Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Иммунолуоресцентные зонды для фенотипирования лейкоцитов онкологических больных

На правах рукописи

Захарова Елена Николаевна

Иммунолуоресцентные зонды для фенотипирования лейкоцитов онкологических больных

14.01.12 онкология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

'8 Ш 2015

005570415

Москва-2015

005570415

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» (директор - академик РАН, Михаил Иванович Давыдов) Научные руководители:

Иванов Павел Константинович доктор медицинских наук

Заботина Татьяна Николаевна доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Боженко Владимир Константинович Заслуженный врач России, доктор

медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр

рентгенорадиологии» Министерства

здравоохранения Российской Федерации, руководитель отдела молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей

Дубинкин Игорь Владимирович Кандидат медицинских наук, Федеральное

государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий лабораторией иммуногематологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр (ГНЦ) институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации (ФМБА РФ)

Защита диссертации состоится «-Д-Р » 20 //"г. на заседании

диссертационного совета (Д 001.017.01) ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (115478, Москва, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 и на сайте www.ronc.ru Автореферат разослан ОУ_201^гГ

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Шишкин Ю.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Успехи современной онкологии напрямую связаны с созданием новых, более информативных диагностических средств. Особенно отчетливо это прослеживается на примере диагностики и лечения гемобластозов, когда внедрение методов иммунологического фенотипирования клеток крови позволило разработать принципиально новые, эффективные схемы лечения заболеваний.

Анализ субпопуляционного состава периферической крови и костного мозга, является важным критерием для дифференциальной диагностики отдельных заболеваний, в первую очередь гемобластозов [Луговская С.А., 2005]. Метод проточной цитометрии позволяет оценивать пролиферативную активность клеток, анализировать параметры клеточного цикла [Боженко В.К., 2009], количественные соотношения отдельных клеточных субпопуляций, состояние специфического или противоопухолевого иммунитета [Симонова A.B., 2001; Хайдуков C.B., 2010; Кадагидзе, З.Г., 2013].

Вместе с тем, по мере расширения технических и методических возможностей для выполнения подобных исследований, усложняются и аналитические задачи. Так, если еще недавно для количественного определения субпопуляций лейкоцитов считалось достаточным использовать монохромный анализ клеточной популяции по единственному маркеру, то сейчас, согласно современным представлениям, следует выполнять комплексное исследование популяции одновременно по нескольким антигенам с использованием многоцветного (мультипараметрического) цитометрического анализа, который позволяет получать информацию о наличии и сочетании нескольких антигенов на поверхности отдельных клеток, проводить оценку популяционного и субпопуляционного состава многокомпонентных клеточных систем. Для выполнения таких анализов применяются смеси нескольких флуоресцентных зондов - каждый из них обладает собственной антигенной специфичностью и индивидуальными спектральными характеристиками. Соответственно, возможности метода прямо зависят от разнообразия и свойств применяемых флуоресцентных зондов, подавляющее количество которых получают конъюгированием специфических для анализируемых молекул лигандов, в том числе — моноклональных антител к поверхностным и внутриклеточным антигенам, с флуорофорами.

В России, в ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН синтезирована группа оригинальных цианиновых флуорофоров, сходных по физико-химическим свойствам с СуЗ и Су5, в частности соединения Imd-306 и Imd-506

[Кузнецова В.Е., 2007-2008]. Для возбуждения флуоресценции Imd-306 необходим лазер с длиной волны 488,5 нм, для Imd-506 — красный диодный 635 нм, что делает последний потенциально пригодным не только для прямого конъюгирования с биоактивным лигандом и последующего использования полученных зондов в двух-трехлазерных проточных цитометрах, но и для создания «тандемных» меток.

В Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина под руководством профессоров А.Ю. Барышникова и З.Г. Кадагидзе были получены и охарактеризованы моноклональные антитела (МКА) серии ИКО. Эти МКА более 20 лет используются в проточной цитометрии как в реакциях непрямой, так и прямой иммунофлуоресценции (в виде конъюгатов с FITC и РЕ).

Таким образом, получение флуоресцентных зондов на основе МКА серии ИКО к дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека является актуальной задачей, решение которой даст возможность проводить научные исследований не только в области в онкологии, иммунологии, эпидемиологии, но и в широкой клинической практике.

Цель исследования

Создание флуоресцентных зондов на основе моноклональных антител серии ИКО для мультипараметрического анализа популяций и субпопуляций лейкоцитов онкологических больных методом проточной цитометрии.

Задачи исследования

1. Оптимизировать методы выделения и очистки МКА серии ИКО и способы их конъюгирования с флуорофорами РЕ, А1еха488, СуЗ, а также с отечественными цианиновыми красителями Imd-306, Imd-506.

2. Получить многоцветные флуоресцентные зонды к антигенам лимфоцитов человека CD4, CD8, CD 16, CD20, CD25, CD38 и HLA-DR, определить их физико-химические характеристики.

3. Исследовать специфическую активность созданных конъюгатов для оптимизации условий одно - и-многоцветного анализа клеточных популяций.

4. Оценить возможность применения полученных флуоресцентных зондов в исследовании клеточных популяций в норме и у онкологических больных.

Научная новизна

Впервые получен набор флуоресцентных зондов на основе уникальных отечественных материалов — моноклональных антител серии ИКО и флуоресцентных

красителей для мультипараметрического анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии. Впервые в качестве флурофоров для создания конъюгатов с МКА использовались отечественные цианиновые красители Imd-ряда.

Научно-практическая значимость

Получена панель МКА серии ИКО к антигенам CD4, CD8, CD20, CD25, конъюгированных с различными флуорохромами для исследования субпопуляционной структуры клеточного звена иммунитета больных с солидными новообразованиями. Создание и внедрение в практику многоцветных флуоресцентных зондов на основе МКА серии ИКО позволит отказаться от закупки дорогостоящих импортных аналогов.

Внедрение результатов в клиническую практику

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность централизованного клинико-лабораторного отдела Научно-исследовательского института клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина».

