Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия при репарации длительно незаживающих ран

На правах рукописи

РГБ ОД

1 5 ИЮП'

ФЁДОРОВ Дмитрий Николаевич

МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ И КЛЕТОЧНО-МАТРИКСНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ РЕПАРАЦИИ ДЛИТЕЛЬНО НЕЗАЖИВАЮЩИХ РАН

/14.00.15. - «Патологическая анатомия»/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Московской Медицинской Академии имени И.М. Сеченова

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Пауков B.C.

Доктор медицинских наук, профессор Иванов А.А.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор

Быкова В.П.

Доктор медицинских наук, профессор Берченко Г.Н.

Ведущая организация: НИИ Морфологии Человека РАМН

Защита диссертации состоится «_»_2002 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.040.01 при ММА им. И.М. Сеченова (119992, Москва, Малая Трубецкая ул., д.8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (117418, Москва, Нахимовский просп., д.49).

Автореферат разослан «_»_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор В.А. Варшавский

Р4& У/-/ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Изучение проблем воспаления и репаративной регенерации является одной из фундаментальных задач современной патологии. Несмотря на большое количество исследований, проводимых в данной области, как в России, так и за рубежом, до настоящего времени не существует четкого представления о многих процессах, протекающих в ходе воспалительно-репаративной реакции. Среди нерешенных вопросов остается и проблема хронического воспаления, а также его связь с процессами репарации.

Одним из наиболее удобных объектов для исследований в данной области являются длительно незаживающие раны кожи, характеризующиеся как наличием хронического воспаления, так и нарушениями в реализации репаративной регенерации [Шехтер А.Б., Серов В.В.,1991]. Разные авторы под термином «длительно незаживающая рана» подразумевают различные состояния, однако большинство исследователей во всем мире используют данное понятие для характеристики следующих патологических процессов: трофические язвы нижних конечностей, диабетические язвы, пролежни, незаживающие раны, развившиеся на месте травмы или оперативного вмешательства, а также в результате обморожения или термического, либо химического поражения кожного покрова [Falanga V., 1993; Ивашкин А.Н., 2001].

Механизмы, участвующие в развитии данного патологического процесса, в настоящий момент изучены недостаточно. Исследование экспрессии цитокинов и факторов роста, задействованных в регуляции воспалительной реакции, их влияние на формирование внеклеточного матрикса и закрытие раневого дефекта составляют основу для понимания механизмов репарации в длительно незаживающих ранах [Mutsaers S.E. с соавт., 1997; O'Kane S. с соавт., 1997; Singer A.J., Clark R.A.F., 1999].

Важность изучения данной проблемы обусловлена высокой частотой встречаемости: больные с длительно незаживающими ранами составляют около 10% от общего числа пациентов общехирургических стационаров в России, при этом на протяжении последних десятилетий сохраняется тенденция к увеличению числа больных этой категории [Ивашкин А.Н., 2001]. Кроме того, исследования в данной области имеют большую практическую значимость, так как создают основу для разработки новых, более эффективных методов лечения.

Целью проведенного исследования являлась оценка межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий при репарации длительно незаживающих ран.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести морфологическое и иммуногистохимическое исследование клеточного и стромального компонентов длительно незаживающих ран различного генеза для выявления характерных особенностей и общих закономерностей их развития.

2. Проследить динамику репаративных процессов в длительно незаживающих ранах после закрытия их аллогенным EGF-содержащим криоконсервированным эпидермисом.

3. Изучить механизмы, регулирующие межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия в процессе репарации длительно незаживающих ран.

Научная новизна:

1. Впервые проведено исследование репаративных процессов у больных с длительно незаживающими ранами после трансплантации криоконсервированного EGF-содержащего аллогенного эпидермиса.

2. Установлено, что длительно незаживающие раны вне зависимости от факторов, обусловивших их развитие (трофические язвы, раны развившиеся после термических поражений кожного покрова и др.) характеризуются стереотипными изменениями со стороны состава воспалительного инфильтрата и внеклеточного матрикса: преобладанием клеток моноцитарно/макрофагального ряда в воспалительном инфильтрате в сочетании с недостаточным количеством Т-хелперов/Т-супрессоров; снижением содержания коллагена III типа, накоплением тенасцина и плазменной формы фибронекгина, изменением типичной локализации ламинина, минимальным количеством миофибробласгов в области раневого дефекта.

3. Выявлены изменения со стороны медиаторных систем, регулирующих ход воспапительно-репаративной реакции: обнаружены повышенное накопление провоспалительных цитохинов (1L-1P, М1Р-1аШР-1р) и нарушение их нормального соотношения, отсутствие фиброгенных факторов роста (TGF-p,, bFGF) в сочетании с повышенной активностью ММР-9 в области раны.

4. Продемонстрирована способность криоконсервированного EGF-содержащего аллогенного эпидермиса активизировать репаративные процессы в длительно незаживающих ранах: после трансплантации наблюдалась нормализация экспрессии провоспалительных цитокинов, активизация продукции факторов роста, снижение активности ММР-9, что способствовало формированию нормального внеклеточного матрикса и заживлению ран.

5. Выявлены особенности репаративных процессов, протекающих в длительно незаживающих ранах после закрытия биологически-активным покрытием: сохранение в течении всего процесса заживления раны инфильтрации моноцитами/макрофагами и минимального количества миофибробластов; заживление раны без контракции и формирования рубца.

Практическая значимость работы:

Полученные в работе результаты могут быть использованы не только для дополнения и систематизации имеющихся данных о причинах и механизмах развития длительно незаживающих ран, но также для разработки новых методов лечения, в т.ч. базирующихся на использовании терапевтического воздействия на клеточном и молекулярном уровнях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Длительно незаживающие раны характеризуются особенностями состава воспалительного инфильтрата и выраженными нарушениями в соотношении компонентов внеклеточного матрихса. Данные патологические изменения стереотипны и характерны для длительно незаживающих ран различного генеза.

2. Репарация в длительно незаживающих ранах, активизирующаяся после трансплантации биологически-активного покрытия, характеризуется восстановлением нормальной структуры внеклеточного матрикса, формированием базальной мембраны и реэпителизацией раневого дефекта. Репаративные процессы, протекающие в длительно незаживающих ранах, имеют свои характерные особенности и в значительной мере отличаются от репаративной регенерации нормально заживающих кожных ран.

