Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Методологические основы комплексного исследования полифенольных веществ и тест-соединений природного и синтетического происхождения

На правах рукописи

ПИСАРЕВ ДМИТРИИ ИВАНОВИЧ

МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОМПЛЕКСНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ И ТЕСТ-СОЕДИНЕНИЙ ПРИРОДНОГО И СИНТЕТИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

6 ИЮН 2013

005060906

КУРСК 2013

005060906

Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального обра-зования«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства науки и образования Российской Федерации.

Научный консультант:

Доктор фармацевтических наук, профессор Новиков Олег Олегович.

Официальные оппоненты: Багирова Валерия Леонидовна, заслуженный работник здравоохранения, доктор фармацевтических наук, профессор, директор по науке и развитию ООО «Новосибхимфарм»;

Боковикова Татьяна Николаевна, доктор фармацевтических наук, профессор, начальник лаборатории химико-фармацевтических препаратов № 1 Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации;

Бубенчикова Валентина Николаевна, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующая кафедрой фармакогнозии и ботаники Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «6» июня 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан <¿¿6 » ОПр^ЛЯ 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета .—. --- Пашин Евгений Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Недостаток оригинальных отечественных лекарственных средств, соответствующих современному мировому уровню, является реальной экономической и национальной проблемой России. Зависимость от импортных субстанций негативно влияет на лекарственную безопасность страны. На российскую фармацевтическую отрасль оказывают влияние негативные факторы, среди которых технологическое отставание от зарубежных производителей с соответствующими различиями в части номенклатуры производимой продукции. Сегмент, по которому отставание приобретает широкий масштаб, представлен наиболее современными лекарствами, производство которых является чрезвычайно ёмким в отношении использования технологий. На сегодняшний день российская фармацевтическая промышленность производит достаточно ограниченный спектр лекарств, многие из которых можно считать устаревшими. Государство на протяжении последних лет демонстрирует высокую степень интереса к перспективным рынкам. Без сомнения, фармацевтический рынок также относится к их числу. Примером государственной заинтересованности является национальная программа «Стратегия Фарма 2020».

В этой связи одной из приоритетных задач действующей государственной программы развития фармацевтической промышленности Российской Федерации, в связи с переходом на инновационную модель, является обеспечение надлежащего контроля качества лекарственных средств.

Только используя эффективную материально-техническую аналитическую базу, можно обеспечить надлежащий уровень качества лекарственных средств, биологически активных соединений и, как результат, их эффективность и безопасность. Это определяет необходимость систематического совершенствования существующих методов фармацевтического анализа.

Известно, что к фармацевтическому анализу предъявляются достаточно высокие требования. Он должен отвечать критериям: «Специфичность», «Чувствительность», «Воспроизводимость», «Точность», «Экспрессность».

Следует иметь ввиду, что острая проблема дефицита инструментальной базы, сложившаяся в нашей стране в постсоветский период, по-прежнему остаётся актуальной. Это в целом препятствует обеспечению системы контроля качества лекарственных средств на уровне, отвечающем международным правилам ОМР. Данное обстоятельство определяет необходимость внедрения новых и модифицированных методов анализа. Одним из путей решения данной проблемы является использование современных масс-спектрометрических методов.

За последние 40 лет создано большое количество масс-спектрометрических методов анализа, в связи с открытием мягких десорбци-онных способов ионизации.

Но из всего многообразия только некоторые из них реально обеспечили возможность эффективного анализа биологически активных соединений, это

электроспрейная ионизация, химическая ионизация при атмосферном давлении, ионизация электронным ударом и матрично-активированная лазерная десорбционная ионизация. Однако первые три метода используются как удобные детекторы в хроматографии, поэтому имеют исключительно подчинённый характер и самостоятельного применения не приобрели.

Выгодно от указанных методов отличается масс-спектрометрия мат-рично-активированной лазерной десорбционной ионизацией {МАЮ1/ТОР/МБ). Основными достоинствами метода являются: универсальность при анализе соединений любой молекулярной массы, полярности и термочувствительности; экспрессность, чувствительность, объём получаемой информации. Важно отметить, что данный метод практически не требует расходных материалов и сложной пробоподготовки.

Опубликованные к настоящему времени работы, посвященные результатам использования МАЬО!/ТОР/М8, не касаются вопросов фармацевтического анализа.

Поэтому теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение использования метода МАЬЭ1/ТОР/М8 для анализа лекарственных средств и биологически активных соединений определяет актуальность настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение возможности использования МАЬ01/Т0р/МБ для количественного анализа на примере исследования отдельных биологически активных соединений различных групп.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие основные и сопутствующие задачи исследования:

1. Экспериментально подтвердить возможности использования метода МАЮиТОР/МБ для исследования качественных характеристик изучаемых тест-объектов природного и синтетического происхождения. Доказать аналитические преимущества МАЬ01/Т0р/МБ перед традиционными методами анализа.

2. Предложить набор оригинальных методик идентификации исследуемых тест-объектов с использованием спектра традиционных и современных методов анализа.

3. Выявить дополнительные аналитические возможности метода МАЬОШОР/МБ в ходе идентификации отдельных соединений.

4. Провести сравнительную характеристику методов МАЬ01/Т0Р/МБ и ОФ ВЭЖХ, ГЖХ при идентификации полифенольных компонентов, жирных масел, каротиноидов, выделенных из растительных объектов.

5. Теоретически обосновать и экспериментально подтвердить возможность количественного определения изучаемых тест-препаратов методом МАЬ01/Т0р/МБ и провести сравнительную оценку с результатами, полученными альтернативными методами анализа.

6. Разработать нормативную документацию на масс-спектрометрический метод анализа. Предложить проекты нормативных актов

на некоторые изученные виды лекарственного растительного сырья с учётом тенденций современной фармацевтической науки, для чего установить значимые анатомические диагностические признаки объектов исследования, в том числе с использованием растровой электронной микроскопии.

Научная новизна работы. Впервые проведена идентификация субстанций 3,5,4'-тригидрокси->н/?онс-стильбена, карнозина и лоратадина с использованием комплекса традиционных методов анализа - ОФ ВЭЖХ, ТСХ, УФ-, ИК-спектроскопии, химических реакций, а также МАЮ^ТОГ/МБ. Показано, что применение метода МАЮТ/ТОЕ/МБ характеризуется существенными преимуществами перед традиционными методами анализа, в первую очередь чувствительностью и экспрессностью.

Впервые разработан новый способ идентификации комплексов растительных полифенолов, заключающийся в использовании матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации с времяпролётным анализатором масс, позволяющий исключить этап предварительного разделения комплексов анализируемых соединений.

Впервые с использованием метода МАЬ01/Т0р/МБ охарактеризован состав фенольных соединений будры плющевидной, репешка обыкновенного, клевера лугового, можжевельника длиннохвойного, лофанта анисового; антоцианов ирги ольхолистной, смородины чёрной, рябины обыкновенной, винограда культурного, черёмухи обыкновенной, поздней и виргинской, шиповника колючейшего. Правильность полученных результатов подтверждена методом ОФ ВЭЖХ.

Проведена количественная оценка биологически активных соединений будры плющевидной, репешка обыкновенного, клевера лугового, лофанта анисового методом абсолютной градуировки по доминирующим компонентам в условиях ОФ ВЭЖХ.

Впервые с помощью метода МАЮ [/ТО Г/МБ установлен состав триа-цилглицеридов жирных масел энотеры двулетней, ореха грецкого. Правильность полученных результатов подтверждена методом газожидкостной хроматографии.

В результате проведённых исследований подтверждена целесообразность использования метода МА Ь01/Т0Р/МБ для идентификации индивидуальных компонентов и суммарных растительных комплексов, в связи с чем впервые сформулировано понятие «масс-спектрометрический профиль».

В результате использования метода ОФ ВЭЖХ для анализа растительных объектов установлены закономерности между строением и подвижностью фенольных соединений.

Впервые теоретически обоснована и доказана в эксперименте возможность количественного определения биологически активных соединений различной природы методом МАЮ1/ТОР/МБ с использованием принципа внутренней стандартизации.

Практическая значимость. Учебно-методические материалы, методики идентификации и количественного определения карнозина, лоратадина, флавоноидов в растительном сырье, внедрены в учебный и научный процесс

Белгородского государственного национального исследовательского университета, Воронежской государственной медицинской академии. Методики идентификации и количественного определения карнозина и лоратадина внедрены в работу ОГБУЗ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» (г. Белгород), БУЗ ВО «Воронежский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» (г. Воронеж).

