Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Минорная субпопуляция гамма/дельта Т-клеток у пациентов старших возрастных групп

На правах рукописи

Левашова Татьяна Вячеславовна

МИНОРНАЯ СУБПОПУЛЯЦИЯ ГАММА/ДЕЛЬТА Т-КЛЕТОК У ПАЦИЕНТОВ СТАРШИХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

14.00.53 - Геронтология и гериатрия 14.00.36 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

003446830

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский геронтологический научно-клинический центр Росзрава»

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Мирошниченко Ирина Вадимовна

Конев Юрий Владимирович Хромова Серафима Семеновна

Ведущая организация:

Самарский государственный медицинский университет

Защита состоится «

Ж

(2 вН/иЖщ2008 г в часов на заседании

диссертационного совета Д208 104 01 при ФГУ Российском геронтологическом научно-клиническом центре Росздрава по адресу 129226, г. Москва, ул 1-я Леонова, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ Российского геронтологического научно-клинического центра Росздрава

Автореферат разослан « 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ср^

Соколова Н М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Возрастные изменения в иммунной системе человека проявляются в течение всей его жизни Они инициируются возрастной инволюцией тимуса и ведут к длительному процессу формирования функциональной недостаточности и снижению численности периферических Т-лимфоцитов Эти события приводят в старости к развитию иммунодефицитных состояний (ИДС) и, как следствие, к повышению риска возникновения злокачественных новообразований, аутоиммунных процессов и ослаблению резистентности к инфекциям [А А Ярилин, 1999, 2003]

На фоне старческих ИДС длительно персистирующая инфекция увеличивает частоту воспалительных процессов и хронического течения заболеваний, что приводит к формированию полиморбидности, характерной для этого возраста

При хроническом инфицировании происходит привлечение в очаги воспаления разнообразных клеток дендритных, тучных, нейтрофилов, моноцитов В экспериментальных исследованиях последних лет указывается, что в первую линию защиты организма могут быть вовлечены также и гамма/дельта Т-клетки (уб Т-клетки) [В Moser, 2007, М Nanno, 2007]

Изучение yö Т-клеток все больше привлекает внимание исследователей В системах in vitro изучаются уникальные свойства этих клеток, связанные с их способностью участвовать в защите эпителиальных тканей, которые первыми отвечают на экзогенную атаку, и воспринимать антигенный сигнал патогена в очагах воспаления Согласно современным научным гипотезам активированные антигеном m situ у5 Т-клетки приобретают способность к хомингу в региональные лимфоузлы, где, подобно дендритным клеткам, могут представлять антиген Т- и B-лимфоцитам [В Moser, 2007] В связи с этим увеличение в кровотоке у5 Т-клеток может быть отражением активации воспалительной иммунной реакции на патоген

Однако изучение у8 Т-клеток человека сталкивается с определенными трудностями Количество этих клеток в норме в кровотоке невелико, основная их масса содержится в эпителиальных тканях, что затрудняет выделение достаточного количества клеток этой субпопуляции для иммунологических исследований К тому же увеличение их численности в циркуляции непредсказуемо из-за недостатка знаний о причинах этого явления Поэтому до сих пор многие представления о роли у5 Т-клеток во врожденном и адаптивном иммунитете человека существовали на стадии научных гипотез

Вместе с тем, тема изучения роли у5 Т-клеток у человека становится особенно актуальной, так как при старении развиваются хронические воспалительные процессы инфекционного генеза

Лишь немногие публикации касаются выявления у5 Т-клеток при заболеваниях человека (Hayday А С 2000, Aljurf М 2002, Трофимова И Б 2005) Отсутствуют сведения о появлении уб Т-клеток у человека при старении В крови долгожителей были выявлены Т-клетки с необычным для здорового человека фенотипом CD3+CD4"CD8", количество которых превышало норму Эти клетки были обозначены авторами как двойные негативные Т-клетки (ДНТ), а их отсутствие на фоне вторичного старческого ИДС было расценено как риск летального исхода [В Н Столпникова, 2006] Было высказано предположение, что ДНТ могут относиться к минорной субпопуляции уб Т-клеток, описанных в литературе [Г Н. Дранник, 2003]

Связь у8 Т-клеток с инфекциями, поражающими слизистые, делает перспективными исследования этих клеток при хронических воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у человека Однако исследования такого плана в научной литературе практически отсутствуют

Ученые, занимающиеся у8 Т-клетками, рассматривают возможность использования их у человека в качестве лечебной вакцины [В Moser, 2007, А Thedrez, 2007] С нашей точки зрения, изучение у8 Т-клеток при старении дает возможность также использовать их для диагностики хронических воспалительных заболеваний инфекционного генеза, в частности, заболеваний ЖКТ, и оценки адаптивных возможностей организма в старости

Цель исследования: определение типа Т-клеточного рецептора на двойных негативных Т-клетках (ДНТ) и причин увеличения их численности в периферической крови пациентов старших возрастных групп

Задачи исследования:

1 Выявить особенности возрастных изменений в структуре субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, в том числе ДНТ клеток, у пациентов старших возрастных групп на фоне полиморбидности

2 Установить связь между увеличением численности ДНТ-клеток, иммунным воспалением и видом патологии у пациентов старших возрастных групп на фоне полиморбидности

3 Подобрать комбинации моноклональных антител (МкАТ), с помощью которых методом проточной цитометрии можно сравнить ДНТ клетки с субпопуляцией уб-Т-клеток

4 Выявить изменения в структуре субпопуляционного состава лимфоцитов и численности у8-Т-клеток у пациентов с нарушениями нормальной микрофлоры кишечника

5 Определить изменения в структуре субпопуляционного состава лимфоцитов и численности у8-Т-клеток у пациентов с заболеваниями желудка и/или двенадцатиперстной кишки, ассоциированными с геликобактерной инфекцией

Научная новизна

Впервые у лиц старше 60-ти лет в периферической крови выявлены ДНТ клетки в количестве, превышающем норму, и с помощью разработанной комбинации (CD4+CD8)FITC/TCRy5PE/CD3PC5 показана их идентичность минорной субпопуляции Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8"TCRyS+ (у5-Т-клетки)

Впервые показано, что увеличение у5-Т-клеток (или ДНТ) в периферической крови человека может быть маркером воспалительных заболеваний ЖКТ, обусловленных нарушением нормальной микрофлоры кишечника или Helicobacter pylori (Нpylori)

Впервые получены данные, что дисбактериоз 1-й и 2-й степени, причиной которого является снижение количества лакто- и бифидобактерий, может расцениваться как фактор риска развития вторичных иммунодефицитных состояний