3. Нарушение соотношения провоспалительных цитокинов, дефицит фиброгенных факторов роста, дисбаланс в системе матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов препятствуют репарации длительно незаживающих ран, создавая самоподдерживающуюся систему, функционирующую по принципу «порочного круга». Трансплантация аллогенного Ев Р-содержащего криоконсервированного эпидермиса приводит к восстановлению систем, регулирующих межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия в длительно незаживающей ране.

Внедрение результатов исследования в практику:

Результаты настоящего исследования используются для проведения дальнейших работ по изучению хронического воспаления и репаративных процессов в длительно незаживающих ранах, а также при разработке новых методов лечения длительно незаживающих ран.

Апробация работы:

Апробация диссертации проведена 25 сентября 2001 на заседании кафедры патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова. Материалы работы представлены на научных конференциях кафедры патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова (октябрь 1999, март 2001), на I! Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (24-28 апреля 2001 г., Москва, Россия), на 18-м Европейском Конгрессе патологов (8-13 сентября 2001 г., Берлин, Германия).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Текст диссертации изложен на 107 страницах машинописного текста, иллюстрирован 3 схемами, 2 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель включает 219 источников, из них 11 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ:

Материалы и методы исследования:

Для исследования был отобран материал, представленный интраоперационными биопсиями, взятыми от больных с длительно незаживающими ранами (ДНР) и нормально заживающими кожными ранами, находившихся на лечении в ГКБ №29 г. Москвы, ГВКГ МО РФ им. H.H. Бурденко, клинике кафедры военно-полевой хирургии ГИУВ МО РФ, НИИ Скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Всего было исследовано 104 биоптата от 29 пациентов, разделенных на основную и контрольную группы, в том числе 89 биоптатов от 25 пациентов с ДНР, составляющих основную группу, и 15 биоптатов от 4 пациентов с нормальным заживлением ран, входящих в контрольную группу.

В основной группе (больные с ДНР) по нозологическим формам материал распределялся следующим образом: трофические язвы, развившиеся на фоне варикозно-расширенных вен нижних конечностей - 14 наблюдений, ДНР развившиеся

после некроэкгомии, выполненной по поводу отморожения дистальных отделов нижних конечностей III - IV степени - 6, длительно незаживающие послеоперационные раны - 2, химический (щелочной) ожог - 1, длительно незаживающая рана, развившаяся на фоне рожистого воспаления - 1, огнестрельное ранение глазницы -1. Следует отметить, что у 44% больных развитие ДНР происходило при наличии тяжелых фоновых и сопутствующих заболеваний - сахарный диабет, хронический остеомиелит голеностопного сустава, гормонозависимая бронхиальная астма, облитерирующий эндартериит сосудов нижних конечностей, ревматический полиартрит, алиментраное общее истощение. Возраст больных был от 18 до 87 лет; женщины в основной группе составляли - 56% (14 больных), мужчины - 44% (11 больных). Длительность существования у больных ДНР колебалась в пределах от 3 месяцев до 20 лет (в большинстве случаев -1,5-2 года).

Биопсийный материал у больных основной группы получали из различных участков раневой поверхности (центр и край раны) до начала лечения, а также на 5-е, 10-е, 15-е сутки после трансплантации биологически активного покрытая (БП) от больных, у которых наблюдалась положительная динамика в состоянии раны на фоне проводимого лечения. Количество биопсийного материала, а также глубина взятия биоптата рассчитывались с учетом необходимости получения максимально информативного образца, включающего в себя все слои раны и прилежащие ткани.

По клиническим данным выраженный положительный эффект наблюдался у 62,8% (19,7% - полная реэпителизация раны, 43,1% - значительное, более чем на 80%, уменьшение площади раневой поверхности), незначительная положительная динамика -у 27,4% больных, отсутствие эффекта - 9,8% [Ивашкин А.Н., 2001]. Выбор больных с позитивной реакцией на проводимое лечение был обусловлен необходимостью изучения возможных путей инициации репаративных процессов у больных с ДНР.

Для закрытия раневого дефекта на предварительно подготовленную раневую поверхность наносили лоскут аллогенного (кадаверного) эпидермиса, обработанный консервантом «С199ГЗФР» и хранившийся при температуре -18'С в течение 10 дней. При необходимости, через 10 - 15 дней, производились повторные трансплантации криоконсервированного аллогенного эпидермиса на раневой дефект.

Метод подготовки трансплантата, предоперационной обработки и закрытия раны был апробирован в лабораторных и клинических условиях и подробно описан в литературе [Киселев И.В., 2000; Ивашкин А.Н. с соавт., 2001].

В качестве контроля использовались биоптаты нормально заживающих послеоперационных кожных ран. Биопсии получали в соответствующие сроки: острая операционная рана, а также на 5-е, 10-е и 15-е сутки.

Основу контрольной группы составили биоптаты, полученные из области раневых дефектов кожного покрова, возникших в месте взятия аутодермотрансплантата у больных

без тяжелых соматических расстройств. Размеры биоптатов и глубина взятия материала обеспечивали получение информативных образцов, содержащих все слои раны и прилежащие ткани. Возраст больных контрольной группы был от 30 до 55 лет, мужчины и женщины были представлены в равном соотношении (50% : 50%).

В работе использовались гистологические и иммуногистохимические методы. Для морфологического и иммуногистохимического исследования биоптаты, полученные в условиях операционной-перевязочной, доставляли в стерильном, охлажденном (+4'С) физиологическом растворе в течении 2-3 часов с момента взятия. Часть полученного материала лрефиксировали смесью параформальдегида и глютаральдегида по Карновскому и фиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия, заливали в аралдит по стандартной методике и в дальнейшем использовали для изготовления полутонких (1 мкм) срезов, которые окрашивали метиленовым синим - азуром И и основным фуксином. Другая часть материала, хранившаяся при температуре -70'С, использовалась для приготовления криостатных срезов. Иммуногистохимические реакции проводили на криостатных срезах толщиной 5 мкм, фиксированных охлажденным ацетоном, по стандартному стрептавидин - биотин - пероксидазному методу с использованием моноклональных ( w ) и поликлональных ("р' ) первичных антител. В исследовании использовались первичные антитела, характеризующие:

Компоненты ВКМ: интерстициальные коллагены I 'р' и III р' типов (IMTEK Ltd., Россия); фибронектин клеточно-ассоциированная'm" (Sigma, USA) и плазменная v формы (IMTEK Ltd., Россия); тенасцин "т"-компонент незрелого ВКМ (NovoCastra, UK); мерозин (Ламинин-2) *'"' (NovoCastra, UK), в том числе базальнай мембраны: коллаген IV типа "р" (IMTEK Ltd., Россия); коллаген VII "т'типа (NovoCastra, UK); ламинин-1'т' (Sigma, USA).