Разработаны проекты фармакопейных статей: ОФС «масс-спектрометрия», ФС «Черёмухи плоды», «Репешка трава». Данные проекты НД приняты к рассмотрению Центром фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения России.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках научного направления «Разработка методологических подходов к анализу природных и синтетических биологически активных соединений в объектах различного происхождения. Изучение фармакологических аспектов использования данных биологически активных соединений» и государственным контрактом №14.740.11.0119 от 8 сентября 2010 года, проект «Комплексные фармакологические и технологические исследования ряда субмикроструктурированных (наноструктуриро-ванных) фармацевтических субстанций с доказанными изменёнными физико-химическими свойствами», номер государственной регистрации темы 01201061846.

Основные положения, выносимые на защиту:

- полученные экспериментальные данные доказали объективные аналитические преимущества метода МАЮиТОР/МБ перед традиционными при определении качественных характеристик исследуемых соединений в поликомпонентных объектах;

— в результате теоретических и экспериментальных исследований доказана возможность применения метода МАЬ01/Т0р/М8 в целях количественного анализа биологически активных соединений различного происхождения на основе принципа внутренней стандартизации.

Личный вклад автора. Автором проведён анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, лично проводился отбор объектов исследования, анализировались экспериментальные образцы растительных материалов и фармацевтических субстанций с помощью классических (ТСХ, УФ- и ИК-спектроскопия, ГЖХ) и современных (ВЭЖХ, Л£4Z,D//7,OF/MS) методов анализа. Диссертантом самостоятельно выполнялись анализ и обобщение результатов, составление таблиц и графиков, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. Доля автора в совместных публикациях составила 75%.

Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.

Апробация работы и публикации. Основные фрагменты диссертационной работы доложены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы фитодизайна» (г. Белгород, 2007), 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008), международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию образования Ботанического сада Белгородского государственного университета «Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения» (Белгород, 2009), 65-й региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 45-летию фармацевтического факультета «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики» (Курск, 2011).

По материалам диссертационной работы опубликована 51 работа, из них: 1 монография, выпущенная издательством РАМН, 35 работ в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК, получено 3 патента Российской Федерации, 2 свидетельства о регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности, 2 методических пособия.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 322 страницах машинописного текста, иллюстрирована 123 рисунками, 75 таблицами и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы, включающего 318 источников, из которых 182 работы иностранных авторов, и приложений.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе обобщены сведения о существующих методах масс-спектрометрии. В результате изучения литературных данных установлено, что масс-спектрометрия в настоящее время является один из самых эффективных и востребованных методов анализа органических соединений. Это определяется высокой чувствительностью, экспрессностью метода, объёмом получаемой с его помощью информации и широкому диапазону определяемых масс.

Проведен литературный и патентный поиск по изучению существующих методов анализа и фармакологической активности выбранных объектов исследования.

Представленные в главе данные позволили сформировать алгоритм выполнения данных диссертационных исследований (рисунок 1).

Тест-препараты: транс-резвератрол, карнозин, лоратадин; комплексы БАВ, выделенных из растительных источников

Цветные реакции, ТСХ, ОФ ВЭЖХ, УФ-и ИК-спектроскопия

Количественное определение транс-резвератрола, карнозина, лоратадина

ОФС - Масс-спектрометрия

ФС - "Репешка трава", "Черёмухи плоды", "Будры трава"

А. Выбор объектов исследования

Б. Сравнительное изучение аналитических характеристик метода МАЬО!/ТОР/М5 и ряда традиционных методов анализа при исследовании тест-объектов растительного происхождения

Гв Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение возможности использования метода МАЬ01/Т0Р/МЗ в целях количественного анализа тест-объектов природного и ^синтетического происхождения^.

Г. Разработка проектов нормативной документации по результатам проведённых исследований

1. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение возможности использования растровой электронной микроскопии в целях морфолого-анатомического и микрокристаллоскопического анализа

2. Подтверждение аналитических преимуществ метода МАЬ01/Т0Р/МЗ

на примерах изучения низкомолекулярных БАВ природного и синтетического происхождения

3. Подтверждение возможностей метода МАЬ01/Т0Р/М5 как инструмента количественного анализа на примерах исследования низкомолекулярных БАВ природного и синтетического происхождения

Рисунок 1 - Схема алгоритма диссертационных исследований

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной главе приведены данные о выбранных объектах исследования. Целесообразность выбора объектов исследования обусловлена необходимостью изучения широкого круга разноплановых химических структур. Именно такой подход, на наш взгляд, в полной мере позволил наглядно показать преимущества метода MALDI/TOF/MS перед альтернативными, широту его аналитических возможностей. Так, исследованный ряд субстанций и растительных объектов позволил охватить в аналитическом аспекте следующий спектр биологически активных соединений природного и синтетического происхождения: флавоноиды, в том числе антоцианы, фитоалексины, пептиды, органические основания, каротиноиды, триацилглицериды.

Кроме того, выбранные растительные объекты представляют определённый ресурсоведческий интерес, так как они интродуцируются в ботаническом саду НИУ «БелГУ».

В главе описаны использованные в диссертационных исследованиях методы, а именно ОФ ВЭЖХ, ГЖХ, ИК- и УФ-спектроскопия, MALDI/TOF/MS.

Хроматографирование методом ГЖХ жирных кислот в виде метиловых эфиров проводили на газовом хроматографе GC-2014 фирмы «Zhimadzu» производства Японии. Разделение проводили на капиллярной кварцевой колонке размером 30 м х 0,25 мм с неподвижной полярной фазой - 50%-пропилнитрилметилполисилоксан (DB-225) с толщиной слоя 0,25 мкм, температура колонки программировалась в диапазоне 170°С (с выдержкой 5 минут) - 225°С (выдержка 7 минут), скорость подъёма 3 °С/мин. Газ-носитель -гелий с постоянным потоком 0,75 мл/мин, давление потока 1:50, температура инжектора - 240°С. Детектор пламенно-ионизационный FID - 40 температура детектора - 250 °С. Объём вводимой пробы 1 мкл.

Хроматографирование методом ОФ ВЭЖХ проводили на хроматогра-фическом приборе фирмы «Agilent Technologies 1200 Infinity» производства США с автоматическим пробоотборником Agilent 1200, вакуумным микродегазатором, градиентным насосом и термостатом той же серии. Электронные спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометрического детектора с диодной матрицей серии Agilent 1200 (диапазон длин волн от 190 до 950 нм, кювета с длиной оптического пути 10 мм; объемом 13 мкл), шаг сканирования - 2 нм.

Для регистрации и обработки спектральных данных и хроматограмм использовали программное обеспечение «Agilent Chem Station».

Для испытаний использовали ряд стальных хроматографических колонок, наиболее подходящими из которых оказались: Reprosil-Pur Cis-AQ 3 рм х 150 мм х2 мм и Ascentis express С\%2,7рм '-<100 мм у 4,6 мм.

Для приготовления подвижных фаз использовали следующие растворители: воду сверхчистую (для жидкостной хроматографии), спирт этиловый (по ГОСТ Р 51652), ацетонитрил (для жидкостной хроматографии), кислоту уксусную ледяную (квалификация х.ч. по ГОСТ 61), кислоту ортофосфорную 85%-ную (по ГОСТ 6552).

Регистрацию УФ-спектров осуществляли на спектрофотометре СФ-56 в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см.

ИК-спектры измеряли на спектрофотометре Shimadzu-IR-840 1. Пробы предварительно прессовали с инертным наполнителем (калия бромид) 1 мг в 200 мг. Измерения проводили в области 4000 - 400 см"1 с разрешением 0,75 см"1.

Регистрацию масс-спектров проводили на приборе масс - спектрометр «AutoflexII» (модификация Microflex) «MALDI/TOF/TOF» (приборная ошибка - не более 0,5 Da) фирмы Bruker Daltonics GmbH производства Германии, состоящего из ионного источника, вакуумной камеры, анализатора масс и персонального компьютера. Прибор оснащён азотным пульсационным лазером с длиной волны 337 нм и пульсацией с периодичностью 0,5 не. В качестве матрицы использовали а-цианокоричную кислоту.

Ионизация производится лазерным излучением, взаимодействующим с пробами, пространственно двумерно расположенными в плоскости мишени. Детектирование образовавшихся ионов происходит во времяпролётном анализаторе масс в линейном и отражённом режимах. Вакуум в приборе формируется за счёт переднего линейного масляного вакуумного насоса, создающего остаточное давлениедо 1><10"2 миллибар. Внутри прибора также имеется видеокамера для отображения отсека с образцом микроканального детектора.

Большинство методик являются собственными авторскими разработками. Предлагаемый набор методик позволил решить поставленные в диссертации задачи с необходимой степенью точности, экспрессности, чувствительности. Кроме того, в работе применен метод растровой электронной микроскопии, позволивший охарактеризовать детали строения кристаллов субстанций, а также расширить возможности анатомического анализа растительных объектов, изучаемых в данной диссертационной работе. Проведённые исследования позволили получить новые научные знания об изучаемых в русле диссертационной работы объектах.

ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП БАВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ В СРАВНЕНИИ С ДРУГИМИ МЕТОДАМИ АНАЛИЗА

В данной главе представлены результаты собственных исследований, посвящённых разработке методологии анализа некоторых тест-препаратов (3,5,4'-тригидрокси-шрянс-стильбен, карнозин, лоратадин), относящихся к различным химическим группам с помощью набора химических и физико-химических методов, в том числе MALDI/TOF/MS.

Предлагаемые наборы разработанных методик имеют реальную практическую значимость, так как решают в достаточной степени весь спектр аналитических задач, связанных с конкретными объектами исследования.

Выбор метода MALDI/TOF/MS из существующего ряда родственных методов для использования в фармацевтическом анализе, обусловлен тем, что он имеет значительные преимущества перед другими методами масс-спектрометрии.

Чтобы полностью оценить возможности МАЬВ1/ТОР/М8, нами выделены и сформулированы его достоинства и недостатки.

Основные достоинства метода:

1. Универсальность. Метод МАЬВ1/ТОР/М5 подходит для анализа соединений любой степени сложности, полярности и термочувствительности.

2. Высокая чувствительность. Замечательной особенностью масс-спектрометрии является сверхвысокая чувствительность, недостижимая никакими другими методами. Следствием этого является возможность обойтись незначительным количеством образца для анализа.

3. Широкий диапазон измерений масс. Метод МАЮ1/ТОР/МЗ позволяет определять молекулярную массу соединений от 0 до 300000 йа.

4. Использование для неочищенных образцов. Вследствие дифференцирующей возможности времяпролётного анализатора масс (ТОР/МБ), на одном спектре можно наблюдать наличие всех компонентов сложной смеси без предварительного сложного и длительного по времени её разделения и очистки на индивидуальные компоненты. Следовательно, для анализа не требуется сложной пробоподготовки.

5. Возможность идентификации. Поскольку МАЬВ1/ТОР/МБ относится к методам мягкой ионизации, то в спектре можно наблюдать пик молекулярного иона, что может служить способом идентификации. Точное измерение массы с высоким разрешением является важным инструментом, наряду с другими спектральными методами для подтверждения структуры природных соединений. Он также используется в качестве структурного доказательства, когда элементный анализ не представляется возможным, например, при изучении второстепенных компонентов.

6. Возможность количественного определения. Масс-спектрометрия является мощным методом количественного анализа, основанием к этому является факт, что масс-спектрометрический сигнал пропорционален потоку частиц.

7. Надёжность и точность. При использовании масс-спектрометрии возможно получение очень точного значения молекулярной массы. Значение прямого определения молекулярной массы с точностью до 1 единицы трудно переоценить.

8. Структурная информация. По данным масс-спектра можно сделать вывод относительно размера и структуры углеродных заместителей, а также структурную информацию о характере агликона и заместителей (сахара, ацильных групп и т.д.); межгликозидных связях и позицию замещения агликона, а также углеводной последовательности. К тому же в масс-спектрах можно наблюдать структурные изменения в молекуле (гидролиз, окисление).

9. Экспрессность. МАЬВ1/ТОР/М8 позволяет быстро получать и обрабатывать результаты. Часто требуется меньше минуты для фактического анализа после элементарной пробоподготовки. Это позволяет осуществлять быстрый скрининг веществ.

10. Простота. Предоставляемая МАЮ!/ТОР/МБ информация понятна даже непрофессионалам, поскольку интерпретация масс-спектрометрических данных не требует глубоких знаний в данной области. Также прибор не требует особого обслуживания, расходных материалов.

Недостатки метода:

1. Высокая стоимость оборудования. Стоимость оборудования некоторых приборов может достигать десятков тысяч евро, хотя имеющиеся настольные приборы позволяют компенсировать этот недостаток.

2. Влияние пиков матрицы. Наблюдению молекулярного пика иона могут мешать пики матрицы. Поскольку для регистрации спектров веществ используется матрица, она может накладываться на пики основных веществ с молекулярной массой ниже 500 Ба. Но в общем случае, матрица пригодна к использованию для анализа малых молекул, если она обеспечивает эффективную ионизацию, минимальную фрагментацию и не вызывает наложений сигналов в масс-спектре.

Нивелировать влияние матрицы можно используя материалы, модифицирующие поверхность и способствующие десорбции/ионизации веществ. Для этого используют пленки аморфного кремния - метод БАЬБРТОР/МБ. Также используются подложки с кремниевыми нанонитями - метод ИАЮ1/ТОР/МБ.

3. Невозможность определить изомеры. Поскольку изомеры имеют одинаковую молекулярную массу, следовательно, с помощью масс-спектрометрии их различить нельзя. К тому же масс-спектрометрия даёт мало информации о конфигурации гликозидной связи.

Таким образом, представленные результаты сравнительного анализа МАЬ01/Т0Р/МБ позволили сделать вывод о существенном преобладании достоинств настоящего метода. Болыцинство перечисленных недостатков может быть легко скомпенсировано.

С использованием ряда тест-препаратов природного и синтетического происхождения доказаны аналитические преимущества метода МА ЮиТОР/МБ перед альтернативными. Применение метода МАТ01/Т0р/МБ упраздняет необходимость длительной пробоподготовки, применения образцов сравнения определяемых веществ, соблюдения специфических условий определения каждого анализируемого вещества.

Разработаны методики идентификации 3,5,4'-тригидрокси-/яра«с-стильбена {транс-резвератрола) в различных объектах исследования. Для этой цели использованы цветные реакции, позволяющие установить феноль-ный характер 3,5,4'-тригидрокси-/и/?анс-стильбена, ТСХ, УФ- и ИК-спектроскопия, МАЬВ1/ТОР/МБ.

Для идентификации 3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена в субстанции методом МАЬВ1/ТОР/МБ использован его спиртовой раствор в концентрации 2,5><10"5 г/мл. Полученный масс-спектрометрический профиль 3,5,4'-тригидрокси-отранс-стильбена приведён на рисунке 2.

Рисунок 2 - Масс-спектр 3,5,4'-тригидрокси-/и/;янс-стильбена

В масс-спектре 3,5,4'-тригидрокси-мракс-стильбена наблюдаются интенсивные пики молекулярных ионов с зарядом m/z = 228,347 и 229,231. Чувствительность метода составляет <5,26х Ю"10 моль/мл.

Представленный метод позволяет однозначно подтвердить подлинность 3,5,4'-тригидрокси-»?/?анс-стильбена, характеризуется минимальной пробоподготовкой, исключительно высокой чувствительностью, недостижимой другими методами, легко реализуется за весьма короткий промежуток времени.

Для идентификации 3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена в объектах растительного происхождения также использован метод MALDI/TOF/MS.

Полученный масс-спектр 3,5,4'-тригидрокси-«?/>акс-стильбена в образцах ягод V. vinifera L. и комплексе полифенолов «Эноант» соответствует молекулярной массеЗ,5,4'-тригидрокси-те/?анс-стильбена.

Таким образом, использованная методика позволяет экспрессно, достоверно подтвердить присутствие 3,5,4'-тригидрокси-/ира«с-стильбена в анализируемых образцах без предварительного хроматографического разделения. Результаты масс-спсктрометрического определения подтверждали с помощью ОФ ВЭЖХ.

Использование ОФ ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования позволило, помимо качественной характеристики, обнаружить примесь цис-резвератрола. При этом цветные реакции, ТСХ, УФ- и ИК- оказались пригодны только для идентификации 3,5,4'-тригидрокси-отранс-стильбена в субстанции, тогда как ОФ ВЭЖХ и MALDI/TOF/MS позволили провести его оп-

ределение также в растительных объектах и БАДах. Наибольшую чувствительность и экспрессность с минимальной пробоподготовкой показал метод MALDI/TOF/MS.

Для идентификации лоратадина в субстанции и лекарственных формах разработаны методы УФ-спектроскопии, ОФ ВЭЖХ и MALDI/TOF/MS. При этом наиболее удобным методом идентификации оказался MALDI/TOF/MS, поскольку обладал наибольшей чувствительностью и экспрессностью, не требовал особых условий проведения эксперимента и пробоподготовки.

Для идентификации лоратадина в субстанции методом MALDI/TOF/MS взят его опытный спиртовой раствор. В результате получен спектр, на котором наблюдался интенсивный пик молекулярного иона с зарядом m/z = 383,319, соответствующий молекулярной массе лоратадина в протежированном состоянии без выраженной фрагментации (рисунок 3).