Личный вклад

Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, лично получены конъюгаты МКА с флуоресцентными красителями СуЗ, Imd-306, Imd-506, Alexa-488, проведена оценка специфической активности полученных зондов, осуществлен анализ и интерпретация результатов работы, статистическая обработка полученных данных, написана и оформлена диссертационная работа.

Соответствие паспорту специальности

Научные положения диссертации соответствует паспорту специальности 14.01.12 онкология, конкретно пункту 3.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Оптимизированы методы очистки МКА серии ИКО и способы их конъюгирования с флуорофорами РЕ, СуЗ, Alexa-488, Imd-ЗОб и Imd-506

2. Конъюгирование МКА с флуорофорами РЕ, СуЗ, Alexa-488, Imd-306 и Imd-506 не меняет иммунологические свойства антител. Вместе с тем, уникальность каждого клона гибридом-продуцентов МКА серии ИКО требует индивидуального подбора флуорофоров.

3. Продемонстрированы возможности одно-, двух-, трехцветного анализа субпопуляций лимфоцитов человека методом проточной цитофлуориметрии.

4. В результате проведенных исследований сформированы наборы флуоресцентных зондов, позволяющие проводить популяционный и субпопуляционный анализ лимфоцитов человека методом проточной цитофлуориметрии.

5. Клиническая апробация разработанных наборов с использованием периферической крови здоровых доноров и онкологических больных показала их высокую диагностическую эффективность, не уступающую зарубежным аналогам.

Апробация результатов Диссертационная работа апробирована и рекомендована к защите 27 февраля 2014 года на совместной научной конференции с участием лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории комбинированной терапии опухолей, лаборатории медицинской химии Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей, с участием лаборатории клинической иммунологии опухолей централизованного клинико-лабораторного отдела Научно-исследовательского института клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.

Структура диссертации Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», ((Материалы и методы», «Результаты и обсуждение собственных исследований», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Указатель литературы содержит 183 источника, из которых 79 отечественных и 104 иностранных. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 77 рисунками.

Работа выполнена в лаборатории медицинской биотехнологии (заведующий лабораторией, д.м.н. Иванов П.К.), в лаборатории клинической иммунологии опухолей НИИ клинической онкологии (заведующая лабораторией, профессор Кадагидзе З.Г.) ФБГНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе использовали панель МКА серии ИКО, представленные в таблице 1.

Таблица 1 Моноклинальные антитела серии ИКО

Антиген МКА Распознаваемые клетки/структуры Аналог фирмы BD Biosciences

CD3 ИКО 90 Т-клетки leu4

CD4 ИКО 86 субпопуляции Т-клеток Leu3a

CD8 ИКО 31 субпопуляции Т-клеток Ieu2b

CD20 ИКО 180 В-лимфоциты leul6

CD38 ИКО 20 лимфоциты, их предшественники, активированные Т-клетки leu 17

CD25 ИКО 105 рецептор интерлейкина IL-2 Ree

HLA-DR ИКО 1 В-лимфоциты, активированные лимфоциты, моноциты HLA-DR

CD16 ИКО 116 ИК-клетки (натуральные киллеры) CLB/FcGranl

Прямомеченые МКА: CD3-FITC (ИКО-90) (производство ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», г. Москва), для контроля применяли прямомеченые МКА производства BD Biosciences (США): CD3-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD16-FITC, CD4-PE, CD8-PE, CD16-PE, CD20-PE, HLA-DR-PE, CD38-PE, CD25-PE, CD14-FITC, CD95-F1TC, CD45-PC5.

Флуоресцентные красители, используемые в работе, представлены в таблице 2.

Таблица 2 Флуоресцентные красители

Наименование Максимум поглощения, нм Максимум испускания, нм Масса, Да Производство

R-Phycoerythrin (PE) 480;565 573, дополнительный пик 498, 545 240 кДа Sigma (США)

Alexa Fluor 488 494 517 643 Invitrogen (США)

Cy3 (512);552 570;(615) 767 Amersham Biosciences (Швеция)

lmd-306 (аналог СуЗ) 548 563 778 ИМБ им. В.А. Энгельгардга РАН, Россия

Imd- 504*,506,507* (аналог Cy5) 644 659 803 ИМБ им. ВА. Энгельгардга РАН, Россия

Imd-504* и 507* выбыли из исследования, так как производство первого —

дорогостоящее, а второй— образовывал агрегаты при мечении.

Доноры и больные

Дня оптимизации условий постановки РИФ в качестве исследуемого биологического материала использовали образцы венозной крови практически здоровых доноров. Кровь забирали из локтевой вены натощак, в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА, Клиническая апробация полученных наборов проводилась на 3 группах пациентов с онкологическими заболеваниями до и после хирургического лечения. Первая группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта. Вторая группа — больные раком яичников в количестве 35 человек. Третья группа состояла из 73 больных первично-операбельным раком молочной железы.

Метод проточной цитометрии

В работе использован проточный двулучевой цитометр FACSCalibur (BD Bioscience, США) с программным пакетом CellQuest. Флуоресценцию учитывали в спектральных диапазонах 512-547 нм (FL1 для FITC, А1еха-488), 575-595 нм (FL2 для РЕ, Imd-306). 610-630 нм (FL3 для РС5) и 650-670 нм (FL4 для Imd-506). Для анализа клеточных популяций учитывали также показатели прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания, на основании которых выполняли гейтирование -программное «выделение» субпопуляции лимфоцитов и дискриминацию иных субпопуляций. В каждом образце анализировали 5000 событий в гейте лимфоцитов. Обработку файлов первичных цитометричес-ких данных проводили с использованием программного пакета WinMDI 2.8, находящегося в свободном доступе в сети Интернет.

Статистическая обработка данных

Использовалось программне обеспечение «Sigma Plot 11.0» для Windows. Достоверность различий в исследовании оценивали по t-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям Вилкоксона-Манна-Уитни и Фишера в зависимости от характера распределения значений выборки. Различия считали достоверными при р<0,05. Все результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение коньюгатов МКА с флуоресцентными красителями

Флуоресцентные зонды получали в несколько этапов: получение асцитической жидкости; выделение и очистка антител; конъюгирование антител с флуоресцентным красителем; очистка от несвязавшегося красителя; консервация и стабилизация готового реактива.

