что многие маркеры могут одновременно экспрессироваться на различных типах клеток и определять их начи-чие следует в режиме не менее чем двухцветного анализа, а типирование лейкозов желательно проводить в четырех- и более цветном анализе (Nagata Н., et al., 2001; Claude L., et al., 2005).

В настоящее время все большее количество клинико-диагностических лабораторий используют метод проточной цитометрии для определения иммунного статуса пациентов, диагностики лимфопролиферативных заболеваний и многих других важных параметров иммунной системы. Однако, отсутствие стандартных подходов к настройке цитометров, созданию протоколов для исследования и подготовке образцов для анализа по-прежнему делает метод проточной цитометрии достаточно субъективным и, в значительной степени, зависимым от опыта оператора.

В процессе цитометрического анализа могут быть допущены ошибки на разных этапах. Во-первых, цитометр должен находиться в рабочем состоянии и проходить все тесты проверки его работоспособности. Во-вторых, протоколы конкретного анализа должны быть правильно настроены. Данная процедура не зависит от типа прибора, поскольку процедуры подготовки инструментов для соответствующего анализа осуществляются практически по одному и тому же алгоритму. В-третьих, на конечный результат значительное влияние оказывает использование некачественных реагентов или реагентов с истекшим сроком годности. И, наконец, в-четвертых, на результат оказывают влияние ошибки, допущенные в ходе подготовки образца для анализа.

Одним из наиболее важных этапов при проведении стандартной процедуры анализа фенотипа клеток 1ПСЧ является правильность настройки протоколов для конкретных типов анализа.

Данный этап состоит в следующем: настройка дискриминатора, настройка параметров светорассеяния, настройка параметров чувствительности фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для флюоресценции, введение коэффициентов компенсации.

А Б

ЭЭ Уп Уп

Рис. 1. Пример использования дискриминатора для удаления из зоны анализа частиц, не соответствующих клеткам по параметрам светорассеяния. А - анализ образца в отсутствии дискриминатора; Б - анализ образца при включенном дискриминаторе.

Оптимизация настройки дискриминатора. Современные цитометры обладают высокой чувствительностью по малоугловому светорассеянию, т.е. по размерам исследуемых частиц (чувствительность достигает 0,1 мкм), поэтому они регистрируют множество объектов, которые не являются клетками. Особенно это проявляется на образцах, приготовленных по так называемой «безотмывочной» технологии. Наличие в образце множества объектов, которые не являются лейкоцитами, приводит к тому, что цитометр «захлебывается» от обилия данных и это приводит к получению недостоверных результатов. Чтобы избежать этого эффекта, необходимо ввести ограничения по отображаемым на гистограмме событиям, т.е. задать границы чувствительности цитометра. Для этих целей служит дискриминатор. Необходимо ввести такие его значения, чтобы были видны все основные популяции клеток анализируемого образца, а частицы, которые не являются клетками (дебрис), не попадали в зону анализа. Как правило, это ограничение ставится на канал малоуглового рассеяния света (рис. 1). Следует отметить, что слиш-

ком завышенные значения дискриминатора могут убрать из анализа часть интересующей исследователя популяции клеток, поэтому к этому этапу настройки цитометра необходимо подходить со всей ответственностью.

Оптимизация настройки параметров светорассеяния. Как правило, современные цитометры используют два канала светорассеяния: регистрируется сигналы от малоуглового светорассеяния и рассеяния света под углом 90°. Малоугловое светорассеяние (Forward Scatter, FS) представляет собой рассеяние света от поверхности клеток под малыми углами (1-19°) и пропорционально диаметру исследуемого объекта. В свою очередь, канал бокового светорассеяния или рассеяния света под углом 90° (Side Scatter, SS) регистрирует весь свет, рассеянный как самой клеткой, так и ее органел-лами, т.е. характеризует структуру и гранулярность объекта. Таким образом, два вида светорассеяния позволяют регистрировать два морфологических параметра клеток.

» и.

Рис. 2. Распределение клеток периферической крови при оптимальной настройке каналов светорассеяния. Рв -малоугловое светорассеяние; вБ - светорассеяние под углом 90°.

SS Lin

__ — j Монвииты

Использование двух этих параметров позволяет в гетерогенной популяции клеток локализовать все входящие в нее компоненты. Данная процедура производится за счет использования «гейтирования». GATE (ворота) - логически ограниченная область клеток с определенными характеристиками на гистограмме их распределения, позволяющая анализировать события, заключенные исключительно в данную область. Гейтиро-вание (от gating) - введение данных логических ограничений из одной гистограммы в другие. Данная функция позволяет отображать и анализировать события, попадающие исключительно в интересующую нас область.

Примером могут служить лейкоциты периферической крови, состоящие из лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов (рис. 2). При анализе периферической крови необходимо соблюдать правило: все основные популяции клеток должны быть отображены на гистограмме распределения клеток по двум светорассеяниям, что облегчит работу.

Использование морфологических параметров (FS и SS) для локализации лимфоцитов достаточно часто приводит к получению некорректных результатов. Это бывает связано, как правило, с неполным лизисом эритроцитов, попаданием базофилов в зону лимфоцитов и т.д. Для диагностики состояния иммунной системы и ее аномалий более корректным представляется локализация лимфоцитов, опираясь на экспрессию общего для лейкоцитов антигена (CD45) в многоцветном анализе (анализ больше трех

цветов) и многостадийное гейтирование. В последнее время все чаще используется метод локализации лимфоцитов именно по наличию СЭ45.

ш п.

О •

о»

"V

1дС31-Р1ТС !дС1-Р1ТС |дС1-р!ТС

Рис. 3. Примеры настройки каналов флуоресценции. Правильная настройка -негативные клетки находятся в середине первой декады логарифмической шкалы интенсивности флуоресценции (А). Б и В - примеры неправильной настройки цитометра. Б - слишком высокое напряжение на ФЭУ. В - слишком низкое напряжение на ФЭУ.

Оптимизация настройки параметров фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для флюоресценции. После настройки каналов светорассеяния приступают к настройке чувствительности каналов флюоресценции. Этот процесс начинают с анализа негативного контроля, который представляет собой клетки образца, окрашенные неспецифическими антителами, мечеными теми же флуорохромами, с которыми предстоит работать в дальнейшем (изотопический контроль). Негативные клетки должны попадать в первую декаду на логарифмической шкале интенсивности флюоресценции по всем задействованным каналам (рис. ЗА). Необходимо добиться того, чтобы клетки контроля легли, по возможности, в центре первой декады. Следует сразу отметить, что неспецифическое взаимодействие антител различных классов с поверхностью клеток мишеней не одинаково. Исходя из этого, антитела для контрольного образца должны быть того же изотипа и в той же концентрации, что и МА к СЭ маркерам, используемые для анализа.

На рис. ЗБ и рис. ЗВ приведены гистограммы, полученные на цитометрах, настроенных некорректно. Если контрольные клетки попадают во вторую декаду, это, в конечном счете, может привести к ложно-позитивным результатам (рис. ЗБ), а низкая чувствительность приводит к занижению реальных значений (рис. ЗВ). И то и другое при клинико-диагностических исследованиях недопустимо.

Оптимизация введения коэффициентов компенсации. После настройки чувствительности прибора в случае многоцветного анализа возникают проблемы. Даже в случаях использования для анатаза линейных маркеров, таких как СЭ19 и СБЗ, можно увидеть дубль позитивные клетки, хотя они в природе не встречаются. Данный парадокс связан с теги, что спектры, испускаемые флуорохромами, не бывают точечными, а имеют свое распределение в определенном диапазоне. Практически невозможно избежать дополнительного вклада излучения во все ФЭУ, предназначенные для регистрации других флуорохромов, даже если использовать различные наборы барьерных светофильтров. Таким образом, необходимо провести вычитание из общей интенсив-

ности флуоресценции на каждом ФЭУ дополнительного сигнала, генерируемого другими флуорохромами. Данное вычитание называется введением в программу анализа коэффициентов компенсации.

ш -W

О

О

> £

MEAN X

Рис. 4. Гистограмма распределения клеток периферической крови иллюстрирующая первое правило введения коэффициентов компенсации.

CD3-FITC

В процессе анализа регистрируегся ряд статистических параметров, среди которых есть такое значение как MEAN (рис 4). Этот параметр отражает среднестатистическое положение максимума пика распределения частиц на гистограммах в выбранном канале флюоресценции или светорассеяния. Для процедуры введения коэффициентов компенсации необходимо использовать клетки, окрашенные антителами, связанными с разными флуорохромами, (например, CD3-F1TC и CD19-PE) и анализировать их в двухпараметрическом режиме. Антитела для этой процедуры подбирают таким образом, чтобы они относились к двум непересекающимся C.D маркерам. Гистограмму разбивают на четыре квадранта, в которых определяют значение MEAN для каждого типа флуоресценции. Первое правило введения коэффициентов компенсации гласит: коэффициенты компенсации введены правильно, если MEAN квадранта 1 равен MEAN квадранта 3 по оси X, a MEAN квадранта 4 равен MEAN квадранта 3 по оси У (рис 4).

Второе правило оптимизации введения коэффициентов компенсации гласит: если мысленно нарисовать линии из центров областей позитивных клеток, то они должны быть приблизительно параллельны осям X и Y или должен образоваться прямоугольник (рис 5).

ш о.

со urea О

Ьяг

10- «Р

Рис. 5. Гистограмма распределения клеток периферической крови иллюстрирующая второе правило введения коэффициентов компенсации.

CD3-FITC

Всегда существует вероятность пере- или недокомленсации. На рис. 6 представлены оба этих случая. При недокомпенсации исследователь может получить завышенный результат и ложно позитивные клетки (рис 6А). При перекомпенсации можно потерять часть позитивных клеток и, как следствие этого, получить заниженный результат (рис 6Б).

MEAN

X CD3-FITC

и*

MEAN X CD3-FITC

Рис. 6. Примеры неправильного использования коэффициентов компенсации. При недокомпенсации (A): MEAN квадранта 4 больше, чем MEAN квадранта 3 по оси У, a MEAN квадранта 1 больше, чем MEAN квадранта 3 по оси X. При перекомпенсации (Б): MEAN квадранта 3 больше, чем MEAN квадранта 4 по оси У, a MEAN квадранта 3 больше, чем MEAN квадранта 1 по оси X.

яте

Рис. 7. Пример оптимизации двухпараметрического анализа ПТС (БЫ) против РЕ (БЪ2) при изменении чувствительности одного из каналов флуоресценции: А -низкая чувствительность по Б - повышение чувствительности по каналу флуоресценции РЬ2 за счет увеличения напряжения на ФЭУ; В - вычитание дополнительного вклада интенсивности флуоресценции МТС за счет увеличения коэффициента компенсации.

Между напряжением на ФЭУ и коэффициентами компенсации существует взаимосвязь. В некоторых случаях, когда используют МА от разных фирм производителей, возникает необходимость изменить чувствительность по одному из каналов флюорес-

ценции. Эта процедура приводит к тому, что изменяется и отображение флюоресценции на двухпараметрических гистограммах. Повышая чувствительность по одному из каналов, необходимо изменить и соответствующий этому каналу коэффициент компенсации. Например, в двухпарамегрическом анализе ИТС против РЕ задействованы два канала флюоресценции (БЫ и РЬ2). Для повышения чувствительности по каналу флюоресценции РЬ2 поднимают напряжение на ФЭУ. При этом наблюдается дополнительный вклад интенсивности флуоресценции БИС в капал РЬ2, который необходимо вычесть за счет увеличения коэффициента компенсации (рис. 7).

Таким образом, алгоритм настройки рабочего протокола выглядит следующим образом: проверка работы цитометра; настройка дискриминатора; настройка каналов светорассеяния; настройка каналов флюоресценции; введение коэффициентов компенсации.

Предложенный подход для настройки проточных цитометров и последующего анализа окрашенных клеток применим к большинству производимых цитометров.

Стандартные настройки и создание протоколов позволяют более корректно проводить анализ как в клинико-диапностических, так и научно-исследовательских целях. В свою очередь, это позволяет- использовать подготовленные протоколы для исследований и включать или исключать те или иные параметры в анализ в зависимости от целей, поставленных перед врачом-лаборантом или научным работником.

Идентификация субпопуляций В-клеток.

При оценке относительного количества и характеристик клеток, участвующих в иммунном ответе на антигены, очень важно иметь представление обо всех типах клеток, участвующих в формировании специфического (адаптивного) иммунного ответа организма на внедрение патогена. При формировании иммунной реакции одна из ведущих ролей принадлежит клеткам тимического происхождения, получивших название Т лимфоциты. В то же время эффекторные механизмы специфической иммуноре-активности обеспечиваются либо эффекторными Т-клетками (Т-эффекторами ГЗТ, цитотоксическими Т-клетками), либо специфическими гуморальными факторами, секретируемые определенной субпопуляцией лейкоцитов. Специфический гуморальный иммунный ответ обеспечивают хорошо всем известные антитела. Они обладают способностью взаимодействовать с внедрившимися микроорганизмами, активировать систему комплемента и стимулировать фагоцитарную активность клеток-фагоцитов, взаимодействуя с их мембранными рецепторами.

Популяцией лимфоцитов, отвечающей за продукцию антител, являются В-клетки. Каждый лимфоцит, относящийся к В-клеткам, запрограммирован на продукцию антител одной-единственной специфичности, и эти антитела присутствуют на его поверхности в качестве рецептора для соответствующего антигена. Один В-лимфоцит несет на своей поверхности примерно 105 идентичных молекул антител. Данные антитела называют поверхностным или мембранными иммуноглобулинами (Робсон А., и др., 2006).

да-i

ш о.

jJ1 12

16.1%10.1% 15.?%¡Í8.0%

Рис. 8 Гистограмма распределения С03 и С019 на лимфоцитах периферической крови. СШ"СБ19+ В-клетки (квадрант Л), СГ)3+С1)1У Т-клетки (квадрант Л4).

G

О

CD3-FITC

Основной формой мембранных иммуноглобулинов являются иммуноглобулины класса М (IgM). Они экспрессируются на мембране всех зрелых В-клеток, которые не имели контакта с антигеном. Однако, на поверхности В-клеток, дифференцировка которых уже завершилась, присутствуют и иммуноглобулины класса D (IgD). В процессе формирования иммунного ответа происходит переключение изотипов мембранных иммуноглобулинов на IgG, IgA, IgE (Ярилин А.А., 1999).