£ 0000

5000 4000 3000 2000

1000

Иногда в спектре встречаются аддукты лоратадина с ионом натрия.

Чувствительность метода < 1,3х 10"10 моль/мл.

Для идентификации субстанции карнозина использованы качественные реакции, ТСХ, ОФ ВЭЖХ и MALDI/TOF/MS.

При регистрации масс-спектра наблюдается интенсивный пик молекулярного иона с зарядом m/z = 227,489, что соответствует протонированной форме карнозина. Кроме того, встречаются пики молекулярных ионов меньшей интенсивности с зарядами m/z = 249,485 и 265,440 свидетельствующие о нахождении карнозина в виде аддуктов с ионами натрия и калия. Полезную информацию для идентификации может предоставить частичная фрагментация молекулы карнозина. Поскольку карнозин является дипептидом, построенным из остатков ß-аланина и гистидина, то на спектре можно увидеть фрагментацию молекулы с образованием гистидина - пик иона с m/z = 156,492, что можно охарактеризовать как специфический признак карнозина (рисунок 4).

74.360 107.395 1*6.380

1 90 335 228.258

J-

i

Рисунок 3 - Масс-спектр лоратадина

Рисунок 4 - Масс-спектр кариозина

Чувствительность метода составила <2,21 хЮ"12 моль/мл, что превышает чувствительность вышеприведённых способов идентификации.

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ, И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ В СРАВНЕНИИ С ДРУГИМИ МЕТОДАМИ ДЛЯ АНАЛИЗА ОБЪЕКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

В настоящей главе приводятся результаты собственных исследований комплексов БАВ выделенных из растительных объектов с помощью набора физико-химических методов анализа, в первую очередь ОФ ВЭЖХ и МАЬВ1/ТОР/М5. В качестве объектов исследования были выбраны растительные биологически активные соединения с разной полярностью, выделенные из растений, а именно: флавоноиды (в том числе антоцианы и изо-флавоноиды) и триацилглицериды.

Идентификацию флавоноидов в растительных объектах осуществили с помощью классических методов - УФ-спектроскопии, в том числе с добавлением шифт-реактивов, определения температуры плавления после предварительного фракционирования на отдельные компоненты выделенных сумм.

Использование МАЬВ1/ТОР/МБ оказалось более полезным для групповой характеристики флавоноидов, когда необходимо подтвердить присутствие искомых компонентов в известных объектах. Для индивидуальной характеристики и количественной оценки компонентов в неизвестном объекте более предпочтительной оказалась ОФ ВЭЖХ.

В качестве примера можно привести анализ полифенольного комплекса травы лофанта анисового - ЬорЬапЖш атзаЫз ВепЙт с использованием ОФ ВЭЖХ и МЛЮиТОР/МБ.

Результаты хроматографирования полифенольного комплекса травы лофанта анисового представлены на рисунке 5.

а с. 51}»:я<1.г *««** «о <шго* иди}<жвзз- к>

Рисунок 5 - Хроматограмма полифенолов травы Ь. anisatus

Критерии пригодности хроматографической системы, рассчитанные по результатам хроматографирования, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Показатели пригодности хроматографической системы для определения полифенолов Ь. атшЫъ

1я N Тг wь Компонент

13,768 141,6 76127 30,6 0,989 0,1996 Лютеолин-6-С-глюкозид

15,913 2942 82505 10,2 0,995 0,2216 Кислота розмариновая

17,491 292,4 186057 5,48 0,836 0,1622 Лютеолин-7-глюкозид

18,904 326,4 118136 7,4 1,073 0,22 Акацетин-7-глюкозид

22,4 602 309332 10,8 0,768 0,1611 Акацетин-5-глюкозид

25,479 331,6 349065 8,83 1,02 0,1725 Диосметин-7-глюкозид

абсолютное время удерживания, Б - плошадь пика, N - число теоретических тарелок, _ коэффициент разделения пиков, Тг - коэффициент асимметрии, '\УЬ - ширина пика на базовой линии

Представленные показатели пригодности (N>5000, 115>1,5, Т(<2) укладываются в допустимые пределы, что служит доказательством эффективности данной системы для анализа полифенолов Ь. апкайю.

При исследовании полифенольного комплекса травы Ь. атьаШн мето-

дом MALDI/TOF/MS наблюдались два интенсивных пика молекулярных ионов с m/z = 447,269 и 463,259 соответствующих гликозидным монозидным структурам, при фрагментации которых образуются пики молекулярных ионов с m/z иона = 285,306, 301,365 и 533,236 (рисунок 6), соответствующие аг-ликонам акацетину, диосметину/хризоэриолу и кислоте розмариновой.

щ. ш. а -а

ш. — 32В Т. ж и

тМ, 1 i [Jy,

Рисунок 6 - Масс-спектрометрический профиль суммы флавоноидов

Ь. атъаЫъ

Таким образом, на основании данных, полученных в ходе МАЬВ1/ТОР/М5 анализа, можно утверждать, что сумма полифенолов травы Ь. атзМж содержит гликозиды акацетина и диосметина в монозидной форме.

Сочетание хроматографических методов с масс-спектрометрией, на наш взгляд наиболее удобно для определения антоцианов, поскольку эти пигменты не имеют чётких точек плавления и мало или практически не различаются по своим спектральным характеристикам.

Идентификация антоцианов с помощью МАЬВ1/ТОР/М5 оказалась предпочтительнее, чем при применении ОФ ВЭЖХ, при использовании которой антоцианы в большинстве случаев мало различаются по хроматогра-фической подвижности.

В качестве наглядного примера можно привести идентификацию антоцианов винограда культурного - Кг/и уШ/ега Ъ.

Результатом хроматографического разделения суммы антоцианов V. уш/ега методом ОФ ВЭЖХ явилось установление наличия 8 компонентов антоциановой структуры (рисунок 7).

JUÜ

Рисунок 7 - Хроматограмма суммы антоцианов плодов V. \inifera

Показатели пригодности хроматографической системы, рассчитанные по результатам хроматографирования, представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Показатели пригодности хроматографической системы

tR S N Rs Tf Wb Компонент

3,817 362,6 13501 - 1,427 0,1314 Пеонидин-З-глюкозид

6,244 605,6 35212 18,35 1,734 0,1331 Пеонидин-З-рутинозид

7,715 1141,2 53116 11,0 1,94 0,1339 Петунидин-З-глюкозид

8,322 8323,4 54340 4,4 0,861 0,1428 Петунидин-З-рутинозид

16,966 5762,6 425806 1,6 0,548 0,104 Мальвидин-З-рутинозид

tR _ абсолютное время удерживания, S - площадь пика, N - число теоретических тарелок, Rs _ коэффициент разделения пиков, Tf - коэффициент асимметрии, Wb - ширина пика на базовой линии

Результаты расчёта критериев эффективности (N>5000, RS>1,5, Tf<2) свидетельствуют о пригодности использованной системы для анализа антоцианов V. vinifera.

Масс-спектрометрический профиль антоцианов плодов V. vinifera показал присутствие пиков молекулярных ионов с зарядами m/z = 463,187, m/z= 479,161, m/z = 493,201, m/z = 609,158, m/z = 625,143, m/z = 639,158, соответствующие монозидным и дигликозидным формам антоцианов. При фрагментации образуются агликоны, молекулярные пики ионов которых имеют заряды m/z = 301,306, m/z = 317,313 и m/z= 331,544 соответствующие пеонидину, питунидину и мальвидину. Для мальвидина и его гликозида можно выделить характерный признак присутствия в спектре в деметилиро-ванном состоянии: m/z = 345[Ci7Hi506]-14[CH2] = 331, та же картина наблюдается в случае гликозида (рисунок 8).

Рисунок 8 - Масс-спектр антоцианов плодов V. гМ/ега

Таким образом, на основании проведённых экспериментов можно утверждать, что использование метода МАЬ01/Т0Р/М8 является важным дополнением к ОФ ВЭЖХ. Кроме того МАЬБиТОР/МБ может использоваться самостоятельно для получения быстрой базовой характеристики входящих в состав соединений.

Проанализировав результаты хроматографирования полифенольных комплексов, полученные в условиях ОФ ВЭЖХ, можно установить определённые закономерности между строением полифенолов и их хроматографи-ческим поведением.

Полифенолы растительного происхождения, а именно флавоноиды, окси-коричные кислоты, фенолокислоты относятся к умеренно полярным соединениям. Поэтому возможность проникновение этих молекул внутрь гидрофобной обращенной фазы ограничена. Удерживание таких соединений обусловливается их гидрофобным выталкиванием на поверхность привитой фазы.