Адгезивные молекулы: VLA-2 "т" (агЗгИНтегрин) - поверхностный клеточный рецептор к коллагену (NovoCastra, UK); VLA-6 w (а6ргинтегрин) - поверхностный клеточный рецептор к ламинину (NovoCastra, UK).

Промежуточные фипаменты: цитокератины 10/13 типов "m (NovoCastra, UK); цитокератины 5/18 типов'm' (NovoCastra, UK); a-SMA'm' - маркер миофибробластов и гладкомышечных клеток (NovoCastra, UK).

Клетки воспалительного инфильтрата: CD4 - Т-хелперы (NovoCastra, UK); CD8 "m" - Т-супрессоры (NovoCastra, UK); CD68 "m" - моноциты/макрофаги (NovoCastra, UK).

Цитокины и факторы роста: IL-1ß-,>' (Sigma, USA); bFGF (FGF-2) "p" - основной фактор роста фибробластов (Sigma, USA); c-MET 'm' (HGF-r) - рецептор к фактору роста гелатоцитов (HGF/FGF-5) (NovoCastra, UK); TGF-ßi "m" - трансформирующий фактор роста-ßi (NovoCastra, UK); MIP-1a "p" - макрофагальный воспалительный белок - 1а (Sigma, USA); MIP-1ß v - макрофагальный воспалительный белок - 1ß (Sigma, USA).

Компоненты системы матриксных металлопротеиназ: ММР-9 "m" - 92kDa желатиназа IV типа / матрикеная металлопротеиназа-9 (NovoCastra, UK); TÏMP-1 "m" -тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 1 типа (NovoCastra, UK); TIMP-2 'm' -тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 2 типа (NovoCastra, UK).

Пролифератиеную активность клеток: Ki-67 'т' (NovoCastra, UK).

Для выявления продуктов реакции использовалась система визуализации HistoStain-Plus (Zymed, USA) с DAB (диаминобензидин) в качестве хромогена. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в эпоксидную смолу. Иммунофлюоресцентное исследование проводилось по аналогичной схеме (непрямой метод), с использованием ФИТЦ для визуализации продуктов реакции.

Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов реакций использовались позитивный (внутренний позитивный контроль - поиск положительной реакции в структурах, достоверно содержащих исследуемый антиген) и негативные (А: замещение первичных антител 0,1%-ым BSA (ZyMed, USA) и ß; А + исключение из реакции вторичных биотинизированных антител) контроли.

При интерпретации результатов учитывали локализацию иммунореактантов и интенсивность их окрашивания, которую оценивали полуколичественным методом по следующим критериям: « - » - реакция отсутствует, «-/+»- слабоположительная реакция, « + », « ++ », « +++ » -степени выраженности положительной реакции.

Результаты проведенного исследования и их обсуждение.

Результаты гистологического и иммуногистохимического исследования.

Характеристика ДНР до трансплантации БП. При гистологическом исследовании биоптатов, полученных от больных с ДНР различного генеза до начала лечения, во всех случаях была выявлена типичная морфологическая картина длительно незаживающей раны - незрелая грануляционная ткань и воспалительный инфильтрат, содержащий, в основном, клетки моноцитарно/макрофагального ряда. В некоторых биоптатах выявлялись отдельные участки разрастания соединительной ткани и очаги некрозов. При иммуногистохимическом исследовании в воспалительном инфильтрате выявлено преобладание CD68* клеток, количество лимфоцитов было незначительным, в некоторых случаях CD4' и CD8* клетки не выявлялись.

В области раневого дефекта и прилегающих областях найдено незначительное количество фибробластов, экспрессирующих aSMA (т.е. имеющих фенотип миофибробластов). В ДНР поверхностные клеточные рецепторы к коллагену (VLA-2) и ламинину (VLA-6) экспрессировались в незначительном количестве на поверхности некоторых фибробластов, входящих в состав незрелой грануляционной ткани. Единичные фибробласты демонстрировали слабоположительную реакцию при исследовании с антителами против с-МЕТ - клеточного рецептора к HGF.

При анализе состава внеклеточного матрикса в длительно незаживающих ранах до начала лечения были обнаружены выраженные изменения в соотношении его компонентов: отмечалось снижение содержания коллагена 111 типа, распределение значительного количества тенасцииа во всех слоях раны, при этом экспрессия коллагена I типа существенно не изменялась. Ламинин до трансплантации диффузно распределялся в грануляционной ткани, кроме того, отмечалось его накопление в стенках кровеносных сосудов.

Фибронектин (плазменная форма) определялся в значительных количествах, при этом отмечалось его неравномерное распределение в строме в области раневого дефекта, выражавшееся в снижение его содержания в периваскулярной зоне, где выявлялись скопления клеток воспалительного инфильтрата. Экспрессия кпеточно-ассоциированной формы фибронектина и мерозина в ране до трансплантации практически отсутствовала.

При иммуногистохимическом исследовании было выявлено практически полное отсутствие экспрессии TGF-p в длительно незаживающих ранах; bFGF слабо экспрессировался в стенках кровеносных сосудов, локализованных в крае раны.

При исследовании провоспалительных цитокинов в ДНР было выявлено повышение накопления IL-1(3. Степень интенсивности иммунопероксидазного окрашивания MIP-1j3, основным источником которого являлись кератиноциты, расположенные в базальных слоях прилегающего к ране эпителия, была несколько выше, чем интенсивность реакции с антителами к М1Р-1а. Слабоположительную реакцию с антителами к М1Р-1а демонстрировали моноциты/макрофаги и отдельные фибробласты, локализованные в области раневого дефекта.