Кроме мембранных иммуноглобулинов, В-клетки экспрессируют целый ряд мембранных маркеров, которые необходимы для формирования В-клеточного рецептора (BCR) и играют важную роль в передаче сигнала в процессе распознавания антигена, а также являются маркерами линейной принадлежности В-клеток, что особенно полезно при идентификации данной популяции лимфоцитов. К таким маркерам, прежде всего, относятся CD19 и CD21. Данные молекулы формируют ко-рецепторный комплекс, в который вовлечен также и CD81 (Hultin L.E., et al., 1993).

CD19 антиген (также известный как В4) представляет собой мембранный глико-протеин, принимающий участие в регулирование развития В-лимфоцитов, их активации и дифференцировки. Эта молекула экспрессируется на всех нормальных В-клетках, включая про-В-лимфоциты, но исчезает у плазматических клеток в процессе их созревания. Молекула CD19 отсутствует на мембране нормальных Т-клеток, NK-клетках, моноцитах и гранулоцитах (рис. 8). В связи с этим данный антиген рекомендуется для количественной оценки общей популяции В-клеток (Huitín L.E., et al., 1993).

CD20 blight CD5«¡m

Рис. 9 Гистограмма распределения CD20 и CD5 на лимфоцитах периферической крови у пациента с ревматоидным артритом.

су 1С-; О

о

CD5-FITC

Кроме перечисленных выше структур, в состав В-клеточного рецепторного комплекса вовлечены и другие молекулы, например CD20 - интегральный не гликозилиро-ванный мембранный белок. Данная молекула является Са2+-каналом и участвует в активации и пролиферации В-клеток за счет регуляции трансмембранной проводимости ионов Са2^. Молекула CD20 присутствует на всех нормальных В лимфоцитах периферической крови, лимфатических узлов, селезенки, миндалин и костного мозга, но отсутствует на плазматических клетках (Hultin L.E., et al., 1993).

Иногда для локализации В-клеток используют CD20, но данная молекула может экспрессироваться в низкой плотности на других популяциях лимфоцитов. Хотя CD20 первоначально был описан как В-клеточный линейный маркер, оказалось, что небольшая субпопуляция Т-клеток человека экспрессирует CD20. Причем, В-клетки экспрессируют CD20 в высокой плотности (CD20bngh'), а Т-клетки в низкой (CD20d,m) и составляют 2.4 -г/- 1.5 % от лимфоцитов периферической крови.

Хотя оценка экспрессии CD20 полезна при характеристике В-клеток, необходимо достаточно осторожно подходить к интерпретации получаемых результатов (рис. 9). Особенно это относится к случаям фенотипирования костного мозга. Сходная проблема может возникнуть при фенотипирования периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом.

В настоящее время среди В-клегок выделяют три основные субпопуляции, а именно: В-1, В-2 и В-клетки памяти. Достаточно важная роль при данном делении отводится молекуле CD5 (рис. 10). CD5 обнаружен на всех зрелых Т-лимфоцитах и на большинстве тимоцитов. CD5 также присутствует на субпопуляциях В-лимфоцитов, но отсутствуег на гранулоцитах и моноцитах. Молекула CD5 является лигандом для CD72 антигена, который присутствует на В-;шмфоцитах. Точная функциональная роль CD5 все еще до конца не изучена, однако для этих молекул была показана физическая ассоциация с антиген-специфическим рецепторным комплексом как на Т-, так и на В-лимфоцитах и возможность модулировать передачу сигналов через этот комплекс. В последние годы было показано, что CD5 может быть посредником негативной регуляции при передаче сигналов для BCR.

ш

D.

® ТО-

а и

#3.

S2

1jy%|1.0% М.9%Гб8.1%

iff- w CD5-FITC

Vi1гЫ

ю!

Рис. 10. Гистограмма распределения CD5 и CDI9 на лимфоцитах периферической крови. Субпопуляции В-клеток: CD19+CD5+ В-1 (квадрант G2); CDJ9+CD5"B-2 (квадрант G1).

Кроме роли, связанной с передачей сигналов при активации, молекула CD5 была расценена как возможный маркер В-клеток, позволяющий различать их субпопуляции:

CD5T В-клетки (также называемые В-1 клетки) и CD5' В-клетки (или В-2 клетки) (рис. 10).

а б

:F1

104

Ш

0l о

о

о

W

71.9% ! 3.5% : 16.8% ] 7.8%

iHt H2

ш а.

I

m

а

о

ЧОР—' ......

ЭДЙУ*

10' «' 10! 10* CD19-FITC

65.4% (1.2% 20.7% |12.7%

Н4й

10° 10' 10= 105

CD19-FITC

Рис. 1). Гистограммы распределения CD5 и CD19 на лимфоцитах периферической крови. Субпопуляции В-1 лимфоцитов у пациента К. с аутоиммунным тиреоидитом: А - до лечения; Б - в процессе лечения.

Анализ В-1 и В-2 киеток в ПКЧ условно здоровых лиц позволил определить среднестатистическое количество этих субпопуляций. Было проанализировано 60 условно здоровых лиц, и результаты представлены в таблице 2.

В-1 клетки вызывают значительный интерес за счет того, что их ассоциируют с продукцией аутоантител, в том числе и при аутоиммунной патологии. Значительная роль В-1 клеток была отмечена при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и синдроме Шегрена. Увеличение количества CD5+ В-клеток наблюдали у пациентов, страдающих миастенией, инсулин-зависимым диабетом и тиреоидитом Ха-шимото. Доля CD5+ В-клеток может составлять треть и более от всех В-клеток (рис. 11).

Таблица 2. Среднестатистическое содержание субпопуляций В-1 и В-2 лимфоцитов в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).

Субпопуляции Содержание

Относительно лимфоцитов (%) Относительно общих В-клеток (%) Абсолютное количество (кл/л)

Общие В-клетки 12 ±5,0 0,099-0,336 х 10'

В-1 клетки 1,3 + 0,8 10,8 ±6,7 0,022-0,115 х 10®

В-2 клетки 10,7 ±4,2 89,2 ±7,1 0,081-0,323 х 10е

Следующей субпопуляцией В-клеток, вызывающей значительный интерес у исследователей, являются В-клетки памяти. Идентификация СВ27 как маркера В-клеток памяти позволила надежно и эффективно идентифицировать в периферической крови наивные В-клетки (1§М+/СВ27~) и В-клетки памяти (С027+) (рис. 12).

Рис. 12. Гистограмма распределения С027 и СБ19 на лимфоцитах периферической крови. Квадрант С2 - субпопуляция В-клеток памяти.

.....10«.....1Ь* 10-''

СЭ27 антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин. Он обнаружен на медуллярных тимоцитах, периферических Т лимфоцитах, активированных В лимфоцитах и ЫК-клетках. Его лигандом является молекула СБ70. Взаимодействие СЭ27 с его лигандом (С070) на Т-клетках является одним из условий дифференцировки В-клеток в плазматические клетки. В свою очередь, существующие данные указывают на то, что отсутствие ^'СТО?" В-клеток памяти в значительной степени объясняет нарушение продукции иммуноглобулинов, несмотря на функциональную передачу сигналов молекулой СВ40 у пациентов с синдромом Х-связанного гиперТяМ.

Анализ В-клеток памяти в ПКЧ условно здоровых лиц позволил определить среднестатистическое количество этой субпопуляции. Было проанализировано 60 условно здоровых лиц, и результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Среднестатистическое содержание субпопуляций В-клеток памяти в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (\ = 60).

Содержание

Субпопуляции Относительно лимфоцитов (%) Относительно общих В-клеток (%) Абсолютное количество (кл/л)

Общие В-клетки 12 ±5,0 0,099-0,336 х 109

В-клетки памяти 4,3 ± 2,5 31,25 ±8,45 0,012-0,040 х 109

Гуморальный иммунный ответ играет значимую роль в устранении как внутриклеточных, так и внеклеточных патогенов. Этот процесс проистекает за счет дифференцировки зрелых В-клеток в плазматические клетки, которые секретируют большие количества антител. Однако большинство антигенов вызывают иммунную реакцию лишь при наличии и участии Т лимфоцитов. Это относится к белковым и клеточным антигенам, а также к вирусам, которые объединяют в понятие "Т-зависимые" антигены. Лишь небольшое количество антигенов способно вызывать иммунный ответ без участия Т-клеток. Некоторые бактериальные липополисахариды при достаточно высокой концентрации способны к поликлональной активации значительной части популяции В лимфоцитов, т.е. для такой стимуляции антигенная специфичность роли не играет. Линейные антигены, медленно распадающиеся в организме и имеющие организованную опреде-

ленным образом и часго повторяющуюся детерминанту (полисахарид пневмококков, полимеры D-аминокислот, поливинилпироллидон) также способны непосредственно стимулировать В лимфоциты. Индуцируемый Т-независимыми антигенами иммунный ответ практически не сопровождается формированием клеток памяти. При иммунном ответе на Т-независимые антигены вырабатываются иммуноглобулины класса М и эффективность Т-независимого ответа во много раз ниже. В свою очередь, Т-зависимые антигены в отсутствии Т-клеток лишены иммуногенности. При ответе на эти антигены требуется подключение Т лимфоцитов. Т-зависимые антигены обеспечивают и определяют кооперативное взаимодействие В- и Т-клеток. В результате такого взаимодействия происходит переключение синтеза с IgM на IgG.

Основываясь на современных данных, различают два пути образования различных репертуаров антител: Т-зависимый путь в терминальных центрах и Т-независимый путь вне них. Точная функция второго пути и генерирование IgMrCD27^ B-клеток в настоящее время окончательно не выяснена. Однако, fglvTCD27v В-клетки играют существенную роль в гуморальном ответе против Т-независимых патогенов, например, инкапсулированных бактерий (Weller S., et al., 2004).

Активация зрелых B-клеток с Т-зависимым антигеном приводит к образованию плазматических клеток двумя независимыми путями дифференцировки. Активированные B-клетки могут войти в экстрафолликулярные пролиферативные центры, где они быстро дифференцируются в короткоживущие плазматические клетки, секрети-рующие IgM. С другой стороны, активированные B-клетки могут попасть в терминальный центр, где происходят различные молекулярные перестройки, такие, как соматические гипермутации, переключение изотипов Ig и отбор высокоафинных вариантов. Антиген-селективные B-клетки терминального центра являются предшественниками двух типов клеток (высокоафинных B-клеток памяти и долгоживущих плазматических клеток), которые являются ответственными за долгосрочную гуморальную устойчивость (Caíame К., 2001; Banchereau J., et al., 1992).

А Б

10»-

3J1 18.1%

Ш iL

(Л 10«

5

о

10°-

J2

J3..J

J4

10° 10' CD3-F1TC

1b2

ю' «2 CD3-FITC

Рис. 13 Гистограммы распределения СОЗ, Ш, \-1)К и СО 19 на лимфоцитах периферической крови. С|)ЗСТ>19~ В-клетки (квадрант А-Л), СШ НГЛ-ВК' клетки (квадрант Б-Л).

Помимо перечисленных выше молекул рецепторного и ко-рецепторного комплекса, на поверхности В-клеток экспрессируюгся антигены МНС класса II (HLA-DR). Они принимают участие в представление антигенов, а В-клетки являются антиген -представляющими клетками. Однако HLA-DR антигены также представлены на активированных Т- и NK-клетках. Этим объясняется несовпадение относительного количества CD3~CD19+ В-клетки и CD3"HLA-DR"1" клетки при некоторых патологиях (рис. 13).

Оценка относительного и абсолютного количества В-клеток является одним из важных диагностических признаков. При воспалительных заболеваниях наблюдаются колебания количества В-клеток в зависимости от типа и стадии иммунного ответа.

Все изложенное выше приводит к тому, что наиболее полную характеристику относительного количества В-клеток и их субпопуляционного состава можно получить при следующей комбинации MA: CD19/CD5/CD27/CD45.

В связи с тем, что молекула CD 19 представляет собой линейно специфический маркер В-клеток и не встречается на других популяциях клеток периферической крови, данный антиген рекомендуется для количественной оценки общей популяции В-клеток. Однако, CD5 и CD27 также экспрессируются на поверхности Т-клеток. Гейти-рование по зоне CD 19 позитивных клеток, как показано на рис. 14, позволяет четко локализовать как В-1 клетки (CD19TCD5^), так и В-клетки памяти (CD19*CD27"r). А Б

1П-

cd19-fitc cd27-pc5

Рис. 14. Гистограммы распределения CD19, CDS и CD27 на лимфоцитах периферической крови. А - анализ по зоне CD19 позитивных клеток (зона D). Б -распределение CD19 позитивных клеток находящихся в зоне D. Квадрант El - В-1 клетки (CD19+CD5+), квадрант Е4 - В-клетки памяти (CD19+CD27+).

Таким образом, в настоящее время оценка и характеристика В-клеточной популяции лимфоцитов является не только важной задачей с точки зрения научных интересов, но и позволяет врачу-клиницисту получить дополнительную информацию о возможном наличии аутоиммунного процесса. Одновременно, что очень важно, современные подходы позволяют оценить эффективность уже сформировавшегося ответа по наличию В-клеток памяти. Расширение потенциальных возможностей современ-

ной проточной цитомстрин значительно увеличивают точность оценки всех этих диагностически-значимых моментов. Применение многоцветного окрашивания и многоэтапного гейтирования позволяют провести многопараметрический анализ клеток периферической крови с высокой точностью и достоверностью в одной пробе пациента. Данный подход значительно облегчает интерпретацию полученных результатов анализа и позволяет судить о функционировании В-клеточного звена иммунной системы больных при разнообразных патологических состояниях.

Идентификация NK-клеток (натуральных киллеров).

Среди больших гранулярных лимфоцитов (LGL, Large Granular Lymphocytes) выделяют отдельную популяцию клеток, получившую название натуральных киллеров или NK-клеток (Natural Killer). NK-клетки являются важным компонентом врожденной иммунной системы за счет наличия цитолитической активности против клеток-мишеней и способности продуцировать цитокины. Первоначально они были описаны на основании их функциональной способности уничтожать клетки некоторых опухолей гемопоэтического происхождения без предшествующей стимуляции. Таким образом, одной из основных функций данной субпопуляции клеток иммуной системы является защита собственного организма от видоизмененного «своего».

Как уже было сказано выше, NK-клетки являются носителями двух основных функций. Первая - это лизис опухолей и инфицированных вирусами клеток. Вторая -регуляция врожденного и адаптивного иммунных ответов за счет секреции хемокинов (CCL3, CCL4, CCL5 и XCL1) и цитокинов (GM-CSF, TNF-a, и IFN-y).

Способность NK-клеток взаимодействовать и убивать опухолевые, но не нормальные клетки была описана, а позже и объяснена рядом авторов. Этот эффект происходит за счет нескольких специализированных рецепторов, распознающих молекулы МНС класса I, которые экспрессируются на нормальных клетках. Эти рецепторы формируются на NK-клетках при ассоциации молекул CD94 с молекулами семейства NKG2 (CD 159).