Умеренная подвижность полифенольных соединений в случае ОФ варианта ВЭЖХ обусловлена присутствием в их молекулах внутри- и межмолекулярных связей (формируемых за счёт наличия в структуре карбонильных и фенольных групп) которые снижают их гидрофильность. Подтверждением этого может являться высокая подвижность антоцианов, у которых отсутствует карбонил, поэтому внутри- и межмолекулярные водородные связи образуются в меньшей степени.

Подвижность флавоноидов повышается с увеличением количества гид-роксильных групп в молекуле, поэтому соответственно понижается время их удерживания. Это связано с гидрофильностью, которую определяют гидро-

ксильные группы. Так, при хроматографировании представленных образцов, первыми из колонки выходят гликозиды кверцетина, затем гликозиды кемп-ферола, лютеолина и апигенина. Наименьшей подвижностью из всех флаво-ноидов обладают изофлавоны, поскольку имеют меньше всего гидроксиль-ных групп. Метоксилирование значительно понижает подвижность флаво-ноидов, так у гликозидов акацетина подвижность ниже по сравнению с таковыми апигенина, гликозиды мальвидина имеют самую низкую подвижность, по сравнению с другими антоцианами.

Гликозидирование существенно влияет на подвижность флавоноидов. Поскольку агликоны обладают заметно большей липофильностью, чем гликозиды, то их подвижность существенно ниже.

Основная хроматографическая константа - время удерживания сильно зависит от прибора, на котором проводят разделение и объёма вводимой пробы. При увеличении концентрации вводимой пробы время удерживания увеличивается, что связано с большей нагрузкой на сорбент. Поэтому настоящая константа в ряде случаев для идентификации флавоноидных гликозидов оказалась ненадёжной характеристикой, особенно когда речь идёт о многокомпонентных составах, в которых концентрация индивидуальных флавоноидов колеблется. Использование диодно-матричного детектора позволило более объективно охарактеризовать индивидуальные компоненты. Но опять же, и здесь возникает ряд трудностей. Между флавоноидными гли-козидами, содержащими разные агликоны, дифференциация на основе данного детектора не представляет сложности. Однако разные гликозиды одного агликона имеют очень близкие профили УФ-спектрофотометрического поглощения, например, некоторые моно- и дигликозиды по УФ-спектрам отличить практически невозможно (рутин и гиперозид).

Относительно использования метода MALDI/TOF/MS при анализе исследованных объектов следует отметить, что, меняя интенсивность лазерного луча, можно тем самым варьировать глубину проникновения вглубь образца, а также изменять характер фрагментационных процессов. Это особенно важно при анализе флавоноидов, поскольку ионизацией данных соединений можно установить структуру агликона и присоединённого к нему сахара, их количество и число углеродных атомов формирующих сахар (пентоза, гексо-за). Кроме того, времяпролётный анализатор масс позволяет разделить входящие в состав анализируемой смеси соединения, исключая тот случай, когда молекулярные массы компонентов совпадают.

Показано преимущество MALDI/TOF/MS перед традиционным методом анализа жирных масел - газожидкостной хроматографией. При этом метод MALDI/TOF/MS характеризуется значительно большей экспрессностью, а полученный объём информации позволяет сделать объективный вывод о составе жирных масел. Кроме того, с помощью MALDI/TOF/MS удалось проконтролировать результаты гидролиза триглицеридов и определить состав жирных кислот, формирующих жирные масла.

Для установления возможности идентификации триацилглицеридов методом MALDI/TOF/MS использованы образцы семян энотеры двулетней -Oenotera biennis L. и ореха грецкого - Juglans regia L.

Поиск триацилглицеридов (ТАГ) осуществляли в пентановых и гексано-вых извлечениях из исследуемого сырья в диапазоне 860 - 940 Da, именно в этой области должны находиться молекулярные массы сложных эфиров глицерина и высших жирных кислот. Полученные спектры представлены на рисунке 9.

А В

Рисунок 9 - Масс-спектры ТАГ семян О. biennis (А) и J. regia (В)

На представленном рисунке присутствуют пики молекулярных ионов в диапазоне от m/z = 901 до 907 Da, хотя молекулярные массы ТАГ лежат в пределах 878 - 882 Da. Это свидетельствует о том, что анализируемые ТАГ находятся в виде аддуктов с ионом натрия.

По полученным молекулярным массам ионов проведена идентификация ТАГ, то есть установлено, остатками каких жирных кислот этерифици-рован глицерин. Результаты идентификации представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты идентификации триацилглицеридов _в исследуемых объектах_

m/z Шифр триацилглицерида Жирные кислоты, входящие в состав триацилглицерида Число атомов углерода и двойных связей

877 ЛПЛ Линолевая, пальмитиновая 55:5

901 ЛЛЛ Линолевая 57:6

903 ЛОЛ Линолевая, олеиновая 57:5

905 ООЛ Олеиновая, линолевая 57:4

907 ООО Олеиновая 57:3

Л - линолевая кислота (18:2), О - олеиновая кислота (18:1), П - пальмитиновая кислота (16:0)

Полученные данные свидетельствуют о присутствии в изученных триацилглицеридах остатков ненасыщенных жирных кислот - линолевой и олеиновой.

Чтобы установить состав жирных масел в проанализированных извлечениях был проведён щелочной гидролиз триацилглицеридов. Продукты

гидролиза подвергали масс-спектрометрированию. На полученных спектрах можно обнаружить присутствие жирных кислот в виде аддуктов с ионом натрия. Масс-спектрометрический профиль продуктов гидролиза во всех случаях оказался однотипным, поэтому на рисунке 10 представлен унифицированный спектр жирных кислот обнаруженных во всех образцах._

Рисунок 10 - Масс-спектр жирных кислот исследуемых ТАГ

Состав жирных кислот, установленных в спектрометрического изучения, представлен в таблице 4.

ходе

масс-

Таблица 4 - Результаты идентификации жирных кислот, полученные методом МАЬРУТОР/МЯ

т/г Жирные кислоты, входящие в состав триацилглицерида Число атомов углерода и двойных связей

279 Пальмитиновая 16:0

301 Линоленовая 18:3

303 Линолевая 18:2

305 Олеиновая 18:1

335 Арахиновая 20:0

Согласно приведённым в таблице 4 результатам, во всех образцах установлено присутствие 5 жирных кислот как насыщенного ряда (пальмитиновая, арахиновая), так и ненасыщенного (олеиновая, линолевая, линоленовая).

Подтверждение результатов, полученных методом МАЬБ1/ТОР/МБ, осуществлялось методом ГЖХ после предварительного перевода жирных кислот в метиловые эфиры по методике ГОСТ 30418-96.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА В МЕТОДЕ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

ИХ МЕТОДОЛОГИЧЕСКОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ И СРАВНЕНИЕ С ТРАДИЦИОННЫМИ МЕТОДАМИ АНАЛИЗА

Теоретически обоснована и экспериментально апробирована количественная оценка тест-субстанций природных и синтетических лекарственных веществ методом МАЬВ1/ТОР/МБ. Базовым инструментом реализации настоящего исследования послужил принцип внутренней стандартизации.

Метод внутреннего стандарта основан на введении в анализируемую смесь определенного количества стандартного вещества. Калибровочный график представляет собой зависимость между содержанием компонента и отношением высот (интенсивностей или площадей) пиков этого компонента и стандартного вещества. Калибровка производится путем добавления постоянного количества стандартного вещества к определенному объему различных смесей, содержащих переменные, но известные количества анализируемых компонентов. Составленные таким образом смеси анализируются.

Использование внутреннего стандарта в методе масс-спектрометрии возможно исходя из следующего представления. Поскольку метод внутреннего стандарта основан на сопоставлении измеряемого параметра пика (площади, высоты, интенсивности) определяемого вещества с аналогичным параметром добавляемого в известном количестве к пробе внутреннего стандарта, следовательно, при масс-спектрометрическом определении отношение интенсивностей стандарта и аналита в калибровочной смеси будет иметь линейную зависимость.

Для реализации варианта внутреннего стандарта методом МАЬ01/Т0Р/МБ необходимо осуществить следующие этапы:

1. Подготовка пробы. Заключается в приготовлении смеси, содержащей точно измеренное количество вещества принимаемого за стандарт, при этом количество стандарта должно соответствовать содержанию аналита. Для этого в склянку вносят точно отмеренное количество анализируемого вещества и туда же фиксированное количество вещества стандарта.

2. Проведение калибровки. Для проведения калибровки готовят серию калибровочных смесей. Концентрация анализируемого компонента в таких смесях должна соответствовать концентрации его в анализируемых смесях. Готовят калибровочные смеси таким образом, чтобы концентрация аналита во всех калибровочных растворах оставалась постоянной, а концентрация внутреннего стандарта возрастала. Далее проводят измерение полученных образцов.