Практическая значимость

Разработанная комбинация МкАТ (CD4+CD8)FITC/TCRy5PE/CD3PC5, установившая идентичность ДНТ с минорной субпопуляцией уб-Т-клеток, дает возможность ориентировочно выявлять уб-Т-клетки (как ДНТ) с помощью комбинации (CD4+CD8)FITC/CD3PE при первичном анализе в любой клинической иммунологической лаборатории, имеющей минимальный стандартный набор МкАТ

Обнаружение при первичном иммунологическом обследовании в периферической крови увеличенного в два и более раза количества ДНТ клеток может быть свидетельством хронических заболеваний, связанных с повреждением слизистых патогенными или условно-патогенными микроорганизмами и может быть рекомендовано в качестве дополнительной диагностики для данной группы заболеваний

Выявление в периферической крови yS-T-клеток и антител к Нpylori может быть использовано в качестве дополнительных маркеров хронических воспалительных заболеваний желудка и/или двенадцатиперстной кишки и в лабораторной диагностике бессимптомных форм этих заболеваний в старших возрастных группах

Основные положения, выносимые на защиту

1 На фоне полиморбидности у пациентов старших возрастных групп в периферической крови появляются ДНТ с фенотипом CD3+CD4 CD8"

2 Увеличение численности ДНТ связано с иммунным воспалением при хронических заболеваниях ЖКТ и дыхательной системы, одним из

этиологических факторов которых является повреждение слизистых патогенными или условно-патогенными микроорганизмами

3 С помощью комбинации МкАТ СВ(4+8)Р1ТС/ТС11убРЕ/СВЗРС5 установлена идентичность С03+С04"СБ8" ДНТ клеток и минорной субпопуляции Т-клеток с фенотипом СВЗ+СВ4"СВ8"ТС11у6+ (уб-Т-клетки)

4 Заболевания ЖКТ, обусловленные нарушением нормальной микрофлоры кишечника и геликобактерной инфекцией, сопровождаются иммунным воспалением, которое выражено в увеличении у5-Т-клеток и Т-хелперов и не зависит от возраста

Внедрение результатов работы

Разработанная усовершенствованная медицинская технология «Схема иммунологического обследования пациентов старших возрастных групп» (Авторы Мирошниченко И В , Столпникова В Н, Левашова Т В , Карпенко ОМ) применяется в иммунологическом обследовании и иммуномониторинге пациентов клиники Российского геронтологического научно-клинического центра (РГНКЦ)

Определение уб-Т-клеток включено в анализ иммунного статуса и выполняется всем пациентам старших возрастных групп в клинике РГНКЦ

Апробация работы

Апробация диссертации проведена на Ученом Совете ФГУ Российского геронтологического научно-клинического центра (РГНКЦ) Росздрава 27 мая 2008 года Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, апрель 2005 года), на II, IV и V Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Москва, сентябрь 2006 года, май 2007 года, июнь 2008 года), на IX и X Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, апрель 2006 и 2007 года), на I Национальном конгрессе терапевтов (Москва, ноябрь 2006 года), на XI Международной научно-практической конференции «Пожилой больной Качество жизни» (Москва, октябрь 2007 года), на II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2007» (Санкт-Петербург, декабрь 2007 года)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 99 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 11 отечественных и 99 зарубежных источников Работа иллюстрирована 21 таблицей и 21 рисунком

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служила периферическая кровь пациентов среднего (46-59 лет), пожилого (60-74 лет), старческого (75-89 лет) возраста и долгожителей (90 лет и старше), проходивших обследование в клинике РГНКЦ Ретроспективный анализ иммунограмм провели 315 пациентам пожилого, старческого возраста и долгожителям 230 из них находились в стационаре с различной возрастной патологией, которая включала преимущественно сердечно-сосудистые, цереброваскулярные заболевания, заболевания ЖКТ, мочеполовой и костно-мышечной системы Остальные 85 пациентов были разделены на две группы в первую вошли пациенты с основным заболеванием сердечно-сосудистой и цереброваскулярной системы и сопутствующими заболеваниями ЖКТ и дыхательной системы, во вторую группу были подобраны пациенты, у которых таких сопутствующих заболеваний не обнаружено

Для предварительной оценки влияния дисбактериоза на изменение субпопуляционного состава лимфоцитов ретроспективно проанализирована группа долгожителей (80 человек)

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов одновременно с бактериологическим анализом фекалий и определением степени дисбактериоза провели 55 пациентам среднего, пожилого и старческого возраста

У 105 пациентов среднего, пожилого и старческого возраста исследовали субпопуляционный состав лимфоцитов, определяли антитела к Нpylori Основную группу составили 66 человек, с язвенной болезнью желудка и/или двенадцатиперстной кишки и гастритами в фазе обострения хронического заболевания Из них у 22 человек определяли Нpylori в биоптате слизистой оболочки желудка быстрым уреазным тестом В контрольную группу вошли 39 пациентов, у которых в анамнезе отсутствовали названные заболевания

В работе использовались следующие методы исследования

1 Определение субпопуляционного состава лимфоцитов методом двухцветной и трехцветной проточной цитофлюорометрии с использованием МкАТ, меченных флюоресцентными красителями (FITC - флюоресцеин изотиоцианат, РЕ - фикоэритрин, РС5 - фикоэритрин-цианин-5)

2 Определение суммарных антител к антигену Cag А Н pylon иммуноферментным методом

3 Оценка состояния микрофлоры кишечника методом серийных разведений фекалий с последующим высевом на дифференциально-диагностические среды и определением степени дисбактериоза Первая степень характеризовалась незначительньм уменьшением числа кишечных палочек, лакто- и бифидобактерий Для второй степени характерно снижение количества представителей нормальной микрофлоры и появление условно-патогенных бактерий в незначительном количестве При третьей степени происходит значительное снижение числа представителей нормальной микрофлоры и увеличение условно-патогенных бактерий Определение дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника проводилась в лаборатории микробиологии РГНКЦ (зав лаб к м н Чулок ТА)

4 Определение уреазной активности Нpylori в биоптате слизистой оболочки желудка быстрым уреазным тестом Исследование проводилось в кабинете эндоскопии (врач-эндоскопист к м н Самсонова ЕЛ)

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTIKA (версия 6 0) Использовали среднее арифметическое значение, 95% доверительные границы для среднего Сравнение двух независимых групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента Корреляционный анализ между двумя количественными признаками проводили, используя метод Пирсона, оценку корреляционной связи между количественными и качественными признаками - с использованием ранговой корреляции по Кендаллу