NK-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов, наиболее чувствительной к физиологическим и психологическим стрессам. В настоящее время доказано выраженное воздействие высоких физических нагрузок на NK-клетки. Их цитолитическая активность увеличивается при нарастании физической нагрузки и уменьшается после ее окончания.

В периферической крови NK-клетки составляют от 5 до 20 % циркулирующих лимфоцитов. По другим данным, среди лимфоидной популяции периферической крови человека NK-клетки составляет приблизительно 10-15%. Существует взаимосвязь между изменением активности NK-клеток и их количеством с клиническими признаками заболеваний у людей. Так, относительное количество NK-клеток и их активность существенно изменяется не только при опухолевых процессах и вирусной инфекции, но и при гнойном воспалении, нарушении функций центральной нервной системы (ЦНС), аутоиммунных заболеваниях и так далее (Whiteside T.L. et al., 1994).. Вероят-

но, что в результате применения более тонких и точных методов исследований, таких как проточная цитометрия и многопараметрический анализ, будут выявлены и другие изменения в субпопуляциях этих клеток при иных патологиях.

Рис. 15. Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием монокло-нальных антител против СВЗ и С016+СВ56, меченых Р1ТС и РЕ. Квадранты: II- 1\К-клетки; 12 - Т-¡ЧК-клетки; 13 - негативные по СБЗ и СБ16+С056 лимфоциты; 14 -Т-клетки.

Для выявления Ж-клеток среди других лимфоцитов используют МА, распознающие различные маркеры, экспрессируемые на их поверхности. Однако многие поверхностные молекулы Ж-клеток представлены и на других субпопуляциях лимфоцитов, и это накладывает свои особенности на идентификацию натуральных киллеров. В связи с этим для их локализации среди других лимфоцитов используют уникальную комбинацию из нескольких маркеров, таких как, СБ56 и СО 16 (рис. 15). С другой стороны, МК-клетки не экспрессируют такие линейные маркеры, как СОЗ, С014 и поверхностные ^ и это также используется при их локализации.

и!

ш

CL

со о о

10Ц

11 12

3.0% 22.5%

'W

'З-СА; ¡4 ■

29.9%,г 44,«%®?-'

Рис. 16. Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против С 1)3 и CD8, меченных FITC и РЕ. В зоне И находятся CD81" NK-клетки.

ю» ' Л'' ' СРЗАТС

Одним из основных маркеров, используемых для выявления ИК-клеток, является молекула СО 16. Антиген СО 16 представляет собой низко-аффинный рецептор дм (РеуШН). Данный антиген существует в двух различных формах, кодируемых двумя различными генами: РсуМИА (или Ш-2) и Реу1Ш1В (или Ш-1). Генетическая разнородность СБ 16 приводит к альтернативным путям ассоциации молекул с мембраной клеток. Первая трансмембранная форма (РсуМИА, 50-65 Ша) экспрессируется на Ж-клетках, моноцитах и макрофагах. Вторая форма (РсуМНВ, 48 Ша), ассоции-

рованная с мембраной за счет гликозилфосфатидилинозитола (GPI), экспрессируется только на нейтрофилах.

Другим антигеном является молекула CD56. Данный антиген умеренно экспрессируется на отдельных субпопуляциях клеток периферической крови, таких как большие гранулярные лимфоциты и все клетки с NK активностью. Молекула CD56 также экспрессируется отдельными субпопуляциями Т лимфоцитов (Dargent J.L., et al., 1998).

Циркулирующие зрелые NK-клетки имеют фенотип CD3'CD56tCD16+CD2t1"1' и отличаются от Т-клеток отсутствием Т-клеточного рецептора и CD3. В свою очередь, отличие от В-клеток заключается в том, что NK-клетки никогда не экспрессируют мембранные иммуноглобулины (Ig), однако, за счет экспрессии FcyRIII, они могут быть позитивными при окрашивании антителами. Поверхностные маркеры, экспрес-сируемые активированными NK-клетками, включают целый ряд молекул, таких как CD25, pi (CD29) и |32 (CD18) интегрины, различные акгивационные антигены, включая HLA-DR, CD71 и CD69. В зависимости от степени активации NK-клеток поверхностные рецепторы могут изменять свою экспрессию за счет повышения или понижения (Whiteside T.L., et al., 1994; Rabinowich H., et al., 1993).

Популяция NK-клеток обладает достаточной гетерогенностью по своему составу. Исследователи выделяют несколько их субтипов, а именно npe-NK-клетки, зрелые NK-клетки и активированные NK-клетки. Данная особенность связана с различной экспрессией маркеров клеточной поверхности. Среди популяции циркулирующих NK-клеток выделяют две основные субпопуляции. Первая экспрессирует CD 16 и низкий уровень CD56 (CD164*" h,gh)CD56dim). Вторая экспрессирует CD56, однако, CD16 на них представлен в низкой плотности или полностью отсутствует (CD164w l0W,CD56bnsh'). Последняя субпопуляция составляет приблизительно 10-20 % от общего количества NK-клеток. Они секретируют IFN-y и другие цитокины, и имеют меньшую цитолитическую активность. В свою очередь субпопуляция CD i6h!BhCD56dlm составляет приблизительно 80-90% от NK-клеток периферической крови, они слабо секретируют цитокины, но обладают высокой цитолитической активностью (Wan-en H.S.,etal„ 1991).

Перечень других маркеров, экспрессируемых на своей поверхности NK-клетками, достаточно широк. Это - CD2, CD5, CD7, CD8, CD94, CD96, CD158, CD159 и многие другие. В настоящее время для локализации и характеристики NK-клеток наиболее широко используют двухпараметрический анализ экспрессии CD16 и/или CD56 на CD3-негативных клетках. Данная комбинация МА позволяет локализовать общую популяцию NK-клеток и количественно ее охарактеризовать (рис. 15), но не охарактеризовать их субтипы.

Достаточно часто NK-клетки экспрессируют на своей поверхности а-цепь CD8 (рис. 16), но в более низкой плотности, чем цитотоксические Т-клетки. Функция CD8 у NK-клеток до последнего времени была неясна, однако было показано, что субпопуляции NK-клеток человека, экспрессирующие аа гомодимер CD8, обладают большей цитотоксичностью, чем CD8" NK-клетки, но механизмы этого оставались неизвестными. Позднее выяснилось, что соединение CD8a цепей в гомодимер индуцирует бы-

строе повышение внутриклеточного Саг* и, инициированное этим, увеличение экспрессии CD69. Хотя секреция цитолитических ферментов инициирует апоптоз NK-клеток, приток экзогенного кальция защищает CD8a+ NK-клетки от данного процесса. Данная защита от апоптоза может быть снята преинкубацией NK клеток с антителами против МНС класса I. Таким образом, данный механизм позволяет CD8cf NK-клеткам сохранять жизнеспособность и принимать участие в многократном лизисе клеток-мишеней.

В последние годы исследователи уделяют большое внимание экспрессии CD38 на поверхности NK-клеток. Молекула CD38 - это мембранный гликопротеин, представляющий собой фермент, регулирующий концентрацию цитоплазматического кальция. Кроме этого, данный фермент обладает целым рядом других активностей таких, как аденозиндифосфат (ADP) рибозил циклазная, циклический аденозиндифосфат рибо-зил гидролазная и NAD гликогидролазная. Данная молекула также играет роль рецептора, модулируя межклеточные взаимодействия, и является переносчиком трансмембранных сигналов. Молекула CD38 экспрессируется на активированных Т-, В-, NK-клегках и некоторых других типах клеток.

В ряде работ приведены данные о том, что обработка CD38+ NK-клеток антителами против CD38 приводит к активации их литической способности. Однако, это происходило только в тех случаях, когда было возможно взаимодействие CD38 со специачизи-рованными сигнальными молекулами. В случае NK-клеток роль такой молекулы играет CD 16.

Представленные выше данные свидетельствуют в пользу того, что для наиболее полной характеристики NK-клеток необходимо определить на СОЗ-негативных клетках следующие поверхностные маркеры: CD16, CD56, CD38 и CD8. В свою очередь следует отметить, что CD38 и CD8 позволяют оценить цитотоксическую активность NK-клеток пациента и, как следствие этого, более корректно представлять картину, происходящую на данном этапе развития иммунного ответа. Для этих целей рекомендуется использовать следующие комбинации MA: CD3/CD16/CD56/CD45 и CD3/CD8/CD38/CD45.

Как уже было сказано выше, применение двухцветного окрашивания лимфоцитов с использованием комбинации антител CD3, CD56+CD16 позволяет локализовать NK-клетки и оценить их абсолютное и относительное количество (рис. 15). Однако в этом случае отсутствует возможность определить их субтипы.

Другим вариантом окрашивания лимфоцитов для выявления NK-клеток является использование комбинации антител CD16 и CD56. На рис. 17А представлена двухпа-раметрическая гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием МА против CD16 и CD56, меченных FITC и РЕ. Но в этом случае результат получается несколько завышенным, поскольку дополнительный вклад вносят Т-клетки, так как они могут экспрессировать на своей поверхности CD56 и CD 16. Это особенно ярко проявляется при наличии различных патологий, когда резко возрастает количество Т-клеток, экспрессирующих данные структуры.

Данную задачу позволяет решить применение многоцветного анализа и следующей комбинации МА С03/С016/С056/С045. В данной комбинации СЭЗ позволяет исключить из анализа Т-клетки (рис. 17Б).

а б

10'"

ш О.

ID

ш о о

ж

Щ

ш а.

(О

■л а о

10Р.

to» 10' та5 ю» CD16-FITC

CD5ebriSh'

CD16brisht

10° 1С1 10=

CD16-FITC

Рис. 17. Гистограммы распределения лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против СБ16 и С1)56, меченных Г1ТС и РЕ. На гистограмме А отображены все СБ45+ позитивные лимфоциты. На гистограмме Б отображены только С045+С1)3" лимфоциты.

Ранее сообщалось, что СВ38+СВ8*"МК-клетки обладают высокой цитолитической активностью. Таким образом, знание о натичии данной субпопуляции, ее относительном и абсолютном количестве имеет важное диагностическое значение.

Для локализации С038+С08+КК-клеток возможно использовать двухпараметри-ческий анализ (рис. 18), но более корректно применять трех- и четырехцветный анализ (С03/С08/С038 и С03/С08/С038/СП45).

Рис. 18. Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против CD8 и CD38, меченных FITC и РЕ. Область Н содержит CD8+CD38+ NK-клетки.

"Ъ"' 10' CD8-FITC

В случае использования комбинации С03/СВ8/С038 для выделения лимфоцитов используют морфологические параметры, но в результате этого всегда существует вероятность исключить из анализа часть больших гранулярных лимфоцитов, которые могут просто не попасть в выделенную зону при гейтировании. Использование СБ45 для локализации всей популяции лимфоцитов является более корректным.

Комбинация моноклональных антител CD3/CD8/CD38/CD45 и многоэтапное позитивное и негативное гейтирование позволяет четко выделить активированные NK-клетки. На рие. 19А представлена двухпар&метрическая гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием МА против CD3.

Дальнейший анализ проводят на отдельных гистограммах с использованием логических ограничений в зонах позитивных и негативных по CD3. На гистограмме, полученной с использованием гейтирования по CD3*", в зоне второго квадранта находятся активированные цитотоксические Т-клетки с фенотипом CD8b"gKCD38+ (рис. 19В).

Гейтирование по зоне CD3 негативных клеток, позволяет выявить активированные NK-клетки с фенотипом CD8dlmCD38* (рис. 19Б). Данное утверждение правомерно, поскольку CD8 экспрессируется не только на Т-клетках, но и на части популяции CD3 негативных клеток, а именно на NK-клетках.

А

Рис. 19. Многоцветный анализ и последовательное гейтирование для локализации активированных NK-клеток. А - гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием CD3 и светорассеяния под углом 90°. Область D содержит Т-клетки, а область С - CD3 негативные лимфоциты. Б -гистограмма распределения CD3" лимфоцитов периферической крови с использованием CD8 и CD38. CI)SdimCD38+ активированные NK-клетки. В - гистограмма распределения CD3+ лимфоцитов периферической крови с использованием CD8 и CD38. CD8br'ehtCD38+ активированные цитотоксические Т-клетки.

Таким образом, используя данную комбинацию \1Л, возможно в одном образце определить активированные цитотоксичсские Т-клетки и активированные NK-клетки.

В последние годы становится весьма очевидной необходимость при тонировании NK-клегок выявлять как общее количество, так и содержание отдельных их субпопуляций, Это связано с большим количеством вновь полученного фактического материала и несколькими направлениями развития современной иммунологии.

Результаты исследований показали, во-первых, ведущее значение NK-клеток и их ци-тотокснческой ф>т!кции при опухолевых и вирус-индуцированных процессах.

Во-вторых, наличие регуляторпой функции у отдельных субпопуляций NK-клсток ставит вопрос об их клиническом и патогенетическом значении.

В-третьих, данные о наличии активационных рецепторов NK-клеток позволяют по-новому оценить их функциональную активность, не ставя трудоемких и весьма затратных экспериментов по киллингу клеток-мишеней.

В-четвертых, появилась возможность оценить степень воздействия лекарственной терапии на собственно NK-клетки как в норме, так и патологии, как in vivo, так и in vitro. Это позволяет значительно расширить возможности клинической фармакологии по поиску средств, напрямую влияющих на данную группу клеток (химиотерапия опухолей, антивирусная терапия и др.).

И, в-пятых, изучение субпопуляций NK-клеток и их функциональной активности может повлиять на наши представления о природе патологических процессов. Эю весьма важно как для известных патологий, где значение NK-клеток уже определено, так и для других процессов, при которых значимость врожденных механизмов иммунитета недостаточно изучена. Как следствие этого, новые данные могут способствовать более корректной иммунотерапии различных патологических состояний с учетом ее влияния на данные клетки.

Идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии сф-TCR и yS-TCR.

Многие микроорганизмы являются внутриклеточными паразитами и, обитая внутри клеток организма-хозяина, недоступны для антител. Облигатные внутриклеточные паразиты, в частности вирусы, способны размножаться только внутри клеток, используя репликационную систему клеток хозяина. Факультативно внутриклеточные микроорганизмы, такие как микобактерии и лейшмании, могут размножаться как в клетках, главным образом в макрофагах, так и вне клеток, но внутриклеточный способ существования для них более предпочтителен, поскольку обеспечивает защиту от факторов иммунной системы. Против данных микроорганизмов действует особый механизм приобретенного иммунитета, а именно клеточный иммунитет. Он обеспечивается отдельной субпопуляцией лимфоцитов, получившей название Т-клетки. В отличие от В-клеток, они дифференцируются в тимусе. Т лимфоциты специализируются на уничтожении клеток организма, которые инфицированы размножающимися внутриклеточно возбудителями инфекции. Т лимфоциты играют важную роль в элиминации опухолевых клеток, в реакциях трансплантат против хозяина и хозяин против трансплантата,

гиперчуствительности замедленного типа и других реакциях организма, направленных на поддержание гомеостаза.