Экспрессия ММР-9 отмечалась в клетках воспалительного инфильтрата, локализованных в зоне раневого дефекта и, менее выражено, в кератиноцитах, расположенных в зоне краевой эпителизации. При выявлении TIMP-1 и TIMP-2 в ДНР реакция была слабоположительной или отсутствовала.

В острой операционной ране, использовавшейся в качестве контроля, при микроскопическом исследовании отмечалось полнокровие кровеносных сосудов, явления стаза в капиллярах, незначительное количество ПЯЛ в периваскулярной зоне. При иммуногистохимическом исследовании были выявлены единичные CD684 клетки, локализовавшиеся диффузно во всех слоях дермы. Положительная реакция с антителами к aSMA обнаруживалась в стенках кровеносных сосудов (гладкомышечные клетки), миофибробласты в дерме не выявлялись. В острой кожной ране была выявлена экспрессия VLA-2 и VLA-6 на поверхности дермальных фибробластов и кератиноцитов, расположенных в базальных и супрабазальных слоях эпидермиса, в которых также отмечалась экспрессия с-МЕТ. Кроме того, в эпидермисе отмечалась выраженная экспрессия СК5/18 и 10/13 типов в базальных и супрабазальных слоях соответственно,

что является нормальной локализацией данных внутриклеточных филаментов. Также в базальных слоях выявлялись отдельные Ki-67* клетки.

При анализе компонентов В КМ отмечалась положительная реакция при выявлении коллагенов I и III типов, равномерно распределенных во всех слоях дермы. Тенасцин в минимальных количествах определялся в субэпителиальных слоях дермы вдоль базальной мембраны. Ламинин выявлялся в стенках кровеносных сосудов и в эпителиальной базальной мембране, которая также включала в себя коллагены IV и VII типов. Клеточно-ассоциированная форма фибронектина в незначительных количествах экспрессировалась в базальных и супрабазальных слоях эпителия и на поверхности дермальных фибробластов.

В острой операционной ране отмечалась слабоположительная реакция с антителами против М1Р-1а; экспрессия М1Р-1(3 практически отсутствовала. Экспрессия ММР-9 и TIMP-1/2 в биоптатах контрольной группы была примерно равной, что демонстрировалось выявлением позитивной реакции умеренной степени выраженности.

Характеристика ДНР на 5-е сутки после трансплантации БП. На 5-е сутки после трансплантации аллогенного эпидермиса на рану при гистологическом и иммуногистохимическом исследовании в большинстве случаев наблюдалось изменение строения грануляционной ткани с признаками формирования зрелой соединительной ткани: при сохраняющемся воспалительном инфильтрате, отмечалось увеличение количества фибробластов, вокруг сосудов внеклеточный матрикс приобретал черты, характерные для нормальной дермы. В воспалительном инфильтрате сохранялось преобладание CD68* клеток, при этом количество CD4* и CD8* клеток оставалось минимальным.

Количество aSMA* клеток не увеличивалось в сравнении с ДНР до начала лечения, в некоторых случаях наблюдалась экспрессия VLA-2 и VLA-6 на поверхности раневых фибробластов.

На 5-е сутки после трансплантации в ДНР наблюдалось увеличение содержания коллагена Ш типа, который диффузно распределялся во всех слоях дермы. Экспрессия коллагена 1 типа оставалась без изменений. В зоне контакта подлежащей созревающей грануляционной ткани с частично лизированным трансплантатом отмечалось выраженное накопление ламинина и формирование провизиональной базальной мембраны. В периваскулярной зоне отмечалось накопление мерозина. Экспрессия тенасцина оставалась достаточно интенсивной, однако в большинстве случаев выявлялось некоторое снижение выраженности реакции относительно наблюдавшейся в ране до трансплантации.

Во всех слоях ВКМ отмечалось умеренное накопление фибронектина (плазменная форма). Экспрессия кпеточно-ассоциированной формы фибронектина обнаруживалась на поверхности фибробластов, в зонах прилегающих к области раны.

Практически во всех наблюдениях к 5-м суткам отмечалось повышение степени выраженности иммунопероксидазного окрашивания с антителами к факторам роста: bFGF и TGF-p. Выраженная позитивная реакция выявлялась в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и фибробластах. Кроме того, отмечалось некоторое снижение экспрессии ММР-9, IL-13 и MIP-10 в сочетании с увеличением интенсивности окрашивания М1Р-1а. При этом выраженность иммунопероксидазного окрашивания с антителами к TIMP-1 и TIMP-2 оставались прежней. Клетки, демонстрирующие позитивную реакцию с с-МЕТ, в биоптатах обнаружены не были.

В нормально заживающих ранах, использовавшихся в качестве контроля, на 5-е сутки количество CD4* и CD6* клеток было большим, чем в ДНР; при этом количество CD68* клеток, преобладавших в воспалительном инфильтрате в ДНР, было приблизительно равным количеству CD4* и CD8* клеток. В области раневого дефекта aSMA* клетки не выявлялись.

На 5-е сутки в ранах, составляющих контрольную группу, соотношение коллагенов I и III типов оставалось идентичным их соотношению в нормальной коже. Тенасцин накапливался по периферии области раны в зоне дерма-эпидермального контакта.

В отличии от ДНР, нормально заживающие раны характеризовались относительно низкой интенсивностью окрашивания IL-1P, в сочетании с повышением выраженности иммунопероксидазной реакции в области раны как с антителами к фиброгенным факторам роста, так и к TIMP-1/TIMP-2.

Характеристика ДНР на 10-е сутки после трансплантации БП. На 10-е сутки после трансплантации наблюдалась реэпителизация раневого дефекта, соединительная ткань в области раны по строению была сходной с нормальной дермой во всех исследованных биоптатах. При иммуногистохимическом исследовании практически во всех случаях в периваскулярной зоне обнаруживались скопления CD63* клеток. Количество миофибробластов к 10-м суткам оставалось по-прежнему незначительным.