Результаты собственных исследований и их обсуяздение

Для изучения возрастных изменений структуры и численности субпопуляционного состава был проведен ретроспективный анализ иммунограмм 230 пациентов пожилого, старческого возраста и долгожителей, прошедших обследование в кардиологическом, терапевтическом и неврологическом отделениях клиники РГНКЦ Иммунограммы включали набор стандартных показателей субпопуляций лимфоцитов, выраженных в относительных и абсолютных значениях и полученных методом двухцветной проточной цитофлюорометрии Дополнительно учитывали ДНТ клетки, лишенные маркеров CD4 и CD8, их количество определяли путем вычитания из общего числа Т-клеток CD4+ и CD8+ Т-клеток

Полученные после статистической обработки данные сопоставляли с общепринятой нормой для практически здорового человека в возрасте 20-50 лет Средние значения относительных и абсолютных показателей в старших возрастных группах представлены на рисунках 1 и 2

% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Рис. 1. Возрастные изменения относительных значений показателей субпопуляционного состава лимфоцитов по сравнению с нормой

Примечание Т-кл - Т-клетки, Т-х - Т-хелперы, Т-ц/к - Т-цитотоксические/киллерные клетки, ЕКК - естественные киллерные клетки, ДНТ - двойные негативные Т-клетки, В-кл -В-клетки, * - статистически значимые отличия от нормы в сторону повышения, либо в сторону снижения

Кл/мкл

2000 1300 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 о

Рис. 2. Возрастные изменения абсолютных значений показателей субпопуляционного состава лимфоцитов по сравнению с нормой

Примечание см рис 1

Субпопуляции лимфоцтов

Субпопу ляции лимфоцитов

Как видно из рисунка 1, во всех изучаемых группах процент Т-п/к и В-кл был статистически значимо ниже нормы, количество ДНТ клеток - выше нормы У пациентов пожилого возраста был увеличен, по сравнению с нормой, процент Т-х У лиц пожилого возраста среднее абсолютное количество всех Т-клеток и Т-х (рис 2), так же как процент Т-х, превышал норму В группе старческого возраста и у долгожителей отмечено существенное снижение количества Т-ц/к лимфоцитов и В-клеток В группе долгожителей средний показатель Т-х был ниже нормы, что расценивалось как признак вторичного ИДС Численность ДНТ-клеток в каждой возрастной группе статистически отличалась от нормы и превышала ее верхний предел

Поскольку абсолютные значения более наглядно демонстрируют снижение потенциала иммунной системы, т к отражают дополнительно возрастное снижение числа лимфоцитов, последующий анализ частоты отклонений от нормы был проведен по абсолютным показателям (рис 3 и 4)

Т-кл Т-х Т-ц/к ЕКК В-кл Субпопуляции лимфоцитов

Рис. 3. Возрастные изменения частоты встречаемости сниженных абсолютных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов старших возрастных групп.

Примечание * - статистически значимые различия между сравниваемыми группами пожилой возраст/старческий возраст, пожилой возраст/долгожители

80

Л пожилой возраст У. /^ старческий возраст у//\долгожители

70

60

20

40

50

30

10

Т-кл Т-х Т-ц/к ЕКК ДНТ В-кя Субнопуляции лимфоцитов

Рис. 4. Возрастные изменения частоты встречаемости абсолютных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов, превышающих норму, у пациентов старших возрастных групп.

Примечание * - статистически значимые различия между сравниваемыми группами пожилой возраст/старческий возраст, пожилой возраст/долгожители

Как видно из рисунков 3 и 4, с возрастом не только увеличивалась доля лиц с количественным дефицитом различных субпопуляций лимфоцитов, но и снижался процент лиц с показателями, превышающими норму Количество пациентов с повышенной численностью ДНТ при этом оставалось высоким и имело тенденцию к незначительному снижению только у долгожителей

Для выявления связи между наличием хронического воспалительного заболевания и появлением в периферической крови ДНТ были ретроспективно проанализированы иммунограммы 85 пациентов в возрасте 60 лет и старше с сердечно-сосудистыми и цереброваскулярными заболеваниями Проведенный анализ историй болезни показал, что у части пациентов (45%, п=38), которые составили группу 1, были диагностированы сопутствующие заболевания, связанные с хроническими воспалительными процессами слизистых оболочек желудочно-кишечного и бронхо-легочного трактов У другой части пациентов сведения о таких заболеваниях в историях болезни отсутствовали, и они составили группу 2 (55%, п=47) У каждого пациента обеих групп рассчитывалось количество ДНТ клеток

В первой группе доля таких пациентов составляла 90%, во второй - 40% (рис.5).

Б ДЧГвнорме С Д-ГГ вьию нор

Рис. 5. Частота встречаемости повышенных и нормальных значений ДНТ у пациентов старше 60 лет в первой и второй группе

Был проведен корреляционный анализ между наличием сопутствующего заболевания и увеличением ДНТ клеток в периферической крови таких пациентов. Степень корреляции составила 0,37 при р<0,05, что подтвердило прямую связь между признаками.

Для того чтобы установить связь ДНТ с признаками иммунного воспаления, у этих же пациентов провели анализ частоты выявления отклонений от нормы показателей иммунитета. Сравнивали две группы пациентов - с повышенным и нормальным содержанием ДНТ (Табл. 1).

Таблица 1

Частота выявления отклонений показателей субпопуляционного состава лимфоцитов от нормы в зависимости от количества ДНТ клеток_

Субпопуляции 195, % повышенных значений Значение р для

лимфоцитов субпопуляций лимфоцитов при: сравниваемых

повышенном нормальном групп

количестве ДНТ количестве ДНТ

Т-кл 48 24 <0,05

33,3-62,7 14,7-33,3

Т-х 48 25 <0,05

33,3-62,7 15,6-34,4

Т-ц/к 24 5 <0,01

11,4-36,6 0,3-9,7

ЕКК 19,6 22,6 >0,05

7,9-31,3 13,5-31,7

В-кл 17,4 14,3 >0,05

6,2-28,6 6,7-21,9

Как видно из таблицы 1, на фоне избытка ДНТ чаще определялись повышенные значения Т-кл, Т-х и Т-ц/к клеток.

Следующей задачей исследования было сравнение ДНТ и уб Т-клеток, для чего нами была разработана комбинация МкАТ (CD4+CD8)FITC/TCRy5PE/CD3PC5, с помощью которой можно определить в одной пробе одновременно как количество ДНТ клеток с фенотипом CD3 fCD4" CD8", так и Т-клеток с уб Т-клеточным рецептором (TCRyS) (рис. 6).