Оценка как относительного, так и абсолютного количества Т-клеток и их основных субпопуляций получила широкое распространение в лабораторной практике. При фе-нотипировании лимфоцитов эти данные являются диагностически значимыми при различных патологических состояниях иммунной системы, включая первичные и вторичные иммунодефицшы. Динамика изменения субпопуляционного состава Т-клеток при некоторых патологиях представляет собой значительную ценность для контроля эффективности терапии, прогноза развития и течения заболевания (Hayball J.D., et al., 2000; Mandy F.F., et al, 2003).

К маркерам, характеризующим Т-клетки, в первую очередь относят Т-клеточный рецептор (T-Cell Receptor, TCR). Подобно B-лимфоцитам, Т лимфоциты несут на своей поверхности специфический рецептор для распознавания антигена. TCR является гетеродимером, состоящим из двух цепей.

Существует два типа TCR, каждый из которых ассоциируется с разными типами Т-лимфоцитов. TCR1, состоящий из у- и 5-цепей, появляется на ранних стадиях онтогенеза. TCR2 состоит из а- и ß-цепей (Davis М.М, et al, 1988; Autran В, et al, 1989; Jarry A, et al, 1990;Van den Beemd R, et al, 2000).

Гены а- и ß-цепей Т-клеточного рецептора организованы так же, как и гены имму-ноглббулинов. Имеются также сегменты V, D и J и гены константных областей (С). Формирование иммунокомпетентных Т-клеток сопровождается транслокацией фрагментов V, D и 3 с образованием непрерывной последовательности VDJ. Как и при синтезе иммуноглобулинов, образование мРНК предусматривает удаление интропов между VDJ и С.

CD3-PC5

iF.....iV "мР

CD3-PC5

Рис. 20. Гистограммы распределения Т-клеток экспрессирующих TCR-VJ3, Квадранты С2 содержат клетки с фенотипом CD3+TCR-Vpr и CD3+TCR-Vpi4+.

Следует отметить, что уже выявлена специфичность отдельных вариантов V-сегмента TCR. Так V|317 является мишенью для суперантигена микоплазмы (MAS) и стафилококкового энтеротоксина В, a VJ38 для стафилококкового энтеротоксина Е. Описано, что при инфицировании вирусом Эпшейн-Бара наблюдалась быстрая кло-нальная пролиферация CD8+ Т-клеток, экспрессирующих TCR V(H4, хотя в норме

TCR Vßl4 Т-клетки составляют только 2-7% (рис. 20) (Haynes B.F., et al., 1995; Van den Beemd R., et al., 2000; Kelsen J., et al., 2004; Wada Т., et al., 2007). Не исключено, что в будущем анализ наличия тех или иных Vß-субьединиц TCR может быть использован для персонифицированной терапии пациентов.

Примерно 87,2-98,4 % Т-клеток представляют собой вариант aß-TCR, и обозначаются эти клетки как aß-T-клегки. Остальные 1.7-8.9 % Т-клеток несут на своей поверхности yS-TCR и обозначаются как у5-Т-клеткп.

aß-T-клетки подразделяются на две различные неперекрывающиеся субпопуляции. Клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном "помогают" в осуществлении иммунного ответа или "индуцируют" его. Данная субпопуляция получила название Т-хелперы. Т-клетки другой субпопуляции несут маркер CD8 и обладают преимущественно цитотоксической активностью.

Небольшая часть aß-T-клеток не экспрессируют ни CD4, ни CD8. С другой стороны, большинство у5-Т-клеток, циркулирующих в периферической крови, также "дважды отрицательны". Однако некоторые из aß-T-клсгок все же экспрессируют молекулы CD8. Напротив, большая часть у5-'Г-клеток в тканях экспрессируют CD8. Кроме молекулы CD8 у8 -Т-клетки на своей поверхности могут экспрессировать CD56, CD94, CD161. Также было продемонстрировано, что цитостатическую активность yö-Т-клеток возможно стимулировать через CD 122 (ß-цепь рецептора IL-2) (Ichikawa Y., et al., 1991; Battistini L., et al., 1997; Fujimiya Y., et al., 1997).

у5-Т-клетки были изучены относительно недавно. Одной из особенностей у5-Т-клеток в отличие от aß-T-клеток является то, что они распознают непептидные антигены, полученные из микробных патогенов, независимо от МНС. Данная субпопуляция выполняет целый ряд важных функций, так они могут усиливать иммунный ответ, производя большие количества интерферона-у (IFN-y), фактора некроза опухолей-а (TNF-a) и хемокины. Кроме этого, yö-T-клетки имеют эффекторную (цитотоксиче-скую) активность. С эволюционной точки зрения, у5-Т-клетки занимают уникальное место между высоко специфичными aß-T-клетками и врожденной иммунной системой для выполнения защиты организма от патогенов. Экспериментальные данные показали, что роль у5-Т-клеток была весьма существенна в устойчивости организма против целого ряда микроорганизмов. Так, функциональную значимость у5-Т-клеток отмечали в устойчивости к Mycobacterium, Borettia, Francisella tularensis, Salmonella и вирусам, включая вирус ВИЧ. Кроме того, yS-T-клетки играют существенную роль и в противоопухолевом ответе, в частности было описано значительное увеличение этих клеток у пациентов с лимфомой. у5-Т-клетки также вовлечены в восстановление эпителия и гомеостаз. С другой стороны, у5-Т-клетки могут быть вовлечены в патогенез заболеваний с гиперактивацией иммунной системы, например, сахарного диабета, болезни Бехчета, а также бронхиальной астмы (Ichikawa Y., et al.,-1991; McClanahan J., et al., 1999; Robak E„ et al., 1999; Yin Z„ et al., 2000).

Содержание у5-Т-клеток в периферической крови варьирует, существуют половые и возрастные различия. Их количество увеличивается с момента рождения до наступления полового созревания, а в дальнейшем постепенно снижается. У женщин коли-

чество у5-Т-клеток несколько выше, и этот уровень сохраняется значительно дольше, чем у мужчин (Caccamo N., et al., 2006).

уб-Т-клегки обладают очень быстрой (начинающейся после 4-6 дней), высокой (в 200 раз) и длительной (>7 месяцев) пролиферативной способностью в ответ на антиген. Кроме того, в течение иммунного ответа антиген-специфические уб-Т-клетки могут составлять до 48-98 % от общего количества циркулирующих уб-Т-клеток. Таким образом, обнаружение увеличенной циркулирующей субпопуляции у5-Т-клеток может позволить сделать предположение о недавней или продолжающейся хронической стимуляции, особенно на слизистых оболочках или участках кожи. Эта информация позволяет клиницистам делать предположение о возможном медленно прогрессирующем инфекционном заболевании (Chen Z.W., et al., 2003).

На клеточной поверхности и а|3-, и у5-антигенраспознающие рецепторы Т-клеток располагаются непосредственно рядом с полипептидным комплексом, имеющим групповое название CD3. Это соседство и ассоциация с CD3 являются необходимым условием для экспрессии всего рецепторного комплекса на поверхности клеток.

ш о.

•ч- «го о

10°-

F1 0.3% »2 52.5%

23.1% =4 -УГ .

1.5%

Ш £L

СО Ю'

D О

10° ■

20.5%

Е2

22.3%

=4 i-Щ

55.7%Ё

CD3-FITC

10« 10' 10» cd3-f1tc

Рис. 21. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови с использованием комбинации моноклональных антител С03/С1)4/С08/СГ)45.

Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу того, что для более полной характеристики Т-клеток пациента анализ следует проводить не только по такому линейно-специфическому маркеру как СШ, но и по наличию субпопуляций а|3-Т-клеток и уб-Т-клеток. Важность определения последних становится очевидной для целого ряда заболеваний. В первую очередь к ним относятся такие заболевания как ВИЧ-инфекция, вторичные и первичные иммунодефицитные состояния, сопровождающиеся длительной персистенцией микроорганизмов в организме человека на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной системы. И особенно важным становится определение у5-Т-клеток при оценке общего количества Т-клеток в тех случаях, когда от их количества зависит доза назначаемых препаратов (например, назначение антиретро-вирусной терапии ВИЧ-инфицированным пациентам).

Количественный анализ Т-клеток является наиболее востребованным исследованием для иммунологического контроля состояний при синдроме приобретенного им-

мунодефицита (СПИД), мониторинга за пациентами как после трансплантации костного мозга, так и эффективности иммунодепрессивной терапии. Стандартные протоколы иммупофенотипирования, использующие четыре цвета, позволяют проводить идентификацию субпопуляций Т лимфоцитов в одном образце (рис. 21). Этот анализ предоставляет исследователю намного больше информации, но до последнего времени она находилась вне зоны внимания клиницистов (Яешапп К.А., й а1., 2000).

Рис. 22. Гистограммы распределения Т-клеток по плотности экслрессии CD3 на их поверхности. А - распределение CD3 позитивных Т-клеток у здорового донора. Б - распределение CD3 позитивных Т-клеток у пациента с вирусом Эпштей-на-Бара.

Так, при использовании комбинации MA CD3/CD4/CD8/CD45 при обычном анализе периферических Т-клеток достаточно часто наблюдается бимодальное распределение экспрессии CD3, которое предполагает наличие двух отличных субпопуляции Т-клеток (рис. 22Б). Помимо молекул CD3 антиген-специфический Т-клеточный рецептор является другом пан-Т-клеточным маркером, который необходимо использовать при анализе пациентов с иммунологическими расстройствами. Как было описано выше, существует два отличных типа TCR - aß-TCR и yS-TCR, которые различаются по происхождению в онтогенезе и функциональным свойствам. В медицинской практике, как правило, внимание клиницистов сосредоточено, прежде всего, на aß-T-клетках, которые составляют большую часть Т-лимфоцитов. Остающиеся около 5% уб-Т-клеток, как правило, выпадают из зоны внимания клиницистов, и эти клетки рассматривали исключительно при исследовании иммунитета слизистых оболочек и в тимусе.

Данный этап необходим, так как большинство уб-Т-клеток, циркулирующих в периферической крови "дважды отрицательны" по CD4 и CD8. Другая их особенность заключается в том, что они имеют более высокую плотность экспрессии молекулы CD3 на своей поверхности (CD3bnght). На рис. 22 изображено достаточно часто встречающееся распределение CD3 положительных лимфоцитов при бактериальных и вирусных инфекциях, первичных и вторичных иммунодефицитах. Как видно из рис. 23, клетки, находящиеся в зонах А, Б и В, экспрессируют высокий уровень CD3. В свою

очередь клетки в зоне А имеют фенотип СБЗЬп8|,,С04\ в зоне Б С03Ьгщ1,,С08<1'т и зоне

А

В

CD3-F1TC

CD3-F1TC

В СВЗЬп8,иСВВ". Все эти признаки характерны для уб-Т-клеток. Чтобы выявить у5- и аД-Т-клеток, как правило, используют следующую комбинацию МА а£!-ТСК/у5-ТСН/СОЗ/СБ45.

10» •

10» ■

ш а

о

и

«р.

21 С2

0.3% 43.1%

<4*

А

22.3%-

СОЗПТС

10"

ЦТ

4.2%

ш а.

а О

■ЮР.

32

гьл%

18.1%;

.'Лй-и:-;

М

49.3%

Л' 1Ьг созптс

Рис. 23. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хроническим носительством вируса Эпштейна-Бара. В зонах А, Б и В находятся СВЗЬг1еМ Т-клетки.

На рис. 24 представлены гистограммы распределения Т-клеток, полученные в результате многоцветного ан&чиза лимфоцитов периферической крови пациента с хроническим носительством вируса Эпштейна-Бара. На рис. 24А в квадранте ¥2 находятся у5-Т-клетки, на рис. 24Б в квадранте Е2 - сф-Т-клетки.

Е2

71.6%

163;^- 84

16.4»;

10*

СОЗТИС

10.9%

10« 10' СОЗЛТС

Рис. 24. Гистограммы распределения Т-клеток, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хроническим носительством вируса Эпштейна-Бара.

Все изложенное выше свидетельствует в пользу того, что для наиболее полной фе-нотипической характеристики Т-клеток необходимо проводить анализ не только линейно-специфичного маркера Т-клеток СБЗ, но и определять субполуляционный состав Т-клеток по экспрессии Т-клеточного рецептора, а именно у5- и сф-ТСК. Для этих целей следует использовать многоцветный анализ и следующие комбинации МА: С03/С04/С08/С045 и аР-ТСК/у5-ТСЯ/С03/С045 (таблица 4).

Таким образом, более полная информация об экспрессии Т-клеточного рецептора в клинической практике значительно расширяет возможности для анализа состояния Т-клеточного звена иммунной системы не только с точки зрения адекватного выявления его дефекгов, но и для правильного назначения химиотерапевтических препаратов, направленных на восстановление нормальною функционирования защитных систем организма.

Таблица 4. Среднестатистическое содержание у5-Т клеток и а(3-Т клеюк в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (X = 60).

Субпопуляции Относительно лимфоцитов (%) Относительно общих Т-клеток (%) Абсолютное количество (кл/л)

Общие Т-клетки 73 ± 12,0 0,946-2,079 х 10'

у5-Т клетки 4,6 ±2,8 5,3 ±3,6 0,022-0,115 х 10'

аР-Т клетки 70,5 ±9,7 92,8 ±5,6 0,924-1,964 х 109

Идентификация регуляторных Т-клеток и Т-клеток памяти.

В крови человека присутствуют как наивные Т-клетки, так и Т-клетки памяти, различающиеся между собой по функциональным и фенотипичсским признакам. Жизненный цикл Т-клеток в организме делится на две фазы. Независимая от чужеродного антигена стадия дифференцировки Т-клеток и стадия, связанная с присутствием чужеродного антигена. Первая из них завершается появлением в русле крови зрелых наивных Т лимфоцитов, каждый из которых способен отвечать только на «свой» антиген. Стимулированные антигеном в ходе первичного ответа Т-клетки проходят дальнейшую дифференцировку (SprentJ, 1994).