После процедуры выделения и очистки в реакции непрямой иммунофлуоресценции оценивали биологические свойства очищенных МКА в диапазоне концентраций от 100 мкг/мл до 0,1 мкг/мл. Нами было обнаружено, что МКА антитела HLA-DR. (ИКО-1) теряли биологические свойства. Возможно, это связано с высокой чувствительностью к изменениям рН. В дальнейшие исследования МКА ИКО-1 не были включены.

Получение препаратов МКА к CD4 (ИКО-86), CD8(HKO-31), CD16 (ИКО-116), CD25 (ИКО-Ю5) проводили путем комбинированной очистки с использованием каприловой кислоты и высаливания иммуноглобулиновой фракции сульфатом аммония МКА. Получение препарата МКА к CD20 (ИКО-180), МКА к CD16 (ИКО-116) проводили на белке G.

Получение конъюгатов МКА с цианиновыми красителями Imd-306, Imd-504/506/507 и СуЗ

Используя опыт работ Waggoner (1996 г.) и Gruber (2001 г.), для конъюгирования МКА серии ИКО с красителями СуЗ, Imd-306, Imd-504/506/507 нами были подобраны следующие условия: реакционная смесь — бикарбонатный буфер, оптимальный рН раствора — 9,3, концентрация антител в реакционной смеси — 1 мг/мл. Время (30 минут) и температура (18-25С°) инкубирования — определены экспериментально. Затем проводили очистку коньюгатов от несвязанного с белком красителя и рассчитывали концентрацию белка и плотность мечения и концентрацию МКА. Методика была отработана на МКА a-CD4 (ICO-86) и флуорофоре Imd-506. В ходе исследования получены панели конъюгатов МКА серии ИКО с циановыми красителями, отличающихся разной плотностью мечения. Для этого МКА инкубировали с сукцинимидным эфиром флуорофоров в молярном соотношении от 1:2 (М:М) до 1:100 (М:М).

Получение конъюгатов МКА с синтетическим флуорофором А1еха-488

Основываясь на работах Panchuk-Voloshina и Haugland (1999 г.), для получения конъюгатов МКА с красителем Alexa Flour-488 были подобраны следующие условия: оптимальный рН реакционной смеси (карбонатного буфера) 8,3, время инкубирования — 90 минут, температура инкубирования 18-25С". Концентрация антител в реакционной смеси — 1 мг/мл. Обязательное условие — темнота. Методики отработаны на мышиных

9

МКА к B-клеточным рецепторам лимфоцитов человека (CD20, клон ICO-180). Если было необходимо получить небольшое количество конъюгатов (до 10), краситель А1еха-488 растворяли в водной среде и использовали его незамедлительно. Поскольку краситель в водной среде очень быстро гидролизуется, для приготовления большого количества конъюгатов использовали следующую методику: Alexa Flour-488 растворяли в диметилсульфоксиде в необходимой концентрации. Затем приготовленный таким образом краситель вносили в раствор МКА (карбонатный буфер pH 8,3) в необходимой пропорции. Затем проводили очистку конъюгатов от несвязанного с белком красителя и рассчитывали концентрацию белка и плотность мечения и концентрацию МКА.

Получена панель конъюгатов МКА серии ИКО с А1еха-488, отличающихся разной плотностью мечения. Для этого МКА инкубировали с сукцинимидным эфиром флуорофора в молярном соотношении от 1:2 (М:М) до 1:100 (М:М).

Получение конъюгатов МКА с флуорофором группы фикобилипротеинов R-PE

(фикоэритрин, ФЭ)

Основными подходами для получения конъюгатов IgG с фикобилинами являются методы синтеза на основе бифункциональных агентов. В научной литературе [Hardy R.R., 1986] и коммерческих наборах для получения флуоресцентных конъюгатов (фирмы AnaSpec, Biomax, Abnova и др.) упоминаются два основных бифункцианальных реагента: сукциннмидил-4-[Ы-малеимидометил]-циклогексан-1 -карбоксилат (SMCC) и N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитао)-пропионат (SPDP). Для получения конъюгатов МКА с фикоэритрином использовали две основные методики синтеза, в первой методике в качестве бифункционального реагента применяли Н-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат, во второй — сукциннмидил-4- [Ы-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилат. В результате проведенных исследований показано, что сукциннмидил-4-fN-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) — эффективный агент, модифицирующий молекулу РЕ, при конъюгировании МКА серии ИКО. Для каждого конъюгата рассчитывали плотность мечения и концентрацию МКА Степень включения флуорофора должна быть в пределах 0,7-2,0. (Получение конъюгатов МКА с фикоэритрином выполнено ведущим научным сотрудником лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина», к.м.н. Гриневичем A.C.)

В ходе работы нами было обнаружено, что для получения конъюгатов МКА с флуорофорами Imd-306, Imd-506, СуЗ и А1еха-488 выбор методики очистки иммуноглобулинов не имеет принципиального значения. Вместе с тем, показано, что ряд МКА серии ИКО (в том числе CD38, ICO-20) обладают индивидуальными особенностями, которые не позволяют использовать их для получения конъюгатов с

вышеперечисленными флуорофорами. Данный факт, очевидно, связан с тем, что процесс конъюгирования приводит к инактивации антигенсвязывающего участка МКА. Наоборот, получение конъюгатов МКА с фикоэритрином требует высокой степени очистки иммуноглобулинов. Присутствие даже небольшого количества примесей резко снижает степень включения флуорофора в конъюгат. Показано, что МКА CD20 (ИКО-180) при коньюгирование с фикоэритрином так же утрачивают свою специфическую активность.Так же обнаружено, что для дальнейшей работы с МКА ИКО 116 (CD16) требуется реклонирование.

Стабилизация и консервация полученных флуоресцентных зондов.

Получение конъюгаты стабилизировали 1% раствором БСА (бычий сывороточный альбумин) и консервировали 10%NaN3 до конечной концентрации 0,01%.