CD(4+8)FITC/CD3PC5 TCRy5PE/CD3PC5

6А

6В

J^m+^n ш UL - 7.3 - Щ** » 7?. 1 WU. * 12.5 LR » 3.1

ц

«г ie> j

CD(4+8) FITC

CD(4+8)FITC/TCRy5PE

w

p

UL =

UR =

LL »

CD4-CD8-TCfty6+ L|5 _

6.6 1.7 13.3 7S.5

(CDI^COehTORvS-

ft®

6Б

Че»'"7a»'"1S2 ie3 "i?-1

CD(4+8) FITC

ю о

CL fi

C>

Q —

О

Я

v:.

C03+TCRy5+

Tjs UL - 76.3

''' W m 9.1

LL = 15.6

lr = a.a

Ш: ■

ш-

. Tmnf mTRif ГТТПП]—гтттт

18е IB1 102 10* 10^

ТСКуб РЕ

Рис.6. Цитофлюорограмма клеток с фенотипами CD3CD4CD8", CD3+TCRy6+. Пациент П., 91 год

Как видно из рисунка 6, количество клеток СВЗХВ4~СВ8" и С03+С04" СВ8"ТС^у6+, интенсивность свечения соответствующих рецепторов, как правило, совпадали. Корреляционный анализ подтвердил с высокой степенью достоверности идентичность ДНТ и у5 Т-клеток у 93 человек старших возрастных групп (Табл. 2).

Таблица 2

Оценка степени корреляции между количеством ДНТ и ТС11уб+ клеток у пациентов старших возрастных групп___

Возрастная группа Кол-во пациентов (п) М, 1д5 (КЛ/МКЛ), минорных субпопуляций Достоверность различий (р) Степень корреляции (г)

ДНТ у5-клетки

60-74 лет 36 90 64-116 105 71-140 0,09 0,87

75-89 лет 25 77 49-106 90 57-123 0,24 0,76

90 лет и старше 32 71 38-104 81 42-120 0,1 0,97

Для выявления связи между увеличением численности в периферической крови у5 Т-клеток и инфицированием слизистых оболочек были подобраны группы пациентов с заболеваниями ЖКТ При поступлении в клинику они проходили эндоскопическое, бактериологическое и иммунологическое обследование

Одним из распространенных симптомов, связанных с нарушением слизистой ЖКТ, особенно у лиц старших возрастных групп, является дисбактериоз кишечника

Для того, чтобы определить, как влияет нарушение нормальной микрофлоры кишечника на изменения субпопуляционного состава лимфоцитов, мы на первом этапе работы сопоставили данные иммунологического и бактериологического анализов 80 долгожителей с множественной патологией Дисбиотические нарушения были выявлены у 40 человек На рисунках 7 и 8 приведены данные по частоте отклонений от нормы показателей субпопуляционного состава лимфоцитов у долгожителей с дисбактериозом и без него

% 60 50 40 30 20 10 0

Рис. 7. Частота встречаемости абсолютных показателей субпопуляций лимфоцитов превышающих норму, у долгожителей с дисбактериозом и без дисбактерноза

% 50 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Рис. 8. Частота встречаемости абсолютных показателей субпопуляций лимфоцитов ниже нормы у долгожителей с дисбактериозом и без него

Примечание * - статистически значимые различия между группами (р<0,05)

Анализ иммунного статуса показал, что в группе долгожителей с дисбактериозом чаще, чем в группе без дисбактериоза встречались как

15

Т-ф

ЕЮС гамма-дельта В-кл Т-кл

сниженные значения Т-х, Т-ц/к, и В-клеток, так и значения, превышающие норму

Мы предположили, что степень дисбактериоза и возраст пациента могут оказывать влияние на изменение показателей иммунитета Поэтому в следующем исследовании была предпринята попытка проанализировать изменения субпопуляционного состава лимфоцитов в старших возрастных группах в зависимости от степени дисбактериоза

Для этого было отобрано 35 пациентов в возрасте от 60 до 90 лет После бактериологического исследования было выявлено, что у 7 человек дисбактериоз отсутствовал (0 степень), 9 человек имели 1 степень, 10 - 2-ую и 9 человек - 3-ю степень дисбактериоза Анализ изменения абсолютных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов в зависимости от степени дисбактериоза в старших возрастных группах представлен в таблице 3

Таблица 3

Изменение абсолютных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов у лиц в возрасте 60-90 лет в зависимости от степени дисбактериоза__

Субпопу- Норм М, 195 кл/мкл при степенях дисбактериоза

ляции значения, 0 степень 1 степень 2 степень 3 степень

лимфоцитов кл/мкл п=7 п=9 п=10 п=9

Т-кл 1450 1654 1248 1440 1884

1100-1800 1277-2031 772-1723 1217-1662 1292-2476

Т-х 850 977 861 842 1185

600-1100 649-1304 458-1264 682-1002 677-1694

Т-ц/к 600 472 314*| 465 546

400-800 210-735 204-424 299-631 278-815

ЕКК 300 272 318 273 385

200-400 134-411 172-465 168-379 170-600

уб Т-кл 35 90 58 91 172*1'

0-70 32-149 35-81 43-139 61-283

В-кл 200 189 172 131*| 162*|

100-300 110-268 59-286 80-182 129-195

Примечание * - показатели, статистически отличающиеся от нормальных значений (р<0,05)

У пациентов старше 60 лет наблюдалась тенденция к снижению численных показателей Т-х и Т-ц/к при 1-ой и 2-ой степени дисбактериоза и к повышению при 3-ей степени дисбактериоза Количество уб Т-клеток также было значительно увеличено по сравнению с нормой при 2-ой и 3-ей степени дисбактериоза

Для того чтобы проверить, как изменяется с возрастом реакция иммунной системы на нарушения состава и свойств нормальной микрофлоры кишечника,

мы сравнили абсолютные показатели субпопуляций лимфоцитов в группах среднего возраста и пациентов старше 60 лет с выражением дисбиотических нарушений 3 степени (Табл 4)

Таблица 4

Сравнение абсолютных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов у лиц среднего возраста и старших возрастных групп при третьей степени дисбактерноза__

Субпопуляции М, 195 (кл/мкл), в возрасных группах Значение р для

лимфоцитов 45-59 лет (п=5) 60 лет и старше (п=9) сравниваемых

групп

Т-кл 2205 1884 0,49

1112-3299 1292-2476

Т-х 1432 1185 0,52

556-2307 677-1694

Т-ц/к 582 546 0,85

205-960 278-815

ЕКК 243 385 0,29

128-357 170-600

уб Т-кл 207 172 0,68

0-417 61-283

В-кл 247 162 0,008*

176-317 129-195

Примечание * - статистически значимые разчичия между группами (р<0,05)

Следующий этап работы включил изучение изменений субпопуляционного состава лимфоцитов, в том числе изменение количества у5 Т-клеток, у пациентов старших возрастных групп при заболеваниях ЖКТ, связанных с инфекцией Н pylon

С этой целью было обследовано 105 пациентов Основную группу составили 66 человек гастроэнтерологического отделения РГТЖЦ с заболеваниями желудка Пациенты основной группы отбирались после эндоскопического исследования желудка и двенадцатиперстной кишки, на основании которого был поставлен диагноз гастрит или язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки (ДПК) В контрольную группу были включены пациенты (п=39), у которых, согласно истории болезни, в анамнезе отсутствовали заболевания желудка и ДПК Пациенты обеих групп были разделены на подгруппы среднего, пожилого и старческого возраста

Из 66 пациентов основной группы у 45 (68%) определялись антитела (AT) к Нpylori, из 39 пациентов контрольной группы - только у 16 (41%) Независимо от возраста у пациентов основной группы AT к Нpylon выявлялись чаще, чем в контрольной группе При этом с возрастом

уменьшалась доля лиц, способных к гуморальному ответу на геликобактерную инфекцию В контрольной группе такой закономерности не прослеживалось

По признаку наличия или отсутствия AT к Нpylori основная и контрольная группы были разделены на две подгруппы, после этого провели определение субпопуляционного состава лимфоцитов (Табл 5)

Таблица 5

Средние абсолютные показатели субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов основной и контрольной групп_

Субпопуляции лимфо- Нормальные значения, М, I95 (кл/мкл) показателей субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов

цитов кл/мкл основной группы при контрольной группы

при

наличии AT к отсутствии AT к наличии AT к отсутствии AT к

Н pylori (п=45) Н pylori (п=21) Н pylori (п=16) Н pylori (п=23)

Т-кл 1450 1100-1800 1885*1 1696-2075 1846*Т 1557-2135 1864 1441-2287 1476 1280-1672

Т-х 850 1140*|' 1087*t 1172*f 961

600-1100 995-1285 892-1282 885-1459 820-1100

Т-ц/к 600 623 594 578 409*4

400-800 528-717 448-740 381-775 330-488

ЕКК 300 346 310 335 288

200-400 284-409 210-411 256-414 204-373

у5 Т-кл 35 117 113 104 69

0-70 92-142 58-168 69-138 46-92

В-кл 200 237 210 271 150

100-300 195-280 144-276 171-371 125-175

Примечание * - статистически значимые отклонения среднего показателя от нормы (р<0,05)

В основной группе независимо от наличия AT к Нpylori наблюдали существенное увеличение средних для уЬ Т-клеток и Т-х

В контрольной группе пациентов, у которых отсутствовали специфические AT, средние значения показателей Т-кл, Т-х, ЕКК, у5 Т-кл соответствовали норме, аТ-ц/к были ниже нормы

В контрольной группе пациентов, у которых имелись AT к Нpylon, были отмечены такие же изменения, как в основной группе Мы предположили, что это могло быть связано с бессимптомным течением заболеваний в пожилом возрасте

Это подтвердилось тем фактом, что в ходе подбора контрольной группы двум пациентам с положительным гуморальным ответом на Нpylori и повышенным количеством у8 Т-клеток предложено пройти эндоскопическое

исследование, в результате которого у одного пациента были выявлены хронические эрозии желудка, у второго - атрофический гастрит.

В связи с этим в качестве контрольной группы оставлены только те пациенты, у которых количество уб Т-кл и титр АТ к Н.ру1оп не превышали норму.

В основной группе пациентов был проведен детальный анализ заключений эндоскопического исследования. Было выявлено, что из 17 пациентов с высокими титрами АТ к Н.ру1оп у всех обнаружена уреазная активность микроорганизма в биоптате слизистой оболочки желудка. Из 5 пациентов, не отвечающих выработкой АТ, уреазный метод показал отсутствие Н.ру1оп только у 1-го пациента. Таким образом, в этом исследовании подтвердилось предположение о том, что у части пациентов, несмотря на наличие Н.ру1оп, АТ отсутствовали.

На следующем этапе работы мы проанализировали возрастные изменения субпопуляционного состава лимфоцитов у отобранных пациентов основной и контрольной групп (рис. 9 и 10).

Кл/МКП 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 О

Рис. 9. Изменение показателей субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов среднего, пожилого и старческого возраста основной группы.

Примечание: * - показатели, статистически выше нормальных значений (нормальные значение ~ см.рис. 1).

В основной группе среднего и пожилого возраста увеличение количества Т-х и у8 Т-кл ассоциировалось с заболеванием, что свидетельствовало о специфичности этих признаков в активном иммунном воспалении, а у пациентов старческого возраста такая активация была выражена слабее.

_Средний возраст

пожилой возраст '(/¿/А старческий возраст

Т-КЛ

Т-Х Т-ц/к Субпопуляции лимфоцитов

_и_____

ЕКК Гамма-дельта В-кл Т-кл

Кл/мкл

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 О

Рис. 10. Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов среднего, пожилого и старческого возраста в контрольной группе

Примечание: * - показатели, статистически выше нормальных значений, ** - показатели, статистически ниже нормальных значений (нормальные значение - см. рис. 1).

Как видно из рисунка 10, в контрольной группе средние арифметические показатели Т-кл, Т-х, Т-ц/к и В-кл находились в пределах нормы или ниже её, т.е. отсутствовали признаки активации, характерные для основной группы. Так же как и в основной группе, прослеживалась тенденция к снижению практически всех показателей субпопуляционного состава с возрастом.

Таким образом, было показано, что при старении от 60 лет и до глубокой старости происходит снижение абсолютного и относительного количества Т-кл, Т-х, Т-ц/к и В-кл за счет увеличения доли лиц с показателями ниже нормы. При этом остается небольшой процент пациентов, у которых сохраняется иммунореактивность, выражающаяся в увеличении количества клеток названных субпопуляций. Кроме этого у пациентов старших возрастных групп наблюдалось появление в кровотоке субпопуляции ДНТ клеток с фенотипом СВЗ+СБ4"СБ8".

Была подтверждена прямая зависимость между появлением ДНТ клеток и наличием хронических заболеваний, локализованных в желудочно-кишечном или дыхательном трактах. Увеличение количества ДНТ клеток ассоциировалось с увеличением и других показателей (Т-кл, Т-х, Т-ц/к), что подтверждало иммунную природу воспаления.

Разработанная комбинация моноклональных антител

(СВ4+С08)Е1ТС/ТСЯу5РЕ/С03РС5 позволила сопоставить и подтвердить идентичность ДНТ и у5 Т-клеток по количеству клеток и интенсивности свечения соответствующих рецепторов.

[_I средний возраст

пожилой возраст Х///А старческий возраст "

Т-кл Т-х Т-ц/к ЕКК Гамма-дельта В-кл

Субпопуляции лимфоцитов

При анализе хронических заболеваний ЖКТ было показано, что причиной увеличения численности уо Т-клеток в периферической крови является инфекция (условно-патогенная микрофлора кишечника при дисбиотических нарушениях или Helicobacter pylori), на которую организм реагирует увеличением Т-кл, Т-х, Т-ц/к и В-кл Возрастные изменения сохраняли тенденцию к снижению показателей субпопуляционного состава лимфоцитов как при наличии инфекции, так и без нее

Выводы

1 У лиц старше 60 лет на фоне полиморбидности прослеживалась тенденция к снижению средних показателей иммунограммы за счет увеличения с возрастом процента лиц с низкими показателями и снижения процента лиц с показателями, превышающими норму Впервые показано, что на фоне этих изменений в периферической крови, независимо от возраста, появляются двойные негативные Т-клетки (ДНТ) с фенотипом CD3+CD4'CD8

2 Увеличение численности ДНТ в периферической крови ассоциировалось с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного и дыхательного трактов, одним из этиологическим факторов которых может быть иммунное воспаление на инфекционный агент Признаки иммунного воспаления были подтверждены увеличением у этих же пациентов численности основных субпопуляций с фенотипами CD3+CD4+(T-x) и/или CD3'CDS'(Т-ц/к)

3 С помощью впервые разработанной комбинации МкАТ (CD4+CD8)FITC/TCRyöPE/CD3PC5 была установлена идентичность ДНТ клеток и минорной субпопуляции Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8"TCRy5+ (у8-Т-клетки)

4 Увеличение у5-Т-клеток при третьей степени дисбактериоза кишечника было связано с появлением условно-патогенной микрофлоры и сопровождалось увеличением Т-хелперов, как маркеров иммунного воспаления При дисбактериозе первой и второй степени на фоне дефицита лакто- и бифидобактерий показатели иммунитета были снижены

5 При заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки увеличение уб-Т-клеток было обусловлено геликобактерной инфекцией, при этом иммунное воспаление характеризовалось увеличением количества Т-хелперов, B-клеток и антител к Helicobacter pylori, ответная реакция на геликобактерную инфекцию снижалась с возрастом

6 Выявление у5-Т-клеток может быть использовано в качестве дополнительной диагностики хронических заболеваний, связанных с воспалительными инфекционными процессами слизистых, и для характеристики иммунного ответа при хронических воспалительных заболеваниях ЖКТ у пациентов старших возрастных групп

7 Для ориентировочного определения у5-Т-клеток при первичном иммунологическом исследовании может быть использована комбинация (CD4+CD8)FITC/CD3PE, составленная из стандартного набора МкАТ, обычно имеющихся в распоряжении большинства клинических иммунологических лабораторий

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Левашова Т В, Мирошниченко И В Минорные субпопуляции Т-лимфоцитов в периферической крови пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта//Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина», 14-16 апреля 2005г, С -Петербург, 2005 -С 67

2 Семенков В Ф , Мирошниченко И В , Столпникова В Н, Левашова Т В Возрастной иммунодефицит и его коррекция/Руководство по геронтологии и гериатрии/Под ред акад РАМН, проф Шабалина В Н, М ."Цитадель-трейд", 2005 -С -187-204

3 Левашова Т В , Мирошниченко И В Двойные негативные Т-лимфоциты при заболеваниях, связанных с воспалительными процессами/Материалы II Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов», 27-29 сентября 2005г, Москва, 2005 -С 62-63

4 Левашова Т В, Мирошниченко И В Характеристика минорных субпопуляций Т-лимфоцитов у лиц пожилого и старческого возраста//Материалы X Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Афины, Греция, 19-25 октября 2005г -С.426

5 Левашова Т В , Мирошниченко И В Роль возраста, полиморбидности и воспалительного процесса в изменении численности Т-клеток периферической крови с фенотипами CD3+CD8+ и CD3+CD4 CD8' /Альманах «Геронтология и гериатрия», М - 2006 г -С 93-96

6 Левашова Т В , Столпникова В Н, Мирошниченко И В Определение минорных субпопуляций Т-лимфоцитов в двухцветной проточной цитометрии и их диагностическое значение//Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых», 25-26 мая 2006 г, М, 2006 -С 5960

7 Левашова Т В Метод определения минорных субпопуляций Т-лимфоцитов с альфа/бета и гамма/дельта Т-клеточным рецептором//Сборник тезисов Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», 22 апреля 2006г, С -Петербург, 2006 -С 186-187

8 Мирошниченко И В , Столпникова В Н , Левашова Т В Моделирование количественных изменений в структуре Т-лимфоцитов при старении //Тезисы VI съезда аллергологов и иммунологов, Москва, 11-14 сентября 2006 г, М -2006 -С 259

9 Мирошниченко И В , Столпникова В Н, Левашова Т В , Кочергина Н И Анализ количественных изменений показателей иммунитета у долгожителейЖлиническая геронтология -2006 -№9 -Том12 -С 89

10Каверина КГ, Чулок ТА, Левашова ТВ, Мирошниченко ИВ, Самсонова Е Л Дисбактериоз кишечника и субпопуляции лимфоцитов у среднего и пожилого возраста с заболеваниями ЖКТ//Клиническая геронтология -2006 -№9 -Том12 -С 31

11 Левашова Т В , Столпникова В Н, Самсонова Е Л , И В Мирошниченко Количественные изменения в субпопуляциях лимфоцитов при старении//Тезисы Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии», С - Петербург, 25-26 ноября 2006 г -С 81-82

12 Левашова ТВ Определение гамма/дельта Т-лимфоцитов при иммунном ответе на Helicobacter ру1оп//Материалы Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», С -Петербург, 20-21 апреля 2007 г -С 238-239

13 Левашова Т В , Каверина К Г, Столпникова В Н , Самсонова Е Л , Чулок Т А , Мирошниченко И В Дисбактериоз кишечника как фактор риска развития вторичного иммунодефицитного состояния/Материалы IV научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых», Москва, 20-21 мая 2007 г -С 62-63

14 Левашова Т В , Самсонова Е Л , Столпникова В Н, Мирошниченко И В Иммунная реакция на Helicobacter pylori у пациентов разных возрастных групп//Успехи геронтологии -2007 -№3 -Том20 -С 137-138

15 Левашова Т В , Каверина К Г, Столпникова В Н, Самсонова Е Л, Чулок Т А, Мирошниченко И В Вторичные иммунодефицитные состояния и роль дисбактериоза в их развитие при старении/Альманах «Геронтология и гериатрия» М -2007 -С 40-43

16 Левашова ТВ , Столпникова В Н, Мирошниченко ИВ , Сухинина ТМ Клеточный и гуморальный ответ на Helicobacter pylon у пациентов старших возрастных групп/Клиническая геронтология -2007 -№9 -С 24

17Левашова ТВ, Мирошниченко ИВ Особенности клеточного и гуморального иммунного ответа на Helicobacter pylon у пациентов разных возрастных групп//Тезисы II международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007», С-Петербург, 5-7 декабря 2007 г -С 50

18 Левашова Т В , Столпникова В Н, Самсонова Е Л , Мирошниченко ИВ Структура субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов с

геликобактерной инфекцией//ФГУ Российский героитологический научно-клинический центр Росздрава -М , 2008 -8с -Деп в ВИНИТИ 22 04 08, №352-В2008 19. Левашова Т В , Столпникова В Н, Мирошниченко И В у5Т-лимфоциты у пациентов старших возрастных групп// ФГУ Российский героитологический научно-клинический центр Росздрава -М , 2008 -8с -Деп в ВИНИТИ 22 04.08, №351-В2008

Подписано в печать 19 08 2008 Печать трафаретная

Заказ № 638 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , (499) 788-78-56 www auloreferat ru

Актуальность темы

Возрастные изменения в иммунной системе человека проявляются в течение всей его жизни. Они инициируются возрастной инволюцией тимуса и ведут к длительному процессу формирования функциональной недостаточности и снижению численности периферических Т-лимфоцитов. Эти события приводят в старости к развитию иммунодефицитных состояний (ИДС) и, как следствие, к повышению риска возникновения злокачественных новообразований, аутоиммунных процессов и ослаблению резистентности к инфекциям [10, 11,9].

На фоне старческих ИДС длительно персистирующая инфекция, увеличивает частоту воспалительных процессов и хронического течения заболеваний, что приводит к формированию полиморбидности, характерной для этого возраста.

При хроническом инфицировании происходит привлечение в очаги воспаления разнообразных клеток: дендритных, тучных, нейтрофилов, моноцитов. В экспериментальных исследованиях последних лет указывается, что в первую линию защиты организма могут быть вовлечены также и гамма/дельта Т-клетки (у5 Т-клетки) [80, 84].

Изучение у5 Т-клеток все больше привлекает внимание исследователей. В системах in vitro изучаются уникальные свойства этих клеток, связанные с их способностью участвовать в защите эпителиальных тканей, которые первыми отвечают на экзогенную атаку, и воспринимать антигенный сигнал патогена в очагах воспаления.

Согласно современным научным гипотезам, активированные антигеном уб Т-клетки приобретают способность к миграции и хомингу в региональные лимфоузлы, где, подобно дендритным клеткам, могут представлять антиген Ти В-лимфоцитам [80]. В связи с этим увеличение в кровотоке уб Т-клеток может быть отражением активации воспалительной иммунной реакции на патоген.

Однако изучение уб Т-клеток человека сталкивается с определенными трудностями. Количество этих клеток невелико в кровотоке, основная их масса содержится в эпителиальных тканях, что затрудняет выделение достаточного количества клеток этой субпопуляции для иммунологических исследований. Еще одна проблема, с которой сталкиваются исследователи, это отсутствие in vivo моделей, на которых можно было бы изучать процесс взаимодействия у8 Т-клеток человека с патогенами. Поэтому до сих пор многие представления о роли уб Т-клеток во врожденном и адаптивном иммунитете существовали на стадии научных гипотез.

Вместе с тем, тема изучения роли у8 Т-клеток у человека становится особенно актуальной, так как при старении развиваются хронические воспалительные процессы инфекционного генеза.

Лишь немногие публикации касаются выявления у8 Т-клеток при заболеваниях человека [53, 12, 7]. Отсутствуют сведения о появлении у 8 Т-клеток у человека при старении.

В крови долгожителей были выявлены Т-клетки с необычным для здорового человека фенотипом CD3+CD4"CD8", количество которых превышало норму. Эти клетки были обозначены авторами как двойные негативные Т-клетки (ДНТ), а их отсутствие на фоне вторичного старческого ИДС было расценено как риск летального исхода [6]. Было высказано предположение, что ДНТ могут относиться к минорной субпопуляции уб Т-клеток, описанных в литературе [2].

Связь у8 Т-клеток с инфекциями, поражающими слизистые, делает перспективными исследования этих клеток при хронических воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у человека. Однако исследования такого плана в научной литературе практически отсутствуют.

Ученые, занимающиеся уб Т-клетками, рассматривают возможность использования их у человека в качестве лечебной вакцины [80, 101]. С нашей точки зрения, изучение у8 Т-клеток при старении дает возможность также использовать их для диагностики хронических воспалительных заболеваний инфекционного генеза, в частности, заболеваний ЖКТ, и оценки адаптивных возможностей организма в старости.

Цель исследования: определение типа Т-клеточного рецептора на двойных негативных Т-клетках (ДНТ) и причин увеличения их численности в периферической крови пациентов старших возрастных групп.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности возрастных изменений в структуре субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, в том числе ДНТ клеток, у пациентов старших возрастных групп на фоне полиморбидности.

2. Установить связь между увеличением численности ДНТ клеток, иммунным воспалением и видом патологии у пациентов старших возрастных групп на фоне полиморбидности.

3. Подобрать комбинации моноклональных антител (МкАТ), с помощью которых методом проточной цитометрии можно сравнить ДНТ клетки с субпопуляцией у8 Т-клеток.

4. Выявить изменения в структуре субпопуляционного состава лимфоцитов и численности у8 Т-клеток у пациентов с нарушениями нормальной микрофлоры кишечника.

5. Определить изменения в структуре субпопуляционного состава лимфоцитов и численности у8 Т-клеток у пациентов с заболеваниями желудка и/или двенадцатиперстной кишки, ассоциированными с геликобактерной инфекцией.

Научная новизна

Впервые у лиц старше 60-ти лет в периферической крови выявлены ДНТ клетки в количестве, превышающем норму, и с помощью разработанной комбинации (CD4+CD8)FITC/TCRy5PE/CD3PC5 показана их идентичность минорной субпопуляции Т-клеток с фенотипом CD3 CD4"CD8"TCRy6 (у5 Т-клетки).

Впервые показано, что увеличение у 5 Т-клеток (или ДНТ) в периферической крови человека может быть маркером воспалительных заболеваний ЖКТ, обусловленных нарушением нормальной микрофлоры кишечника или Helicobacter pylori (H.pylori).