Все Т-клетки памяти появляются в результате дифференцировки активированных антигеном наивных предшественников в ходе норматьного развития первичного иммунного отвега in vivo. Экспрессия на клеточной поверхности различных изоформ молекулы CD45 позволяет разделить CD4+ Т лимфоциты человека на наивные Т-клетки и Т-клетки памяти. Принято относить субпопуляцию CD4+CD45RA~CD45R0+ Т лимфоцитов к Т-клеткам памяти и соответственно CD4+CD45RA+CD45R0~ — к наивным Т-клеткам (рис. 25). Подобное разделение основано исключительно на способности CD4'"CD45RA~CD45R0+ Т-клеток, а не наивных Т лимфоцитов, интенсивно отвечать на повторный контакт с антигеном in vitro. В свою очередь, быстрый и усиленный ответ Т-клеток памяти на специфический антиген является их важнейшим функциональным отличием от наивных предшественников (Sanders М.Е, et al, 1988; Michic, С.А, et al, 1992).

Покоящиеся CD4+ T лимфоциты памяти также отличаются от наивных предшественников системой внутриклеточной сигнализации, приводящей к резистентности к действию Са2+-ионофоров. Чувствительная к действию Са2+-ионофоров популяция CD4+ Т-клеток человека составляет основную часть покоящихся наивных CD4+CD45RA+CD45R0" Т лимфоцитов. В свою очередь, большинство резистентных к

действию Са2+-ионофоров CD4+ Т-клеток являются покоящимися CD4+CD45RA~ CD45R0+ Т лимфоцитами памяти (Ishida Y., et al., 1988; Miller R.A., et al., 1991; Sigova A., et al., 1999).

ь

о

Чм 32

ЗМ.9% 8.9-/.

\т-

!

Го.«7.

cd45r0-ecd

Б

о i-

Q О

да 1b"

cd45r0-ecd

ы iH.3% 32 11.0%

fo.4% 1

cd45r0-ecd

Рис. 25 Распределение лимфоцитов условно здорового лица (А и В) и пациента в послеоперационный период (Б и Г). На гистограммах В и Г анализ лимфоцитов проводили только по С045 позитивным клеткам. На гистограммах А и Б анализировали клетки при помощи многоэтапного гейтирования по СБ45 и СБ4.

Основная методическая сложность в исследованиях процесса дифференцировки CD4+ Т лимфоцитов в периферической крови здоровых лиц связана с тем, что активированные клетки составляют лишь незначительную часть. Как правило, в крови здоровых лиц доля активированных CD4+ Т-клеток составляет менее 10% от общего числа CD4+ Т лимфоцитов (Reimann К.А., et al., 2000).

Однозначным фенотипическим признаком дифференцировки покоящихся наивных CD4+CD45RA+CD45R0~T лимфоцитов человека в покоящиеся Т-клетки памяти принято считать появление на поверхности клеток молекул CD45R0 взамен изоформы CD45RA. Данная особенность позволяет выявить три субпопуляции CD4+ Т лимфоцитов человека: покоящиеся наивные CD45RA+CD45R0~ Т-клетки, покоящиеся CD45RA" CD45R0+ Т-клетки памяти и активированные - CD45RA+CD45R0+ Т-клетки (рис. 25). Все активированные CD4+CD45RA+CD45R0+ Т лимфоциты возникают в процессе стимуляции наивных Т-клеток антигеном in vivo (Sanders М.Е., et al., 1988; Michie, C.A., et al., 1992).

Появление молекул CD69 считают основным фенотипическим признаком наиболее ранней (первые часы) стадии активации наивных CD4+ Т лимфоцитов. Как прави-

ло, в крови здоровых лиц не удается обнаружить присутствие более чем 1-4% CD4+CD69+ 'Г-клеток (Cerosa F., et al., 1991; Maschcr В., ct al., 1999; Pala Р., et al., 2000).

to-

io1 10' 10! 10' CD95-FITC

Рис. 26 Алгоритм анализа субпопуляций CD4+CD25+ Т лимфоцитов человека: CD4+CD25b'8h - зона Е, CD4+CD25|0,V - зона D, CD4+CD25" - зона С. В однопара-метрических гистограммах представлено распределения молекул CD95+ на CD4+CD25high, CD4+CD25|0W и CD4+CD25" Т лимфоцитах. Распределения молекул CD38, CD62L и HLA-DR на поверхности CD4+CD25high, CD4+CD25iow и CD4+CD25~ Т-клеток оценивалось аналогичным способом.

Определение относительного количества CD4+CD45RA+CD45R0~ и CD4+CD45RA~ CD45R0+ лимфоцитов может служить хорошим диагностическим признаком. Этот эффект четко проявляется при развитии инфекции или при хирургическом вмешательстве, поскольку происходит накопление доли CD4+CD45RAXD45R0+ клеток и снижение CD4+CD45RATCD45R0~. Как видно из рис. 25, определение относительного количества CD45RA+ и CD45R0+ клеток по всей популяции лимфоцитов мало информативен и только анализ по зоне CD4 позитивных клеток позволяет четко увидеть это различие.

Популяция CD4+CD25+ Т-клеток человека гетерогенна по функциональным свойствам и фенотипическим признакам. Она включает в себя популяции пролиферирую-щих CD4+CD45RA+CD45R0+CD25low Т-клеток и «регуляторных» (T-reg - Т regulatory) CD4TCD45R0+CD25hlgh Т лимфоцитов. Идентификацию этих популяций клеток принято проводить по совокупности количественных параметров экспрессии молекул CD38, CD62L, CD95 и HLA-DR. В подобном случае правильный выбор областей ана-

лиза (рис. 26 и 28) в наибольшей степени определяет корректность описания субпопуляций С04+С025+ Т лимфоцитов человека. Согласно проведенному анализу, феноти-пические признаки субпопуляции СОгб1"^, С025ь" и СТ>25~ Т лимфоцитов полностью отвечают существующим критериям для данных типов Т-клеток (.(отйек Н., е1 а1., 2001; ВаесЬег-АПап С., й а1., 2001; БЬеуасЬ Е.М., 2002).

А Б

103-

?Р1

1Л

о

CL Lß OJ

О о

10е-

F2

1'о' да ИР CD127-PE

10s-

ю и

°г и> гч а и

:2

;з,

с4

в3 т> то> CD4-PC7

Рис. 27. Многоэтапное гейтирование при анализе T-reg клеток в периферической крови. А - гистограмма распределения CD127 и CD25 после одновременного гейтирования по CD4 и CD45. В зоне Е находятся регуляторные клетки. Б -гистограмма распределения CD4 и CD25 после гейтирования только по CD45. Черные точки - T-reg клетки.

T-reg клетки имеют следующий фенотип CD3+CD4+CD25h,ghCD45R0+CD95+, однако наиболее важным их маркером является FOXP3. Исследования показали, таз FOXP3, который кодирует фактор транскрипции скурфин (scurfm), является главным регулирующим геном для развития и функционирования CD4+CD25b'8h регуляторных Т-клеток. Таким образом, самым точным маркером для идентификации T-reg клеток является как раз фактор транскрипции FOXP3. Однако он является внутриклеточным маркером, что значительно затрудняет работу по идентификации T-reg (Schubert L.A., et al.,2001).

Исследования последних лет показали, что экспрессия CD127 на T-reg клетках снижена или отсутствует. В свою очередь, эксперементы in vitro выявили, что экспрессия CD 127 после активации Т-клеток резко снижается. CD 127 представляет из себя а-цепь гетеродимерного рецептора IL-7, который состоит из CD 127 и общей уцепи, которая представлена и у других рецепторов цитокинов (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, и LL-21R). CD127 экспрессируется на тимоцитах, Т- и В-предшествинниках, зрелых Т-клетках, моноцитах, и некоторых других лимфоидных и миелоидных клетках. Показано, что IL-7R играет важную роль в пролиферации и дифференцировке зрелых Т-клеток (Ryan D.H., et al., 1997; Zaunders J.J., et al, 2006).

Таким образом, окончательный фенотип T-reg клеток будет выглядеть следующим образом: CD3+CD4+CD25b"shtCD127dm'10 -™^Р0ХРЗ+ и для их детектирования можно использовать данный фенотип T-reg, без выявления FOXP3. Для более точной локали-

зации Т-ге# клеток предпочтительно использовать многоцветный анализ и многоэтапное гейтирование с использованием следующего набора ¿МА - С045-Р1ТС, С04-РС7, С025-РС5 и СВ127-РЕ (рис. 27). Среднестатистические результаты анализа T-reg клеток взрослых условно здоровых лиц представлены в таблице 5.

Таблица 5. Среднестатистическое содержание субпопуляций регуляторных Т-клеток в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (14 = 60).

Субпопуляции Содержание

Относительное (%) Абсолютное количество (кл/л)

Общие Т хелперы 45 ± 10 0,576-1,336 х Ю"

Рсгуляторныс Т-клстки (относительно Т хслперов) 3,7± 2,05 0,009-0,078 х 10ч

Субпопуляции CD4+CD25+ Т-клеток проявляют неодинаковую чувствительность к действию иономицина. В иономицин резистентной фракции (ИР-фракции) значительно возрастает доля CD4xCD25h;8h Т-клеток по сравнению с кровью того же донора, а содержание CD4rCD25lmv Т лимфоцитов уменьшается. Следовательно, большинство CD4+CD25l"eh Т лимфоцитов представлено резистентными к действию иономицина клетками. Полного исчезновения CD4+CD25l0"' Т лимфоцитов в ИР-фракции никогда не наблюдалось. Следовательно, и в составе CD4*CD25low Т лимфоцитов присутствуют клетки, различающиеся rio своей чувствительности к действию иономицина. Изменение содержания субпопуляций CD4+CD25* Т лимфоцитов в ответ на действие иономицина напрямую зависело от исходной доли Т-клеток с данным фенотипом в крови. Однако обогащение ИР-фракции CD4+CD25h,gh Т-клетками и одновременное с ним снижение доли CD4+CD25lmv Т лимфоцитов наблюдалось наиболее часто.

В сравнении с CD4+CD25hIgh Т-лимфоцитачи ПКЧ, ИР-популяция (рис. 28) всегда обогащена клетками с высоким уровнем экспрессии молекул HLA-DR и CD95. Одновременно ИР CD4+CD25hleh Т лимфоциты характеризуются меньшей долей CD62I/ клеток (рис. 28) и заметным снижением уровня экспрессии этих молекул. По сравнению с CD4+CD25low Т-клетками ПКЧ, ИР-фракция обогащена CD95" клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул (рис. 28). При этом в ИР-фракции CD4+CD25i0W Т лимфоцитов наблюдалось выраженное уменьшение доли CD62L+ клеток и снижение уровня экспрессии этих молекул. Среди ИР CD4+CD25l0W Т лимфоцитов уменьшение доли CD38+ клеток (рис. 28) происходит за счет лимфоцитов с низким уровнем экспрессии этого маркера.

Появление молекул HLA-DR на CD4+ Т лимфоцитах считается признаком поздней стадии активации этих клеток. Существование CD44CD25+HLA-DR+ Т-клеток в ПКЧ не позволяет полностью разграничить данный этап активации Т лимфоцитов от предыдущего. Большинство CD4+HLA-DR+ Т-клеток ПКЧ имеют, как правило, фенотип CD4+CD45RA~CD45R0+. Скорее всего, на поздних стадиях активации m vivo в ходе нормального развития первичного иммунного ответа основная часть этих СD4T Т

лимфоцитов человека качественно изменяет свой характер регуляции внутриклеточного Са2" и приобретает резистентность к действию низких доз иономицина. а б

■CD25I-) \ OCD2& (Icvíl :aCQ25<MglYv

Рис. 28. Анализ субпопуляций CD4+ Т лимфоцитов человека до (а) и после (б) инкубации клеток с иономицином, проведенный методом проточной цитофлуо-риметрии и разработанного алгоритма (см. рис. 26). По оси ординат приведены значения долей клеток в составе соответствующей субпопуляции.

Маркер наиболее поздней стадии активации in vivo Т лимфоцитов человека - молекулы CD29 (VLA - Very Late Antigen) - часто используется как дополнительный признак покоящихся CD4TCD45RATD45R0~ Т-клеток памяти. В составе ИР-фракции CD4+CD45R0+CD29" Т-клеток значительно больше, чем в исходной популяции того же донора (рис. 29). Вместе с тем, на значительной доле (в среднем около половины) CD4"rCD45RATD45R(T Т лимфоцитов ИР-фракции этот антиген отсутствует. Никаких экспериментальных данных в литературе о взаимосвязи молекул CD29 и CD45R0 до настоящего времени не описано. Степень обогащения ИР-фракции CD4+CD45R(TCD29' Т-лимфоцитами зависит от исходной доли клеток с данным фенотипом в составе лимфоцитов ПКЧ, но во всех исследованных случаях молекулы CD29 экспрессируются на меньшей доле ИР CD4+CD45RATD45RCf Т-клеток. Как правило, CD4+CD45RCrCD29T Т-клетки в ощутимых количествах встречаются только в крови больных хроническими инфекциями. Сопоставимые результаты были получены для лимфоцитов здоровых лиц. Вероятнее всего, на поздней стадии активации большая часть CD4TCD45R(TCD29" Т лимфоцитов состоит из резистентных к действию иономицина клеток, а, возможно, определенная часть CD4TCD45RCfCD29~ Т лимфоцитов является чувствительными к его действию клетками.

Появление CD4XD26" Т лимфоцитов также принято считать признаком специфической активации Т-клеток, хотя до сих пор остается неясным, на какой стадии диффе-ренцировки появляется данный маркер. В норме, около четверти CD4~ Т-клеток ПКЧ экспрессируют молекулы CD26. В ИР-фракции доля CD4*CD26* Т лимфоцитов всегда значительно выше, чем в ПКЧ того же донора, и составляет, как правило, более половины соответствующей популяции (рис. 29). Таким образом, значительная часть

CD4+CD26+CD45RA~CD45R0+ T лимфоцитов человека является резистентной к действию иономицина.

г б

10' 7,2"«, 7,4«

ш (D 1 СЧ : О : О а- ü ■ é

Ш 37 6».

ИГ 10'

CD4-FITC

iff" 10' " i» lo1

CD4-FITC

ш

О-

É 1Л

... to- 11 3% 1У ш а. 45,2?о 4?

lo-' • , I'*1', § ю т Q

1С ш i- , 11.4« О 3,1'Ь

■

№ 1 ю1 1 да to* 10" ¡ 10a to1

CD29-FITC

CD29-FITC

Рис. 29 Анализ состава CD4+ Т лимфоцитов человека до (а) и после (б) инкубации клеток с иономицином. Гистограммы показывают экспрессию CD4SR0, CD26 и CD29 молекул на поверхности CD4+ Т-клеток.