3. Измерение полученных образцов. В методе МАЮ1/ТОР/М5 для реализации измерений, полученные калибровочные образцы в определённом количестве наносят на мишень, высушивают и сверху помещают каплю мат-

рицы. После высушивания образцов мишень помещают в масс-спектрометр и проводят регистрацию интенсивности анализируемого образца (1ап) и внутреннего стандарта (Its), далее рассчитывают их отношение (IJIün) и фактор отклика (KJ.

По результатам измерений строят калибровочный график в координатах Сстандарта ^st^an*

На основании определения трех вышеназванных параметров вычисляют содержание анализируемого вещества в пробе.

Для реализации варианта внутреннего стандарта в методе MALDI/TOF/MS использованы тест-образцы 3,5,4'-тригидрокси-/ирсшс-стильбена, карнозина и лоратадина.

Проведена валидационная оценка разработанного метода MALDI/TOF/MS, во всех рассмотренных случаях методика признана корректной. Оценка результатов проведена посредством сравнения позиционируемого метода с традиционными методами количественного определения.

В качестве примера можно привести количественное определение 3,5,4'-тригидрокси-/иранс-стильбенав субстанции.

В качестве внутреннего стандарта при количественном определении 3,5,4'-тригидрокси-даранс-стильбена использовано производное бснзо-у-пирона - кверцетин. Данные вещества друг с другом не взаимодействуют, имеют чётко различающиеся молекулярные массы. Пик молекулярного ио-наЗ,5,4'-тригидрокси-от/?анс-стильбена (m/z = 228,342) не накладывается на таковой кверцетина (m/z = 303,248).

Каждую пробу регистрировали 3-х кратно и вычисляли среднее значение их интенсивности (I), а также отношения интенсивностей внутреннего стандарта и аналита.

При проведении калибровки также проводили вычисление фактора отклика Кх по формуле 1:

где ^-интенсивность пика иона стандарта кверцетина;

1ап- интенсивность пика иона аналита 3,5,4'-тригидрокси-трсшс-стильбена;

Cs, - количество внутреннего стандарта нанесённого на мишень;

Сап - количество аналита нанесённого на мишень.

Для оценки прямолинейности зависимости концентрации внутреннего стандарта от аналитического сигнала (отношение интенсивностей внутреннего стандарта и аналита) построен калибровочный график в координатах Сста„. дарта, мкг/мл - IJIa„. (рИСуНОК 11).

(1)

0,2 -

0 -I-,-,-,-,-,-,

0 0,05 0,1 „ 0,15 0,2 0,25 0,3 С стандарта, мкг/мл

Рисунок 11 - Калибровочный график зависимости концентрации внутреннего стандарта кверцетина от отношения интенсивностей внутреннего стандарта и аналита

Из приведённого графика следует, что отношение Ist/Ian к концентрации стандартного раствора имеет прямолинейную зависимость. Это указывает на то, что отношение площадей пиков ионов аналита и внутреннего стандарта остается постоянным.

Конечная формула расчётадля аналита выглядит следующим образом (формула 2):

Сх = Кхх х 1ап (2)

где Кх - фактор отклика;

Cst - количество внутреннего стандарта нанесённого на мишень;

Ist-интенсивность пика иона стандарта;

1ап- интенсивность пика иона аналита.

Относительную ошибку определяли в ходе 7 параллельных измерений разных образцов анализируемого раствора. Полученные данные подвергали-статистической обработке. Результаты определения содержания 3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена в субстанции методом масс-спектрометрии представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты определения 3,5,4'-тригидрокси-/яра/1с-стильбена в субстанции методом масс-спектрометрии

№ Масса на- Содержание 3,5,4'-тригидрокси- S АХ е,%

п/п вески, г транс-стильбена (Х),%

1. 0,102 99,6

2. 0,103 105,6

3. 0,103 105,5

4. 0,102 98,86 1,49

5. 0,101 96,8 3,6 3,66

6. 0,101 96,43

7. 0,102 97,2

Х = 100,0%

Данные таблицы 5 показывают, что относительная ошибка единичного определения методом масс-спектрометрии с вероятностью 95% не превышает 5,0%, что укладывается в пределы, регламентируемые ГФ и для 3,5,4'-тригидрокси-/иранс-стильбена составила ±3,66%.

Подтверждением отсутствия систематической ошибки были проведённые опыты с добавками СО 3,5,4'-тригидрокси-отра«с-стильбена (таблица 6).

Таблица 6 - Результаты опытов с добавками СО 3,5,4'-тригидрокси-отрянс-стильбена для методики количественного

определения его в с; убстанции

Взято, г Добавлено СО, г Должно быть, г Найдено, г Ошибка

Абсолютная, г Относительная, %

0,1 0,025 0,125 0,127 +0,002 1,57

0,1 0,05 0,15 0,148 -0,002 1,35

0,1 0,075 0,175 0,178 +0,003 1,68

0,1 0,1 0,2 0,197 -0,003 1,52

Опыты с добавками СО для 3,5,4'-тригидрокси-/?транс-стильбена методики количественного определения 3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена в субстанции показали, что относительная ошибка не превышает погрешности точечного эксперимента и имеет отклонения в сторону положительных и отрицательных величин, что исключает присутствие систематической погрешности.

Проведена валидация методик количественного определения и идентификации 3,5,4'-тригидрокси-тр<яностильбена методом масс-спектрометрии.

Характеристики правильности и прецизионности методики количественного определения 3,5,4'-тригидрокси-/я/?а«остильбсна изучались на исследуемой субстанции в модельных смесях с концентрацией от 80% до 120% содержания по отношению к СО 3,5,4'-тригидрокси-/и/7анс-стильбена с концентрацией 100%, что соответствует диапазону применения данной методики (таблица 7).

Таблица 7 - Статистическая обработка результатов анализа

модельных смесей, содержащихот 80 % до 120 %3,5,4'-_тригидрокси-/ира»с-стильбена_

Среднее 100,17

Относительное стандартное отклонение, Бг, % 1,16

Относительный доверительный интервал Д,% - 1(95%,7)х8г 2,714

Критическое значение для сходимости результатов, тахДАв, % 6,4

Систематическая погрешность, 5=2ср -100 0,17

Критерий незначимости систематической погрешности 1) 5<Д/3 выполняется

2) если не выполняется1), то 5<2.0 выполняется

Общий вывод о методике корректна

Представленные в таблице результаты позволяют утверждать, что для 3,5,4'-тригидрокси-/я/;а«с-стильбена данная методика характеризуется надлежащей правильностью и прецизионностью в исследованном отрезке концентраций (от 80 % до 120 %) и является корректной. В указанном промежутке концентраций методика не имеет значительной систематической погрешности.

Линейность методик также изучали в диапазоне концентраций 3,5,4'-тригидрокси-/м/;ш/с-стильбена от 80% до 120% по отношению к СО. Обнаружено, что требования к параметрам линейности выполняются, то есть линейность методики существует в отрезке концентраций от 80% до 120% от номинального значения (рисунок 12).

130 -| 125 -120 115 -110 -105 -^рЮО ->.-95 -90 -85 -80 -75 -70 -70

Рисунок 12 - Линейная зависимость 1«/1ап пика от концентрации 3,5,4'-тригидрокси-/иранс-стильбена в нормализованных координатах

Таким образом, методика количественного определения испытуемой субстанции валидирована на отрезке 80 % - 120 % от заложенного значения по следующим характеристикам: специфичность, правильность, прецизионность, линейность и диапазон применения и является корректной.

Для сравнения предлагаемого варианта масс-спектрометрии нами также изучены количественные показатели субстанции 3,5,4'-тригидрокси-шрянс-стильбена с использованием ОФ ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрии и ацетилирования с алкалиметрическим завершением.

Сравнительную оценку полученных результатов количественного определения 3,5,4'-тригидрокси-л?ря«с-стильбена разработанными методами проводили по критериям экспрессности (время выполнения анализа), чувствительности и воспроизводимости. Полученные результаты приведены в таблице 8.

у = 1,002х - 0,087 R2 = 0,993

85 90

95 100 105 110 115 120 125 130

х,%

Таблица 8 - Результаты сравнительной оценки методик количественного определения 3,5,4'-тригидрокси-/ирд»с-стильбена

Метод анализа Время выполнения единичного анализа, мин Чувствительность анализа, мг/мл Погрешность определения

Масс-спектрометрия 2-4 1,2x10"* 3,6

УФ-спектрофотометрия 2-4 4x10"3 3,05

ОФ ВЭЖХ 30 1,5x10"" 3,18

Ацетилирование 60 400 2,0

При сравнительной оценке указанных выше методов с МАЬМТОР/МБ в отношении 3,5,4'-тригидрокси-/ярднс-стильбена все методы были признаны адекватными.