Впервые получены данные, что дисбактериоз 1 -й и 2-й степени, причиной которого является снижение количества лакто- и бифидобактерий, может расцениваться как фактор риска развития вторичных иммунодефицитных состояний.

Практическая значимость

Разработанная комбинация МкАТ (CD4+CD8)FITC/TCRy5PE/CD3PC5, установившая идентичность ДНТ с минорной субпопуляцией у8 Т-клеток, дает возможность ориентировочно выявлять у5 Т-клетки (как ДНТ) с помощью комбинации (CD4+CD8)FITC/CD3PE при первичном анализе в любой клинической иммунологической лаборатории, имеющей минимальный стандартный набор МкАТ.

Обнаружение при первичном иммунологическом обследовании в периферической крови увеличенного в два и более раза количества ДНТ клеток может быть свидетельством хронических заболеваний, связанных с повреждением слизистых патогенными или условно-патогенными, микроорганизмами и может быть рекомендовано в качестве дополнительной диагностики для данной группы заболеваний.

Выявление в периферической крови у5 Т-клеток и антител к H.pylori может быть использовано в качестве дополнительных маркеров хронических воспалительных заболеваний желудка и/или двенадцатиперстной кишки и в лабораторной диагностике бессимптомных форм этих заболеваний в старших возрастных группах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На фоне полиморбидности у пациентов старших возрастных групп в периферической крови появляются ДНТ с фенотипом CD3+CD4"CD8\

2. Увеличение численности ДНТ связано с иммунным воспалением при хронических заболеваниях ЖКТ и дыхательной системы, одним из этиологических факторов которых является повреждение слизистых патогенными или условно-патогенными микроорганизмами.

3. С помощью комбинации МкАТ CD(4+8)FITC/TCRy5PE/CD3PC5 установлена идентичность CD3+CD4"CD8" ДНТ клеток и минорной субпопуляции Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8"TCRy5+ (у5 Т-клетки).

4. Заболевания ЖКТ, обусловленные нарушением нормальной микрофлоры кишечника и геликобактерной инфекцией, сопровождаются иммунным воспалением, которое выражено в увеличении у8 Т-клеток и Т-хелперов и не зависит от возраста.

Внедрение результатов работы

Разработанная усовершенствованная медицинская технология «Схема иммунологического обследования пациентов старших возрастных групп» (Авторы: Мирошниченко И.В., Столпникова В.Н., Левашова Т.В., Карпенко О.М.) применяется в иммунологическом обследовании и иммуномониторинге пациентов клиники Российского геронтологического научно-клинического центра (РГНКЦ).

Определение уб Т-клеток включено в анализ иммунного статуса и выполняется всем пациентам старших возрастных групп в клинике РГНКЦ.

Апробация работы

Апробация диссертации проведена на Ученом Совете ФГУ Российского геронтологического научно-клинического центра (РГНКЦ) Росздрава 27 мая 2008 года. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, апрель 2005 года), на II, IV и V Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Москва, сентябрь 2006 года, май 2007 года, июнь 2008 года), на IX и X Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, апрель 2006 и 2007 года), на I Национальном конгрессе терапевтов (Москва, ноябрь 2006 года), на XI Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, октябрь 2007 года), на II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2007» (Санкт-Петербург, декабрь 2007 года).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 99 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов,

Выводы

1. У лиц старше 60 лет на фоне полиморбидности прослеживалась тенденция к снижению средних показателей иммунограммы за счет увеличения с возрастом процента лиц с низкими показателями и снижения процента лиц с показателями, превышающими норму. Впервые показано, что на фоне этих изменений в периферической крови, независимо от возраста, появляются двойные негативные Т-клетки (ДНТ) с фенотипом CD3+CD4"CD8".

2. Увеличение численности ДНТ в периферической крови ассоциировалось с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного и дыхательного трактов, одним из этиологическим факторов которых может быть иммунное воспаление на инфекционный агент. Признаки иммунного воспаления были подтверждены увеличением у этих же пациентов численности основных субпопуляций с фенотипами CD3+CD4+(T-x) и/или CD3+CD8+(T-4/k).

3. С помощью впервые разработанной комбинации МкАТ (CD4+CD8)FITC/TCRySPE/CD3PC5 была установлена идентичность ДНТ клеток и минорной субпопуляции Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8~TCRyS+ (уб Т-клетки).

4. Увеличение уб Т-клеток при третьей степени дисбактериоза кишечника было связано с появлением условно-патогенной микрофлоры и сопровождалось увеличением Т-хелперов, как маркеров иммунного воспаления. При дисбактериозе первой и второй степени на фоне дефицита лакто- и бифидобактерий показатели иммунитета были снижены.

5. При заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки увеличение уб Т-клеток было обусловлено геликобактерной инфекцией, при этом иммунное воспаление характеризовалось увеличением количества Т-хелперов, В-клеток и антител к Helicobacter pylori; ответная реакция на геликобактерную инфекцию снижалась с возрастом.

6. Выявление у8 Т-клеток может быть использовано в качестве дополнительной диагностики хронических заболеваний, связанных с воспалительными инфекционными процессами слизистых, и для характеристики иммунного ответа при хронических воспалительных заболеваниях ЖКТ у пациентов старших возрастных групп.

7. Для ориентировочного определения у 5 Т-клеток при первичном иммунологическом исследовании может быть использована комбинация (CD4+CD8)FITC/CD3PE, составленная из стандартного набора МкАТ, обычно имеющихся в распоряжении большинства клинических иммунологических лабораторий.

Практические рекомендации

С помощью разработанной комбинации МкАТ

CD4+CD8)FITC/TCRySPE/CD3PC5 установлена идентичность ДНТ и минорной субпопуляцией у8 Т-клеток периферической крови, в связи с этим рекомендуется выявлять у8 Т-клетки (как ДНТ) с помощью комбинации (CD4+CD8)FITC/CD3PE при первичном анализе в любой клинической иммунологической лаборатории, имеющей минимальный стандартный набор МкАТ.

Если при первичном иммунологическом обследовании в периферической крови отмечено увеличение количества ДНТ клеток выше нормы (5%), это может быть показателем воспалительных заболеваний, связанных с повреждением слизистых патогенными или условно-патогенными микроорганизмами. Этот показатель может быть рекомендован в качестве дополнительной диагностики для данной группы заболеваний.

Выявление в периферической крови у8 Т-клеток и антител к H.pylori может быть рекомендовано к использованию в качестве дополнительных маркеров хронических воспалительных заболеваний желудка и/или двенадцатиперстной кишки и в лабораторной диагностике бессимптомных форм этих заболеваний в старших возрастных группах.

90 '