В целом возникновение резистентности к действию низких доз иономицина и изменение гомеостаза ионов кальция в CD4+ Т-клетках наиболее характерно для самых поздних стадий дифференцировки активированных in vivo CD4^ Т лимфоцитов человека. В полной мере это свойство характерно для долгоживущих покоящихся CD4+CD45RA"CD45R0+ Т лимфоцитов памяти человека.

Как и следует ожидать от системы, работающей по принципу клональной селекции, каждый антиген активирует лишь ничтожно малую часть всей популяции Т лимфоцитов. Дм выполнения своих функций наивным Т-лимфоцитам необходима пролиферация (поскольку на антиген реагируют лишь немногие клоны, содержащие малое число клеток, и для развития интенсивного ответа требуется их предварительное размножение). По этой причине подавляющее большинство работ по изучению закономерностей активации Т лимфоцитов выполнены in vitro с использованием митогенных лектинов (СопА и ФГА), смеси ФМА с Са2+-ионофорами (иономицин), или МА к комплексу CD3-TCR. Каждый этап специфической активации Т-клеток in vivo происходит в конкретном микроокружении, полностью смоделировать которое в реальных условиях эксперимента вряд ли представляется возможным.

Общепринятый фенотип наивных CD4+ Т-клеток человека может быть описан как CD45RA+CD45R0XD25 CD29'CD62L+CD69XD95TÍLA-DR". Большинство покоящихся наивных CD4+CD45RA+CD45R0~ Т лимфоцитов, как и Т-клетки тимуса, являются чувствительными к действию Са2+-ионофоров. Многократное возрастание ионов Са2+ всегда происходит наиболее резко в первые минуты стимуляции Т лимфоцитов и достигает максимума в течение 5-10 мин. Следовательно, чувствительность к присутствию ионов кальция в среде и к действию иономицина является необходимым условием для осуществления стадий индукции активации наивных Т лимфоцитов.

Чувствительность ранних этапов активации (от момента начала поликлональной стимуляции и до появления на поверхности Т лимфоцитов молекул CD25) к присутствию ионов кальция во внешней среде и их зависимость от амплитуды роста внутриклеточного Са2+ в ответ на стимул признается большинством исследователей. Данный этап активации по продолжительности колеблется от 8 до 12 ч. Этот же временной интервал принято характеризовать и по появлению молекул CD69. Экспрессия молекул CD69 в активированных Т-клетках полностью подавляется EGTA. Среди лимфоцитов ИР-фракции присутствие CD4+CD45R0~CD45RA+CD69+ Т-клеток никогда не наблюдается. Скорее всего, большинство CD4+CD45RA+CD45R0,owCD69+ Т-лимфоцитов человека представляют собой чувствительные к действию иономицина клетки. Возможно, до появления молекул CD25 на активированных CD4 CD45R0XD45RA* Т-лимфоцитах эти клетки и проходят несколько этапов начатьной стадии активации, но все они не сопровождаются качественными изменениями их чувствительности к действию иономицина. Следовательно, для инициации процесса активации чувствительность Т-клеток к ионо-мицину совпадает с их наиболее сильной зависимостью от присутствия Са2+ в среде. Так как ионы кальция всегда присутствуют в организме, то резистентность к действию иономицина просто не может появиться на данном этапе активации.

Одной из ключевых стадий процесса активации принято считать появление CD4+CD25+ Т-клеток. Влияние удаления ионов кальция с помощью EGTA из среды на экспрессию молекул CD25 Т-клетками сильно зависит от времени добавления хелатора. Как правило, чем на более ранней стадии ионы кальция были удалены из среды инкубации клеток, тем большее влияние это оказывает на экспрессию молекул CD25. Скорее всего, для индукции синтеза молекул CD25 de novo присутствие ионов кальция абсолютно необходимо. Экспрессия молекул CD25 на активированных Т-клетках, прошедших стадию индукции, значительно меньше зависит от EGTA. Дтя более поздних стадий активации какого-либо эффекта EGTA на CD25+ Т-клетки отмечено не было. Это свидетельствует о значительном снижении зависимости этой и, возможно, последующих стадий активации Т-клеток от присутствия ионов кальция в среде.

Доля CD4+CD25+ Т-клеток в составе ИР-фракции лишь незначительно отличалась от их содержания в крови того же донора. Это позволяет предположить появление ИР Т-клеток, в которых произошла перестройка гомеостаза ионов кальция, именно на данной стадии активации in vivo CD4* Т лимфоцитов. В популяции CD4+CD25i Т-клеток ПКЧ присутствуют пролиферирующие и регуляторные CD4+ Т лимфоциты. Существуют ли взаимные переходы между CD4+CD25blg1' и CD4+CD25low популяция-

ми, до сих пор остается неизвестным. Субпопуляции этих клеток проявляют неодинаковую чувствительность к Са2+-ионофору. Большинство CD4TCD25h'sh Т лимфоцитов представлено резистентными к действию иопомицина клетками. В сравнении с CD4+CD25h'sh Т-лимфоцитами ПКЧ, ИР-фракция всегда обогащена HLA-DR+, CD95" и CD38+ клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул, но одновременно содержит меньше CD62L* клеток. В сравнении с CD4'CD25low Т-клетками ПКЧ, ИР популяция обогащена CD95+ клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул. При этом в ИР-фракции CD4+CD25low Т лимфоцитов наблюдается выраженное уменьшение доли CD62I7 клеток. Скорее всего, Т-клетки с измененным гомеостазом ионов кальция появляются на стадии интенсивной пролиферации активированных CD4+ Т лимфоцитов, но составляют меньшую долю этой популяции. В популяции ре-гуляторных CD4'CD25h'gh Т лимфоцитов доля ИР-клеток значительно выше. Какие-либо данные о зависимости этих популяций от присутствия ионов кальция в среде на настоящий момент отсутствуют.

Появление молекул HLA-DR является общепринятым признаком поздней стадии активации CD4+ Т лимфоцитов. Специальных работ по изучению роли ионов кальция в экспрессии молекул HLA-DR не проводилось, но отмечается минимальный вклад кальмодулин-зависимых процессов (сАМР- или cGMP-зависимые протеинкиназы) в осуществление экспрессии. Доля ИР CD4+HLA-DR+ Т-клеток всегда была значительно выше, чем в крови того же донора. Скорее всего, на поздних стадиях активации т vivo большая часть активированных CD4f Т-клеток качественно изменяет характер внутриклеточной регуляции ионов кальция и приобретает резистентность к действию иономицина.

Молекулы CD29 часто используются в качестве дополнительного признака покоящихся CD4+CD45RA"CD45R0+ Т-клеток памяти. Для этого маркера отсутствуют четкие указания на зависимость его экспрессии от стадии активации CD4+ Т лимфоцитов. Роль ионов кальция в индукции экспрессии этих молекул также до сих пор неизвестна. ИР-фракция значительно обогащена CD4+CD45R0fCD29+ Т-клетками по сравнению с исходной популяцией в крови донора. Однако на значительной доле (в среднем около половины) CD4+CD45RA"CD45R0+IiP Т-клеток этот антиген отсутствует. Скорее всего, на этой, достаточно поздней стадии активации CD4+ Т лимфоцитов, происходит полная замена изоформы CD45RA на CD45R0. Вероятно, на этой стадии активации большая часть CD4+CD29+ 'Г лимфоцитов состоит из резистентных к действию иономицина клеток. Никаких работ по сравнительному анализу функциональных свойств CD45R0+CD29~ и CD45R0+CD29+CD4" Т-клеток до настоящего времени не проводилось.

Дополнительным признаком покоящихся CD4+CD45RA~CD45R0+ Т лимфоцитов памяти человека принято считать присутствие в популяции CD28+ клеток. Действие иономицина на лимфоциты ПКЧ сопровождается значительным обогащением популяции CD4+CD45RA~CD45R0+CD28+CD29+CD62LIOW Т-клетками. Неодинаковая чувствительность к иономицину CD62Lhlgh и CD62L|0W Т лимфоцитов хорошо совпадает с общепринятым подразделением популяции CD4+ Т-клеток человека по путям мигра-

ции по организму. Для Т лимфоцитов человека имеются указания на различную чувствительность к апоптозу СБ28~ и С028" клеток - наиболее готовыми к апоптозу клетками принято считать С04,"С0951"81'С028~ клетки. Согласно современной классификации, наиболее полно фенотип ИР СИ4* Т-клеток человека совпадает с популяцией «центрального ядра» Т-клеток памяти. В этой популяции Т лимфоцитов памяти представлены покоящиеся Т-клетки человека, полностью прошедшие зависимую от антигена дифференцировку в ходе первичного иммунного ответа. Данные клетки обладают ограниченной способностью к миграции по высоко-эндотелиальным вепу-лам.

Т-клетки _k CWSRQj

памяти

С 04

а,

CD4SRA

CD3

Наивные Т-клетки

s

I

S

0

1 с S к J t-о о

X

Дифференцировка CD4+ Т-лимфоцитов

Рис. 30. Диаграмма, иллюстрирующая возникновение резистентности к действию иономицина, CD4+ Т лимфоцитов памяти человека в ходе зависимой от антигена дифференцировки из наивных предшественников как результат нормального развития первичного иммунного ответа ш vivo.

ИР Т-клетки были описаны ранее для селезенки и лимфатических узлов мыши. Использование лабораторных животных дает редкую возможность проводить эксперименты методом адоптивного переноса: выделенные и охарактеризованные популяции иммунных клеток доноров (мышей) переносят наивным сингенным реципиентам, в которых и проверяют ш vivo функциональные свойства перенесенных клеток. Только выделенные ИР Т-клетки из селезенок переболевших или вакцинированных мышей-доноров оказались способны адоптивно переносить наивным ре-

ципиентам невосприимчивость к последующему заражению Mycobacterium tuberculosis и Neisseria meningitidis в соответствующих моделях. Приведенные данные прямо свидетельствуют о способности ИР Т-клеток к выполнению основных функций Т лимфоцитов памяти, связанных с распознаванием антигенов возбудителя и быстрого и усиленного ответа на них in vivo, приводящего к эффективной защите реципиентов от патогена. Большинство специфичных к антигену Т лимфоцитов селезенки и лимфатических узлов мыши также сосредоточено в ИР-фракции Т-клеток.

ИР Т-клетки человека сохраняют способность отвечать на стимуляцию смесью ФМА с иономицином. Для выделенных CD4TCD45R0+ Т-клеток памяти человека также показана значительно меньшая зависимость пролиферации и продукции IL-2 от концентрации ионов кальция в среде при стимуляции МА к CD3, по сравнению с наивными CD4+ Т-клетками того же донора. Следовательно, резистентность к действию иономицина Т-клеток памяти «не мешает» им осуществлять важнейшие функции Т-клеток памяти in vivo и in vitro.

Полученные экспериментальные данные суммированы в виде схемы, приведенной на рис. 30, иллюстрирующей изменение гомеостаза ионов кальция в CD4+ Т-лимфоцитах в процессе их активации и дифференцировки in vivo. Данная схема носит гипотетический характер, так как не все стадии активации и дифференцировки CD4+ Т-клеток in vivo описаны одинаково подробно.

Ионы кальция всегда присутствуют в организме. Они необходимы для протекания множества биохимических реакций в клетках. При дифференцировке in vivo активированных Т лимфоцитов роль ионов кальция постоянно меняется. Все покоящиеся наивные CD4+CD45RA"CD45R0~ Т-клетки чувствительны к действию низких доз иономицина. Индукция активации наивных Т лимфоцитов всегда приводит к повышению Ca2" внутри клеток. На этой стадии активации Т-клетки сохраняют чувствительность к действию иономицина. Более поздние стадии активации значительно меньше зависят от присутствия ионов кальция, и часть активированных клеток приобретает резистентность к действию иономицина. Покоящиеся CD4+CD45RA~CD45R0' Т-клетки памяти вообще резистентны к действию иономицина, но это не препятствует осуществлению ими своих физиололнческих функций, связанных с распознаванием антигенов возбудителя и быстрого и усиленного ответа на них in vivo, приводящего к эффективной защите организма от патогенов.

ВЫВОДЫ

1. Разработанный алгоритм оптимизации настройки приборов и создания протоколов цитометрического анализа для стандартизации исследований изучаемых параметров клеток иммунной системы применим для работы на большинстве проточных цитометров ведущих фирм производителей.

2. Последовательное введение логически ограниченных зон при многоцветном анализе лимфоцитов выявляет наличие отдельных минорных субпопуляций, различие

в плотности экспрессии маркеров внутри изучаемой субпопуляции клеток, стадию дифференцировки и степень их активации.

3. Результаты проведенных скрининговых исследований условно здоровых лиц в различных регионах России с определением среднестатистическиих значений параметров иммунного статуса сопоставимы со среднестатистическими значениями параметров иммунного статуса человека опубликованными в литературе.

4. Методологический подход, включающий введение в первичную панель скриниго-вого исследования иммунной системы антител для выявления аутореактивных клонов В-клеток (В1, СВ19-КЛЭ5+), улучшает диагностику и мониторинг за пациентами с аутоиммунными заболеваниями (аутоиммунный тиреоидит).

5. В клинико-диагностической практике наиболее предпочтителен четырехцветный цитометрический анализ по сравнению с двух- и трехцветным, что дает возможность получать достоверные данные, характеризующие как субпопуляционный состав, так и ряд функциональных параметров иммунокомпетентных клеток при уменьшении количества образцов и времени, затраченного на получение конечного результата.

6. Предложена и внедрена в практическую работу четырехцветная панель монокло-нальных антител к различным кластерам дифференцировки лимфоцитов периферической крови учитывающая степень активации различных субпопуляций Т-кяеток, В-клеток и Ж-клеток:

120%Ст/[£0СГ)45 - изотопический контроль; С019/СБ5/С027/С045 - В1, В2, В-клетки памяти; С01б/С056/С03/С045 - субпопуляции Ж-клеток; СБ8/С04/С03/С045 - субпопуляции Т-клеток;

С08/С038/С03/С045 - активированные Т-цитотоксические и Ж-клетки; С04/С025/Ш,А-ВМЛ)45 - активированные Т хелперы; СБ45КА/С045110/СВ4/СВ45 - активированные Т хелперы и Т-клетки памяти; ТСК-ар/ТСК-у5/СОЗ/СБ45 - ар- и у5-Т-клетки; С04/СБ25/СШ27/С045 - Т-регуляторные клетки.

7. Разработанные критерии применения многоцветных параметров для иммунофе-нотипирования клеток, в том числе при использовании первичной панели для скрининговых исследований и вторичной панели для более углубленного анализа включают: а) анализ гистограмм на наличие клеток с измененной экспрессией линейных маркеров; б) сравнение полученных значений с референтными; в) анализ плотности экспрессии значимых маркеров лимфоцитов; г) оценка степени активации иммунокомпетентных клеток.

