Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Клинико-прогностическое значение маркеров системы протеолиза у больных язвенным колитом

На правах рукописи

Мазовка Карина Евгеньевна

КЛИНИКО-ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ СИСТЕМЫ ПРОТЕОЛИЗА У БОЛЬНЫХ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ

14.01.04 - внутренние болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

г о: :я 2014

г. Ростов-на-Дону-2014 г.

005555644

005555644

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Ткачев Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

Белоусова Елена Александровна - доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области Московский областной научно- исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского, заведующая кафедрой гастроэнтерологии ФУВ, главный гастроэнтеролог Московской области.

Павленко Владимир Васильевич - доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой пропедевтики внутренних болезней.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 19 декабря 2014 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.02 на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29.

С диссертацией можно ознакомиться на сайте http ://www.rostgmu.ru и в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан «J^>> 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Беловолова P.A.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) остаются одной из наиболее сложных проблем в области гастроэнтерологии, что обусловлено тяжестью течения, частотой осложнений, высокой летальностью, а также неуклонным ростом распространённости и заболеваемости язвенного колита (ЯК) в структуре патологии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (Белоусова Е.А. с соавт.,2010, Халиф И.Л., 2011, Барановский А.Ю. с соавт., 2013).

За последние десятилетия достигнут очевидный прогресс в понимании патогенеза и подходов к лечению ЯК. Тем не менее, количество нерешенных вопросов продолжает расти, поскольку этиология заболевания до сих пор остается неизвестной. Благодаря многочисленным фундаментальным исследованиям в изучении ВЗК можно говорить об участии в патогенезе изменений эпителиальной клеточной функции, лейкоцитарно эндотелиального взаимодействия, цитокинов, хемокинов, факторов роста, генетической предрасположенности (Румянцев В.Г., 2009, Агафонов В.Е. с совт.,2011, Окороченков С.А. с соавт., 2012, Павленко В.В. с соавт., 2013).

До конца не изученными остаются механизмы формирования воспаления в кишечнике, а, следовательно, и нарушения функционального состояния органа. Процессы повреждения и репарации слизистой оболочки контролируются тремя основными группами регуляторных белков: факторами роста, цитокинами и матриксными металлопротеиназами (ММП) (Inoue S., et al., 1999, Kruidenier L. et al., 2003, Румянцев В.Г., 2009). Известно, что ММП являются одними из основных ферментов системы протеолиза и принимают участие в различных физиологических и патологических процессах, таких как повреждение печени, канцерогенез, патология сердечно-сосудистой системы, ВЗК и т.д. (Nagase H., 1997, Adamson I.Y., 2003, Jin Won Huh M.D., 2008, McKeown S., 2009, Nanni S., 2007, Tchetverikov I., 2003, Mohammed F.F.,2003, Турна A.A., 2010). Установлено, что

протеолитическая активность ММП регулируется балансом между активацией и подавлением проферментов посредством эндогенных субстратов, таких как альфа2-макроглобулин и тканевыми ингибиторами ММП (ТИМП), которые представлены ТИМП-1, ТИМП-2, ТИМП-3, ТИМП-4 (Sternlicht M.D. et al., 2001).

По данным Ravi A. et al. (2007) ММП оказывают большое влияние на патогенез ВЗК. Такие ММП, как ММП-2, ММП-3, ММП- 7, ММП-МТ-1 экспрессируются постоянно и выполняют защитную роль при ВЗК посредством воздействия на клеточный гомеостаз. В тоже время, ММП-1, ММП -8, ММП -9, ММП-10, ММП- 12, ММП-13, в слизистой оболочке толстой кишки в норме не определяются. Вместе с тем, повышение их активности влияет на адгезию клеток, миграцию иммунных клеток и процессы репарации. Дисбаланс между провоспалительными, противовоспалительными ММП и ТИМП ведет к нарушению защитной функции кишечника, что вызывает впоследствии развитие воспаления, образование язв (Ravi А., 2007). Это обстоятельство определяет необходимость совместной оценки уровня экспрессии ММП и их ингибиторов, так как значение для протеолиза имеет нарушение баланса «протеаза/ингибитор» (Nagase Н. et al., 1999).

На протяжении последних лет активно изучалась активность ММП и ТИМП в клинико - экспериментальных условиях. Вместе с тем, участие ферментов системы протеолиза при ВЗК, в частности ЯК, мало изучено.

