Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Иммунологический фенотип лимфоцитов в клинических исследованиях цельноклеточных вакцин

Надтравах рукописи

005009571

БАРЫШНИКОВ КИРИЛЛ АНАТОЛЬЕВИЧ

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ЛИМФОЦИТОВ В КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫХ ВАКЦИН

Специальность: 14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 йнв т

Москва, 2012

005009571

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Демидо доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидэ

Официальные оппоненты:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор A.B. Карауло доктор медицинских наук, профессор В.Ю. Сельчу

Ведущая организация:

ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «16» февраля 2012 г. часов на заседани

диссертационного совета Д.001.017.01 при Учреждении Российско: академии медицинских наук Российском онкологическом научном центр им. H.H. Блохина РАМН по адресу: г. Москва, Каширское ш., д. 24.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, г. Москва, Каширское ш., 24.

Автореферат разослан

2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор /у/ Ю.В. Шишкин

АКУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В настоящее время меланома кожи в нашей стране и за рубежом остается одной из основных проблем онкологии. Ежегодно в России регистрируется около 7500 тысяч заболевших, что составляет 1,5% среди всех злокачественных новообразований. При этом стандартизированные показатели заболеваемости в России и развитых странах Европы составляют около 3-4 на 100 тыс, населения.

В России с 1990 по 2010 год заболеваемость меланомой кожи увеличилась на 59% для мужчин и на 64% для женщин.

Прирост смертности в России от меланомы кожи составил 42% для мужчин и 18% для женщин. По сравнению с другими злокачественными опухолями по темпам прироста смертности меланома кожи вышла на 1 место у мужчин и на 2 место у женщин.

Кроме того, серьезные опасения вызывает несвоевременная диагностика меланомы кожи, когда почти у 30% заболевших опухоль обнаруживается в ПНУ ст. Если учитывать прогностически неблагоприятные стадии ПЬ-Г/, то на их долю выпадает 64% пациентов впервые обратившихся за специализированной помощью.

В связи с этим, поиск новых путей лечения меланомы кожи представляется весьма актуальным. Особенно это касается лечения диссеминированной меланомы кожи, когда исчерпаны возможности хирургического и лучевого методов лечения.

Современные схемы химиоиммунотерапии меланомы кожи обладают недостаточной эффективностью, которая не превышает 10-15%. Вместе с тем установлено, что меланома является в достаточной степени иммуногенным новообразованием, что создает предпосылки для разработки методов иммунотерапии.

Попытки стимуляции иммунной системы для лечения рака предпринимались давно и неоднократно. Однако лишь в последнее десятилетие удалось добиться определенного эффекта от применения

иммуностимулирующих препаратов. Оказалось, что преодолеть иммунодепрессию у онкологических больных можно с помощью вакцинотерапии. Иммунная система организма способна реагировать на различные опухоль-ассоциированные антигены. В связи с чем были созданы генноинженерные противоопухолевые вакцины.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка безопасности и иммунологической эффективности цельноклеточных вакцин, разрабатываемых в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, у больных меланомой кожи.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Оценить безопасность применения цельноклеточных вакцин. %. Оценить фенотип иммунокомпетентных клеток периферической крови у онкологических больных в процессе вакцинотерапии вакцинами Аллоген, Мелавак и дендритноклеточной вакциной.

3. Оценить функциональную активность клеток эффекторного звена иммунной системы методом проточной цитометрии у онкологических больных в процессе вакцинотерапии.

4. Определить субпопуляции иммунокомпетентных клеток, активация которых коррелирует с эффективностью используемой вакцинотерапии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в России в первой фазе клинических исследований доказана клиническая безопасность вакцин Аллоген, Мелавак и дендритноклеточной вакцины. Впервые оценен иммунологический ответ у больных меланомой кожи в процессе иммунотерапии вакцинами Аллоген, Мелавак и дендритноклеточной вакцины. Показано, что аллогенная вакцина Аллоген, состоящая из клеток меланомы линии Ме1-Р, транзнторно трансформированных геном Tag-7, вызывает активацию иммунокомпетентных клеток, проявляющуюся в увеличении экспрессии