Соотношение компонентов ВКМ в области заживающей раны было практически нормальным, отмечалось формирование полноценной базальной мембраны, содержащей коллаген IV и VII типов. Ламинин локализовался преимущественно вдоль базальной мембраны и в стенках кровеносных сосудов, количество которых оставалось значительным, однако структура их была близкой к строению стенки зрелых кровеносных сосудов дермы. Экспрессия aSMA* клеток выявлялась в субэндотелиальном слое. Тенасцин обнаруживался в ране в меньших количествах, отмечалась его аккумуляция в верхних слоях дермы и периваскулярной зоне.

Формирование базальной мембраны сопровождалось активной пролиферацией эпителия, расположенного под остатками гибнущего аллогенного трансплантата. В базальном слое эпидермиса определялось значительное количество Ki-67* клеток. Кератиноциты, участвующие в реэпителизации раневого дефекта имели нормальный

фенотип: цитокератины 5/18 типов локализовались в базальных и супрабазальных слоях кератиноцитов, в то время как цитокератины 10/13 толов - в зоне стратификации эпителиальных клеток.

с-МЕТ экспрессировался как в базальных, так и в супрабазально расположенных кератиноцитах. Экспрессия VLA-2 и VLA-6 определялась в базальных и супрабазальных слоях эпидермиса и на поверхности клеточных мембран дермальных фибробластов.

На 10-е сутки после трансплантации наблюдалось ослабление степени интенсивности иммунопероксидазной реакции с антителами к TGF-ß в области заживающей раны, при этом выраженность иммунопероксидазного окрашивания bFGF оставалась высокой. Ослабление в области раневого дефекта интенсивности окрашивания провоспалительных цитокинов (IL-1ß и MlP-1a/ß) коррелировало с уменьшением количества клеток воспалительного инфильтрата.

Кроме того, отмечалось повышение интенсивности иммунопероксидазной реакции с антителами к TIMP-2, что, вероятно, свидетельствует об увеличении уровня экспрессии данного ингибитора как фибробластами, так и кератиноцитами. При этом выраженность иммунопероксидазной реакции при выявлении Т1МР-1 увеличилась незначительно. Интенсивность иммунопероксидазного окрашивания ММР-9 не изменилась: основными клеточными элементами, в которых определялась положительная реакция с антителами к ММР-9, при этом оставались фибробласты и клетки воспалительного инфильтрата.

8 некоторых случаях (как в ДНР, так и в контрольной группе) в строме выявлялись клетки, сходные по строению с дермальными фибробластами, которые при этом демонстрировали положительную реакцию с антителами к с-МЕТ и СК10/13 типов.

В отличии от ДНР, при репарации в контрольных ранах к 10-м суткам отмечалось значительное увеличение числа aSMA* клеток (миофибробластов). Кроме того, контрольная группа характеризовалась более низкими темпами формирования базальной мембраны, меньшим количеством Ki-67* клеток и менее выраженной интенсивностью иммунопероксидазного окрашивания с антителами к провоспалительным цитокинам, ММР-9 и Т1МР-1/2.

Характеристика ДНР на 15-е сутки после трансплантации БП. К15-м суткам у большинства пациентов с ДНР отмечалась реэпителизация раны, в области раневого дефекта формировалась зрелая дерма. В области дерма-эпидермапьного контакта обнаруживались скопления С068-положительных клеток, однако их число было незначительным. Количество сосудов в дерме уменьшалось, при этом количество фибробластов, содержащих aSMA, оставалось по-прежнему небольшим. Также отмечалось снижение количества KÍS7* клеток в базальных слоях эпидермиса.

Тенасцин выявлялся в минимальных количествах в периваскулярной и субэпидермальной областях, что соответствует его локализации в нормальной коже. Ламинин локализовался в базальной мембране и стенках кровеносных сосудов.

Фибронекгин (плазменная форма) в умеренных количествах содержался в дерме. Клеточно-ассоциированная форма фибронектина выявлялась на поверхности фибробластов и в базальных слоях кератиноцитов; там же отмечалась экспрессия У1А-2 и У1_А-6,

Выраженность экспрессии фиброгенных факторов роста (ТвР-р, ЬРвР), провослалительных цитошнов (И- 1(5, М1Р-1а, М1Р-1(3), ММР-9, Т1МР-1/2 соответствовала экспрессии в контрольной группе.

Клинически на 15-е сутки у большинства пациентов отмечалось активное заживление раны без формирования рубца, в некоторых случаях происходила полная реэпителизация раневого дефекта.

Таблица 1: «Распределение компонентов внеклеточного матрикса, миофибробластов и моноцитов/макрофагов в длительно незаживающих ранах до начала лечения и на 5-е, 10-е и 15-е сутки после трансплантации аллогенного ЕСР-содержащего эпидермиса».

Иммуногистохимические маркеры В ране до трансплантации 5-е сутки после трансплантации 10-е сутки после трансплантации 15-е сутки после трансплантации

Коллаген 1 типа ++ ++ ++ ++

Коллаген III типа -/+ ++ ++

Ламинин ++ ++ + +

Тенасцин +++ ++ + -/+

CD68* клетки +++ ++ ++ +

aSMA* клетки + + + +

Критерии оценки: « - » - реакция отсутствует, «-/+»- слабоположительная реакция, « + », « ++ », « +++ »- степени выраженности положительной реакции.

Таблица 2: «Экспрессия факторов роста, провослалительных цитокинов, ММР-9 и Т1МР-1/Т1МР-2 в длительно незаживающих ранах до начала лечения и на 5-е, 10-е и 15-е сутки после трансплантации аллогенного ЕвР-содержащего эпидермиса».

Иммуногистохимические маркеры В ране до трансплантации 6-есутхм после трансплантации 10-е сутки после трансплантации 15-е сутки после трансплантации

bFGF -/+ ++ ++ ++

TCF-P - ++ + /++ +

IL-ip +++ ++ + +

MIP-1a -/+ + + -1+

MIP-1P ++ + + -/+

ММР-9 ++ + + +

TIMP-1 -/+ + +

TIMP-2 -/* -/+ + +

Критерии оценки: « - » - реакция отсутствует, «-/+»- слабоположительная реакция, « + », « ++ », « +++ » - степени выраженности положительной реакции.

Анализируя полученные результаты, можно сказать, что все изученные случаи ДЫР характеризуются значительными нарушениями со стороны внеклеточного матрикса с выраженным дисбалансом в соотношениях составляющих его компонентов.

Снижение содержания коллагена 111 типа было выявлено во всех изученных биоптатах, при этом количество коллагена I типа оставалось неизменным также во всех случаях. В нормальной дерме на коллаген III типа приходится приблизительно 15% от общего числа коллагеновых волокон, основной его функцией является обеспечение механической прочности и эластичности дермы. Кроме того, взаимодействуя с интегриновыми рецепторами, коллагеновые волокна могут влиять на функциональную активность клеточного микроокружения, и, в первую очередь, на синтетическую активность дермальных фибробластов, приводя к изменению спектра синтезируемых ими компонентов внеклеточного матрикса. Обладая меньшей, чем коллаген I типа, устойчивостью к действию протеолитических ферментов, коллаген III типа быстрее деградирует при развитии ДНР что, в сочетании со сниженной синтетической функцией фибробластов, обусловливает характерный для ДНР дисбаланс компонентов ВКМ.

Изменения структуры ВКМ в ДНР также проявляются накоплением в строме тенасцина и плазменного фибронектина, изменением локализации ламинина. Ламинин -один из основных гликопротеидов базальной мембраны, выполняющий роль адгезивного субстрата для различных эпителиальных и мезенхимальных клеток, в больших количествах выявлялся в стенках кровеносных сосудов и диффузно откладывался в матриксе незрелой грануляционной ткани раны и в прилегающей дерме.

Тенасцин, гликопротеид ВКМ, выявляющийся преимущественно в эмбриональной ткани, а так же в ограниченных количествах входящий в состав неизмененной кожи, в значительных количествах обнаруживался в области раны. Интенсивное накопление тенасцина, который проявляя антиадгезивные свойства, в норме способствует миграции клеток и обеспечивает неоангиогенез и формирование грануляционой ткани, в случае развития ДНР препятствует нормальным клеточно-матриксным взаимодействиям, что также свидетельствует о неполноценности формируемой соединительной ткани.

Одной из возможных причин нарушения синтетической функции фибробластов, приводящей к формированию в ДНР незрелой соединительной ткани, является изменение спектра экспрессируемых цитокинов и факторов роста. В проведенном исследовании было выявлено практически полное отсутствие положительного иммунопероксидазного окрашивания с антителами к TGF-p, одному из основных фиброгенных факторов роста; также в большинстве случаев наблюдалось выраженное снижение экспрессии bFGF. Известно, что bFGF, являясь хемоаттракгантом для фибробластов, также способен регулировать пролиферативную активность, синтез компонентов ВКМ, трансформацию в миофибробласты. Не менее важным для формирования полноценной соединительной ткани является присутствие TGF-J3,: помимо

активации синтеза компонентов ВКМ, TGF-ß-, ингибирует продукцию протеолитических ферментов, активирует синтез ингибиторов протеаз, повышает уровень экспрессии поверхностных клеточных рецепторов.

Следует отметить, что наблюдаемое снижение интенсивности иммунопероксидазного окрашивания с антителами к факторам роста может быть обусловлено не только угнетением их синтеза, но также и повышенной их утилизацией.

Кроме дефицита факторов роста в ДНР было обнаружено повышение интенсивности иммунопероксидазной реакции при выявлении провоспалительных цитокинов - \L-1ß и MIP-1ß,

М1Р-1а и MIP-1ß - цитокины, являющиеся хемоаттрактантами для мононуклеарных лейкоцитов. Известно, что М1Р-1а оказывает более выраженное влияние на миграцию мононуклеарных фагоцитов в очаг воспаления, чем MIP-1 р. В некоторых случаях М1Р-1а и М1Р-1 р могут проявлять противоположное действие, т.е. угнетать миграцию моноцитов/макрофагов. В проведенном исследовании было выявлено повышение экспрессии MIP-1ß в ДНР, при этом экспрессия М1Р-1а в большинстве случаев была выражена слабо, что, вероятно, свидетельствует о рассогласовании систем, ответственных за регуляцию миграции клеток воспалительного инфильтрата в очаге повреждения.

Все случаи ДНР характеризовались повышенной интенсивностью иммунопероксидазной реакции с антителами к IL-1ß - провоспалительному цитокину, который синтезируется большинством клеток организма. В литературе описана способность IL-1ß стимулировать пролиферацию фибробластов и активировать синтез различных матриксных молекул [Raines E.W. с соавт., 1989]. Возможно, с увеличением экспрессии IL-1ß, в сочетании с изменением профиля синтеза других цитокинов и .факторов роста, связано повышение содержания в ВКМ ламинина и плазменной формы фибронекгина, а также аккумуляция тенасцина при развитии ДНР, однако данное предположение требует подтверждения.

Неполноценность формируемого в области раны внеклеточного матрикса так же связана с повышенной концентрацией протеиназ и снижением синтеза их ингибиторов, что в итоге обусловливает дисбаланс в процессе реорганизации внеклеточного матрикса со смещением в сторону повышенной утилизации компонентов ВКМ [Cook Н. с соавт., 2000; Wysocki A.B. с соавт., 1999]. В нашем исследовании мы наблюдали повышение экспрессии ММР-9 в сочетании со снижением выявления TIMP-1 и TIMP-2.

Некоторыми исследователями была продемонстрирована возможность ММР-9 (желатиназы V типа) принимать участие в утилизации интерстициальных коллагенов, однако основным субстратом для ММР-9 является коллаген IV типа, входящий в состав базальных мембран. Высокий уровень содержания ММР-9, в сочетании с дефицитом ингибиторов протеаз (TIMP-1/T1MP-2) возможно является причиной замедления или

отсутствия реэпителизации ДНР, что обусловлено повышенной деградацией одного из основных компонентов базальной мембраны.

Кроме того, высокая активность в ДНР протеолитических ферментов, и в первую очередь сериновых и матриксных металлопротеиназ, в сочетании с недостатком их ингибиторов, может являться причиной повышенной утилизации различных цитокинов и факторов роста, тем самым обусловливая их дефицит и в сочетании с другими факторами, приводя к развитию длительно протекающего, функционирующего по принципу «порочного круга», патологического процесса.

Типичное для ДНР хроническое воспаление в изученных нами случаях также имело свои характерные особенности: воспалительный инфильтрат в подавляющем большинстве случаев состоял из клеток моноцитарно/макрофагального ряда (CD68* клетки), и только в некоторых случаях в составе инфильтрата определялись CD4 и CD8 -положительные лимфоциты (Т-хелперы и Т-супрессоры соответственно). Преобладание в воспалительном инфильтрате моноцитов/макрофагов возможно связано с описанными выше нарушениями в системе хемоаттрактантных белков (MIP-1a I М1Р-1|3). Кроме того, мононукпеарные фагоциты являются одним из основных источников провоспалительных цитокинов и некоторых протеолитических ферментов, поэтому их постоянная повышенная активность в зоне повреждения также может являться причиной замедления репаративных процессов в ране.

Практически все исследованные нами случаи возникновения ДНР характеризовались небольшим количеством миофибробластов в области раны. Как известно, в норме миофибробласты, отличительной чертой которых является синтез большого количества aSMA что делает их сходными с гладкомышечными клетками, ответственны за контракцию раны и принимают активное участие в регуляции заживления кожных ран [Moulin V. с соавт., 2000]. Кроме того, Gabbiani G. с соавт., 2001, продемонстрировал прямую зависимость между количеством миофибробластов в ране и развитием рубца на месте раневого дефекта, что указывает на возможное участие миофибробластов в регуляции синтеза компонентов ВКМ. Обнаруженное в наших исследованиях уменьшение количества миофибробластов и связанное с этим отсутствие контракции также является одной из особенностей длительно незаживающих ран.

Следует отметить, что описанные выше изменения выявлялись во всех изученных случаях ДНР, включавших в себя как трофические язвы, развившиеся на фоне варикозной болезни вен нижних конечностей, так и раны, развившиеся в результате термического, либо химического поражения кожных покровов, травматического воздействия и под влиянием инфекционных агентов. Значимых различий в структуре ВКМ, соотношениях клеток воспалительного инфильтрата, уровнях интенсивности иммунопероксидазного окрашивания при выявлении факторов роста, цитокинов, компонентов системы матриксных протеиназ и их ингибиторов выявлено не было,

несмотря на существенные различия этиологических факторов, приводивших к развитию ДНР. Исходя из полученных данных, можно предположить, что все ДНР, вне зависимости от причин, обусловивших их возникновение, имеют сходные механизмы развития и характеризуются стереотипными нарушениями в системе клеточных и клеточно-матриксных взаимодействий.

Использование аллогенного криоконсервированного эпидермиса активизирует процессы ремоделирования ВКМ в ране - на 5-е сутки после трансплантации при иммуногистохимическом исследовании было обнаружено увеличение содержания коллагена III типа в сочетании со снижением накопления тенасцина в области раны. Кроме того, наблюдалось перераспределение ламинина, который входил в состав формирующейся в зоне контакта с БП провизиональной базальной мембраны, а также положительная иммунопреоксидазная реакция в стенках кровеносных сосудов при выявлении мерозина (Ламинин-2). Появление в сосудистой стенке мерозина является маркером созревания кровеносных сосудов, и, как правило, сочетается с повышением экспрессии ангиогенных факторов роста (VEGF) и увеличением синтеза протеаз, участвующих в процессах неоангиогенеза. Vitolo D. с соавт., 2001, экспериментально продемонстрировали регулирующее влияние EGF на экспрессию мерозина в стенках кровеносных сосудов.

К 15-м суткам после трансплантации соотношение компонентов ВКМ в ДНР было близким к норме, тенасцин обнаруживался в субэпителиальной зоне, что было обусловлено участием в процессах миграции кератиноцитов. Ламинин выявлялся в составе эпителиальной базальной мембраны, которая также включала коллагены IV и VII типов, что соответствует норме.

Параллельно с восстановлением базальной мембраны начинается процесс реэпителизации раны собственными кератиноцитами, имеющими нормальный фенотип. О высокой активности процессов пролиферации можно судить по повышенному уровню экспрессии Ki-67 в базальных слоях эпидермиса, располагающегося под остатками частично лизированного аллодермотрансплантата.

Трансплантация БП на рану вызывала значительные изменения в распределении цитокинов и факторов роста в области раны. К 5-м суткам после трансплантации отмечалось увеличение интенсивности иммунопероксидазной реакции при выявлении всех исследуемых факторов роста, что по времени совпало с началом процесса активного ремоделирования ВКМ и формирования базальной мембраны. К 10-м - 15-м суткам отмечалось снижение выраженности реакции с антителами к TGF-pf. Интенсивность реакции с антителами к bFGF оставалась при этом несколько повышенной. Параллельно с увеличением продукции факторов роста отмечалось снижение содержания провоспалительных цитокинов, интенсивность

иммунопероксидазного окрашивания которых к 10-м суткам соответствовала выраженности реакции в контрольных нормально заживающих кожных ранах.

Повышенная интенсивность иммунопероксидазного окрашивания с антителами к ММР-9, наблюдавшаяся в ДНР, после трансплантации БП постепенно уменьшалась, нормализовавшись к 10-м суткам. Одновременно в области раны повышалось содержание TIMP-1 и TIMP-2, достигнувшее нормы также к 10-м суткам. Изменение соотношения ММР-9 и ингибиторов металлопротеиназ по времени совпало с формированием полноценной базальной мембраны и реэпителизацией раны, что подтверждает наличие прямой зависимости между протеазной активностью в длительно незаживающих ранах и темпами восстановления базальной мембраны и реэпителизацией раневого дефекта.

Экспрессия VLA-2 (a2Pi - интегринов) и VLA-6 (a6Pi - интегринов), являющихся рецепторами к коллагену и ламинину, на поверхности кератиноцитов и фибробластов, так же свидетельствует о восстановлении нормальных стромально-эпителиальных взаимодействий в ДНР после трансплантации БП.

Большой интерес представляет выявление в строме фибробластоподобных клеток, демонстрирующих позитивное иммунопероксидазное окрашивание при исследовании с антителами к цитокератинам 10/13 типов - внутриклеточным промежуточным микрофиламентам, являющимся специфическими маркерами эпителиальных клеток, и с-МЕТ - клеточному рецептору к HGF, также характерному для эпителиальных клеток. Можно предположить как минимум два варианта появления в строме клеток, имеющих фенотипические признаки фибробластов и экспрессирующих эпителиальные маркеры. Одной из причин может являться сохранение в ране отдельных низкодифференцированных клеток базальных слоев предсуществовавшего эпидермиса, которые сохранили способность к пролиферации и дифференцировке в условиях ДНР.

Другим вариантом является трансдифференцировка, заключающаяся в приобретении эпителиальными клетками признаков, характерных для клеток мезенхимального происхождения. Данный феномен неоднократно описывался в литературе. Fan J. с соавт., 2001, сообщает о наблюдении in vitro трансдифференцировки клеток эпителия почечных канальцев, которые под воздействием IL-1 через TGF-p,-опосредованный механизм приобретали миофибробластоподобный фенотип. Трансдифференцировка эпителия почечных канальцев в фибробластоподобные клетки, способные к продукции компонентов ВКМ, может также происходить под воздействием EGF и bFGF. Funderburg J. с соавт., 2001, сообщает о способности кератоцитов приобретать под воздействием TGF-f5, фенотип, сходный с фенотипом миофибробластов, и синтезировать широкий спектр компонентов ВКМ, отличный от продуцируемого в норме.

Для подтверждения как первого, так и второго предположений необходимо проведение дальнейших исследований с применением более точных молекулярно-

генетических методов для определения происхождения этих клеток и изучения их роли в патогенезе длительно незаживающих ран и влияния на репаративные процессы.

Количество миофибробластов в ране после трансплантации БП не увеличилось по сравнению с ДНР до начала лечения и оставалось неизменным в течение всего периода заживления ран, что говорит об отсутствии контракции раневого дефекта. При этом во всех случаях заживление ран происходило без формирования рубца, что является отличительной особенностью репаративных процессов в ранах при применении БП. Кроме того, наблюдаемое отсутствие формирования рубцовой ткани на месте заживающей ДНР в сочетании с небольшим количеством раневых миофибробластов, подтверждает предположение об их влиянии на развитие рубца.

Проведенное исследование продемонстрировало основные особенности, характеризующие длительно незаживающие раны и специфику репаративных процессов в них. Подтверждена целесообразность применения биологически активных покрытий для лечения ДНР. Однако для более полного понимания механизмов, приводящих к развитию ДНР а также детального объяснения процессов, происходящих в ходе репаративной регенерации в ДНР необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий на молекулярно-генетическом уровне.

ВЫВОДЫ.

1. Длительно незаживающие раны характеризуются: наличием хронического воспаления, особенностью которого является преобладание в инфильтрате клеток моноцитарно/макрофагального ряда; повышенной экспрессией провоспалительных цитокинов (IL-1P, М1Р-1а/М1Р-1р) и нарушением их нормального соотношения; усилением экспрессии ММР-9 в сочетании с дефицитом TIMP-1 и TIMP-2; отсутствием экспрессии факторов роста (TGF-01, bFGF), стимулирующих продукцию компонентов внеклеточного матрикса.

2. Нарушение формирования в ДНР нормальной соединительной ткани проявляется снижением содержания коллагена III типа, накоплением тенасцина и плазменной формы фибронектина в строме, перераспределением ламинина, уменьшением количества миофибробластов в ране. Данные патологические изменения стереотипны для большинства ДНР вне зависимости от причин, обусловивших их возникновение, и свидетельствуют об идентичности механизмов развития и существования ДНР.

3. Репарация в ДНР характеризуется нормализацией состава внеклеточного матрикса - повышением содержания коллагена III типа, снижением аккумуляции тенасцина и плазменной формы фибронектина в строме; восстановлением баланса в экспрессии ММР-9 и ингибиторов матриксных металлопротеиназ;

увеличением продукции факторов роста (TGF-ß,, bFGF) и уменьшением экспрессии провоспалительных цитокинов (IL-1ß, MIP-1a/MIP-1ß). В зоне контакта трансплантата и подлежащего матрикса формируется провизиональная базальная мембрана, необходимая для восстановления эпителиального покрова.

4. Характерной особенностью репарации в длительно незаживающих ранах является сохранение в течении длительного времени инфильтрации области раны клетками моноцитарно/макрофагального ряда, а также минимальное количество миофибробластов в течении всего периода репаративной регенерации, обусловливающее отсутствие контракции раневого дефекта и формирование рубцовой ткани.

5. Закрытие поверхности длительно незаживающей раны аллогенным EGF-содержащим криоконсервированным эпидермисом является пусковым фактором для активизации репаративных процессов, инициализация которых происходит в неблагоприятных условиях повышенной протеиназной активности и дефицита факторов роста.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федоров Д.Н. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика репаративных процессов в длительно незаживающих ранах II Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Материалы II Российской конференции молодых ученых России с международным участием. 24-28 апреля 2001г, Москва. -М., 2001. - Том II. -С.56.

2. Ивашкин А.Н, Хрупкин В.И., Писаренко Л.В, Терских В.В., Васильев A.B., Федоров Д.Н. Использование криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов в лечении длительно незаживающих ран. II Военно-медицинский журнал. - 2001. - N4. - С.23 - 30.

3. Fedorov D., Ivanov A., Ivashkin A., Shinin V., Paukov V. The features of reparation of chronic cutaneous wounds //Virchows Arch. - 2001. - Vol.439, №.3 - P.368.

4. Ivanov A., Fedorov D., Shinin V., Vasiliev A., Paltsev M. The stromal-epidermal interaction in chronic wound healing//Virchows Arch. -2001. - Vol.439, №.3- P.370.

5. Федоров Д.Н., Ивашкин A.H., Шинин B.B., Васильев A.B., Иванов A.A. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика репаративных процессов в длительно незаживающих ранах //Арх. пат. - 2002,- N1 - С. 8 -11.

6. Иванов A.A., Федоров Д.Н., Васильев A.B., Ходжабекян Г.В., Ивашкин А.Н. Роль EGF-стимулированного эпидермиса в регуляции заживления ран // Арх. пат. - 2002.-N1 -С.11 -14.