8. Дифференцировка Т лимфоцитов от наивных Т-хелперов (СО4+СВ7+СО45КА+СО45Я0ТВ25ТП29"СВ62Ь+СОб9"СО95-НЬА-ВГ) к Т-клеткам памяти (С04Х07"С04511АТ045Я(ГС028Х029ХВ62Ь10"') сопровождается изменением рецепторного репертуара и перестройкой системы Са2+-гомеостаза, что приводит к возникновению их резистентности к действию кальциевых ионофоров.

9. Обоснованное применение многоцветного цитомстрического анализа значительно расширяет возможности клинико-диагностических и научных исследований иммунной системы человека и биологических объектов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Коллективные монографии и главы в книгах.

1. Дозморов И.М., Багаева Л.В., Коваленко ГШ., Кузин И.Л, Литвинов И.С., Луцан

H.И., Луценко Г.В., Молотковская И.М., Петров Р.В., Прохорова А.Л., Рысева И.А., Хайдуков С.В., Сапожников A.M., Свирщевская Е.В. Альтернативность в действии гликопептидов бактериальной стенки на иммунную систему и ее компа-ненты. // Синтетические иммупомодуляторы. Под ред. Р.В. Петрова, М.: Наука,

1991, с. 38-96.

2. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Dorodnikh E.G., Valyakina T.I., Malakhov A., Brisken K. The molecular mechanism of muramyl peptides' biological activity. // Hacmotology and Blood Transfusion, Modern Trends in Human Leukemia IX, R. Neth et al. (Eds.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg,

1992, p. 290-293.

3. Vlasova E.V., Galanina O.E., Khaidukov S.V., Tuzikov A.B., Tzvetkov Y.E., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Bovin N.V. Specificity of Workshop mAb S071-S076 towards synthetic selection receptors and cell lines A431 and HL-60. // Leucocyte Typing V. White Cell Differentiation Antigens. S.F. Schlossman et al. (Eds.), Oxford University Press vol.

I,1995, p. 1534-1535.

4. Vlasova E.V., Kovalenko E.I., Lukin S.V., Khaidukov S.V., Nifant'ev N.E., Piskarev V.E., Bovin N.V. Myeloid Blind Panel biochemical analysis: Specificity of anti-carbohydrate MA submitted to Myeloid cells section.'/ Leucocyte Typing VI. White Cell Differentiation Antigens, Tadamitsu Kishimoto (Eds.), Garland Publishing, Inc. NY & London, 1997, p. 1038-1040.

5. Избранные вопросы современной проточной цитометрии. // Под ред. Хайдукова С.В., Зурочки А.В. Челябинск, Издательство "Челябинская государственная медицинская академия", 2007, 85 с.

6. Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях: Краткое методическое руководство. // Екатеринбург, УрО РАН, 2008, 59 с.

7. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. // Под ред. Хайдукова С.В., Зурочки А.В. Челябинск. Издательство "Челябинская государственная медицинская академия". 2008,196 с.

Статьи в журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

8. Юровский В.В., Сафонова Н.Г., Хайдуков С.В., Василов Р.Г., Демин В.В. Синтез и иммунохимическое изучение антигенной детерминанты Н^-молекулы главного комплекса гистосовместимости мыши. // Биоорганическая химия, 1986, 12 (1), с. 89-99

9. Гиляревский С.Д., Хайдуков С.В., Лунева Н.М., Несмеянов В.А. Фенотипирование и функциональная характеристика линии клеток лимфосаркомы крысы. // Иммунология, 1987,2, с. 33-36.

Ю.Несмеянов В.А., Хайдуков С.В., Комалева Р.Л., Андронова Т.М., Иванов В.Т.. Влияние N-ацетилглюкозамини л-(31 -4^-ацетилмурамои л-Е-аланил-D-

изоглутамина на экспрессию 1а-антигенов макрофагами мыши. // Биологические мембраны, 1989, 6 (3), с. 245-249.

ll.Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Khaidukov S.V., Golovina T.N., Kamraz M.V., Ko-mal'eva R.L., Andronova T.M., Makarov E.A., Nesmeyanov V.A., Ivanov V.T. Muramyl peptide-binding sites are located inside target cells. // FEBS Lett. 1991,295 (1-3), p. 4850.

12. Stratieva-Taneeva P.A., Khaidukov S.V., Kovalenko V.A., Nazimov I.V., Samochvalova L.V., Nesmeyanov V.A. Bispecific monoclonal antibodies to human Interleikin 2 and horseredish peroxidase. //Hybridoma, 1993,12 (3), p. 271-284.

13. Vlasova E.V., Byramova N.E., Tuzikov A.B., Zhegis L.S., Rapoport E.M., Khaidukov S.V., Bovin N.V. Monoclonal antibodies directed to synthetic carbohydrate antigen Ley. // Hybridoma, 1994,13 (4), p. 295-301.

14. Pukhalsky A., Toptygina A., Khaidukov S. Interleukin-2 receptor ß chain as a possibile target for low doses of mafosfamide. // Mediators of Inflammation, 1995, 4 (3), p. 175180.

15.Хайдуков C.B., Комалева P.JI., Несмеянов B.A. Макрофаги - основная мишень ди-сахаридсодержащих мурамил-пептидов. // Иммунология, 1995, 3, с. 26-30.

16. Марквичева Е.А., Мареева Т.Ю., Хайдуков C.B., Бронин A.C., Несмеянов В.А., Зубов В.П. Влияние иммобилизации в гранулы гидрогеля на структурно-функциональные особенности гибридных клеток в процессе культивирования. // Биологические мембраны, 1995,12(2), с. 122-129.

17. Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Nesmeyanov V.A. N-acetylglucosamine-containing muramyl peptides directly affect macrophages. // Int J Immunopharmacol. 1995, 17(11), р.^ОЗ-ЭИ.

18. Шиян С.Д., Пухальский А.Л., Хайдуков C.B., Топтыгина А.П., Бовин H.B. Взаимодействие лейкоцитов периферической крови с а^кислым гликопрогеином, его углеводными цепями и неогликоконъюгатами. // Гематалогия и трансфузиология, 1996,41(2), с. 24-29.

19. Шебзухов Ю.В., Токсамбаева С.Ж., Хайдуков C.B., Мысякин Е.Б. Влияние фактора активации тромбоцитов и его синтетических аналогов на экспрессию 1а-антигенов перитонеальными макрофагами мыши. // Журнал Эпидемиологии, Микробиологии и Иммунобиологии, 1996,3, с. 114-117.

20. Калашникова Е.А., Хайдуков C.B., Пухальский А.Л. Влияние разных доз дексаме-тазона и состава клеточной популяции на продукцию in vitro фактора некроза опухолей и интерлейкина-6 мононуклеарами периферической крови человека. // Бюллетени Экспериментальной Биологии и Медицины, 1996,6, с. 667-672.

21. Еремеев В.В., Лядова И.В., Майоров К.Б., Хайдуков C.B., Мороз A.M., Апт A.C.. Получение и частичная характеристика специфических к антигенам микобактерий клонов Т-клеток от мышей с генетически различной чувствительностью к туберкулезу. // Бюллетени Экспериментальной Биологии и Медицины, 1997, 123 (4), с. 431-434.

22. Хайдуков C.B., Бочарова И.В., Межлумова М.Б., Литвинов И.С., Яхин Р.Т., Никоненко Б.В. Иммунологическая память, индуцированная Mycobacterium bovis (BCG) у инбредных мышей. // Бюллетени Экспериментальной Биологии и Медицины, 1997,123(11), с. 553-555.

23. Коваленко Е.И., Саблина М.А., Хирова Е.В., Хайдуков C.B., Бовин Н.В. Встраивание неогликолипидов в мембрану клеток К562. Модель для изучения углеводзави-симого лизиса клеток-мишеней естественными киллерами. // Биоорганическая химия, 1998,24 (3), с. 224-228.

24. Водовозова E.JL, Хайдуков С.В., Гаенко Г.П., Бондарчук Т.Н., Михалев И.И., Гре-чишникова И.В., Молотковский Юл.Г. Транспортировка цитотоксических липосом к злокачественным клеткам с помощью углеводных детерминант. // Биоорганическая химия, 1998, 24 (10), с. 760-767.

25. Pichugin A.V., Khaidukov S.V., Moroz A.M., Apt A.S. Capacity of murine T cells to retain long-term responsiveness to mycobacterial antigens is controlled by the H-2 com-plex.//Clin. Exp. Immunol.. 1998, 111 (2),p. 316-324.

26.Lyadova I., Yeremeev V., Majorov K., Nikonenko В.. Khaidukov S., Kondratieva Т., Kobcts N., Apt A. An ex vivo study of T lymphocytes recovered from the lungs of I/St mice infected with and susceptible to Mycobacterium tuberculosis. // Infect. Immun. 1998,66(10), p. 4981-4988.

27. Рапопорт E.M., Некрасов M.B., Хайдуков C.B., Свирщевская Е.В., Жигис Л.С., Козлов Л.В., Баталова Т.Н., Зубов В.П., Бовин Н.В. Изучение клеточной локализации галактозосвязывающего листана из сыворотки крови человека. // Биохимия,

2000, 65 (И),р. 1558-1563.

28. Lyadova I.V., Eruslanov Е.В., Khaidukov S.V., Yeremeev V.V., Majorov K.B., Pichugin A.V., Nikonenko B.V., Kondratieva Т.К., Apt A.S. Comparative analysis of T lymphocytes recovered from the lungs of mice genetically susceptible, resistant, and hyperresis-tant to Mycobacterium tuberculosis-triggered disease. // J Immunol. 2000, 165 (10), p. 5921-5931.

29. Kondratieva Т.К., Kobets N.V., Khaidukov S.V., Yeremeev V.V., Lyadova I.V., Apt A.S., Tarn M.F., Stevenson M.M. Characterization of T cell clones derived from lymph nodes and lungs of Pseudomonas aeruginosa-susceptible and resistant mice following immunization with heat-killed bacteria. // Clin Exp Immunol. 2000, 121 (2), p. 275-282.

30. Никоненко Б.В., Хайдуков С.В., Литвинов И.С., Бочарова И.В., Апт А.С. Иммунологическая память у мышей линий СВА и CBA/N при вакцинации Mycobacterium bovis (BCG). // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 13 J (6),

2001, с. 649-651.

ЗЕСащенко Л.П., Козырь А.В., Лукьянова Т.И., Габибов А.Г., Сучков С.В., Бобик Т.В., Хайдуков С.В., Алекберова З.С., Гнучев Н.В. Каспаззависимая цитотоксич-ность ДНК-аутоантител. // Доклады Академии Наук, 2001,380 (1), с. 117-119.

32. Lyadova I.V., Vordermeier Н.М., Eruslanov Е.В., Khaidukov S.V., Apt A.S., Hewinson R.G. Intranasal BCG vaccination protects BALB/c mice against virulent Mycobacterium bovis and accelerates production of IFN-gamma in their lungs. // Clin. Exp. Immunol. 2001,126 (2), p. 274-279.

33. Blishchenko E.Y., Kalinina O.A., Sazonova O.V., Khaidukov S.V., Egorova N.S., Suro-voy A.Y., Philippova M.M., Vass A.A., Karelin A.A., Ivanov V.T. Endogenous fragment of hemoglobin, neokyotorphin, as cell growth factor. // Peptides, 2001, 22 (12), p. 19992008.

34.Ночевный B.T., Хайдуков C.B. Культура клеток кожи перепелиных эмбрионов. // Аграрная наука, 2001, №> 6, с. 22-24.

35. Петрова Е.Э., Валякина Т.И., Хайдуков С.В., Несмеянов В.А. Эндогенный фактор некроза опухолей демаскирует на поверхности клеток меланомы центры связывания К-ацетилглюкозаминил-ф М)-№ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамииа. // Биоорганическая химия, 2001,27 (4), с. 249-256.

36. Гаенко Г.П., Козлов A.M., Сапрыкина Н.С., Доротникова Е.Б., С.В. Хайдуков, Молотковский Ю.Г. Некоторые характеристики фенотипа клеток карциномы легкого Льюис. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2002,134 (10), с. 443-446.

37. Хайдуков С.В., Холоденко И.В., Литвинов И.С. Иономицин-резистентная субпо-пуляцт CD4+ Т лимфоцитов периферической крови человека. Фенотипическая характеристика. // Цитология, 2003,45 (3), с. 249-254.

38. Хайдуков С.В., Литвинов И.С. Иономицин-резистентная субпопуляция CD4+ Т лимфоцитов периферической крови человека. Функциональная характеристика. // Биологические мембраны, 2003,20 (4), с. 333-340.

39. Хайдуков С.В., Литвинов И.С. Фенотипическая характеристика CD4+ Т лимфоцитов периферической крови человека, экспрессирующих белки множественной лекарственной устойчивости. // Биологические мембраны, 2003,20 (5), с. 381-385.

40. Rapoport Е., Khaidukov S., Baidina О., Bojenko V., Moiseeva Е., Pasynina G., Karsten U., Nifant'ev N., LePendue J., Bovin N. Involvement of the Galbetal - 3GalNAcbeta structure in the recognition of apoptotic bodies by THP-1 cells. // Eur. J. Cell. Biol. 2003, 82 (6), p. 295-302.

41. Sashchenko L.P., Dukhanina E.A., Yashin D.V., Shatalov Y.V., Romanova E.A., Korobko E.V., Demin A.V., Lukyanova T.I., Kabanova O.D., Khaidukov S.V., Kiselev S.L., Gabibov A.G., Gnuchev N.V., Georgiev G.P. Peptidoglycan recognition protein tag7 forms a cytotoxic complex with heat shock protein 70 in solution and in lymphocytes. //J. Biol. Chem. 2004, 279 (3), p. 2117-2124.

42. Коваленко Е.И., Хирова E.B., Молотковская И.М., Овчинникова Т.В., Саблина М.А., Сапожников A.M., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Модификация поверхности клеток с помощью липофильных гликоконъюгатов и взаимодействие модифицированных клеток с натуральными киллерами // Биоорганическая химия, 2004, 30 (3), с. 281-292.

43.Гяенко Г.П., С.В. Хайдуков, Молотковский Ю.Г. Экспрессия коллагена IV типа клетками карциномы легкого крысы. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2004,137 (1), с. 78-80.

44. Колышкин В.М., Ночевный В.Т., Юрков С.Г., С.В. Хайдуков, Виолин Б.В. Проточная цитометрия для стандартизации линии клеток фибробластов и эмбрионов кур. // Аграрная наука, 2004,3, с. 27-29.