Результаты, приведенные в таблице 8 указывают, что метод масс-спектрометрии имеет преимущества по критерию экспрессности и чувствительности перед другими вариантами. Критерий погрешности настоящего метода сопоставим с УФ-спектрофотометрией и ОФ ВЭЖХ.

Разработаны методики количественного определения субстанции кар-нозина с помощью косвенной йодометрии, прямого ацидиметрического титрования, метода ОФ ВЭЖХ в изократическом режиме. При количественном определении методом МАЬШТОР/МБ в качестве внутреннего стандарта использован пептид - глутатион. При сравнительном анализе представленных методик установлено, что методы ОФ ВЭЖХ и прямой ацидиметрии вполне адекватны МАЬБШОР/МБ, в отличие от метода косвенной йодометрии.

Осуществлено исследование количественных показателей субстанции лоратадина с помощью ОФ ВЭЖХ в изократическом режиме, УФ-спектрофотометрии, метода МАЮ1/ТОР/МБ (внутренний стандарт -СО кофеина). Сравнительная оценка МАЮГ/ТОР/МБ с ОФ ВЭЖХ и УФ-спектроскопией доказала адекватность использованных методов анализа в отношении изучаемого соединения.

Таким образом, разработан набор методик контроля качества 3,5,4'-тригидрокси-/я£>днс-стильбена, лоратадина и карнозина по количественным характеристикам, пригодный для их определения в различных лекарственных объектах. Метод МАЬБ1/ТОР/МИ показал преимущества по критериям «экс-прессность» и «чувствительность» перед другими использованными методами.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА НОРМАТВНОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ НА ОТДЕЛЬНЫЕ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ, РАССМОТРЕННЫЕ В ХОДЕ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты, приведённые в настоящей главе, касаются разработки нормативной документации на метод масс-спектрометрии в виде ОФС и некоторые растительные объекты, изученные в ходе наших исследований. В частности, предложены проекты ФС на травубудры плющевидной - С/ссАо/яа

hederacea L. и репешка обыкновенного - Agrimonia eupatorio L.,a также переработана ФС «Плоды черёмухи».

Опираясь на итоги проработки отечественной и зарубежной литературы, и результаты собственных исследований, убедительно продемонстрированы возможности метода масс-спектрометрии. В связи с этим актуальность разработки НД на указанный метод является бесспорной.

Разработанная нами нормативная документация «Масс-спектрометрия» включает такие традиционные для ОФС разделы как:

- общие положения - рассмотрены имеющиеся на сегодня классические и современные методы масс-спектрометрии с описанием механизмов ионизации;

-прибор - указаны основные узлы приборов масс-спектрометров и принцип их действия;

-методика - описывается пробоподготовка образцов для регистра-циимасс-спектров;

— области применения в фармации - перечислены области использования масс-спектрометрии в фармации.

Необходимость переработки ФС на плоды черёмухи обыкновенной -Padus avium Mili, вызвана следующими обстоятельствами. Действующая в настоящее время НД на Р. avium не отвечает требованиям современной науки, предъявляемым к растительному сырью, поскольку устарела и требует пересмотра. Действующая НД предусматривает стандартизацию сырья по таким показателям, как влага, зола, содержание примесей, содержание дубильных веществ методом титриметрии, что не позволяет объективно оценить качество сырья. Поэтому нами существенно переработана ФС на плоды Р. avium. В качестве индикатора качества плодов Р. avium нами выбраны антоцианы, которые, как известно, являются достаточно лабильной группой веществ и уменьшение их содержания является объективным доказательством снижения качества сырья.

Разработка ФС на траву A. eupatorio обусловлена тем, что в настоящее время нормы качества настоящего объекта не разработаны.

Проведённые нами химические исследования травы G. hederacea позволяют утверждать, что обладая набором ценных химических компонентов, весьма важных в фармакологическом отношении, настоящее растение может представлять интерес для практической медицины. Поскольку нормативной документации на сырьё данного растения в России не существует, поэтому разработан проект фармакопейной статьи на траву G. hederacea.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Полученные экспериментальные данные показали объективные аналитические преимущества метода МАЮ1/ТОР/МБ перед альтернативными при исследовании качественных характеристик ряда тест-препаратов природного и синтетического происхождения. Применение данного метода исключает длительную пробоподготовку, использование образцов сравнения и соблюдения специфических условий анализа для данного конкретного вещества.

2. В ходе исследования предложен набор оригинальных методик идентификации следующих тест-соединений различного происхождения: пептиды (карнозин), органические основания (лоратадин), представители по-лифенольного ряда (3,5,4'-тригидрокси-отрдне-стильбен, флавоноиды, анто-цианы), липиды (триацилглицериды). При этом исследованы объекты различного происхождения и использованы такие методы качественного анализа, как: цветные реакции, УФ- и ИК-спектроскопия, ТСХ, ОФ ВЭЖХ, ГЖХ, МЛЬШ/ТОР/МБ, титриметрия.

3. При исследовании отдельных соединений выявлены дополнительные аналитические возможности, предоставляемые методом МАЬО//ТОР/МБ. А именно, при изучении карнозина установлено, что фрагментация его молекулы с образованием гистидина может рассматриваться в качестве маркера. В случае анализа жирных масел показана возможность контроля результатов гидролиза триглицеридов и определения состава жирных кислот.

4. Комплекс проведённых экспериментов позволил констатировать, что при анализе соединений полифенольной природы (флавоноиды, анто-цианы) использование МАЮитОР/МБ оказалосьболее полезным для групповой характеристики, когда необходимо подтвердить присутствие искомых компонентов в известных объектах. Для индивидуальной характеристики и количественной оценки компонентов в неизвестном объекте более предпочтительной оказалась ОФ ВЭЖХ. Результаты анализа жирных масел показали, что метод МАЮ1/ТОР/МБ характеризуется значительно большей экспресс-ностью по сравнению с традиционным методом анализа этой группы веществ - ГЖХ, а полученный объём информации позволяет сделать объективный вывод о составе жирных масел.

5. Теоретически обоснована и доказана в эксперименте возможность количественного определения биологически активных соединений различной природы методом МАЬБРТОР/МБ с использованием принципа внутренней стандартизации. Для исследованных тест-объектов разработаны оригинальные методики количественного анализа методом МАЬ01/Т0Р/МБ, проведена их валидация и сравнительная оценка с альтернативными методами анализа изучаемых веществ. Установлено, что валидационная оценка разработанного метода МАЮ1/ТОР/МБ во всех рассмотренных случаях признана корректной. При сравнительной оценке МА ЬО!/ТОР/МБ в случае шранс-резвератрола с ОФ ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрией и ацетилированием с алкалиметриче-ским завершением методы были признаны адекватными друг другу. При количественном определении карнозина сравнительный анализ показал, что

методы ОФ ВЭЖХ и прямой ацидиметрии вполне адекватны MALDI/TOF/MS, в отличие от метода косвенной йодометрии. Сравнительная оценка MALDI/TOF/MS с ОФ ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрией при количественном определении лоратадина доказала адекватность использованных методов анализа в отношении изучаемого соединения. Разработанный набор методик контроля качества гарамс-резвератрола, лоратадина и карнозина по количественным характеристикам пригоден для их определения в различных лекарственных объектах. Метод MALDI/TOF/MS показал преимущества по критериям «экспрессность» и «чувствительность» перед другими использованными методами.

6. На основании объёма и полноты проведённых исследований разработан пакет проектов следующих нормативных актов: ОФС «Масс-спектрометрия», ФС «Трава будры плющевидной», «Трава репешка обыкновенного», переработана ФС «Плоды черёмухи». Предложенный пакет проектов фармакопейных статей принят к рассмотрению Центром фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. Проект ФС «Трава будры плющевидной» подготовлен к рассмотрению.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ, ОПУБЛИКОВАННЫХ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДУЕМЫХ ПЕРЕЧНЕМ ВАК:

1. Фармакологическая характеристика резвератрола / Г. В. Васильев, О. О. Новиков, ... Д. И. Писарев // Человек и его здоровье. - Курск, 2007. -№ 3. - С. 97-104.

2. Разработка методик идентификации резвератрола в модельной смеси / Г. В. Васильев, Т. С. Киселёва, ... Д. И. Писарев [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - Тула, 2008. - Т. XV, № 2. - С. 25-26.

3. Современное состояние и тенденции развития рынка антоциансо-держащих биологически активных добавок / Е. Т. Жилякова, О. О. Новиков, Д. И. Писарев [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - Тула, 2008.-Т. XI, № 1.-С. 192.