Исследование биологической активности полученных флуоресцентных зондов в одноцветном анализе субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии.

Для получения корректных и воспроизводимых результатов количественного анализа клеточных популяций в прямой РИФ флуоресцентные зонды должны иметь оптимальные характеристики, в том числе плотность метки и рабочую концентрацию раствора зонда. Оптимальная плотность метки должна обеспечивать достаточную интенсивность флуоресцентного сигнала, получаемого от каждой молекулы зонда. Оптимальная концентрация зондов в прямой РИФ должна обеспечивать насыщение зондом всех молекул исследуемого антигена на поверхности клеток, но не приводить к заметному неспецифическому связыванию зонда с клеточной поверхностью. Для определения рабочего разведения полученных конъюгатов использовали методику титрования антител, предложенную С.С Stewart.(1999 г.) Методика основана на дробном понижении концентрации зондов в прямой РИФ с определением их минимальной концентрации, при которой еще сохраняется максимальная интенсивность флуоресценции антигенпозитивных клеток. Дальнейшее понижение концентрации зондов приводит к смещению антигенпозитивного пика на гистограмме влево и уменьшению соотношения «сигнал»/«шум» (S/N). Изучали выявляемость различными конъюгатами антиген-позитивных событий в одном и том же образце периферической крови (%) и отношение интенсивности специфического сигнала флуоресценции антигенпозитивных клеток к «шуму» (S/N) аутофлуоресценции: S/N = Mean Ml/ Mean М2

В качестве примера приводим результаты определения рабочей концентрации CD8-AIexa488.

Получена серия конъюгатов a-CD8-Alexa-488 с плотностью мечения (D/P) от 1 до 10, для каждого из которых в диапазоне концентраций МКА 0,5-100 мкг/мл было определено соотношение S/N (Рис. 1).

110 100 90 80 70 5 60 Í 50

40 30 20 10 О

100 50 25 10 5 2.5 1 0.5 Концентрация CDS-Alexa-488, мкг/мл

Рисунок 1 Зависимость отношения специфического сигнала к «шуму» (S/N) от концентрации a-CD8-Alexa-488 с различной плотностью мечения (D/P).

Наибольшие значения отношения S/N характерны для конъюгатов с плотностью

мечения в диапазоне 4:10 (моль:моль). Далее, используя конъюгат с плотностью метки 10, определили диапазон рабочих концентраций этого зонда и адекватность получаемых результатов результатам цитометрического анализа того же образца крови с использованием эталонного реагента - коммерческого продукта МКА CD8PE производства компании BD Bioscience, США. На рис 2. представлены гистограммы распределения популяции лимфоцитов периферической крови донора с использованием в диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл.

Рисунок 2 Гистограммы распределения Т-лимфоцитов периферической крови донора с использованием CD8-Alexa-488 с плотностью мечения (D/P) 10 в диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл.

В диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл гистограммы имеют вид, соответствующий антигену CD8, экспрессированного на Т-лимфоцитах. Повышение концентрации зонда выше 10 мкг/мл приводит к смещению пика аутофлуоресценции (на гистограммах он слева) вправо, следовательно, концентрация 10 мкг/мл является максимально допустимой для выполнения цитометрического анализа клеточных популяций.

Рисунок 3 Гистограммы распределения Т-лимфоцитов периферической крови донора с использованием CD8-Alexa-488 с плотностью мечения (D/P) 10 в диапазоне концентраций 5-25 мкг/мл.

При концентрациях зонда в диапазоне 5-10 мкг/мл (рис.3) в составе лимфоцитов

периферической крови донора выявляется около 33% CD8+ клеток, однако при концентрации зонда 25 мкг/мл величина соотношения S/N снижается, за счет сдвига пика автофлуоресценции вправо. Цитометрический анализ лимфоцитов того же донора, выполненный с использованием эталонного реагента (МКА CD8PE производства BD Biosciences, США), выявил такое же содержание антигенпозитивных клеток в образце (рис.38), что говорит об адекватности применения для цитометрического анализа полученных нами иммунофлуоресцентных конъюгатов CD8-Alexa-488. Таким образом, конъюгаты CD8-Alexa-488 в диапазоне концентраций 5-10 мкг/мл являются оптимальными и рекомендуются нами для анализа клеточных популяций периферической крови методом проточной цитометрии.

Для каждого полученного в настоящем исследовании флуоресцентного зонда методом дробного титрования определены соотношения «сигнал/шум» в диапазоне концентраций от 100 до 0,5 мкг/мл и рекомендованы к использованию в одноцветном

анализе клеточных субпопуляций лимфоцитов следующие иммунофлуоресцентные зонды (Рис.4):

ада 52.1

6.4%

..^4. . , .-,

10а 10' ю- ю* ю'

С020 |тсЗ 306 (Ир 7 25 тсдАп)

Я,_™

10° 10' 10= 10* 10' СО« та 306 а/рю 2.5 тсдЛп!

10° 10' 10; 10' 10' С081пи1306 йф 610 тсдАп!

С025 РЕ 10 тсдЛп!

Рисунок

Иммунофлуоресцентные зонды

оптимальными

характеристиками (плотность мечения, рабочая концентрация МКА, мкг/мл).

С04 РЕ 10 тсдМ

Определение оптимальной рабочей концентрации полученных флуоресцентных зондов для двухцветного анализа

Для оценки возможности применения различных зондов в одной двухцветной РИФ использовали простой методический прием: в три различные пробирки вносили аликвоты одного образца исследуемой крови, в первую пробирку добавляется раствор первого зонда (в оптимальной конечной концентрации), во вторую пробирку - раствор второго зонда, а в третью - смесь обоих зондов в той же конечной концентрации каждого. После выполнения прямой РИФ все три образца анализировали на проточном цитометре. По результатам анализа строилигистограммы распределения зарегистрированных событий по первому калану флуоресценции (FL1) для содержимого пробирок №№ 1 и 3 и по второму каналу (FL2) - для пробирок №№ 2 и 3. Гистограммы, построенные по результатам монохромного анализа (пробирки №№ 1 и 2) должны с точностью совпадать с соответствующими гистограммами двухцветного анализа (пробирка № 3). Если на гистограммах по результатам анализа содержимого пробирки № 3 положение пика специфической флуоресценции смещается влево относительно того же пика для пробирок №№ 1 и/или 2, в реакционной смеси для двухцветной РИФ следует увеличить конечную концентрацию соответствующего зонда для достижения требуемого соответствия.

В качестве примера приводим результаты определения рабочей концентрации зондов в комбинации CD8Cy3 /CD3FITC.

На рисунке 5а представлена двумерная дот-плот диаграмма распределения лимфоцитов крови при их двухцветном анализе с использованием зондов CD3FITC (FL1) и CD8Cy3 (FL2) с плотностью мечения 6:1 и концентрацией последнего 10 мкг/мл. На диаграмме четко выделяется субпопуляции цитотоксических Т-клеток с фенотипом CD3+CD8+ (24,8%) и прочих Т-лимфоцитов CD3+CD8" (50,47%); суммарное содержание Т-лимфоцитов в популяции, таким образом, составляет 75,3%. Контрольные значения, полученные для того же образца крови донора с применением коммерческих препаратов сравнения, составили: CD3+- 76,3%;CD3+CD4+ - 49,5%; CD3+CD8+ - 26,9%, что соответствует результату анализа с использованием нового зонда. CD19+ 11.2%, CD3" CD16+CD56+ 10, 5%. Контрольная сумма Т, В. NK- лимфоцитов составляет 98%, сумма CD4+% и CD8+% = CD3+%. На рисунке 56 представлены «наложенные» гистограммы по каналу FL2 для монохромного и двухцветного анализа, гистограммы идентичны, следовательно, конъюгат CD8Cy3 с плотностью мечения 6:1 и конечной концентрацией зонда 10 мкг/мл может использоваться как в монохромном анализе, так и в двухцветной реакции с CD3FITC («РОНЦ им. H.H. Блохина»),

2,9% 24,8%

27,8%

И1

С08Су310шсд/Ы

а)

6)

Рисунок 5 а) Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата СБ8СуЗ с плотностью мечения 6:1 и конечной концентрацией 10 мкг/мл. б) Одно и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата СБ8СуЗ с плотностью мечения 6:1 и конечной концентрацией 10 мкг/мл. Голубым цветом выделена гистограмма для монохромного анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа.

Однако при снижении концентрации того же конъюгата до 5 мкг/мл (Рис. 6а), доля

дважды позитивных (СОЗ+СВ8+) клеток составляет в двухцветной реакции лишь 24,2% популяции, тогда как в монохромной реакции определяется 25,0% положительных событий, а «наложение» гистограмм по каналу БЬ2 выявляет их не полную идентичность (Рис. 66). Следовательно, концентрация данного зонда в 5 мкг/мл является недостаточной для двухцветного анализа, но может применяться для монохромного.

Рисунок 6 а) Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата СМСуЗ с плотностью мечения 6:1 и конечной концентрацией 5 мкг/мл. б) Одно и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата СБ8СуЗ с плотностью мечения 6:1 и конечной концентрацией 5 мкг/мл. Голубым цветом

выделена гистограмма для монохромного анализа, черным коитуром-гистограмма для двухцветного анализа.

Конъюгат CD3FITC был получен и охарактеризован в «РОНЦ им. H.H. Блохина»

ранее, рабочая концентрация МКА в монохромном анализе составляет 5-10 мкг/мл. На рисунке бв представлены «наложенные» гистограммы по каналу FL2 для монохромного (голубое заполнение) и двухцветного (черный контур) анализа, следовательно, конъюгат CDFITC с конечной концентрацией зонда 5 мкг/мл может использоваться в монохромном анализе, но не в двухцветной реакции с другими конъюгатами. Однако при концентрации того же конъюгата 10 мкг/мл (Рис. бг), «наложение» гистограмм по каналу FL2 выявляет их полную идентичность. Следовательно, концентрация данного зонда в 10 мкг/мл является достаточной для двухцветного анализа, в монохромном анализе выявляется 75,5% CD3+ лимфоцитов, что соответствует результату анализа с использованием эталонного конъюгата.

в г

Рисунок 6 в) Одно и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD3FITC с конечной концентрацией 5 мкг/мл. г) Одно и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD3FITC с конечной концентрацией 10 мкг/мл. Голубым цветом выделена гистограмма для монохромного анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа. Используя данный прием сравнительного анализа полученных конъюгатов для

двухцветного анализа субпопуляций лимфоцитов человека рекомендуются следующие

комбинации: CD3 FITC (10 мкг/мл) + CD8Cy3 и CD8Imd306 с концентрацией 10 мкг/мл;

CD3 FITC и CD4Imd306 с концентрацией 5-10 мкг/мл; CD3 FITC и CD20Imd306 с

концентрацией 10-20 мкг/мл; CD3 FITC и CD8PE с концентрацией 5-10 мкг/мл; CD3 FITC

и CD4PE с концентрацией 20 мкг/мл; CD3 FITC и CD25PE с концентрацией 10-20 мкг/мл;

CD3 FITC и CD20 Imd506 с концентрацией 10 мкг/мл; CD3 FITC и CD8 Imd506 с

концентрацией 10 мкг/мл.

•

'Ш ш

■Ш

ф "K'-. V '

' '•■v- .íV

ш ■уЩШ

ЁО Ог

fi-'Л

1,7%.

oi.

10°

21,6%

53,1%

ГО" 10' CD3FITC

10'

20mcg/ml

20 mcg/ml

Í01 Í02 103 104 CD3 FITC

25.4%

10' 1C!......10'

CD3 FITC

7.5% 18.7%

1Ü о о о Ж i

ISífítói

о. ' "в; Ю в%

10" CD3FITC

5 mcg/ml

■ Щ • '"-ОА •Ш

•Ш ... . ..—

CD3 FITC

Рисунок 6. Комбинации иммунофлуоресцентных зондов, рекомедованные для двухцветного анализа субпопуляций лимфоцитов человека методом проточной цитометрии

Для оценки возможности применения различных зондов в одной трехцветной РИФ в 4 различные пробирки вносятся аликвоты одного образца исследуемой крови, в первую пробирку добавляется раствор первого зонда (в оптимальной конечной концентрации), во вторую пробирку - раствор второго зонда, а в третью - раствор третьего зон&а, в четвертую — смесь трех зондов в той же конечной концентрации каждого. После выполнения прямой РИФ все три образца анализируются на проточном цитометре так, как описано выше для двухцветного анализа. В результате в данном исследовании рекомендованы для трехцветного анализа субпопуляций лимфоцитов человека методом проточной цитометрии две комбинации, представленные на рисунке 7.

Рисунок 7. Комбинации иммунофлуоресцентных зондов, рекомендованные для трехцветного анализа субпопуляций лимфоцитов человека методом проточной цитометрии.

Первая комбинация — СОЗРГГС (10 мкг/мл), С04РЕ (10 мкг/мл), С08-1тс1-506 (10 мкг/мл); Вторая комбинация — СВЗРГГС (10 мкг/мл), С04Р1шс1-306 (10 мкг/мл), С08-1гш1-506 (10 мкг/мл).

Хранение флуоресцентных зондов.

Рекомендуемые условия хранения полученных реагентов +2 - +8 С. Показано, что флуоресцентные зонды с концентрацией белка не менее 200 мкг/мл сохраняют свою биологическую активность в течение 2 лет.

Клиническая апробация кОнъюгатов МКА с флуоресцентными красителями.

Клиническая апробация полученных наборов проводилась на 3 группах больных онкологическими заболеваниями. Первая группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта до и после хирургического лечения (таблица 3). Вторая группа — больные раком яичников до и после хирургического лечения в количестве 35 человек (таблица). Третья группа состояла из 73 больных первично-операбельным раком молочной железы до и после хирургического лечения (таблица 5).

19

Группа I. В работе использованы материалы клинических наблюдений 64 первичных больных раком слизистой оболочки полости рта, находившихся на лечении и обследовании в «РОЩ им. Н.Н. Блохина» в отделении опухолей головы и шеи в период с 2009 по 2012гг. Диагноз плоскоклеточного рака был установлен первично, без проведения в предоперационном периоде химиолучевой терапии и подтвержден гистологически. В исследование включены больные с II-IV стадией заболевания, примерно в равном соотношении по полу, в возрасте от 20 до 88 лет. Наибольшая частота этого заболевания наблюдалась у пациентов в возрастном промежутке от 50 до 59 лет. Всем больным на первом этапе было проведено хирургическое лечение. В таблице 3 представлены результаты иммунологического обследования до и после хирургического лечения (через 10-14 дней после операции) по сравнению с группой здоровых лиц. Показано, что еще до начала лечения у больных раком слизистой оболочки полости рта в структуре Т-клеток статистически достоверно снижено число CD3+CD4+ Общий уровень CD8+ лимфоцитов статистически достоверно превышает показатели донорской группы. Уровень CD3"CD19+ В-лимфоцитов больных не отличался от группы сравнения. Согласно полученным результатам можно сказать, что проведенное хирургическое лечение не оказывало влияния на показатели субпопуляционной структуры лимфоидных клеток, но при этом обнаружено статистически достоверное отличие параметров больных по сравнению с донорами (Циклаури В.Т, 2012 г.).

Группа II. В исследование включены 35 первичных больных РЯ, находившихся в гинекологическом отделении для выполнения планового хирургического лечения. Средний возраст по группе составил 53,9 года. В зависимости от гистологической структуры опухоли больные распределились следующим образом: серозный рак — 62,1%, муцинозный рак — 13,8%, эндометриоидный рак — 20,7%, светлоклеточный рак — 3,4%. В качестве контрольных образцов использовали периферическую кровь 11 практически здоровых женщин в возрасте от 25 до 58 лет. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили до хирургического лечения и через 2 недели после него. Окрашивание клеток осуществляли с применением моноклональных антител МКА, конъюгированных FITC, PE, РЕ-Су5, РС5, Per-CP («Beckman Coulter» Использовали следующие двухцветные реагенты: CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19. Анализ линейных маркеров, характеризующих основную структуру лимфоидных клеток у первичных больных РЯ, позволил выявить, что в среднем по группе количество Т-лимфоцитов CD3+ статистически значимо снижено по сравнению с показателями у доноров (Таблица 4). Следует отметить, что хирургическое лечение не влияло на динамику распределения этих показателей. В то же время среднее количество В-лимфоцитов (CD 19+) в исследуемой

группе больных как до, так и после лечения практически не отличалось от такового в донорской группе. Таким образом, на первом этапе исследования выявлены нарушение линейной структуры лимфоцитов периферической крови у больных РЯ. Хирургическое лечение не влияло на уровень основных популяций лимфоцитов при анализе общей группы больных. В то же время разброс минимальных и максимальных значений (М ± 6) в Т-клеточном (до лечения 62,5 ± 16,5%, после — 61,8 ± 14,4%) звене иммунитета свидетельствует о неоднородности анализируемых больных по уровню основных популяций иммунокомпетентных клеток (Заботина Т.Н., 2010 г).

Группа Ш.В исследование включено 77 женщин первичных больных раком молочной железы. Распределение по стадиям: I (TINO) - 31,2%, II (T1N1, T2N0-1) -49,3%, III (Т2-4, N0-2) - 19,5%. Всем больным были выполнены радикальные операции: (мастэктомия с сохранением грудных мышц - 76,6% случаев или органосохраняющая операция - 23,3%). Средний возраст пациенток составил 56,4±1,1 лет. Иммунофенотипи-рование лимфоцитов проводили методом многопараметрового цитометрического анализа до и через 2 недели после хирургического лечения с использованием коммерческих наборов моноклональных антител, конъюгированных FITC, РЕ, PE-Cy5, РС5 (BD Biosciences, Bekman Coulter, США). Использовали следующие двух- и трехцветные реагенты: CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19. В качестве контрольных образцов использовали периферическую кровь 25 практически здоровых женщин в возрасте 25-^58лет. При анализе показателей иммунологического статуса до начала лечения и после операции у всех больных выявлено, что практически все средние значения основных линейных показателей CD3, CD4, CD8, CD19 находились в пределах физиологической нормы. Однако количество CD3-CD8+ клеток у данной группы пациенток статистически достоверно отличалось от аналогичных показателей здоровых женщин (табл 5). Разброс минимальных и максимальных значений (М ± 6) в Т-клеточном (до лечения 67,5±12,4%, после — 68,5±13,4%) звене иммунитета свидетельствует о неоднородности анализируемых больных по уровню основных популяций иммунокомпетентных клеток (Короткова О.В., 2011г.).

Испытания разработанных наборов в лаборатории клинической иммунологии опухолей НИИ КО ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» показали их высокую специфичность и эффективность, не уступающую зарубежным аналогам. Таким образом, разработанные наборы флуоресцентных зондов позволяют: оценить экспрессию нескольких антигенов одновременно, сократить необходимый для анализа объем материала, сократить время подготовки и фактического анализа, увеличить объем информации, снизить себестоимость анализа.

Таблица 3

Определение субпопуляций лимфоцитов периферической крови больных раком слизистой оболочки полости рта до и после хирургического лечения (% антиген-положительных клеток), п=64

Маркер до лечения доноры ВОР/РЕ и зс Ьн т 0 ■о в 1 г») ЗЕ/8 РЕ о о ■о г нн § го ■ ЗГ/4 РЕ/СБ81шй-506 ЗГ/201т(Ш6 ЗР/201пн1506

после лечения

СОЗ+ 74,0±1,5 67,8±1,7* 66,4±1,8* 67,3±1,5* 68,0±1,4* 68,3±1,8* 67,5±1,5* 67,3 ±1,3* 65,6±1,7*

65,0 ±1,5+ 64,6 ±1,5* 65,3 ±1,1* 65,1±1,3* 65,5 ±1,0* 66,2±1,3* 64,7 ±1,1 + 65,6 ±1,7*

С03+/С04+ 43,0±1,6 38,0±1,0* 37,8±1,0* 38,1±0,9*

35,4±1,3* 34,8±1,2* 35,7±1,3*

СШ+/С08+ 27,0±1,1 26,4±1,0 27,1±1,0 26,8±1,0 27,7±1,0 26±1,2

25,2±1,0 26,0±1,0 25,7±1Л 25,7±0,8 25,5±0,7

С03-/С08+ 7,5±0,6 13,0±1,0* 11,5±1,1* 12,5±1,0* 13,1±1,1* 12,9±0,9*

13±0,9* 13,0±0,9* 12,3±1,1* 12,7±1,1* 12,5±1,3*

С08+ 34,5±1,4 39,4±1,1* 38,9±1,3* 38,7±1,1* 40,1±1,0* 38,7±1,0*

38,3±1,0 38,3±1,2 38,2±1,3 39,1±1,1 38,2±1,2

20,4±1,2

СБЗ-/СШ9+ 6,6±0,7 6,2±0,5 7,0±0,8 6,3±0,6

6,4±0,6 б,0±0,9 6,5±Г,0

* Статистически значимые различия по сравнению с показателями доноров (р<0.05)

Таблица 4

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных раком яичников до и после хирургического лечения (% антигеи-положительиых клеток), п=35

о. « а до лечения л а. о ы £ го и го чо о го ■а ЗШРЕ о о го ■о а Р- М5 О О «а й о а С! ^

я г после лечения я о « о и нн § ГО д-го Е5 го ь и го В нн го В NN

СОЗ+ 73,9±2,5 62,5±3,1* 61,3±2,1* 60,5±1,1* 61,8±0,9* 60,4±3,0* 61,5±1,4* 60,7±1,0* 61,4±2,0*

61,8±2,7* 61,5±1,1* 62,0±1,1* 61,б±2,1* 61,4±2,0* 62,1±0,7*: 62,1±0,8* 61,9±1,8*

СБЗ+,С04+ 41,7±2,9 32,0±2,4* 33,1±1,0* 31,7±1,1*

34,5±2,8* 33,9±2,4* 32,7±2,3*

С03+,С08+ 26,5±1,4 23,7±2,2 22,8±1,0 23 Д±1,1 22,9±0,8

21,5±1,7 21,3±1,0 21,1±1,3 20,9±0,8

СБЗ-,С08+ 7,5±0,7 11,9±1,3 10,2±0,9 11,1±0,8 10,9±1,1

11,6±1,2 11,3±0,9 11,9*0,5

СШ+ 34,0±1,2 35,6±1,7 35,5±1,1 34,9±1,2 36,1±0,5

33,1±1,7 33,5±1,2 32,8±1,3 33,1±0,7

СОЗ-, СШ9+ 7,5±1,4 6,9±0,9 6,8±1,1 7,1±0,5

8,4±1,2 7,9±1,3 8,1 ±0,7

* Статистически значимые различия по сравнению с показателями доноров (р<0.05)

Таблица 5

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных псрнично-операбельиым раком молочной железы до и после хирургического лечения (% антиген-положительных клеток), п=73

Маркер до лечения доноры ВБР/РЕ го >1 и оо и; го «о о го ■а В 1-И § и. го ЗР/8 РЕ чо о го ■а В м и. го ЗР4РЕ ЗР/20 1шсШ6 ЧО О -а г N4 О § го

после лечения

СБЗ+ 73,8±1,5 67,5+12,4 66,9+11,3 67,0+11,5 66,8+12,2 67,4+12,0 66,3+9,3 67,8+9,3 67,1+10,8

68,5*13,4 67,5+14,1 68,0+10,2 67,6+12,1 68,4+12,3 69,8+13,1 67,9+11,2 68,1+10,8

С03+,С04+ 43,4+1,6 35,7+9,3 35,8+8,4 36,1+7,3

37,4±11,5 36,8+12,1 37,1+10,6

СОЗ+,СЮ8+ 26,9+1,1 25,7+9,4 25,3+10,0 25,4+11,3 25,9+10,1

25,0+9,2 24,3+10,0 25,1+8,3 26,9+8,3

СОЗ-,СВ8+ 7,7+0,6 13,6+8,8* 12,8+9,7* 13,3+8,9* 13,5+8,5*

12,8+8,6* 12,6+7,7* 12,3+9,9* 12,9+8,5*

СБ8+ 34,6+1,4 39,3+9,7 38,5+10,2 37,9+11,1 38,1+10,2

37,8:1:9,2 37,5+8,2 38,3+10,3 37.6+8,7

15,2+7,6;