45. Хайдуков С.В., Литвинов И.С. Изменение гомеостаза ионов кальция в CD4+ Т_лимфоцитах периферической крови человека в процессе дифференцировки in vivo. // Биохимия, 2005,70(6), с. 838 - 849.

46. Хайдуков С.В., Агафонова С.А., Литвинов И.С. Сравнительный анализ фенотипи-ческих характеристик наивных Т-клеток и Т-клеток памяти селезенки мышей линии СВА. // Биологические мембраны, 2005,22 (6), с. 482-491.

47. Кирилина Е.А., Суворов Н.И., Попова С.С., Хайдуков С.В., Рапопорт Е.М., Фонина ЛА., Михайлов А.А. Индукция дифференцировки в лейкозных клеточных линиях под влиянием миелопептида-4. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2005,140 (11), с. 565-569.

48. Гурьянов С.А., Кирилина Е.А., Хайдуков С.В., Суворов Н.И., Молотковская И.М., Михайлова А.А. Специфическое связывание и проникновение внутрь клетки-мишени флуоресцентно меченного миелопептида-4, обладающего дифференциро-вочной активностью. // Биоорганическая химия, 2006, 32 (6), с. 574-578.

49.Petrova Е.Е., Valyakina T.I., Simonova М.А., Komaleva R.L., Khaidukov S.V., Makarov E.A., Blokhin D.Y., Ivanov P.K., Andronova T.M., Nesmeyanov V.A. Mura-myl peptides augment cytotoxic effect of tumor necrosis factor-alpha in combination with cytotoxic drugs on tumor cells. // Int. Immunopharmacol. 2006, 6 (9), p. 1377-1386.

50. Ponomarenko N.A., Vorobiev I.I., Alexandrova E.S., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Khaidukov S.V., Avalle В., Karavanov A., Morse H.C. 3rd, Thomas D., Friboulet A., Gabibov A.G. Induction of a protein-targeted catalytic response in autoimmune prone

mice: antibody-mediated eleavage of HIV-1 glycoprotein GP120. // Biochemistry, 2006, 45(1), p. 324-330.

51.Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Проточная цитометрия как современный мезод анализа в биологии и медицине. // Медицинская иммунология, 2007, 9 (4-5), с. 373378.

52.Хайдуков С.В. Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для им-мунофепотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для анализа. // Медицинская иммунология, 2007, 9 (6), с. 569-574.

53. Sashchenko L.P., Dukhanma Е.А., Shatalov Y.V., Yashin D.V., Lukyanova T.I., Ka-banova O.D., Romanova E.A., Khaidukov S.V., Galkin A.V., Gnuchev N.V., Georgiev G.P. Cytotoxic T lymphocytes carrying a pattern recognition protein Tag7 can detect evasive, HLA-negative but Hsp70-exposing tumor cells, thereby ensuring FasL/Fas-mediated contact killing. // Blood. 2007, 110(6), p. 1997-2004.

54. Kovalenko E.I., Abakushina E., Telford W., Kapoor V., Korchagina E., Khaidukov S., Molotkovskaya I., Sapozlmikov A., Vlaskin P., Bovin N. Clustered carbohydrates as a target for natural killer cells: a model system. // Histochem Cell. Biol., 2007, 127 (3), p. 313-326.

55.Хайдуков C.B., Зурочка А.В. Расширение возможностей метода проточной цитометрии для клинико-иммунологической практики. // Медицинская иммунология, 2008, 10(1), с. 5-13.

56. Blishchenko Е., Sazonova О., Surovoy A., Khaidukov S., Sheikine Y., Sokolov D., Freidlin I., Philippova M., Vass A., Karelin A., Ivanov V. Antiproliferative action of valorphin in cell cultures. IIJ Pept Sci. 2002, 8 (8), p. 438-452.

57. Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Lukjanova T.I., Redchenko I.V., Kabanova O.D., Lu-kanidin E.M., Blishchenko E.Yu., Satpaev D.K., Khaidukov S.V., Chertov O.Yu. Time-dependent changes of LAK cell phenotypes correlate with the secretion of different cytotoxic proteins.//Immunol. Lett.,, 1993,37 (2-3), p. 153-157.

58. Kozyr A.V., Sashchenko L.P., Kolesnikov A.V., Zelenova N.A., Khaidukov S.V., Igna-tova A.N., Bobik T.V., Gabibov A.G., Alekbcrova Z.S., Suchkov S.V., Gnuchev NV. Anti-DNA autoantibodies reveal toxicity to tumor cell lines. // Immunol. Lett., 2002, 80 (1), p. 41-47.

59. Хайдуков C.B., Зурочка А.В. Многоцветный цито,метрический анализ. Идентификация В-клеток. // Российский Иммунологический Журнал, 2007,1(10), 3-4, с. 220228.

60. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Многоцветный цитометрический анализ. Идентификация NK-клеток. // Российский Иммунологический Журнал, 2008, 2 (11), 1, с. 2030.

61. Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Чсрешнев В.А. Многоцветный цитометрический анализ. Идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии a(5-TCR и у8-TCR.//Медицинская иммунология, 2008,10 (2-3), с. 115-124.

62. Шипаева Е.В., Коваленко Л.П., Хайдуков С.В., Колик Л.Г., Гудашева Т.А., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Иммунокорригирующие свойства дипептида ГБ-115. / Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2008 г., 145 (5), с. 548-551.

Публикации (тезисы докладов и статьи) в журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

63. Kovalenko E.I., Khaidukov S.V., Sablina М.А., Khirova E.V., Bovin N.V. The model system for the study of carbohydrate-dependent NK cells-mediated cytotoxicity. // Immunology, Supplement 1, Abstracts 6th Annual Congress of the British Society for Immunology, Harrogate, UK, 1-4 December 1998,95, p. 105.

64. Хайдуков С.В., Литвинов И.С., Дедкова Е.Н., Агафонова С.А. Зинченко В.П. Особенности Са2+-зависимой внутриклеточной сигнализации в Т-лимфоцитах памяти. // Медицинская иммунология, Материалы III конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99" 18-20 мая 1999,1 (3-4), с. 17.

65. Хирова Е.В., Коваленко Е.И., Саблина М.А., Хайдуков С.В., Бовин Н.В.Модельная система для изучения роли углеводов поверхности клеток-мишеней на цитотокси-ческую активность естественных киллеров человека. // Медицинская иммунология, Материалы III конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99" 18-20 мая 1999, 1 (3-4), с. 26-27.

66. Агафонова С.А., Котельникова О.В., Литвинов И.С., Хайдуков С.В., Несмеянов В.А Клеточный иммунный ответ к возбудителю менингита группы В - Neisseria meningitidis. фенотипический анализ "протективных" субпопуляций. // Медицинская иммунология, Материалы III конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99" 18-20 мая 1999,1 (3-4), с. 91.

67. Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Хайдуков С.В., Филиппова М.М., Калинина О.А., Сазонова О.В., Яцкин О.Н., Пивник А.В., Иванов В.Т. Компаненты тканеспецифи-ческих пептидных комплексов тканей: биологическая роль при норме и патологии. // Медицинская иммунология, Материалы IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мая, 2000,2 (2), с. 122.

68. Коваленко Е.И., Хирова Е.В., Овчинникова Т.В., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Изучение влияния углеводов на цитотоксическую активность NK-клеток человека с использованием липофильных гликоконъюгатов. // Медицинская иммунология, Материалы IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мЛ, 2000,2(2), с. 130-131.

69. Коваленко Е.И., Хайдуков С.В., Хирова Е.В., Поклонский Д.Л., Литвинов И.С. NK-клетки человека резистентны к низким дозам иономицина. // Медицинская иммунология, Материалы IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мая, 2000,2 (2), с. 131.

70. Хайдуков С.В., Чудакова Д.А., Агафонова С.А., Литвинов И.С. Фенотипическая характеристика Т-клеток памяти мышей. // Медицинская иммунология, Материалы IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мая, 2000, 2 (2), с. 141-142.

71.Тонеев В.В., Поклонский Д.Л., Хирова Е.В., Чудакова Д.Л., Хайдуков С.В., Литвинов И.С. Различная чувствительность субпопуляций Т-клеток человека к низким дозам иономицина. // Медицинская иммунология, Материалы IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мая, 2000,2 (2), с. 141.

72. Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Филиппова М.М., Калинина О.А., Сазонова О.В., Яцкин О.Н., Шейкин Ю.А., Соколов Д.И., Хайдуков С.В., Фрейдлин И.С., Иванов В.Т. Компоненты тканеспецифических пептидных комплексов тканей: негативные регуляторы пролиферации клеток. // Медицинская иммунология, Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3 (2), с. 120-121.

73. Сазонова О.В., Блищенко Е.Ю., Калинина О.А., Хайдуков С.В., Карелин А.А., Иванов В.Т. Пролиферативный эффект эндогенных фрагментов гемоглобина: роль в тканевой регуляции. // Медицинская иммунология, Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3 (2), с. 130-131.

74. Хирова Е.В., Хайдуков С.В., Коваленко Е.И., Овчинникова Т.В., Сапожников A.M. Увеличение опосредованного натуральными киллерами лизиса клеток К562 и ИАЛ, модифицированных с помощью липофильных гликоконьюгатов, не связано с экспрессией белков теплового шока на поверхности клеток-мишеней. // Медицинская

иммунология, Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 200Г21-24 мая 2001,3(2), с. 133.

75. Поклоиский Д.Л, Беляева Т, Хайдуков СБ, Литвинов И.С. Изучение механизма действия СА2т-ионофора - иономицина на субнопуляции Т-клеток периферической крови человека. // Медицинская иммунология, Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3 (2), с. 151.

76. Хайдуков C.B., Поклонский Д.Л, Литвинов И.С. Фенотипическая характеристика иономицин резистентных CD4* Т-клегок человека. // Медицинская иммунология, Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001*' 21-24 моя 2001, 3 (2), с. 155.

77. Холоденко И.В, Хайдуков С.В, Сеферян К.Р., Литвинов И.С. Изучение взаимодействия конканавалина а и фитогемоглютинина фасоли с субпопуляциями Т-клеток периферической крови человека. // Медицинская иммунология, Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3 (2), с. 156.

78. Хайдуков С.В, Хирова Е.В, Чудакова ДА, Литвинов И.С. Фенотипическая характеристика субпопуляций Т-клеток человека, различающихся но чувствительности к иономиципу в низких дозах. // Цитология, Материалы конференции, 2001,43 (4), с. 408.

79. Сазонова О.В, Блищенко Е.Ю, Карелин А.А, Филиппова М.М, Калинина О.А, Яцкин О.Н, Шейкин Ю.А, Соколов Д.И, Хайдуков С.В, Фрейдлин И.С, Иванов

B.Т. Компоненты тканеспецифических пептидных комплексов: ингибиторы роста тканей. // Медицинская иммунология, Материалы VI всероссийской научной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002", 20-23 мая 2002, 4 (2), с. 132-133.

80. Хайдуков С.В, Холоденко И.В, Литвинов И.С. Функциональная характеристика резистентных к Са2+-ионофору - иономицину - CD4+ Т-клеток периферической крови человека. // Медицинская иммунология, Материачы VI всероссийской научной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002," 20-23 мая 2002, 4 (2), с. 134-135.

81. Хайдуков С.В, Литвинов И.С. Изменение систем поддержания гомеостаза ионов Са2+ в процессе дифференцировки Т-клеток памяти ПКЧ из наивных предшественников в ходе первичного иммунного ответа. /7 Медицинская иммунология, Материалы VII всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2003", 23-26 июня 2003, 5 (3-4), с. 220.

82. Валякина Т.И, Петрова Е.Э, Симонова М.А, Ко.\илева Р.Л, Хайдуков С.В, Несмеянов В.А. Комбинация ГМДП, цисплатина и TNF-a обладаетпротивоопухоле-вым действием и влияет на иммунный статус мышей опухоленносителей. // Медицинская иммунология, Материалы VII всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004" 23-26 июня, 6 (3-5), с. 350-351.

83. Хайдуков С.В, Литвинов И.С. Изменение гомеостаза ионов кальция в Т-регуляторной популяции CD4' Т лимфоцитов периферической крови человека. // Медицинская иммунология, Материалы VIII всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004" 23-26 сентября 2004,6 (3-5), с. 126.

84. Хайдуков С.В, Литвинов И.С. Различная чувствительность популяций CD4+ Т лимфоцитов к концентрации внеклеточного [Са2+]. // Медицинская иммунология, Материалы IX всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2005" 23-26 мая 2005, 7 (2-3), с. 125.

85. Васюнина Н.Ю, Ростовская М.С, Коржикова С.В, Чупикова Н.И, Шарифуллина

C.З, Тепляшин З.А, Тепляшин А.С, Хайдуков С.В, Савченкова И.П. Влияние

различных условий культивирования на экспрессию поверхностных маркеров ге-мопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. // Медицинская иммунология, Материалы X всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2006" 29 мая -1 июня, 2006,2006, 8 (2-3), с. 416.

86. Хайдуков C.B. Иммунофенотипирование. Стандартизация метода проточной ци-тометрии. !! Russian Jornal of Immunology. 2-я конференция "Иммунология репродукции", Сочи, 15-18 мая, 2007,9, Supplement 4, с. 143-144.

87. Кабанова О.Д., Лукьянова Т.И., Духанина Е.А., Шаталова Ю.В., Яшин Д.В., Романова Е.А., Хайдуков C.B., Гнучев Н.В., Сащенко Л.П. Лимфоциты человека узнают и убивают HLA-опухолевые клетки: новая функция белка TAG7 (PGPP-S). // Медицинская иммунология, Материалы XI всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2007" 28-31 мая, 2007,9 (2-3), с. 141.

88. Хайдуков C.B. Иммунофенотипирование клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии. Стандартизация методов. // Медицинская иммунология, Материалы XI всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2007" 28-31 мая, 2007,9 (2-3), с. 342.

89. Зурочка A.B., Хайдуков C.B. Изменение представлений об оценке иммунного статуса человека, новые проблемы и подходы к их решению. // Медицинская иммунология, Материалы XI всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2007" 28-31 мая, 2007,9 (2-3), с. 339-340.

Автор выражает искреннюю благодарность и глубокую признательность своим научным консультантам академику РАН и РАМН, доктору медицинских наук, профессору Черешневу Валерию Александровичу и доктору медицинских наук профессору Зурочка Александру Владимировичу за интерес, проявленный к данной работе, ценные замечания и предложения. Глубокую благодарность автор выражает всем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях.

Подписано в печать 17.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1115 Тираж: 120 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш.. 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru