Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Митохондриальные нарушения при болезни Паркинсона: клинико-цитохимическое исследование

На правах рукописи

Полевая Елена Валерьевна

МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА: КЛИНИКО-ЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

14.00.13 - НЕРВНЫЕ БОЛЕЗНИ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте неврологии Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Иванова-Смоленская И. А. доктор медицинских наук Сухорукое B.C.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кадыков А.С. доктор медицинских наук, профессор Авакян Г.Н.

Ведущая организация - Российская медицинская академия последипломного образования врачей.

Защита состоится марта 2004 г. В ^ часов на заседании диссертационного

совета Д 001.006.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте неврологии Российской академии медицинских наук по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ неврологии РАМН. Автореферат разослан «¿^fi февраля 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

С.Н. Иллариошкин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Паркинсона - второе по частоте (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративное заболевание позднего возраста, которое встречается во всех популяциях мира и имеет распространенность от 2 до 4% среди лиц старше 65 лет [Шток В.Н., Федорова Н.В., 1997; Голубев В.А. с соавт., 2000; Mutch W.J., Lien С, 2001].

Исследования последних лет показали, что важная роль в патогенезе болезни Паркинсона (БП) отводится дефекту электронной цепи митохондрий [Mizuno Y. et al, 1998; Schapira A.H.V. et al., 1998]. Нарушение энергетического обмена в виде дефицита комплекса I дыхательной цепи митохондрий (NADH-CoQ-редуктазы) в нейронах черной субстанции больных БП было выявлено Schapira с соавторами в 1989 г: дефицит активности составил ~ 35% от возрастной нормы. В последующем исследователи установили, что снижение активности электрон-транспортной цепи митохондрий при БП имеет системный характер: нарушения окислительного фосфорилирования митохондрий были выявлены также в ряде других тканей больных при болезни Паркинсона - в тромбоцитах, лимфоцитах, мышцах. [Parker W.D. etd., ¡989;ShqffherJM. etal., 1991;ÁfytímeouC eíd, 1994; YashmoH. etd, 1992).

В связи со значимостью митохондриальной функции в модулировании клинических проявлений БП, возможностью эффективной лекарственной коррекции нарушений клеточного энергообмена, а также в связи с влиянием на окислительное фосфорилирование ряда противопаркинсонических препаратов (в частности,

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

осда

леводопы), актуальной задачей становится проведение мониторинга активности клеточного энергообмена у пациентов с БП.

В последние годы благодаря совместным успехам клиницистов и специалистов по лабораторной диагностике появился адекватный, относительно простой и малотравматичный количественный цитохимический метод исследования митохондриальных ферментов, достоверно отражающий полисистемное состояние энергетического обмена клеток и тканей [Suchorukov V.S. et al, 2000). Исследования в области клинической цитохимии с использованием данного метода показали, что метаболические изменения в лимфоцитах крови в значительной степени отражают аналогичные сдвиги в других клетках организма и органах [Нарциссов Р.П., 1998; Петричук СВ., 1996; Суслова Г.Ф., 1991]. Это делает актуальным использование цитохимического метода оценки активности митохондриальных ферментов при различных заболеваниях, характеризующихся системными нарушениями окислительного фосфорилирования.

По-прежнему актуальной остается проблема поиска новых средств для коррекции нарушений окислительного фосфорилирования у больных БП. При этом большой интерес представляют препараты янтарной кислоты, играющие центральную роль обеспечении стабильности энергетического обмена и функционировании митохондрий [Кондрагиова М.Н., 1997]. Входя в состав комплекса II дыхательной цепи митохондрии, янтарная кислота может быть особенно эффективной при дефектах комплекса I, что имеет место при БП, обеспечивая бесперебойный перенос электронов на комплексы III и IV.

Исходя из вышеизложенного, нами была определена следующая цель исследования цитохимический анализ состояния окислительного

фосфорилирования у пациентов с БП, а также установление взаимосвязи выявленных митохондриальных нарушений с клиническими характеристиками заболевания.

Задачи исследования:

1. У пациентов с БП оценить эффективность системного энергетического метаболизма на основе исследования митохондриальных и цитоплазматических ферментов-дегидрогеназ лимфоцитов: сукцинат-дегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

2. Проанализировать особенности анаэробного обмена у больных БП путем определения молочной и пировиноградной кислот в крови натощак и после нагрузки глюкозой, а также их соотношение.

3. Провести количественную оценку нарушений в системе окислительного фосфорилирования при БП с помощью анализа активности ключевого митохондриального фермента - сукцинатдегидрогеназы - методом компьютерной морфометрии.

4. Провести сравнительный анализ активности изучаемых ферментов в различных клинических группах и при различных формах первичного паркинсонизма (поздняя БП и ювенильный паркинсонизм, больные на фоне леводопа-содержащей терапией и без приема леводопа препаратов). Сопоставить выявленные при первичном паркинсонизме изменения с группой сравнения - пациентами с другим характером нейродегенеративного процесса (хореей Гентингтона).

5. Оценить эффективность медикаментозной коррекции выявленной митохондриальной недостаточности при БП с помощью активатора дыхательной цепи митохондрий - янтарной кислоты. Сопоставить полученные цитохимические данные с динамикой клинических симптомов у больных БП.

Научная новизна. Впервые при проведении комплексного клинико-цитохимического исследования изучено состояние клеточного энергообмена в лимфоцитах периферической крови у больных БП до лечения леводопа-содержащими препаратами, на фоне лечения, а также у пациентов с ювенильной формой БП и у больных с хореей Гентингтона (группа сравнения). Показана взаимосвязь клинических проявлений заболевания с системными нарушениями клеточного энергообмена. Впервые выявлены цитоморфометрические отличия ювенильного паркинсонизма от «классической» поздней формы БП. У пациентов БП, которым проводилась терапия леводопа-содержащими препаратами и, напротив, которые не принимали леводопа-содержащие препараты, выявлена динамика митохондриальных нарушений на фоне лечения регулятором энергетического обмена - янтарной кислотой.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований показана информативность цитоморфометрического анализа ферментативного статуса лимфоцитов периферической крови для контроля течения первичного паркинсонизма в разных возрастных группах, а также для оценки эффективности терапии регуляторами энергетического обмена, в частности, янтарной кислотой, у БП.

Предложен патогенетически обоснованный метод коррекции митохондриальных нарушений у больных БП, не принимавших леводопа-

содержащую терапию, что способствует увеличению арсенала терапевтических возможностей при данном заболевании.

Дополнительное назначение янтарной кислоты больным БП, не принимающим леводопа-содержащие препараты, внедрено в практику нейрогенетического отделения НИИ неврологии РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Цитохимический анализ лимфоцитов периферической крови может служить адекватным методом оценки митохондриальной недостаточности у больных БП.

2) У больных БП, принимавших препараты леводопы, имеет место наиболее значительное снижение окислительного фосфорилирования. Это проявляется при цитохимическом исследовании значительным уменьшением числа гранул формазана, снижением их площади, средней и интегральной оптической плотности и других показателей по сравнению с одновозрастной группой контроля и больными с другими формами первичного паркинсонизма (пациентами с БП, без леводопа-терапии и больными ювенильным паркинсонизмом).

3) Результаты проведенного нами цитохимического исследования свидетельствуют об общности патогенетических механизмов развития первичного паркинсонизма в пожилом и молодом возрасте, т.е. о близости патогенеза БП и ювенильного паркинсонизма.

4) Улучшение клинических и цитоморфометрических параметров у пациентов с БП, не принимавших леводопа-содержащую терапию, на фоне использования регуляторов энергетического обмена (янтарной

кислоты) позволяет судить о возможности эффективной лекарственной коррекции нарушений клеточного энергообмена у больных на начальной стадии заболевания.

Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, II и III сосудистых, нейрогенетического, нейрохирургического, нейроинфекционного, научно-консультативного отделений, лабораторий клинической электрофизиологии и биохимии ГУ НИИ неврологии РАМН 30 сентября 2003 года. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: Всероссийском рабочем совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001); Ш международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2002), III Съезд биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), XXXV Международном Дунайском симпозиуме по нейронаукам (Белград, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ; одна работа находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания общей характеристики обследованных больных и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, библиографического указателя (включающего 163 источников, в том числе 37 работ отечественных и 126 зарубежных авторов) и приложения. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 10 таблицами.

2. ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика больных и клиническихметодов исследования.

В нейрогенетическом отделении НИИ неврологии РАМН нами стационарно и амбулаторно обследованы 77 пациентов с БП. Учитывая вероятные клинико-цитохимические отличия, лежащие в основе патогенеза разных форм БП, а также возможное отрицательное влияние препаратов леводопы на окислительное фосфорилирование, все больные БП были разделены на три группы. Распределение обследованных больных на группы представлено в таблице 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика обследованных больных.

Клинические группы Количество наблюдений Возраст (в годах) Тхжестъпо шкале ирш^ (в баллах) Тяжесть по шкале НосЬл &УаЬг (стадия) Длительность болезни (в годах)

Группа 1 32 62,8±7,4 (48-77) 30,5±13,3 (11-66) 2,0±0,7 (1-3) 3,6±1,9 (1-7)

Группа 2 32 65,6±8,3 (45-79) 39,8±1б,5 (14-74) 2,5±0,8 (1-4) 7,1±3,8 (1-15)

Группа 3 13 36,6±10,3 (17-58) 21,5±7,3 (8-31) 1,9±0,5 (1-2,5) 8,2±8,7 (3-35)

Группа сравнения 13 55,9±10,5 (45-80) - - 11,1±8,2 (3-32)

В первую группу вошли больные, не получавшие леводопа-содержащих

препаратов (п=32); вторую группу составили пациенты с БП, получавшие леводопа-содержащие препараты (п=32), причём по возрасту эта группа была сопоставима с первой группой (см. таб.1). Третью группу составили больные с ювенилъным паркинсонизмом (п=13). Группу сравнения составили 13 пациентов с хореей Гентингтона в возрасте от 45 лет до 80 лет (55,9+10,5 лет).

В группу контроля вошли 25 клинически здоровых людей двух возрастных категорий: 10 человек молодого возраста (средний возраст 30±1,4 лет) и 15 лиц

пожилого возраста (средний возраст 63,6+4,2 лет); при этом в исследование не включались лица с выраженной соматической патологией с заболеваниями центральной и периферической нервной системы, а также недавно перенесшие простудные заболевания (что могло сопровождаться дисбалансом в системе окислительного фосфорилирования).

Диагноз БП устанавливался на основании критериев, предложенных Haghes с соавторами (1992). Базисная оценка тяжести и стадии БП проводилась с использованием стандартных шкал: унифицированной рейтинговой шкалы проявлений паркинсонизма -UPDRS, а также шкалы ИогИп ММ., УаИгМ.Б.(1967) в модификации Ып(уа11 0.(1989).

2.2. Характеристика биохимического и цитохимического методов исследования.

Определение уровней молочной и пировиноградной кислот в крови. у больных в первой и второй группах проводилось с помощью энзиматического метода RollinghofF(1967) натощак и после стандартной нагрузки глюкозой.

Цитохимическое исследование выполнялось в лаборатории общей патологии Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России. Системная оценка энергетического метаболизма у обследованных больных проводилась путем определения параметров активности ферментов тканевого дыхания: сукцинат-дегидрогеназы (СДГ), а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ), глутамат-дегидрогеназы (ГДГ), малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцитах периферической крови. Выбор этих энзимов определялся их ключевой позицией в аэробном и анаэробном энергообеспечении клетки, а также тем фактом,

что изменение их активности является маркёром митохондриальной дисфункции [КлембовскийА. И. и соавт., 1999; Suchorukov V.S. etal, 2000].

Для определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах нами использовался цитохимический метод Пирса в модификации Р.П.Нарциссова (1985, 1998). При этом ферментная активность выражается в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул формазана, являющегося продуктом цитохимической реакции. Исследование оценки нарушений энергетического обмена состояла из двух этапов. На первом этапе рутинным способом с использованием светового микроскопа «Биолам» визуально определялось среднее количество гранул и ориентировочно оценивались изменения их качественных параметров (распределение гранул в клетке, форма и размер гранул, наличие кластеров).

На втором этапе была проанализирована цитохимическая активность лимфоцитарной СДГ с помощью метода компьютерной морфометрии с использованием диагностической системы, состоящей из персонального компьютера со специальным пакетом морфометрических программ «Видео-тест Авто 4.0» (методика Сухорукова B.C., Тозлиян Е.В.) и светового микроскопа с цифровой камерой. Данный метод, помимо числа гранул формазана в каждой клетке, позволяет определить площадь депозитов, их оптическую плотность и разнородность по оптической плотности (интервал яркости), другие параметры организации депозитов в клетке. В связи с локализацией СДГ только в митохондриях геометрические размеры депозитов мы рассматривали как размеры митохондрий, а оптическую плотность депозитов - как интенсивность ферментной реакции, т.е. активность фермента или функциональную активность митохондрий. Анализ проводился раздельно по гранулам разной площади: мелкие, средние,

кластеры. При этом предполагалось, что мелкие гранулы соответствуют мелким митохондриям, средние - крупным, а кластеры - конгломератам митохондрий.

Статистический анализ полученных данных с использованием стандартного пакета компьютерных прикладных программ STATISTIKA, версия 6.0 (StatSoft, 2003). При этом применялись следующие непараметрические методы: анализ связи (корреляции) двух признаков (метод Спирмена); сопоставление двух независимых групп по количественному признаку (U-критерий Манная-Уитни); сравнение двух зависимых (связанных) групп по количественному признаку (критерий Вилкоксона); описательная статистка.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Резул ьтат ы биохими ческого и цитохими ческого анализа Б П.

Исходная оценка системы окислительного фосфорилирования у больных БП проводилась нами на- основании исследования биохимических критериев митохондриальной недостаточности (уровня молочной и пировиноградных кислот в крови до и после нагрузки глюкозой и их соотношение), а также показателей цитоморфометрического исследования лимфоцитов крови.

Как видно из представленной гистограммы (на рисунке 1), у больных первой и второй групп с БП значения молочной и пировиноградной кислот натощак и после приема глюкозы (через 60 минут) оставались в пределах возрастной нормы. Таким образом, по данному показателю БП отличается от первичных митохондриальных цитопатий, характеризующихся в большинстве случаев системным лактат-ацидозом [DxMauroS, 1993;ShojfnerJ.M., 1995;SchapiraA.H.V, 1997, 1999].

Рисунок 1. Содержание молочной и пировиноградных кислот в сыворотке крови у больных БП первой и второй групп.

Лактат Пируват

Натощак Через 60 Натощак Через 60

минут минут

Примечание: достоверность отличия от одновозрастного контроля - *р<0,05; **р <0,01

Цитохимический анализ митохондриальных нарушений проводился раздельно в 3 группах больных БП - не получавших леводопа-препараты, получавших леводопа-препараты и у больных с ювенильной формой БП. Одновременно проводились аналогичные исследования цитохимической активности в группах контроля среди пожилых и молодых лиц и в группе сравнения - у больных хореей Гентингтона (ХГ).

В таблице 2 суммированы результаты проведенного визуального цитохимического анализа в обследованных группах больных и в контроле.

При визуальном анализе гранул формазана в лимфоцитах здоровых 30-летних людей наблюдалась высокая функциональная активность митохондрий. Это выражается в большом количестве очагов ферментативной активности с относительно равномерным распределением гранул по клетке.

С возрастом эта активность снижалась по всем ферментам. Так, средняя активность исследованных ферментов в группе контроля позднего возраста (63,6±4,2 лет) была ниже

Таблица 2. Сравнительная характеристика активности ферментов энергетического обмена в 3 группах больных БП ив группе сравнения (визуальная оценка).

Параметры СДГ а-ГФДГ ЛДГ МДГ ГДГ

Контроль / 17,6±1,3 7,210,5 8,8±1,4 7,04+1,3 6,8±0,8

Контроль II 19,2±0,5 12,4±1,4 12,4±1,8 12,6±1,7 13,4±1,4

Группа I 11,8±2,0* 4,9±1,1* 7,2±2** 5,2±1,б** 4,3±1,4

Группа 2 10,3±1,8** 4,1±0,9** 6,9±1,8 5,2±1,6** 4,0±1,2

Группа 3 15,6±2,8* 6,1±1,3 9,2±1,4* 6,1±1,6* 6,0±1,6

Группа 15,4±1,8** 6,0±0,8* 8,4±1,2** 5,9±0,7 6,1±0,9**

сравнения

Примечание: числовые значения в таблице отражают ферментативную активность лимфоцитов в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул формазана, являющегося продуктом цитохимической реакции.

Контроль I- пожилые лица, возраст которых составил 63,6 ±4,2 лет. Контроль II - молодые лица, возраст которых составил 30,0±1,4 лет. Группа 1 - пациенты с БП, не получавшие леводопа-содержащей терапии; Группа 2 - пациенты с БП, получавшие леводопа-содержащие препараты; Группа 3- пациенты с ювенильной формой БП.

Достоверность отличия от одновозрастного контроля - »р<0,05, ♦»pcO.OI.

по сравнению со здоровыми молодыми людьми: соответственно, СДГ - 17,6±1,3 и 19,2iO,5; а-ГФДГ - 7,2±0,5 и 12,4±1,4; ЛДГ - 8,8±1,4 и 12,4±1,8;МДГ - 7,0±1,3 и 12,6±1,7; ГДГ - 6,8±0,8 и 13,4±1,4. Это подтверждает литературные данные о том, что активность электрон-транспортной цепи митохондрий значительно снижается с возрастом [BowlingAC, et al. 1993; Chen Y.I. et al, 1994], в том числе в связи с тем, что при старении происходит снижение тканевого потребления кислорода и интенсивности основных метаболических процессов [Scheffler I.E., 2001]. Уменьшение митохондриальной активности с возрастом может объяснять отсроченное начало некоторых нейродегенеративных заболеваний [Илюриошкт СЕ, 2003].

У всех больных БП были обнаружены значительные нарушения энергетического обмена, проявляющиеся достоверным снижением активности как митохондриальных, так и цитоплазматических ферментов (см. таблицу 2). Все это

указывает на нарушение окислительно-восстановительных процессов в митохондриях лимфоцитов крови у больных первой, второй и третьей групп.

Ферментативная активность лимфоцитов крови у больных ювенильным паркинсонизмом была несколько выше, чем у пациентов с классической формой БП (у пациентов первой и второй групп), однако она значимо не достигала своей возрастной нормы.

Наибольшее снижение активности исследованных энзимов наблюдалось во второй группе - у пациентов, принимавших препараты леводопы. Полученные данные могут явиться косвенным клиническим подтверждением активно обсуждаемой в литературе возможности отрицательного воздействия на окислительное фосфорилирование леводопа-содержащих препаратов [Bravi D. et ai, 1992; Przedborski S. et (I, I993;Gu M., et ш, 1997 ]. Следует отметить, что при этом пациенты второй группы, как правило, были старше и имели большую давность и тяжесть заболевания, что также могло вносить свой вклад в выраженность указанных изменений.

Для более детальной оценки функционального состояния клеточной энергетики на втором этапе у обследованных больных было проведено цито-морфологическое исследование активности лимфоцитарной СДГ с помощью метода компьютерной морфометрии.

При сопоставлении полученных данных у обследованных групп больных степень выраженности морфометрических параметров митохондриальньгх нарушений была неоднородной.

У больных первой и второй групп имелась тенденция к достоверному относительному увеличению наиболее крупных и оптически плотных ассоциаций

депозитов-кластеров; в первой группе их процентное соотношение было 27,8%, во второй 37,8% (при возрастной норме 25,7%). Как видно из рисунка 2, этот процесс был более выражен во второй группе больных.

Рисунок 2 Процентное, соотношение гранул у больных БП первой и второй групп

У пациентов второй группы было выявлено достоверное абсолютное снижение количества митохондрий при относительном повышении процесса кластерообразования - патологического скопления большого количества гранул (митохондрий) в конгломераты. Конгломераты митохондрий компенсаторно разрастались, с одновременным повышением ферментативной активности в каждой отдельной митохондрии (увеличивалась средняя и интегральная оптическая плотность депозитов - см. таблицу 2). Снижение числа активных митохондрий с высокой вероятностью может быть связано с отрицательным действием препаратов леводопы, поскольку, по данным корреляционного анализа, доза леводопы отрицательно коррелировала с общим количеством депозитов (р=-0,69; р=0,04).

Таблица 2. Средние значения морфометрических параметров активности лимфоцитарной СДГ в периферической крови по гранулам всех размеров (кластерам, средним и мелким) в обследованных группах больных

Параметры Число депозитов Площадь депозитов Интервал яркости Средняя оптическая плотность Интефальная оптическая платность

Контроль 1 6,6±2,4 3,3±1,7 88,8±18,1 0,23±0,06 34,2±21,8

Контроль 11 6,1 ±2,4 4,0±2,1 67,8±8,3 0,23±0,04 32,0±19,4

Группа 1 до лечения 6,1±2,0" 2,7±0,8 65,6±26,6 0,23±0,1 22,1±13,3*

Группа 2 до лечения 4,8±1,4** 2,6±0,7* 75,3±10,8 0,25±0,05» 30,2±10,0

Группа 3 5,0±1,7* 3,8±1,6 86,8±10,7* 0,25±0,04* 39,25±21,4

Группа 4 5,2±0,8 3,06±0,9 73,7±12,1 0,22±0,05* 31,0±11,3 ... .. !

Примечание: * р<0,05; ** р<0,001 в соответствии с одновозрастной группой контроля. По

всем анализируемым параметрам значения представлены в виде М±ш.

Объединение митохондрий в конгломераты, имеющее, по-видимому, компенсаторный характер, наблюдалось у пациентов первой группы, но в менее выраженной степени. У пациентов первой группы процесс кластеризации сопровождался незначительным увеличением интенсивности ферментной реакции (оптической плотности депозитов). Данный процесс характеризовался снижением активности фермента (интегральная оптическая плотность составляла 22,1±13,3 при норме ЗО,О±21,8 (р<0,05).

Несколько отличные по своей выраженности, но качественно аналогичные изменения энергетического обмена наблюдались в третьей группе (у пациентов с ювенильной формой паркинсонизма). Несмотря на уменьшение количества гранул формазана, у пациентов с ювенильной формой паркинсонизма увеличиваются основные характеристики, свидетельствующие о повышении функциональной активности митохондрий (повышается гетерогенность гранул, а также средняя и

интегральная оптическая плотности). У пациентов данной группы прослеживается тенденция, в ходе которой в развитии компенсаторных реакций активное участие принимают не только наиболее активные митохондрии, объединенные в кластеры, но и мелкие митохондрии. Это может служить цитохимическим подтверждением более «доброкачественного» характера нейродегенеративного процесса при данной форме первичного паркинсонизма.

В результате корреляционного анализа было установлено, что в первой группе больных БП имеется тесная корреляционная связь цитоморфометрических параметров с тяжестью заболевания, оцененной в баллах по стандартной шкале ЫоеИп&УаЪг (р=-0,60; р=0,0003); у пациентов второй, третьей и четвертой групп цитоморфометрические параметры гранул коррелировали с продолжительностью заболевания (соответственно р=0,85 при р=0,00З, р=0,74 при р=0,004 и р=0,77 при р=0,04), а у пациентов третьей группы - с тяжестью заболевания, рассчитанной по шкале иРБИЗ (р=-0,80; р=0,02). В группе сравнения у пациентов с ХГ цито-морфометрические показатели коррелировали только с продолжительностью заболевания (р=0,76; р=0,05).

3.2. Клиническая и цитоморфометрическая динамика митохондриальных нарушений на фоне приема янтарной кислоты.

На основании выявленных нарушений энергетического метаболизма, наиболее отчетливых у больных БП в первой и во второй группах, нами была проведена корригирующая терапия препаратом янтарной кислоты (янтавитом) -естественным клеточным метаболитом, стимулирующим физиологическую активность митохондрий в качестве донора электронов в митохондриальную дыхательную цепь [Кондрашова М.Н., 1997].

Анализ осуществлялся в группе из 20 пациентов. При этом возраст больных БП, не принимавших препараты леводопы варьировал от 54 до 71 лет (в среднем 63,4±6,7 лет), продолжительность заболевания составила от 1 до 5 лет (в среднем 4,2±2,2 лет), тяжесть заболевания по шкале иРБИ^ варьировала 15 до 37 баллов (средний балл 27,7±1,1), а по шкале ЫоеЪп&УаИг - от 1,5 до 3 баллов (средний балл 2,0±1,7). В группе больных БП, принимавших препараты леводопы возраст вальировал от 51 до 75 лет (в среднем 64,5±7,1 лет), продолжительность заболевания - от 1 до 10 лет (в среднем 6,1±5,2 лет), тяжесть заболевания по шкале иРБИЗ - от 13 до 42 баллов (средний балл 28,3±2,3), а по шкале ЫоеЪп&УаИг - от 1,5 до 3,5 баллов (средний балл 2,5±1,6).

Помимо янтарной кислоты, у всех пациентов обеих групп осуществлялся приём сопутствующих противопаркинсонических препаратов в стабильной, не менявшейся дозе: в первой группе - агонистов дофаминовых рецепторов (мирапексом или пирибедилом), амантадина и/или холинолитиков, а во второй группе - леводопа-содержащих препаратов в дозировке 681,25±231,0 мг в сутки (средняя продолжительность приема 4,2±2,3 года) в сочетании с агонистами дофаминовых рецепторов (мирапексом или пирибедилом), амантадином и/или холинолитиками. Доза янтарной кислоты, согласно рекомендациям Л.З.Казанцевой (1999), разработанной для лечения митохондриальных цитопатий, была прерывистой и составляла 50-100 мг/сутки в течение 4 недель по схеме: 4 дня прием, 3 дня перерыв. В целом нами была отмечена хорошая переносимость янтарной кислоты. Нежелательных явлений зафиксировано не было.

При клинической оценке эффективности проведенной терапии в обеих группах больных достоверных изменений при оценке тяжести состояния по шкалам иРБИЗ и ЫоеИп & УаИг, выявлено не было, несмотря на отчетливое субъективное улучшение у 30% больных (улучшалось общее самочувствие, снижалась гипокинезия, улучшался контроль над дрожательным гиперкинезом).

На фоне приема янтарной кислоты в обеих исследованных группах произошло достоверное повышение активности ключевых митохондриальных и цитоплазматических ферментов (см. рисунок 3). При этом в обеих группах становилось более уравновешенным распределение гранул в клетках.

Рисунок 3 Динамика активности митохондриальных ферментов у больных БП на фоне лечения янтарной кислотой (п-20).

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Контроль! Группа 1 Группа 1 Группа 2 Группа 2

после после

печения лечения

Примечание: *р<0,05; р<0,01 - в соответствии с одновозрастной группой контроля

При проведении компьютерного цитоморфометрического исследования лимфоцитов у пациентов БП первой группы, не принимавших леводопа-содержащие препараты, было выявлено заметное повышение активности СДГ, которое

выражалось, помимо увеличения общего количества гранул, в увеличении общей площади депозитов, интервала яркости и интегральной оптической плотности гранул. Указанная тенденция была весьма отчетливой и лишь немного не достигала уровня статистической значимости по критерию Вилькоксона (р=0,07). Эти данные свидетельствуют о том, что у больных БП первой группы сохраняется способность митохондрий адекватно реагировать в ответ на использование активаторов дыхательной цепи митохондрий.

Таблица 6. Динамика морфометрических показателей активности лимфоцитарной СДГв периферической крови больных БП на фоне лечения янтарной кислотой (п=20)

Параметры Число депозитов Площадь депозитов Интервал яркости Средняя оптическая плотность Интегральная оптическая плотность

Контроль 1 6,б±2,4 3,3±1,7 88,8±18,1 0,23±0,06 34,17±21,8

Группа 1 до лечения 6,1±2,0** 2,7±0,8 65,6±26,6 0,23±0,1 22,07±13,3*

Группа 1 после лечения 6,8±2,3* 3,2±2,0 72,5±23,7» 0,20*0,07 27,4±21,4*

Группа 2 до лечения 4,8±1,4** 2,б±0,7* 75,3±10,8 0,25±0,05* 30,2±10,0

Группа 2 после лечения 6,0±2,2 2,9±1,9* 54,1± 12,2 0,17±0,04* 23,4±22,0

Примечание: *р<0,05; **р <0,001- в соответствии с одновозрастной группой контроля.

У пациентов БП, принимавших леводопу, после 4~недельного курса лечения янтарной кислоты имела место диссоциация цитоморфометрических показателей -увеличение количества гранул депозитов при одновременном снижении их показателей, выражающих функциональную активность митохондрий (снижение интервала яркости, средней и интегральной оптической плотностей и площади гранул). Это свидетельствует об истощении процессов энергообразования и

косвенно может служить подтверждением отрицательного влияния терапии леводопой на эффективность окислительного фосфорилирования.

Полученные в ходе исследования данные свидетельствуют о глубоком нарушении функции митохондрий и системной декомпенсации энергетического обмена у больных с различными вариантами первичного паркинсонизма. Результаты проведенного нами цитохимического исследования, несмотря на некоторые особенности распределения активности митохондриальных ферментов в отдельных группах, свидетельствуют об общности патогенетических механизмов развития первичного паркинсонизма в пожилом и молодом возрасте. Проведенное исследование подтверждает и уточняет на цитохимическом уровне роль митохондриальной дисфункции в качестве одного из ключевых звеньев патогенеза БП.

СДГ а-ГФДГ

ГДГ

МДГ

ЛДГ

ХГ

БП

Условные сокращения и специальные термины

- болезнь Паркинсона

- хорея Гентингтона

- сукцинатдегидрогеназа

- альфа-глицерофосфатдегирогеназа

- глутаматдегидрогеназа

- малатдегидрогеназа

- лактатдегидрогеназа

23

ВЫВОДЫ

1) Цитохимический анализ активности дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови при различных формах БП позволил выявить полисистемные нарушения клеточного энергообмена во всех обследованных группах больных. Они заключались, главным образом, в перестройке морфофункциональной организации митохондрий и снижении их числа, а также в изменении ряда морфометрических параметров депозитов (оптической плотности, интервала яркости и др.).

2) Степень изменения цитоморфометрических параметров активности митохондриальных ферментов у больных БП достоверно коррелирует с продолжительностью и тяжестью заболевания, оцениваемых по стандартным шкалам иРБИЗ и ЫоеИп&УаИг.

3) Однонаправленность изменений активности цитоморформетрических параметров митохондриальных ферментов в обследованных подгруппах больных свидетельствует об общности патогенетических механизмов развития первичного паркинсонизма в пожилом и молодом возрасте. При этом у больных с ювенильным паркинсонизмом нарушения клеточного энергообмена более компенсированы, что может служить цитохимическим подтвержением относительно "доброкачественного" характера нейродегенеративного процесса при данной форме первичного паркинсонизма.

4) Положительная динамика клинических и цитоморфометрических показателей после 4-недельного курса лечения янтарной кислотой у пациентов, не принимавших леводопа-содержащие препараты, подтверждает принципиальную возможность коррекции имеющихся при БП системных нарушений

энергетического обмена на основе использования активаторов дыхательной цепи митохондрий.

5) У больных БП, принимающих леводопу, использование препаратов «митохондриального ряда» сопровождается диссоциацией

цитоморфометрических показателей - увеличением количества гранул депозитов при одновременном снижении их интервала яркости, оптической плотности и площади гранул. Это свидетельствует об истощении процессов энергообразования и может служить косвенным подтверждением негативного влияния леводопа-терапии на эффективность окислительного фосфорилирования.

Практические рекомендации

1. Предложенный цитохимический метод может использоваться в качестве тонкого дополнительного лабораторного теста с целью мониторинга течения патологического процесса и оценки эффективности проводимой терапии при различных формах первичного паркинсонизма.

2. У пациентов с БП, не принимавших леводопу (т.е. преимущественно на начальных стадиях паркинсонизма), обоснованным является дополнительное включение в терапевтическую схему препаратов, способствующих утилизации органических субстратов и стабилизации дыхательной цепи митохондрий (янтарная кислота, коэнзим р10 и другие доноры электронов дыхательной цепи митохондрий).

Список научных работ по теме диссертации

1. Е.В. Полевая, И.А.Иванова-Смоленская, В.С.Сухоруков. Митохондриальная недостаточность при болезни Паркинсона: клинико-цитохимическое исследование. В сб. « Митохондрии в патологии» (материалы Всероссийского рабочего совещания): тез. докл. Пущино, 2001: 132-133.

2. Е.В. Полевая, И.А.Иванова-Смоленская, В.С.Сухоруков. Новые современные технологии при изучении болезни Паркинсона В сб. «Здоровье и образование в XXI веке» (материалы III Международной научно-практической конференции): тез. докл. Москва, 2002: 324-325.

3. Е.В. Полевая, ИАИванова-Смоленская, В.С.Сухоруков. Цитохимическая диагностика как метод выявления митохондриальной недостаточности при болезни Паркинсона. В сб. материалы IIIСъезда биохимического общества: тез. докл. Санкт-Петербург, 2002:257.

4. Е.В. Полевая, И.А.Иванова-Смоленская, С.Н. Иллариошкин, М.В. Ершова. Цитохимический мониторинг применения регуляторов энергетического обмена при лечении некоторых нейродегенеративных заболеваний. В сб. X Российского национального конгресса « Человек и лекарство»: тез. докл. Москва, 2003: 315.

5. V.S. Sukhorukov, E.V.Tozliyan, M.V. Ershova, E.V. Polevaya, EA Shabelnikova, E.A. Nikolaeva, S.N.Illarioshkin, A.V. Merkurjeva, D.A. Chamchad Screening mitochondrial insufficiency test in neurological patients. Abstr. 35'"' International Danube symposium for neurological sciences & continuing education. Belgrade, 2003: 140.

6. E.B. Полевая, И.А. Иванова-Смоленская, С.Н. Иллариошкин, B.C. Сухорукое, Е.Д. Маркова Цитохимическая активность митохондриальных ферментов при болезни Паркинсона. Журн. неврол. и психиатр, им. С.С. Корсакова (в печати).

»-2942

На сегодняшний день болезнь Паркинсона (БП) является одним из наиболее распространенных прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний (вторым по частоте после болезни Альцгеймера), которым страдают преимущественно лица пожилого и старческого возраста. Актуальность этой проблемы возрастает в связи с тем, что во всем мире наблюдается существенное увеличение старших возрастных групп в общей популяции. Это приведет к тому, что в ближайшее время число больных паркинсонизмом будет неуклонно расти [Яхно Н.Н., 1995; De Rijk М. et al., 1995; Graeber M.B. et al., 1998].

Несмотря на более чем 100-летний период исследования болезни Паркинсона, до настоящего времени многие этапы ее патогенеза остаются недостаточно изученными. Достигнутые в последнее десятилетия успехи фундаментальных нейробиологических наук в понимании процессов выживания и гибели нейронов, развитие представления о роли экзайтотоксичности и окислительного стресса как единых механизмов повреждения клетки, позволяют более оптимистично оценивать прогностические аспекты терапии БП [Гомазков О.А., 2003; Marsden C.D., 1994; Gorman A.M., etal., 2000].

По мнению большинства исследователей, БП является мультифакторным заболеванием, в развитии которого играет важную роль генетическая предрасположенность и средовые факторы [Langston J.W., 1989; Marsden C.D., 1994; Ramsden D.B., etal., 2001].

Главной гисто-патологической основой болезни Паркинсона является дегенерация большей части дофаминергических нейронов компактной зоны черной субстанции и вентрального мезенцефалона. Одним из значимых механизмов патогенеза гибели клеток черной субстанции являются окислительный стресс, связанный с накоплением свободных радикалов в дофаминергических нейронах [Гуляева Н.В., Ерин А.Н. 1995; Артемьев Д.В. и соавт., 2001; Gotz М. et al, 1994; Folley P., Riederer P., 2000] и митохондриальные нарушения [Mizuno Y. et al, 1998; SchapiraA.H.V. etal., 1998].

В 80-ых годах прошлого столетия была выявлена способность нейротоксина МРТР (Ы-метил-1-4 фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридил) вызывать МРТР - индуцированный паркинсонизм путем ингибирования комплекса I дыхательной цепи митохондрий [Langston J.W. et al., 1983; Ramsay R.R. et al, 1986]. Это сосредоточило внимание ученых всего мира на том, что данное нарушение функции митохондрий, обнаруженное чуть позже в черной субстанции головного мозга больных БП, может быть одним из этапов патогенеза БП. Аналогичные изменения митохондриального комплекса I возникают и в экстранейрональных тканях больных БП (тромбоцитах, мышцах, фибробластах, лимфоцитах) [Parker W.D. et al., 1989; Shoffner J.M. et al, 1991; Mytilineou C. et al, 1994; Yoshino H. et al, 1992]. Понимание причин, приводящих к дефициту митохондриального комплекса I будет способствовать обоснованию патогенетических механизмов гибели нейронов у больных БП.

Выявление энергетических нарушений в различных тканях возможно при проведении дорогостоящих и трудоемких методов, таких как позитронно-эмиссионная томография и магнитно-ризонансная спектроскопия [Taylor D.J. et al.,1994; Schapira A.H.V.,1994]. В литературе больше нет указаний на более простые способы оценки уровня энергетического обмена, которые могли бы шире использоваться в практике и служить как ориентиром для оценки степени энергетического дефицита, так и быть критерием эффективности терапии митохондриальных нарушений у пациентов.

Цитохимический анализ ферментного статуса лимфоцитов периферической крови является высокоинформативным методом, достоверно отражающим энергетический обмен клеток и тканей при митохондриальной патологии [Сухорукое B.C. и соавт., 2000; Suchorukov V.S. et al., 2000]. Для диагностики митохондриальной недостаточности целесообразно определение активности дегидрогеназ лимфоцитов: сукцинатдегидрогеназы (СДГ), альфа-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и малатдегидрогеназы (МДГ). Данные ферменты занимают ключевые позиции в аэробном и анаэробном энергообмене клетки, и снижение их активности является маркёром митохондриальной дисфункции [Клембовский А. И. и соавт., 1999; Suchorukov V.S. et al., 2000]. Лимфоцит - клетка с преимущественным аэробным типом обмена - является одним из многочисленных клеток-мишеней митохондриальной патологии. Исследования в области клинической цитохимии показали, что метаболические изменения в лейкоцитах крови отражают аналогичные сдвиги во внутренних органах [Нарциссов Р.П., 1998; Петричук С.В., 1996; Суслова Г. Ф., 1991]. При этом относительная простота и малая травмотичность при получении материала делают это исследование чрезвычайно значимым.

Таким образом, исходя из вышеизложенного, цель исследования: цитохимический анализ состояния окислительного фосфорилирования у пациентов с БП, а также установление взаимосвязи выявленных митохондриальных нарушений с клиническими характеристиками заболевания. Задачи исследования:

1. У пациентов с БП оценить эффективность системного энергетического метаболизма на основе исследования митохондриальных и цитоплазматических ферментов-дегидрогеназ лимфоцитов: сукцинатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

2. Проанализировать особенности анаэробного обмена у больных БП путем определения молочной и пировиноградной кислот в крови натощак и после нагрузки глюкозой, а также их соотношение.

3. Провести количественную оценку нарушений в системе окислительного фосфорилирования при БП с помощью анализа активности ключевого митохондриального фермента — сукцинатдегидрогеназы - методом компьютерной морфометрии.

4. Провести сравнительный анализ активности изучаемых ферментов в различных клинических группах и при различных формах первичного паркинсонизма (поздняя БП и ювенильный паркинсонизм, больные на фоне леводопа—содержащей терапией и без приема леводопа препаратов). Сопоставить выявленные при первичном паркинсонизме изменения с группой сравнения - пациентами с другим характером нейродегенеративного процесса (хореей Гентингтона).

5. Оценить эффективность медикаментозной коррекции выявленной митохондриальной недостаточности при БП с помощью активатора дыхательной цепи митохондрий - янтарной кислоты. Сопоставить полученные цитохимические данные с динамикой клинических симптомов у больных БП.

Научная новизна.

Впервые при проведении комплексного клинико-цитохимического исследования изучено состояние клеточного энергообмена в лимфоцитах периферической крови у больных БП до лечения леводопа-содержащими препаратами, на фоне лечения, а также у пациентов с ювенильной формой БП и у больных с хореей Гентингтона (группа сравнения). Показана взаимосвязь клинических проявлений заболевания с системными нарушениями клеточного энергообмена. Впервые выявлены цитоморфометрические отличия ювенильного паркинсонизма от «классической» поздней формы БП. У пациентов БП, которым проводилась терапия леводопа-содержащими препаратами и, напротив, которые не принимали леводопа-содержащие препараты, выявлена динамика митохондриальных нарушений на фоне лечения регулятором энергетического обмена - янтарной кислотой.

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований показана информативность цитоморфометрического анализа ферментативного статуса лимфоцитов периферической крови для контроля течения первичного паркинсонизма в разных возрастных группах, а также для оценки эффективности терапии регуляторами энергетического обмена, в частности, янтарной кислотой, у БП.

Предложен патогенетически обоснованный метод коррекции митохондриальных нарушений у больных БП, не принимавших леводопасодержащую терапию, что способствует увеличению арсенала терапевтических возможностей при данном заболевании.

Дополнительное назначение янтарной кислоты больным БП, не принимающим леводопа-содержащие препараты, внедрено в практику нейрогенетического отделения ГУ НИИ неврологии РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Цитохимический анализ лимфоцитов периферической крови может служить адекватным методом оценки митохондриальной недостаточности у больных БП.

2) У больных БП, принимавших препараты леводопы, имеет место наиболее значительное снижение окислительного фосфорилирования. Это проявляется при цитохимическом исследовании значительным уменьшением числа гранул формазана, снижением их площади, средней и интегральной оптической плотности и других показателей по сравнению с одновозрастной группой контроля и больными с другими формами первичного паркинсонизма (пациентами с БП, без леводопа-терапии и больными ювенильным паркинсонизмом).

3) Результаты проведенного нами цитохимического исследования, свидетельствуют об общности патогенетических механизмов развития первичного паркинсонизма в пожилом и молодом возрасте, т.е. о близости патогенеза БП и ювенильного паркинсонизма.

4) Улучшение клинических и цитоморфометрических параметров у пациентов с БП, не принимавших леводопа-содержащую терапию на фоне использования регуляторов энергетического обмена (янтарной кислоты) позволяет судить о возможности эффективной лекарственной коррекции нарушений клеточного энергообмена у больных на начальной стадии заболевания.

выводы

1) Цитохимический анализ активности дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови при различных формах БП позволил выявить полисистемные нарушения клеточного энергообмена во всех обследованных группах больных. Они заключались, главным образом, в перестройке морфофункциональной организации митохондрий и снижении их числа, а также в изменении ряда морфометрических параметров депозитов (оптической плотности, интервала яркости и др.).

2) Степень изменения цитоморфометрических параметров активности митохондриальных ферментов у больных БП достоверно коррелирует с продолжительностью и тяжестью заболевания, оцениваемых по стандартным шкалам UPDRS и Hoehn&Yahr.

3) Однонаправленность изменений активности цитоморформетрических параметров митохондриальных ферментов в обследованных подгруппах больных свидетельствует об общности патогенетических механизмов развития первичного паркинсонизма в пожилом и молодом возрасте. При этом у больных с ювенильным паркинсонизмом нарушения клеточного энергообмена более компенсированы, что может служить цитохимическим подтвержением относительно "доброкачественного" характера нейродегенеративного процесса при данной форме первичного паркинсонизма.

4) Положительная динамика клинических и цитоморфометрических показателей после 4-недельного курса лечения янтарной кислотой у пациентов, не принимавших леводопа-содержащие препараты, подтвержает принципиальную возможность коррекции имеющихся при БП системных нарушений энергетического обмена на основе использования активаторов дыхательной цепи митохондрий.

5) У больных БП, принимающих леводопу, использование препаратов «митохондриального ряда» сопровождается диссоциацией цитоморфометрических показателей - увеличением количества гранул депозитов при одновременном снижении их интервала яркости, оптической плотности и площади гранул. Это свидетельствует об истощении процессов энергообразования и может служить косвенным подтверждением негативного влияния леводопа-терапии на эффективность окислительного фосфорилирования.

Практические рекомендации

1. Предложенный цитохимический метод может использоваться в качестве тонкого дополнительного лабораторного теста с целью мониторинга течения патологического процесса и оценки эффективности проводимой терапии при различных формах первичного паркинсонизма.

2. У пациентов с БП, не принимавших леводопу (т.е. преимущественно на начальных стадиях паркинсонизма), обоснованным является дополнительное включение в терапевтическую схему препаратов, способствующих утилизации органических субстратов и стабилизации дыхательной цепи митохондрий (янтарная кислота, коэнзим Q]0 и другие доноры электронов дыхательной цепи митохондрий).