СОЗ-, СБ 19+ 6,6±0,9 6,9±3,9 7,0+3,7 7,2+2,3

6,714,0 7,1+3,7 6,9+3,3

* Статистически значимые различия по сравнению с показателями доноров (р<0.05)

выводы

1. Для конъюгирования МКА серии ICO с красителями СуЗ, Imd-306, Imd-506 и Alexa-488 Ig достаточно простых методов очистки и выделения антител (осаждение сульфатом аммония, применение каприловой кислоты, ионообменная хроматография), в то время как мечение МКА фикоэритрином требует высокой степени очистки иммуноглобулинов с применением аффинной хроматографии.

2. Оптимальными условиями для мечения МКА серии ICO красителями СуЗ, Imd-306, Imd-506 являются: бикарбонатный буфер с pH 9,3, концентрация антител в реакционной смеси — 1 мг/мл, время инкубации — 30 минут, температура — 18-25 С°; краситель А1еха-488 требует повышения pH карбонатный буфера до 8,3, повышения времени инкубации до 90 минут.

3. Сукциннмидил-4-[Ы-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) — эффективный агент, модифицирующий молекулу РЕ, при конъюгировании МКА серии ИКО.

4. Для конъюгатов МКА с цианиновыми флуорофорами СуЗ, Imd-306 оптимальная плотность мечения D/P находится в диапазоне 4-10; для Imd-506 — 3,5-7,0, для Alexa-488 — 4-13,5, а для РЕ в диапазоне 1,1-1,4.

5. Разработанные методы конъюгирования МКА с флуорофорами не меняют иммунологические свойства антител. Вместе с тем, уникальность каждого клона гибридом-продуцентов МКА серии ICO требуют индивидуального подбора флуорофоров.

6. В результате проведенных исследований получены многоцветные флуоресцентные зонды, на их основе сформированы наборы, позволяющие проводить популяционный и субпопуляционный анализ лимфоцитов человека методом проточной цитофлуориметрии.

7. Клиническая апробация разработанных наборов с использованием периферической крови здоровых доноров и онкологических больных показала их высокую диагностическую эффективность, не уступающую зарубежным аналогам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации, в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ:

1. Захарова E.H. Иммунофлюоресцентные зонды на основе моноклональных антител ICO-31 и цианинового красителя IMD-506 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии/ E.H. Захарова, П.К. Иванов, Т.Н. Заботина, Н.В. Голубцова, М.Н. Краева, И.В.Чинарева, А.С.Гриневич, Д.Ю. Блохин//Рос. Биотерапевт. Журнал. 2013,—№4, —Том 12, —С. 27-32

2. Захарова E.H. Двухцветный анализ клеточных популяций метом проточной цитометрии с использованием МКА серии ICO, конъюгированных с цианиновым красителем IMD-306/ E.H. Захарова, П.К. Иванов, Т.Н. Заботина, , Н.В. Голубцова, И.В.Чинарева, А.С.Гриневич, Д.Ю. Блохин// Рос. Биотерапевт. Журнал. — 2014. — №1. — Том 13. — С. 17-21, рисунки на вклейке

Другие работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Захарова Е.Н.Производные флуорофора Су5 для цитометрического анализа клеточных популяций/ Е.Н.Захарова,В.Е. Кузнецова, A.C. Гриневич, Е.Ю. Лысюк,Д.Ю. Блохин, A.B. Чудинов, П.К. Иванов.// Маг. Междунар. Симп. "Молек. механизмы регуляции функции клетки". — Тюмень 2005. — С. 13-15

2. Захарова Е.Н.Производные флюорофора Су5 для цитометрического анализа клеточных популяций./ E.H. Захарова,В.Е. Кузнецова, A.B. Чудинов,A.C. Гриневич, Е.Ю. Лысюк, Д.Ю. Блохин, П.К. Иванов// Рос. Биотерапевт. Журнал. — 2006. — № 5. — Том. 1. — С. 8-9

3. Захарова Е.Н.Двухцветный анализ клеточных популяций метом проточной цитометрии с использованием цианинового красителя IMD-306/E.H. Захарова,Т.Н. Заботина, A.B. Чудинов, A.C. Гриневич, Д.Ю. Блохин, П.К. Иванов// Рос. Биотерапевт. Журн., 2007, 1: Мат. Всерос. Науч.-практ. Конф. "Отечественные противоопухолевые препараты". — Москва 16-18.03.2007. — С.66

4. Захарова E.H. Иммунофлюоресцентные зонды на основе МКА серии ICO и отечественного флюорофора IMD-306./E.H. Захарова,Т.Н. ЗаботинаД.В. Чудинов, A.C. Гриневич, Д.Ю. Блохин,П.К. Иванов// Рос. Биотерапевт. Журнал. — 2007 — №1: Мат. Всерос. Науч.-практ. Конф. "Отечественные противоопухолевые препараты". — Москва 16-18.03.2007. —С.66-67

5. Захарова Е.Н.Получение коньюгатов моноклональных антител с флуорофором Alexa-488 для анализа клеточных популяций методом прточной цитометрии/ E.H. Захарова, Т.Н. Заботина, Д.Ю. Блохин, П.К. Иванов// Рос. Биотерапевт. Журнал 2011. — 1. — Мат. Всерос. Науч.-практ. Конф. "Отечественные противоопухолевые препараты». — Москва 22-23.03.2011. — С.24-25

Подписано в печать 26.03.15 Формат 60x84/16. Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № ' ? 19 Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. ННБлохина» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24