на лимфоцитах активационных антигенов CD25, CD71 и HLA-DR. Вакцина Мелавак, состоящая из клеток меланомы линии Mel-Kor, стабильно трансформированных геном ГМ-КСФ, приводит к увеличению эффекторных лимфоцитов клеточного звена иммунитета, содержащих гранзим и перфорин. Дендритноклеточная вакцина, состоящая из аутологичных дендритных клеток, нагруженных in vitro опухолевым лизатом, вызывает активацию эффекторного звена иммунной системы. Впервые показано, что нарушение линейной структуры лимфоцитов коррелирует с течением заболевания.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Проведенное исследование показало, что вакцинотерапия больных вакцинами Аллоген, Мелавак и дендритноклеточной вакциной индуцирует активацию иммунного ответа, проявляющуюся развитием реакции гиперчувствительности замедленного типа и увеличением экспрессии активационных антигенов.

КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Выявлена субпопуляция клеток CD4+GrB+, увеличение которой сопровождалось быстрым прогрессированием заболевания.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы доложены на симпозиумах и конференциях: VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», 17-19 марта, 2008 г., Москва.

IX международная конференция молодых онкологов «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии», 23-24 апреля, 2008 г., Киев.

X Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», 22-23 марта, 2010 г., Москва.

Апробация диссертации состоялась 16 апреля 2011 г. на совместной конференции с участием отделения биотерапии опухолей, лаборатории клинической иммунологии опухолей, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств (дневной стационар амбулаторной химиотерапии), лаборатории иммунологии гемопоэза - НИИ КО и лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории медицинской биотехнологии - НИИ ЭДиТО.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи и 5 тезисов докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация построена по традиционному стилю и состоит из введения, четырех глав, включающих литературный обзор, материалы и методы, две главы по результатам исследования, а также заключения, выводов и списка литературы, содержащего 146 источников, из которых 14 отечественных и 132 зарубежных авторов. Работа представлена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 9 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика больных

В рамках первой фазы клинических исследований вакцин Аллоген, Мелавак и дендритноклеточной вакцины было пролечено 42 пациента. У всех больных гистологически верифицирована меланома кожи. Все пациенты получили до участия в исследовании химио- или химиоиммунотерапию. На момент участия в исследовании у всех больных имелись отдаленные метастазы.

Средний возраст больных, включенных в исследование, составил 51 год. Общее количество вакцинаций составило 240. Каждый больной

получил минимум 6 введений вакцины. По количеству вакцин выделено 3 группы: В 1-й группе 12 больных получили лечение вакциной Аллоген. 2-ю группу составили 13 больных, которым проводилось лечение вакциной Мелавак. 3-ю группу составили 17 пациентов, которым проводилось лечение дендритноклеточной вакциной.

Все вакцины вводились внутрикожно в 8 точек в непосредственной близости от регионарных лимфатических коллекторов: область плеча, лопаточную, паховую и околопупочную области.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа, опосредованная действием Т-хелперов, которые при помощи цитокинов привлекают к месту введения аллергена другие лимфоциты и макрофаги. Реакция РГЗТ проявляется в виде местной воспалительной реакции на введение.

Оценку субпопуляционного состава лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител против клеточных антигенов CD3, CD4, CD8, CD1 lb, CD 16, CD20, CD25, CD28, CD45, CD56 (Caltag Laboratories, США). Уровень экспрессии транскрипционного фактора Foxp3 определяли с помощью внутриклеточного окрашивания моноклональными антителами к Foxp3 (Miltenyi Biotec Inc., Германия).

Учет результатов реакции иммунофлюоресценции проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), с использованием программного обеспечения CellQuest.

Иммунологический фенотип лимфоцитов крови больных сравнили с аналогичным фенотипом здоровых доноров.

Статистический анализ данных выполнялся с помощью программы SPSS statistic 18. При сравнении иммунологических показателей использовали непараметрические критерии Манна-Уитни и Уилкоксона, а так же метод множественного сравнения с применением критерия Тьюки с помощью программы biostat 5.3.0.

Рисунок 1. Схема создания вакцины Аллоген

опухоль

«I щ

1® щ-

Облучение трансфецированных клеток в дозе ЮОГр

получение клеточной линии

. антигены

- .-- .

пдЩв45./,. ^Щs Щ -TyrosinaaSaS

Н1?МК

\ ЧЖА-АВС"

" ; . ,»., » трансфекция V* опухолевых

- : клеток геном

Введение пациенту опухолевых клеток модифицированных геном

Вакцина Аллоген (рис. 1). Стартовая доза составляла 2x106 с интервалом 1 раз в 12 недели. Нескольким больным проведена эскалация дозы от 2 млн. до 40 млн. клеток.

Вакцина Мелавак (рис. 2). Стартовая доза, составляла 1х107 клеток на человека, с интервалом: первые 5 введений раз в неделю, далее раз в 2 недели. У 6 больных проведена эскалация доз до 6^107 клеток на человека.

Рисунок 2. Схема создания вакцины Мелавак

опухоль

taais

получение клеточной линии

антигены

ЬМе!"

ЩМ ^Ж2S «Зв»

—'.-».и, - - <чТ, » "MW5

• - W^MAGr a-HihA ,,

^.-Tyrosina

HLA-DR Ш

( If LA-ЛВС

Облучение

трансфецированных .- l I'll _лшш,

клеток в дозе ЮОГр ВД5К?

, клеток геном

I

Введение пациенту опухолевых клеток модифицированных геном

Рисунок 3. Схема создания аутологичной вакцины на основе дендритных клеток

Дендритноклеточная вакцина (рис. 3).

Стартовая доза составляв 1хЮб клеток на человека, интервалом между вакцинациями 2 недели.

Дендритные клетки

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Была выполнена оценка общей выживаемости больных (рис. 4).

Наибольшая выживаемость достигнута в группе больных, получавших дендритноклеточную вакцину. Медиана общей выживаемости составила 34,4 мес. У пациентов получавших вакцину Аллоген медиана общей выживаемости составила 18,6 мес. Самая низкая выживаемость была в группе пациентов получавших вакцину Мелавак, она составила 11,2 мес (табл. 1 и 2).

Рисунок 4. Общая выживаемость больных в трех группах, получавших вакцины

Общая выживаемость

дендритнйклеточная

вахцкка ■ ■

вакцнна Мелавак вжцнка. Аллоген

20X0 «.00

месяцы

«.со

Проверка равенства распределений дожития для различных уровней с использованием критерия Log Rank не показала статистической разницы в данных группах.

Вакцины Средняя ± ошибка, мес 95% доверительный интервал

Дендритноклеточная 45,34±9,83 [26,06-64,61]

Мелавак 11,42±2,37 [6,7 - 16,08]

Аллоген 29,24±9,51 [4,3-41,59]

Таблица 2. Медиана общей выживаемости

Вакцины Медиана, мес 95% доверительный интервал

Дендритноклеточная 34.8 [34,48-35,12]

Мелавак 11.2 [2,5-19,86]

Аллоген 18.6 [0,02-37,18]

I фаза клинических исследований вакцины Аллоген

Tag7/PGRP-S - семейство генов пептидогликан-распознающих белков. Tag-7 реализует свое действие посредством усиления хемотаксиса и ускорения созревания дендритных клеток. С целью получения противоопухолевой аллогенной вакцины геном Tag-7 трансфецировали клетки человеческой меланомы кожи mel-P. Количество секретируемого белка варьировало от 5 до 80 нг в 1 мл культуральной среды за 24 ч.

Первая фаза клинических испытаний проведена у 12 пациентов с диагнозом меланома кожи. Среди них 3 мужчины и 9 женщин; возраст больных - от 22 до 84 лет. Пациенты получили от 5 до 25 вакцинаций. Вакцинотерапию Аллогеном начинали через 4 недели после стандартных методов лечения. Минимальная доза соответствовала 2 млн. клеток, максимальная 40 млн. клеток за одно введение. Нескольким больным проведена эскалация дозы от 2 млн. до 40 млн. клеток.

Реакция гиперчувствителыюсти замедленного типа При анализе 12 пациентов, получивших лечение вакциной Аллоген, РГЗТ наблюдалась у 6 из них.

- ю-

Иммунологический ответ на вакцину Аллоген

Для оценки динамики иммунологических показателей в процессе вакцинотерапии выполнено сравнение субпопуляций лимфоцитов относительно точки до введения первой вакцины (рис. 5).

Изучение Т-клеточного звена иммунитета данной группы больных показало, что количество СБ45+СОЗ+ лимфоцитов в процессе вакцинотерапии оставалось без динамики. Анализ основных субпопуляций Т-лимфоцитов показал, что количество С045+СБ4+ клеток статистически достоверно увеличилось в процессе лечения (Р < 0,05). Субпопуляция С045+СБ8+ лимфоцитов, оставалась без статистически значимых изменений, так же как и иммунорегуляторный индекс.

Выявлено статистически значимое увеличение субпопуляций Т-лимфоцитов С04+СБ38+ и СБ8+СБ38+ (Р < 0,002 и Р < 0,05)

Количество В-клеток в процессе лечения оставалось без динамики.

Различия в субпопуляции ШС-клеток СЭ11Ь+С016+, С011Ь+С08+, СБ11Ь+СЭ56+ были статистически не значимы, что связано, вероятно, с малой численностью групп.

При изучении гранзим-позитивных ИК-клеток было выявлено, что субпопуляция СВ45+СБ16+Ог+ клеток в процессе проводимой терапии увеличилась с 10 до 17%.

Кроме того обнаружили статистически значимое повышение СВЗ активированных клеток СБЗ+СБ25+ с 4 до 6%.

В процессе вакцинации обнаружили повышение экспрессии антигенов СБ25+ (Р < 0,05), С095+ (Р < 0,002), СБ 71+ (Р < 0,005).

Таким образом, вакцина Аллоген индуцировала активацию Т-лимфоцитов.

- и -

Рисунок 5. Изменение фенотипа лимфоцитов в процессе вакцинации вакциной Аллоген

I фаза клинического исследования вакцины Мелавак

Вакцина Мелавак представляет собой стабильно трансфецированную геном ГМ-КСФ клеточную линию меланомы человека Ме1-Ког.

Первая фаза клинических исследований противоопухолевой вакцины Мелавак показала ее безопасность при введении в дозе от 1x107 до 6*107. Проведен анализ иммунологической эффективности вакцины.

В клиническое исследование безопасности противоопухолевой I вакцины Мелавак в иммунотерапии диссеминированной меланомы кожи включены 13 пациентов. Из них 9 мужчины и 4 женщины. Возраст пациентов от 31 года до 60 лет. У всех больных гистологически подтвержденная меланома кожи. Все пациенты получали химио-, иммунотерапию по поводу меланомы кожи, и при обследовании у всех больных было зафиксировано прогрессирование заболевания. Перед включением в исследование все пациенты подписали информированное согласие. 12 пациентов получили 6 вакцинаций в соответствии с протоколом исследования. 1 пациент выбыл из исследования после 5 вакцинаций, в связи с прогрессированием заболевания на фоне лечения. У

6 пациентов проведена эскалация доз до 6хЮ7млн клеток на введение.

На основании проведенного исследования можно сделать заключение, что исследуемая вакцина при введении в дозе от 1><107 до 6x107 внутрикожно токсическими эффектами не обладает. Серьезных побочных реакций 3 или 4 степени не отмечено. Переносимость хорошая. У 8 пациентов отмечен легкий гриппоподобный синдром. Реакция гиперчувствительности замедленного типа При анализе 13 пациентов, получивших лечение вакциной Мелавак, РГЗТ наблюдалась у 8 из них, однако степень выраженности была низкой. Иммунологический ответ на вакцину Мелавак Изучение Т-клеточного звена иммунитета данной группы больных показало, что количество СВ45+СОЗ+, СБ45+СВ4+, а так же СП45+СВЗ+С08+лимфоцитов было в пределах донорских показателей как до начала вакцинотерапии, так и в процессе лечения. Субпопуляции СБ45+СБ8+ и С1345+С03-С08+ лимфоцитов, напротив, до начала вакцинотерапии были в 1,3 раза больше показателей донорской группы и в процессе лечения продолжали увеличиваться, превышая нормальные значения после 5-й вакцинации в 1,5 и 2 раза соответственно. (Р < 0,002) (Р < 0,003). Иммунорегуляторный индекс был статистически значимо снижен по сравнению с здоровыми донорами.

Следует отметить ещё одну минорную субпопуляцию СВ45+СБЗ+СВ4+С08+ лимфоцитов. Эта субпопуляция клеток до начала лечения в 3 раза превышала значения донорской группы и на фоне проводимой вакцинотерапии оставалась без изменений.

Количество В-клеток было в пределах нормальных показателей как до начала вакцинотерапии, так и в процессе лечения.

Исследование ЫК-клеточного звена иммунитета выявило высокое (в 1,5 раза превышающее норму) содержание С045+С016+ лимфоцитов в периферической крови больных до начала терапии. На фоне проводимого

лечения количество Ж-клеток продолжало увеличиваться, превышая после 5-й вакцинации донорские значения в 1,7 раза (Р < 0,038).

Динамика субпопуляций С045+С016+С03+ и С045+С016+С08+ в процессе лечения не была статистически значимой. Аналогичная картина выявлена при изучении экспрессии молекулы СЭ25 на поверхности лимфоцитов периферической крови больных. При исследовании экспрессии СБ25 антигена на поверхности С045+СБ4+ Т-лимфоцитов периферической крови было выявлено, что до начала вакцинотерапии количество СБ45+С04+С025+ клеток было в 1,9 раза меньше, чем в группе здоровых доноров. На фоне дальнейшего лечения эта субпопуляция клеток увеличивалась, достигая после 5-го введения вакцины нижней границы нормы.

Исследование внутриклеточного содержания перфорина показало, что на фоне проводимой вакцинотерапии было отмечено статистически значимое увеличение популяций С045+регй>пп+, СВ45+СБ8+РегГопп+.

При изучении перфорин-позитивных Ж-клеток было выявлено, что в процессе проводимой терапии наблюдалось увеличение субпопуляции С045+СБ16+Регйюп+.

Анализ внутриклеточной экспрессии гранзима-В в лимфоцитах периферической крови больных меланомой показал, что до начала вакцинотерапии количество СВ45+Сгапгуше В+ клеток в 1,6 раза превышало норму (Р < 0,006). В процессе терапии наблюдалось дальнейшее увеличение этой популяции клеток. Следует отметить, что минорная субпопуляция С045+СП4+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих гранзим-В, у онкологических больных до начала вакцинотерапии превышала нормальные показатели, составляя 4,6±2,6% (Р< 0,001), на фоне проводимой терапии количества этих клеток увеличивалось до 7,6±3,6% (Р<0,001).

Количество С045+С04+СБ25+Рохр-3 Т-лимфоцитов, было в пределах донорских показателей как до начала лечения, так и в процессе терапии.

Однако в процессе вакцинотерапии не обнаружили статистически значимых изменений в иммунологическом статусе лимфоцитов между первой и последующими точками измерений. Исключением являются СЭ8+С028+ Т-лимфоциты, процент которых статистически значимо повысился к 6 вакцинации. Это же касается клеток, содержащих перфорин и гранзим, процент которых существенным образом возрос, и различия стали статистически значимыми. Это прямым образом указывает на то, что в результате вакцинации произошло увеличение цитотоксических Т-клеток С08+Р+ и является показателем эффективности вакцинотерапии вакциной Мелавак (рис. 6).

Рисунок 6. Динамика изменений фенотипа СБ45+ лимфоцитов в процессе терапии вакциной Мелавак

45 -

40

I фаза клинического исследования дендритиоклеточной вакцины

В I фазе клинических исследований была изучена безопасность дендритиоклеточной вакцины. В исследование включены 17 пациентов, из них 6 мужчин и 11 женщин. Возраст пациентов от 28 года до 72 лет. У всех больных гистологически подтвержденная меланома кожи. Все пациенты получали химио-, иммунотерапию по поводу меланомы кожи и при обследовании на момент включения в исследование было зафиксировано прогрессирование заболевания.

Все 17 пациентов получили 6 и более вакцинаций в соответствии с протоколом исследования.

По клиническому течению заболевания 17 больных были разделены на две группы. В 1-ю группу вошли 6 больных, у которых на фоне вакцинотерапии (6 вакцинаций) оставалась в стабилизация опухолевого процесса и имелся более благоприятный прогноз заболевания, выраженный в медленном прогрессировании болезни и характеризующийся статистически достоверным более длительным временем выживаемости (рис. 7), а во 2-ю - 11 больных, у которых в процессе вакцинотерапии было выявлено прогрессирование основного заболевания.

Иммунологический ответ при дендритиоклеточной вакцине

Был изучен иммунологический фенотип лимфоцитов периферической крови 17 больных диссеминированной меланомой кожи, получивших лечение аутологичной вакциной на основе дендритных клеток, нагруженных лизатом. Исследование проводили до начала лечения, после 3-х и б-ти вакцинаций.

Рисунок 7. Общая выживаемость больных в двух группах, получавших дендритноклеточную вакцину

Общая выживаемость

группа 1 группа 2

4о,w боло ео.оо

месяцы

Проверка равенства распределений дожития с использованием критерия Log Rank показала статистическую разницу в данных группах (Р<0.01).

В первой группе больных (рис. 8) (медленно прогрессирующие) количество С045+С03+ Т-лимфоцитов до начала вакцинотерапии в 1,2 раза превышало нормальные значения и в процессе вакцинотерапии оставалась без динамики (Р>0,05). Во второй группе (рис. 9) (быстро прогрессирующие) было выявлено, что количество СБ45+СБЗ+ клеток было в пределах донорских показателей как до начала вакцинотерапии, так и на фоне проводимого лечения.

Анализ основных субпопуляции Т-лимфоцитов показал, что до начала лечения и в процессе вакцинации количество С045+СБ4+ в первой группе больных оставалось в пределах нормальных значений. С другой

стороны, у больных второй, быстро прогрессирующей группы, перед вакцинацией уровень С045+СБ4+ клеток был снижен, но это снижение было статистически не значимым. В процессе вакцинотерапии уровень этих клеток снизился с 38 до 30 % и стал статистическим значимым (Р> 0,01). После 6-го введения вакцины их количество было в 1,4 раза меньше донорских значений.

Изучение субпопуляции СВ45+С08+ Т-лимфоцитов показало, что у больных первой и второй групп до начала терапии количество этих клеток статистически значимо превышало нормальные показатели, в 1,5 раза и в 1,6 раза соответственно. На фоне проводимого лечения субпопуляция СБ45+С08+ Т-лимфоцитов у больных первой группы количественно практически не менялась, тогда как у больных второй группы было выявлено дальнейшее увеличение этой субпопуляции клеток и после 6-ой вакцинации их количество в 1,8 раза превышало значения донорской группы. Следует отметить, что иммунорегуляторный индекс у больных первой и второй групп был на уровне нижней границы нормы. В процессе вакцинотерапии у больных первой группы этот показатель оставался без динамики, а у больных с прогрессированием основного заболевания было выявлено уменьшение индекса, и после 6-го введения вакцины соотношение С04/СБ8 лимфоцитов было в 2 раза меньше нормы.

Выявленное увеличение количества СП45+С08+ клеток у всех больных было обусловлено увеличением субпопуляции СВ45+СБЗ+С08+ Т-лимфоцитов, которая повторяла динамику СЭ45+С08+ лимфоцитов. Так у больных в стабилизации (первая группа) количество С045+С03+СБ8+ Т-клеток как до начала терапии, так и в процессе лечения в 1,7 раза превышало показатели здоровых доноров (Р<0,002). У больных второй группы эта субпопуляция лимфоцитов до начала вакцинотерапии в 1,7 раза, а после 6-й вакцинации - в 2 раза превышала нормальные значения (Р<0,002).

Исследование минорной субпопуляции CD45+CD8+CD4+ Т-клеток показало, что у больных первой группы количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности одновременно и CD4 и CD8 антигены было в пределах донорских показателей как до начала терапии, так и в процессе вакцинотерапии. У больных с прогрессирующим течением заболевания (вторая группа) количество этих клеток до начала лечения было в 3 раза больше нормы (Р<0,01), а на фоне проводимой терапии наблюдалось уменьшение субпопуляции CD45+CD8+CD4+ Т-лимфоцитов (Р<001), достигающее нормальных значений после 6-го введения вакцины. Уровень В-клеток не изменялся.

Изучение NK клеточного звена иммунитета показало, что до начала терапии количество CD45+CD16+ лимфоцитов у больных первой группы оставался без динамики. У больных второй группы на фоне лечения количество CD45+CD16+ лимфоцитов увеличивалось, и после 6-й вакцинации в 1,8 раза превышала нормальные значения (Р<0,01).

При исследовании экспрессии СОЗ-антигена на поверхности CD45+CD16+ клеток было выявлено, что во второй группе больных до начала вакцинотерапии количество CD45+CD16+CD3+ лимфоцитов в 2 раза превышало показатели здоровых доноров. В процессе лечения наблюдалось увеличение этой субпопуляции. У больных первой группы субпопуляция CD45+CD16+CD3+ лимфоцитов была в пределах нормальных значений, как до начала вакцинотерапии, так и на фоне проводимого лечения.

Анализ С025-антигена на поверхности CD45+ лимфоцитов периферической крови первой группы показал, что до начала лечения количество CD45+CD25+ клеток было нормальным, однако в процессе терапии наблюдалось увеличение этой популяции клеток в 1,4 раза (Р > 0,05). Исследование субпопуляции CD45+CD4+CD25+ клеток у больных первой группы показало, что количество этих лимфоцитов было в пределах значений донорской группы на всех этапах исследования. У

больных второй группы популяция СВ45+С025+ клеток до начала вакцинотерапии в 1,3 раза превышала донорские показатели, на фоне лечения наблюдалось дальнейшее увеличение, и после 6-й вакцинации их количество было в 1,9 раза больше нормы (Р > 0,05).

При исследовании экспрессии НЬЛ-ЭЯ антигена на поверхности лимфоцитов периферической крови больных первой группы было показано, что количество С045+НЬА-0Я+ и СБ45+СОЗ+НЬА-ОЯ+ лимфоцитов до начала вакцинотерапии было в пределах нормы, и на фоне последующего лечения оставалось без динамики. Тогда как у больных второй группы до начала терапии популяция СВ45+НЬА-Б11+ лимфоцитов в 1,6 раза превышала нормальные значения, в процессе вакцинотерапии наблюдалось незначительное уменьшение этой популяции клеток, и после 6-го введения вакцины количество СВ45+НЬА-011+ лимфоцитов было в 1,4 раза больше нормальных показателей (Р > 0,05). Субпопуляция активированных С045+С03+НЬА-0Я+ Т-лимфоцитов у больных с прогрессирующим течением заболевания до начала лечения превышала значения донорской группы в 2,2 раза (Р > 0,05). На фоне проводимой терапии было отмечено уменьшение этой субпопуляции клеток до нормальных значений, после 6-ти вакцинаций.

Популяция С045+регйтп+ клеток до лечения у больных двух групп находилась в пределах нормы. На фоне лечения у больных первой группы эта популяция клеток увеличивалась, и после 6-й вакцинации в 1,6 раза превышала донорские показатели (Р < 0,007), а у больных второй группы, напротив, оставалась без динамики.

При изучении экспрессии перфорина в С08+ Т-лимфоцитах было выявлено, что у больных второй группы количество СВ45+СВ8+РегЛ>пп+ клеток было в 1,6 раза больше нормы. У больных первой группы до начала вакцинотерапии популяция перфорин-позитивных С08+ Т-лимфоцитов была в пределах нормальных значений, а на фоне лечения увеличивалась,

и после 6-го введения вакцины почти в 2 раза превышала донорские показатели (Р < 0,007).

Анализ перфорин-позитивных ИК-клеток у больных двух исследуемых групп показал, что количество СБ45+СО16+Рег{опп+ лимфоцитов, как до начала лечения, так и на фоне проводимой вакцинотерапии оставалось в пределах нормы.

Интересным оказалось исследование внутриклеточной экспрессии гранзима-В. Следует отметить, что минорная субпопуляция СБ45+СВ4+Огапгуте В+ Т-клеток у больных первой группы, как до начала вакцинотерапии, так и на фоне лечения оставалась в пределах донорских показателей, составляя менее 3%. У больных второй группы, с прогрессирующим течением заболевания, до начала терапии популяция СВ45+Огапгуте В+ клеток была больше нормы в 1,5 и в процессе вакцинотерапии оставались без динамики. Субпопуляция С045+С04+Сгапгуте В+ Т-лимфоцитов до начала лечения значительно превышала нормальные показатели (1,0±0,6%), составляя 10,5±6,5% (Р < 0,001). На фоне проводимой терапии количество гранзим В-позитивных СБ45+СБ4+ Т-лимфоцитов существенно не менялось.

Изучение внутриклеточной экспрессии белка Бохр-З в Т-лимфоцитах периферической крови больных двух групп не выявило отклонений от нормы на фоне вакцинотерапии в количестве С045+СБ4+СВ25+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих Бохр-З.

Рисунок 8. Динамика изменений фенотипа СЭ45+ лимфоцитов в процессе терапии дендритноклеточной вакциной (группа прогрессирования заболевания)

Рисунок 9. Динамика изменений фенотипа СБ45+ лимфоцитов в процессе терапии дендритноклеточной вакциной (группа медленного прогрессирования заболеваня)

выводы

1. Первая фаза клинических исследований показала клиническую безопасность вакцин Аллоген, Мелавак и дендритноклеточной вакцины.

2. Лечение больных меланомой кожи вакциной Аллоген приводит к повышению экспрессии активационных маркеров на лимфоцитах периферической крови онкологических больных, стабилизация заболевания на момент введения 6-й вакцины отмечена у 25% пациентов.

3. Терапия вакциной Мелавак привела к увеличению эффекторных лимфоцитов клеточного звена иммунитета, содержащих перфорин и гранзим, однако клинического эффекта у данной группы пациентов не отмечено.

4. В группе больных с медленным прогрессированием заболевания в процессе лечения дендритноклеточной вакциной отмечено повышение уровня цитотоксических лимфоцитов с фенотипом СБ8+, СОЗ+СВ8+ и С08+Р+.

5. В группе больных с быстрым прогрессированием заболевания в процессе лечения дендритноклеточной вакциной отмечено увеличение количества клеток эффекторного звена иммунной системы: С08+, СОЗ+СБ8+, С03-С08+, СЭ16+, СБ11Ъ, СВ8+СБ16+.

6. Выявлена субпопуляция лимфоцитов СБ4+Ог+, увеличение которой коррелирует с плохим прогнозом течения заболевания. У пациентов со стабилизацией заболевания на момент обследования СБ4+ОгВ+ клетки находились в пределах здоровых доноров. У пациентов при прогрессировании болезни наблюдалось 5-кратное увеличение количества клеток С04+СяВ+ (р<0.001).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАИЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлова И.Н., Бурова О.С., Лукашина М.И., Морозова Л.Ф., Утяшев И.А., Петенко H.H., Барышников К.А., Иванов П.В., Парсункова К.А., Черемушкин Е.А., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. Вакцинотерапия диссеминированной меланомы геномодифицированными клетками // Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». - 2006. - Т. 10, №2. -С. 25.

2. Михайлова И.Н., Барышников К.А., Бурова О.С., Лукашина М.И., Смирнова А.Л., Петенко H.H., Утяшев И.А., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой геномодифицированной вакцины. Оценка иммунного статуса // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 51-54.

3. Барышников К.А., Михайлова И.Н., Бурова О.С., Лукашина М.И., Демидов Л.В. Оценка иммунного статуса при терапии геномодифицированной вакциной // Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - Т. 7, №1. - С. 4.

4. Борунова A.A., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Барышников К.А., Михайлова И.Н., Демидов Л.В., Барышников А.Ю., Кадагидзе З.Г. Динамика CD45+CD3-CD8+ популяции лимфоцитов у больных диссеминированной меланомой кожи при вакцинотерапии // Материалы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ, Душанбе, 1-4' октября 2010.-С. 65.

5. Барышников К.А., Борунова A.A., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Барышников А.Ю., Михайлова И.Н., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г. Динамика СО45+СОЗ+НЬА-ОЯ-активир0ванных Т-лимфоцитов у больных диссеминированной меланомой кожи при вакцинотерапии // Материалы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ, Душанбе, 1-4 октября 2010.-С. 64-65.

6. Михайлова И.Н., Иванов П.В., Петенко H.H., Барышников К.А., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Черемушкин Е.А., Субраманиан С., Чкадуа

Г.З., Барышников А.Ю. Внутрикожная клеточная реакция на фоне вакцинотерапии меланомы кожи // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, №1. - С. 63-67.

7. Ермакова Н.П., Михайлова И.Н., Меркулова И.Б., Коняева О.И., Кульбачевская Н.Ю., Абрамова Т.В., Барышников К.А., Михайлова JI.M. Доклинические исследования токсичности противоопухолевой вакцины Мелавак // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. -Т. 9, № 1.- С. 57-62.

8. Борунова A.A., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Михайлова Т.Н., Барышников К.А., Демидов JI.B., Кадагидзе З.Г. Исследование структуры популяции Т-лимфоцитов у больных диссеминированной меланомой кожи при вакцинотерапии // Российский биотерапевтический журнал.-2011.-Т. 10, № 1.-С. 12.

Подписано в печать 2В .11.11 Формат 60x84/16. Бумага офисная «ЗуеЬСору». Тираж 100 экз. Заказ № 1252 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24