При ВЗК исследовали ММП-1 ММП-3, ТИМП-1, а также соотношение ММП-1/ТИМП-1 и ММП-З/ТИМП-1 (Castañeda F.E. et al., 2005, von Lampe В., 2000, Medina С. et al., 2006). В литературе имеются данные о роли ММП-9 при различных заболеваниях, таких как астма, ревматоидный артрит, атеросклероз, НПВС-индуцированные гастропатии. При ВЗК ММП-9 является протеазой, которая в большом количестве продуцируется клетками воспаления, преимущественно полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПМЯЛ) (Baugh M.D, 1999), специфическим ингибитором ММП-9 является ТИМП-1

(Lichtinghagen R. et al., 2003). По данным Castañeda F.E. et al. (2005) эпителиальная ММП-9 увеличивает степень повреждения ткани при колитах. С другой стороны, у мышей с дефицитом ММП-9 выявляется менее тяжелое повреждение слизистой оболочки, индуцированное декстран сульфатом натрия или Salmonella typhimurium (Castañeda F.E. et al., 2005). Тем не менее, полученных данных об участии ММП-9 в патогенезе Ж недостаточно для получения целостной картины.

Таким образом, изучение активности ММП и их ингибирования у пациентов с ЯК представляет научно-практический интерес, так как позволит в перспективе дополнить диагностические критерии прогнозирования течения заболевания и создать теоретические предпосылки для разработки новых мишеней лекарственной терапии. Цель исследования

Определить клиническое, диагностическое и прогностическое значение матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в слизистой оболочке толстой кишки у больных язвенным колитом. Задачи исследования

1. Определить экспрессию матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки у больных язвенным колитом в зависимости от активности заболевания и распространенности воспалительного процесса у больных.

2. Определить соотношение матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки, диагностическую и прогностическую значимость для оценки активности и тяжести течения язвенного колита.

3. Изучить взаимосвязь между уровнями экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки у больных язвенным колитом и клинико-эндоскопическими и морфологическими характеристиками заболевания.

4. Провести сравнительный анализ показателей экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1, их соотношения в слизистой оболочке толстой кишки у больных язвенным колитом и при функциональной патологии толстой кишки - синдроме раздражённой кишки.

5. Усовершенствовать алгоритм диагностики язвенного колита с использованием протеолитических маркеров прогноза риска рецидива и достижения клинико-эндоскопической и гистологической ремиссии у больных язвенным колитом.

Научная новизна

Впервые определено патогенетическое значение матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки у больных язвенным колитом в зависимости от тяжести течения и активности заболевания.

Впервые установлено, что дисбаланс между показателями экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки при язвенном колите связан с активностью заболевания.

Впервые на основании показателей экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 установлено их соотношение в слизистой оболочке толстой кишки у больных с язвенным колитом в разные фазы течения заболевания.

Определены показатели экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1, которые позволяют прогнозировать риск развития рецидива язвенного колита и дополняют возможность оценки достижения клинико - эндоскопической и гистологической ремиссии заболевания.

Впервые показаны различия экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения у пациентов с язвенным колитом и синдромом раздраженной кишки. Практическая значимость

Показаны изменения экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в зависимости от тяжести течения и активности язвенного колита.

Разработаны критерии тяжести течения, активности заболевания и достижения клинико-эндоскопической и гистологической ремиссии язвенного колита с использованием оценки показателей ферментов системы протеолиза (матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1) в слизистой оболочке толстой кишки.

Установлены показатели, позволяющие прогнозировать рецидив язвенного колита, а также тяжесть течения заболевания, в основе которых лежит определение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения в слизистой оболочке толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При рецидиве язвенного колита повышена экспрессия матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки, коррелирующая с тяжестью течения заболевания. Увеличение активности язвенного колита сопровождается нарастанием экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки.

2. Определение соотношения матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке толстой кишки позволяет уточнить активность заболевания и ремиссию язвенного колита. При рецидиве язвенного колита отмечается увеличение отношения

показателя экспрессии матриксной металлопротеииазы 9 к тканевому ингибитору матриксной металлопротеииазы 1 в слизистой оболочке толстой кишки.

3. Показатели экспрессии матриксной металлопротеииазы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеииазы 1, полученные на основании математической модели, позволяют прогнозировать риск развития рецидива язвенного колита и дополняют возможность оценки достижения клинико -эндоскопической и гистологической ремиссии. Личное участие автора

Личное участие автора осуществлялось на всех этапах выполнения диссертационной работы и включало: отбор пациентов, проведение клинического обследования, первичную обработку полученного материала, его систематизацию и статистическую обработку, написание статей в профильные научные журналы. Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендуемых ВАК. Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на Конференциях Южного Федерального Округа «Проблемы клинической Гастроэнтерологии», «Клинические перспективы гастроэнтерологии и гепатологии. Совершенствование оказания медицинской помощи больным с заболеваниями органов пищеварения» (г. Ростов-на-Дону, 2013), II и III межрегиональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов «Интернист» (г. Ростов-на-Дону, 2013, 2014). Внедрение результатов работы в практику

Материалы и результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре пропедевтики внутренних болезней, кафедре общеврачебной практики (семейной медицины) с курсами гериатрии и физиотерапии ФПК и ППС ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

Результаты работы внедрены в практику работы терапевтического отделения МБУЗ «Городской больницы №20 г. Ростова-на-Дону» и гастроэнтерологического отделения ГБУ РО Ростовская областная клиническая больница. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы, иллюстрирована 12 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Указатель литературы включает 287 источников, из них 28 отечественных и 259 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выполнено открытое клиническое исследование, в которое после подписания информированного согласия были включены 86 человек, из них 54 (63%) пациента с ЯК (1 группа), 17 (20%) пациентов - СРК с диареей вариант (СРК-Д) и 15 (17%) здоровых добровольцев (контрольная группа). В группе больных с ЯК возраст колебался от 21 до 61 года, средний возраст составил 40,0 ± 12,7 года, у пациентов с СРК-Д - 26,4 ± 6,1 лет, у здоровых добровольцев- 41,7 ± 13,4 года.

На первом этапе проводилась верификация диагноза. Пациентам с ЯК выполнялось эндоскопическое исследование толстой кишки с забором биопсийного материала для последующего морфологического исследования, что позволило оценить распространённость и тяжесть воспалительного процесса, и общеклинические исследования, которые включали показатели системной воспалительной реакции (определение уровня лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ, фибриногена, С - реактивного белка в сыворотке крови). Диагноз СРК-Д устанавливался на основании Римских критериев III с учетом результатов колоноскопии, морфологического исследования колонобиоптатов и общеклинических исследований. Для исключения инфекционной природы патологического процесса всем пациентам

выполнялось микробиологическое исследование содержимого толстой кишки. Здоровые добровольцы, у которых после проведенных клинико-лабораторных и инструментальных исследований патологии не выявлено, составили контрольную группу.

Использование индекса активности ЯК по Мэйо позволило выделить группу больных ЯК в стадии обострения (38 (70%) человек), внутри которой оценивалась тяжесть течения заболевания: легкая степень тяжести- 7 (13%) пациентов, средняя - 8 (15%) пациентов,- тяжелое течение- 23 (42%) пациента, и группа больных ЯК в стадии ремиссии (16 (30%) человек). Распространённость воспалительного процесса оценивалась у всех пациентов с ЯК: проктит- 12 (22%) пациентов, левосторонняя форма- 21 (39%) пациентов, тотальная форма- 21 (39%) пациентов. Также в оценке активности ЯК использовались клинический и эндоскопический индекс Рахмилевича, индекс Мэйо- 8сИгоес1ег и гистологический индекс активности заболевания.

На втором этапе всем категориям пациентов и здоровым добровольцам было проведено специальное исследование, которое включало в себя определение экспрессии ММП-9 и ТИМП- 1 в СО сигмовидной и прямой кишки. Экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки оценивали полуколичественно иммуногистохимическим методом (от 0 до 4 баллов) с использованием поликлональных кроличьих антител к ММП-9 и моноклональных мышиных антител к ТИМП-1 (фирма Бако, Дания).

На третьем этапе был проведен анализ полученных данных (клинико -эндоскопических проявлений ЯК, результатов морфологического исследования СО толстой кишки, результатов специального исследования) посредством статистического анализа с применением пакета «БТАТКТЮА 11». Результаты проведенного исследования представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (М±80), медианы, нижней и верхней квартили (Ме, Q0.25-Q0.75)- Проверка нормальности распределения осуществлялась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения групп пациентов по количественным или порядковым показателям использовались И-

критерий Манна — Уитнн и критерий Краскала — Уоллиса. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. Корреляции с участием порядковых показателей оценивались коэффициентом ранговой корреляции Спирмена. Оценку чувствительности, специфичности и прогностической значимости изучаемых специальных исследований (ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки) проводили посредством анализа ROC- кривых и AUC для каждого показателя и использования соответствующих формул. При проведении анализа ROC-кривых на основании соотношения чувствительности и специфичности были определены диагностические пороги разделения, при превышении которых вероятность формирования обострения заболевания повышалась. Модели прогноза были построены на основе множественной логистической регрессии, коэффициенты для которой рассчитывали методом Ньютона и путем использования метода множественной регрессии.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что ММП-9 считается одной из ключевых субстанций в повреждении ткани при ВЗК (Pender S.L.,2000, Pender S.L., 2004), что подтверждается данными о том, что ММП-9 нокаутные мыши являются устойчивыми для различных видов воспаления (Castañeda F.E. et al, 2005, Medina С. et al. 2003, Medina C. et al., 2006).

В проведенной работе установлено отсутствие экспрессии или слабая экспрессия исследуемой протеазы (0,0(0,0-0,0)) и ее ингибитора (0,0(0,0-0,0)) в СО толстой кишки в группе здоровых добровольцев, что, вероятно, объясняется отсутствием нейтрофилов, а в одиночных макрофагах количество фермента так мало, что практически не верифицировалось, что соответствует данным, представленным в литературе (Ravi A. et al.,2007).

У всех пациентов ЯК отмечалось повышение экспрессии ММП-9 в СО сигмовидной и прямой кишки (рисунок 1,2). Наибольшее увеличение экспрессии ММП-9 в СО и сигмовидной, и в прямой кишки

регистрировалось у пациентов с тяжелым течением заболевания (3,0 (3,04,0)/ 4,0 (3,0-4,0)), при этом максимально интенсивная экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 отмечалась в зоне более тяжелых изменений СО - крипт-абсцессов, эрозий, язв. При среднетяжелом (3,0(3,0-3,0) и легком 3,0(2,0-3,0) течении заболевания выраженная экспрессия ММП-9 в СО сигмовидной и прямой кишки выявлялась в цитоплазме ПМЯЛ в зоне эрозии, язв и крипт -абсцессов, грануляций, в меньшей степени - в цитоплазме ПМЯЛ, расположенных диффузно в собственной пластинке СО, в области криптита (р< 0,05) (рисунок 1,2). Также, отмечалась умеренная экспрессия ММП-9 в межклеточном веществе эрозий и язв, что, вероятно, объясняется активностью воспаления, связанной с дегрануляцией и гибелью нейтрофилов с высвобождением ММП-9. В группе пациентов с ЯК в стадии ремиссии регистрировался более низкий уровень экспрессии ММП-9 (1,0 (1,0-2,0) / 1,0 (1,0-2,0)) (рисунок 1,2), в основном в цитоплазме ПМЯЛ и макрофагов с преимущественной локализацией под покровным эпителием и в одиночных клетках - диффузно в собственной пластинке СО. Экспрессия ММП-9 в межклеточном веществе не выявлялась, так как отсутствовали эрозии и язвы.

4.5 -.-,___,_

4.0

3.5

3.0 -II-

2.5

Z

I 2,0 -

ш

1.5

1.0 ■ -.I— _р

0.5

0.0

Пациенты с ЯК. обострение Заоро>ые добро.ольцы ..

Пациенты с ЯК. ремиссий n Median

025*-75%

Д"*™« iMin-Max

Рис. 1. Экспрессия ММП-9 в СО сигмовидной кишки в зависимости от стадии заболевания

4.5 -.-.-1-

4.0 —i—

3.5 ■

3.0 ■ -II-

2.5

3

i 2,0 —I— -

Ш

1.5

1.0 ■ -в--—j—

0,5 ■

□ --

Пациенты с ЯК, обострение Здоро»ые доброюльцы Q Median

Пациенты с ЯК, ремиссия []25%75%

Диагноз XMin-Max

Рис. 2. Экспрессия ММП-9 в СО прямой кишки в зависимости от стадии заболевания

Следовательно, можно говорить о том, что экспрессия ММП-9 зависит от степени активности ЯК и увеличивается по мере нарастания тяжести заболевания и выраженности воспалительных изменений в СО толстой кишки.

Представленные данные являются основанием, для использования показателей экспрессии данной протеазы и ее ингибитора в оценке степени активности воспаления. Наиболее информативным является изучение экспрессии ММП-9 в СО прямой кишки, подтверждением чего служит более высокий уровень статистической значимости различий данного показателя при его оценке в вышеуказанном отделе кишечника (р<0,00002) по сравнению с сигмовидной кишкой (р<0,00005) у больных ЯК в стадии обострения и ремиссии.

В норме ММП связываются с ТИМП в соотношении 1:1, образуя нековалентные стехиометрические комплексы (Соловьева Н.И., 1998, Zitka О. et al., 2010). По данным von Lampe В. et.al (2000) увеличение уровня ММП-1 и ММП-3 сопровождается умеренным увеличением уровня ТИМП-1

(von Lampe В.,2000), изменяя соотношение ММП/ТИМП, что, возможно, создает условия для повреждения ткани. Данных, касающихся ММП-9 и ТИМП-1 и их соотношения, в доступной нам литературе обнаружено не было.

Экспрессия ТИМП-1 в СО сигмовидной (2,0(2,0-3,0)) и прямой (2,0(2,0-3,0)) кишки в группе больных Ж в стадии обострения была повышена, менее интенсивная экспрессия ингибитора (1,0 (0,0 - 1,0)) отмечалась в группе пациентов ЯК в стадии ремиссии (Рисунок 3,4).

В группе пациентов ЯК в стадии обострения умеренная экспрессия ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки наблюдалась в ПМЯЛ и макрофагах в зоне эрозий, язв, крипт-абсцессов, слабая - в межклеточном веществе в зоне эрозий и язв, что, вероятно объясняется теми же причинами, что и экспрессия ММП-9 в этих клеточных элементах. В группе пациентов ЯК в стадии ремиссии преимущественно слабая экспрессия ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки отмечалась в цитоплазме ПМЯЛ и макрофагов с преимущественной локализацией под покровным эпителием и в одиночных клетках - диффузно в собственной пластинке СО. Экспрессия ТИМП-1 в межклеточном веществе практически не выявлялась, так как отсутствовали эрозии и язвы в СО толстой кишки.

При проведении исследования была отмечено, что у больных с рецидивом ЯК ММП-9 на 1 балл превышает экспрессию ингибитора в СО сигмовидной и прямой кишки. С учетом известных свойств ММП-9 наиболее выраженной экспрессия выявлялась в ПМЯЛ, макрофагах и межклеточном веществе зоны эрозий и язв. Преобладание экспрессии ММП-9 над ТИМП-1 частично объясняет механизм развития эрозий и язв, а, следовательно, и тяжесть течения и прогноз развития рецидива ЯК. Так же отмечалась выраженная экспрессия ММП-9 в грануляционной ткани в дне язв СО толстой кишки, что подтверждает ее участие в репаративных процессах, и, вероятно, отражает механизм возникновения дефектов СО толстой кишки у этой категории пациентов.

Пйци*ктм в ЯК. *Оостр«нм«

П1ЦМ«МТМ в ЯК. м*иеси*

Д)«ми

0 и.й.дг.

»вброю!»»!»!

1 М.»Ми

Рис. 3. Экспрессия ТИМП-1 в СО сигмовидной кишки в зависимости от стадии заболевания

4А 4Д ЗА ЗА ЗА ЗА 1А 1.0 О А ОА

п«цмити с ЯК. »еостр»«« Э*ор»|м| до<ре|«л»ц» 0 м,<>4„

П.«»«-п. • ЙК. >••>«•• П

Дх'ГКМ 1МЫМ«

Рис. 4. Экспрессия ТИМП-1 в СО прямой кишки в зависимости от стадии заболевания

При оценке экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки в группе больных ЯК у мужчин и женщин статистически значимых различий не выявлено (р > 0,05).

При анализе экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки с различными формами заболевания (тотальной, левосторонней, проктитом) статистически значимых различий не выявлено (р > 0,05).

В работах ряда авторов было выявлено, что соотношение между ММП-1 : ТИМП-1 и ММП-3 : ТИМП-1 увеличивается в участках воспаления СО толстой кишки у пациентов с ВЗК (Castañeda F.E. et al., 2005 , von Lampe В . et al., 2000, Medina C., 2006).

Важным аспектом нашей работы явилось определение соотношения ММП-9 : ТИМП-1 в СО толстой кишки у больных ЯК в различные стадии заболевания, которое было выполнено впервые у данного контингента больных. Установлено, что соотношение показателей ММП-9 : ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки у больных с рецидивом ЯК составляет 1,5 : 1, что свидетельствует о дисбалансе экспрессии протеазы и ее ингибитора. У пациентов с ремиссией ЯК соотношение ММП-9 : ТИМП-1 -1:1. Можно предположить, что одним из факторов, влияющих на выраженность воспалительного процесса, тяжесть заболевания, а также продолжительность ремиссии и возникновение рецидива заболевания является баланс между ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки. Баланс этих показателей у больных с ЯК в стадии ремиссии при ее оценке с использованием индекса гистологической активности свидетельствует о разрешении активного воспалительного процесса в СО толстой кишки при наличии сохраняющихся признаках хронического воспаления, что обуславливает назначения поддерживающей терапии на длительный период времени (Румянцев В.Г., 2009).

Были изучены корреляционные связи между клиническим, эндоскопическими, лабораторными данными и показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО прямой и сигмовидной кишки.

Наиболее выраженная связь выявлена между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной, прямой кишки и индексом Мэйо, соответственно (г Е [0,75; 0,63],г G [0.74;0.55], р<0,05)). Коэффициенты

корреляции при определении взаимосвязи экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО прямой кишки с индексом Мэйо (г 6 [0,75; 0,70], г 6 [0.60; 0,55]) были выше по сравнению с индексом Рахмилевича (г £ [0,70; 0,70], г £ [0,60; 0,59]), соответственно, (р<0,05), что свидетельствует о том, что именно применение индекса Мэйо наиболее достоверно отражает активность заболевания. Корреляция между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной (г Е [0,73; 0,57]) и прямой кишке (г £ [0.53; 0.70]) и индексом эндоскопической активности по Рахмилевичу является выраженной и сопоставима с показателями корреляции с индексом Мэйо (р<0,05). Так, наиболее высокие коэффициенты корреляции были установлены для показателей повреждения СО толстой кишки (г £ [0.68; 0.56], г £ [0,73; 0.57]), затем - изменений сосудистого рисунка г £ [0.47; 0.34], г £ [0,47; 0.16]), и ранимости СО (г £ [0.47; 0.31], г £ [0,33; 0.41]), соответственно (р<0,05). Надо отметить, что взаимосвязь между показателями экспрессии ММП-9 в сигмовидной кишке и эндоскопическим индексом Рахмилевича была выше, чем в прямой кишке. В тоже время, значения коэффициентов для показателей экспрессии ТИМП-1 и вышеуказанного индекса были выше в прямой кишке по сравнению с сигмовидной кишкой. Более выраженная взаимосвязь была установлена между показателями экспрессии ММП-9 в колонобиоптатах и показателями индекса гистологической активности, связь между показателями ТИМП-1 в исследуемых отделах кишечника носила менее выраженный характер. Более высокие коэффициенты корреляции были выявлены между исследуемыми протеазами и следующими показателями индекса гистологической активности: активным и хроническим воспалением. Корреляция между показателями экспрессии ММП-9 в СО сигмовидной, прямой кишки и активным воспалением составила г £ [0,69; 0,65], хроническим воспалением г £ [0,59; 0,60]), соответственно. При анализе корреляции экспрессии ТИМП-1 в сигмовидной и прямой кишке с гистологической активностью Ж также

была выявлена высоко - значимая прямая связь (активное воспаление г £ [0,64; 0,52], хроническое воспаление г £ [0,50; 0,49]), соответственно (р<0,05) (таблица 1).

Таблица 1

Взаимосвязь экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки и клинико-эндоскопическими проявлениями и гистологической активностью ЯК

Показатель Сигмовидная кишка Прямая кишка

ММП-9 ТИМП-1 ММП-9 ТИМП-1

Индекс Мэйо 0,75* 0,63* 0,77* 0,55*

Клинический индекс по 0,70* 0,60* 0,70* 0,59*

Рахмилевичу

Эндоско- Зернистость 0,09 0,02 0,09 0,21

пический Вид сосудов 0,47* 0,34 0,47* 0,16

индекс Ранимость 0,47* 0,31 0,33 0,41*

по СО

Рахмилевичу Повреждение СО 0,68* 0,56* 0,73* 0,57*

Индекс Активное 0,69* 0,64* 0,65* 0,52*

гистоло- воспаление

гической Хроническое 0,59* 0,50* 0,60* 0,49*

активности Воспаление

Деформация 0,32 0,23 0,34 0,27

крипт

Примечание: *-р<0,05

Установлено, что уровень экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 и в межклеточном веществе в зоне язв, в цитоплазме большинства макрофагов, ПМЯЛ, и в цитоплазме одиночных энтероцитов, а также их суммарный показатель, имели высоко-значимую (р<0,01) корреляцию между собой.

Для оценки связей между экспрессией ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки был проведен корреляционный анализ. Выявлена умеренная обратная связь с уровнем гемоглобина (г 6 [-0,44; -0,35]), между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной кишки (р<0,05). Корреляционной зависимости экспрессии ММП-9, ТИМП-1 в соответствующих отделах кишечника и уровня лейкоцитов, СОЭ установлено не было (р>0,05). Была выявлена высоко-значимая прямая связь

между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в сигмовидной (г е [0,55; 0,53]) и прямой кишке (г £ [0,54; 0,62]) и СРБ (р<0,05).

С целью прогнозирования рецидива ЯК построены модели логистической регрессии, на основе которых были проведен ЯОС-анализ изученных показателей, что позволило определить диагностические пороги рецидива и ремиссии заболевания, а также оценить чувствительность и специфичность используемых показателей.

Установлено, что повышение экспрессии ММП-9 в прямой кишке на 1 балл (иммуногистохимический метод) ведет к увеличению в 1,7 раз риска развития рецидива ЯК (с очень высокой статистической вероятностью (р<0,0001)). На базе математической модели разработана формула для расчета вероятности развития рецидива ЯК с использованием показателя экспрессии ММП- 9 в СО прямой кишки: Р = (0,54322 * [ММП-9 Прямая кишка - общая]), где Р- вероятность развития рецидива ЯК. Установлено, что показатель экспрессии ММП-9 в СО прямой кишки равный 3 и 4 баллам, соответствует рецидиву ЯК (чувствительность 92% и специфичность 99%).

Не менее информативным для определения риска развития рецидива ЯК является показатель экспрессии ТИМП-1 и в СО прямой, и в СО сигмовидной кишки. При использовании показателя экспрессии ТИМП-1 в СО прямой и сигмовидной кишке АиС=0,96, чувствительность составляет 92%, специфичность - 91%.

В диагностических целях была построена математическая модель, на основании которой была разработана формула, позволяющая оценить наступление полной ремиссии ЯК с использованием показателя экспрессии ММП-9 в СО прямой кишки: Р = 1о§й( 3,29 * [ММП-9 Прямая кишка -общая] + -1,56 * [ММП-9 Прямая кишка - общая]2), где Р-вероятность наступления полной ремиссии Ж. Установлено, что экспрессия ММП-9 в СО прямой кишке равная 1 или 2 баллам, соответствует полной ремиссии ЯК (АиС = 0,94, чувствительность 99% и специфичность 89%).

При СРК-Д регистрировалось отсутствие видимых изменений СО толстой кишки, однако при иммуногистохимическом исследовании выявлялась слабая экспрессия ММП-9 в СО сигмовидной и прямой кишке. Возможно, это свидетельствует о наличии морфологического субстрата при данной патологии, которая сопровождается экспрессией ТИМП-1 в СО толстой кишки, в количестве, которое, вероятно, способно ограничивать иротеолнтическую активность ММП-9 и, соответственно, лести к развитию поверхностного воспаления СО толстой кишки, в отличии от более выраженной экспрессии ММП-9 и отставания в экспрессии ТИМП-1 в СО толстой кишки при ЯК в стадии обострения, результатом чего являются тяжелые воспалительные изменения в толстой кишке (рисунок 5).

Э 2.5 2 1.S 1 0,5 О

U

у

_

•

/Г -к

L

ММП-9 в ТИМП-1 а ММП-9 ■ ТИМП-1 а СО сигмоа. СО сигмоа СО примой СО примой кишки кишки кишки кишки

1

- пациенты с як, обострение

/ пациенты с ЯК, ремиссия

* пациенты с СРП. диарейный вариант

в 1дороаые добровольцы

Рис. 5. Экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки у больных ЯК и СРК-Д.

Соответственно, показатели экспрессии исследуемой нротеазы и ее ннгнбнтора были выше у больных с рецидивом ЯК. Вместе с тем, экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у пациентов с ЯК в стадии ремиссии и у больных с СРК-Д, имеют сходные показатели.

Установлено, что для больных СРК-Д, соотношение ММП-9 : ТИМП-1 в СО толстой кишки составляет 1 : I, и совпадает с показателем соотношения указанных показателей у больных ЯК в стадии ремиссии, однако отличается

от соотношения ММП-9 : ТИМП-1 у больных ЯК в стадии обострения- 1,5 : 1 (р<0,05).

Следовательно, полученные результаты указывает на важную роль ММП-9 и ТИМП-1 и их соотношения в образовании дефектов СО толстой кишки и репаративных процессах, что является основанием для использования данных показателей в качестве дополнительные критериев в оценке риска развития рецидива заболевания и наступления полной ремиссии ЯК, что в конечном итоге является наиболее важной целью проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Установлено повышение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке сигмовидной и прямой кишки у больных с рецидивом язвенного колита, которое зависит от степени активности заболевания.

2. Показана необходимость определения соотношения матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 для оценки тяжести заболевания и возможного развития рецидива язвенного колита. У пациентов с рецидивом соотношение матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 составило 1,5 : 1, а у пациентов в стадии ремиссии -1:1.

3. У больных язвенным колитом выявлена корреляционная зависимость между показателями экспрессии матриксной металлопротеиназы 9, тканевым ингибитором матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке сигмовидной и прямой кишки и показателями индекса Мэйо. По мере нарастания тяжести заболевания и выраженности воспалительных изменений в толстой кишке наблюдается повышение исследуемых показателей.

4. Установлены отличия экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения

у пациентов с язвенным колитом и с синдромом раздраженной кишки. У больных язвенным колитом в стадии обострения показатели имели более высокие значения по сравнению с больными синдромом раздраженного кишечника, у пациентов язвенным колитом в стадии ремиссии и синдромом раздраженного кишечника - не отличались, и были выше, чем у здоровых добровольцев.

5. Установлено, что экспрессия матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки > 3 баллам (при оценке иммуногистохимическим методом) соответствует рецидиву язвенного колита (диагностическая чувствительность 92% и специфичность 99%). Показатель экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки < 2 балла (при оценке иммуногистохимическим методом) соответствуют ремиссии язвенного колита (диагностическая чувствительность 99% и специфичность 89%). Повышение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки на 1 балл (при оценке иммуногистохимическим методом) ведет к увеличению в 1,7 раз риска развития рецидива язвенного колита. Практические рекомендации

1. Для диагностики язвенного колита и оценки полноценности ремиссии рекомендуется определение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения в слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки.

2. Предложено использовать математические модели прогноза риска развития рецидива язвенного колита на основе показателей экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ткачев А. В., Мкртчян Л. С., Никитина К. Е. Особенности эпидемиологии и этиопатогенеза воспалительных заболеваний кишечника: состояние проблемы.-Шаучная мысль Кавказа.-2011.-№2.-С.175-180.

2. Ткачев A.B., Мкртчян Л.С., Никитина К.Е., Волынская Е.И.. Воспалительные заболевания кишечника: па перекрёстке проблем.-//Практическая медицина.-2012.-№03.-С.17-22.

3. Мазовка К.Е., Ткачев A.B. Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 в слизистой оболочке кишечника у больных с воспалительными заболеваниями кишечника в зависимости от активности заболевания.- //Практическая медицина.-2014.-№01.-С.53-56.

4. Мазовка К.Е., Ткачев А. В. Активность протеаз при воспалительных и функциональных заболеваниях кишечника.-//Известия высших учебных заведений. Северо- Кавказский регион. Естественные науки,-2014.-№2.-С. 102-104.

5. Мазовка К.Е., Ткачев А. В., Девликамова Т. А. Современное представление и патогенез воспалительных заболеваний кишечника. Роль матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов.-//Научная мысль Кавказа.-2014.-№2.-С.119-127.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЗК - воспалительные заболевания кишечника ВКМ - внеклеточный матрикс ММП - матриксная металлопротеиназа ПМЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты СО - слизистая оболочка СРК - синдром раздраженной кишки

СРК-Д - синдром раздраженной кишки, диарейный вариант ТИМП - тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы ЯК - язвенный колит

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 3556. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88