4. Применение спектрофотометрии для количественного определения 3,5,4'-тригидроксистильбена в мягкой лекарственной форме / Г. В. Васильев, Е. Т. Жилякова, ... Д. И. Писарев [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - Тула, 2008. - Т. XV, № 2. - С. 207-208.

5. Жирнокислотный состав семян Oenothera biennis L. флоры Белгородской области / Д. И. Писарев, Е. Т. Жилякова, Н. Н. Нетребенко [и др.] // Химия растительного сырья. - 2010. -№ 1. - С. 195-196.

6. Изучение флавоноидного состава шишкоягод можжевельника длиннохвойного / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, М. Ю. Новикова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 150, № 12.-С. 657-660.

7. Изучение флавоноидного состава цветков клевера лугового / О. О. Новиков, Д. И. Писарев, В. Н. Сорокопудов [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Естественные науки. - 2010. - № 21, вып. 13. - С. 113-117.

8. Изучение черёмухи виргинской - Padus virginiana как перспективного источника биологически активных полифенолов / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, М. Д. Безменова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Естественные науки. — 2010. - № 21, вып. 13. - С. 118-122.

9. Тимошенко, Е. Ю. Разработка состава модельной смеси для получения препарата с гипохолестеринемическим действием / Е. Ю. Тимошенко, Д. И. Писарев, О. С. Воронкова // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12/2. - С. 32-35.

10. Исследование стехиометрии комплекса карнозин-Cu [И] и его использование в количественном определении карнозина / Д. А. Фадеева, М. А. Халикова, ... Д. И. Писарев [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12/2. - С. 94-97.

11. Применение прямой ацидиметрии для количественного определения карнозина // Д. А. Фадеева, М. А. Халикова, ... Д. И. Писарев [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12/2.-С. 98-100.

12. Стандартизация новой детской лекарственной формы для лечения аллергии - гранул с лоратадином / Е. Т. Жилякова, О. О. Новиков, ... Д. И. Писарев [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12/2. - С. 101-105.

13. Хроматографическое изучение состава жирного масла семян энотеры двулетней / О. О. Новиков, Д. И. Писарев, Е. Т. Жилякова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12/2.-С. 106-109.

14. Писарев, Д. И. Разработка экспресс-метода определения кароти-ноидов в сырье растительного происхождения / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, Т. А. Романова // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. -2010.-№22, вып. 12/2.-С. 119-122.

15. Химическое изучение биологически активных полифенолов некоторых сортов рябины обыкновенной - Sorbus aucuparia / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, В. Н. Сорокопудов [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12/2. - С. 123-128.)

16. Лесовая, Ж. С. Разработка методики стандартизации травы репеш-ка обыкновенного Agrimonia eupatorio по флавоноидам / Ж. С. Лесовая, Д. И. Писарев, О. О. Новиков // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация.-2010.-№22, вып. 12/2.-С. 150-154.

17. Изучение черёмухи поздней - Padus serótina (Ehrh.) Agardh. как перспективного источника биологически активных полифенолов / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, М. Д. Безменова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. -№ 22, вып. 12/2. - С. 155-161.

18. Применение титриметрических методов анализа для количественного определения карнозина / Д. А. Фадеева, В. И. Кочкаров, ... Д. И. Писарев [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 2. -С. 170-174.

19. Химическое изучение флавоноидов будры плющевидной (Glechomae hederaceae L.). / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, В. Н. Сорокопудов [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Естественные науки. - 2011. -№ 3, вып. 14.-С. 179-185.

20. Жирнокислотный состав семян отборных форм ореха грецкого {Juglans regia L.), интродуцированного в Белгородской области / В. Н. Сорокопудов, А. А. Зинченко, ... Д. И. Писарев [и др.] // Научные ведомости Бел-ГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. - № 4, вып. 13/2. - С. 174-177.

21. Изучение флавоноидного состава травы лофанта анисового / О. С. Воронкова, Д. И. Писарев, О. О. Новиков [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация.-2011 .-№4, вып. 13/2.-С. 186-191.

22. Особенности химического состава плодов Ribes nigrum L в условиях Белгородской области / Е. И. Шапошник, В. Н. Сорокопудов, ... Д. И. Писарев [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация.-2011.-№4, вып. 13/2.-С. 192-195.

23. Фитохимическое изучение плодов шиповника колючейшего флоры Северного Кавказа / О. О. Новиков, Д. И. Писарев, Е. Т. Жилякова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152, № 8.-С. 176-178.

24. Изучение состава антоцианов ирги ольхолистной - Amelanchier alnifolia Nutt. с использованием матрично-активированной лазерной десорб-ционной ионизации (MALDI) / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, Н. А. Писарева [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. -№22, вып. 16/2.-С. 167-172.

25. Способ выделения и идентификации тилианина / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, О. С. Воронкова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация.-2011.-№ 22, вып. 16/2.-С. 176-181.

26. Использование хромато-масс-спектрометрии для обнаружения резвератрола в объектах растительного происхождения / О. О. Новиков, Д. И. Писарев, М. Ю. Новикова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. - № 22, вып. 16/2. - С. 182-184.

27. Изучение состава антоцианов смородины черной - Ribes nigrum L. с использованием матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, Н. А. Писарева [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. - № 22, вып. 16/2.-С. 185-187.

28. Писарев, Д. И. Классические и современные методы масс-спектрометрии [Электронный ресурс] / Д. И. Писарев // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2012. - № 10, вып. 18/2. - С. 5-11. -Режим доступа: http://unid.bsu.edu.ru/upload/iblock/d9e/kl0dl29v_18_2.pdf.

29. Писарев, Д. И. Транс-резвератрол - перспективное биологически активное соединение [Электронный ресурс] / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, Г. В. Васильев // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. -2012. - № ю, вып. 18/2. - С. 12-16. - Режим доступа: http://unid.bsu.edu.ru/upload/iblock/d9e/kl0dl29v_18_2.pdf.

30. Биологическая активность полифенолов растительного происхождения: перспектива использования антоцианов в медицинской практике [Электронный ресурс] / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, О. А. Селютин [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2012. -№ 10, вып. 18/2. - С. 17-24. - Режим доступа: http://unid.bsu.edu.ru/upload/iblock/d9e/kl0dl29v_18_2.pdf.

31. Опыт использования метода МАЬ01/Т0Р/М8 в фармацевтическом анализе [Электронный ресурс] / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, Г. В. Васильев [и др.] II Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2012. -№ 10, вып. 18/2. - С. 76-85. - Режим доступа: http://unid.bsu.edu.ru/upload/iblock/d9e/kl0dl29v_18_2.pdf.

32. Писарев, Д. И. Результаты сравнительных исследований варианта внутреннего стандарта МАЬВ1/ТОР/М8 с другими методами количественного анализа резвератрола [Электронный ресурс] / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, Г. В. Васильев // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2012. - № 10, вып. 18/2. - С. 86-93. - Режим доступа: http://unid.bsu.edu.ru/upload/iblock/d9e/kl0dl29v_18_2.pdf.

33. Изучение химического состава травы будры плющевидной и разработка на её основе лекарственной формы [Электронный ресурс] / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, А. С. Шабельникова [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 4. - С. 307. - Режим доступа: 11йр://8аепсе-education.ru/104-6666.

34. Новиков, О. О. Изучение флавоноидов клевера лугового с использованием матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации [Электронный ресурс] / О. О. Новиков, Д. И. Писарев, М. А. Журавель // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 4. - Режим доступа: http://science-education.ru/104-6653.

35. Использование метода матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации для анализа флавоноидных гликозидов в объектах растительного происхождения [Текст] / О. О. Новиков, Д. И. Писарев, Е. Т. Жиля-кова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. -Т. 154, №9. -С. 387-391.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ, ДОЛОЖЕННЫЕ НА КОНФЕРЕНЦИЯХ:

1. Писарев, Д. И. Обзор современного состояния исследований в области систематики, химии и фармакологии рода .Титретв Ь / Д. И. Писарев // Современные проблемы фитодизайна : материалы междунар. науч.-практ. конф., Белгород, 28-31 мая 2007 г. / БелГУ. - Белгород, 2007. - С. 296-304.

2. Применение масс-спектрометрии для анализа 3,5,4'-тригидроксистильбена (резвератрола) / Г. В. Васильев, О. О. Новиков, ... Д. И. Писарев [и др.] // Фармация из века в век : сб. науч. тр. / Санкт-Петерб. хим.-фарм. акад. - СПб., 2008. - Часть III : Анализ и стандартизация лекарственных средств. — С. 167-170.

3. Разработка новых антисеборейных препаратов на основе резверат-рола / Д. А. Фадеева, Т. С. Киселёва, ... Д. И. Писарев [и др.] // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 1. - С. 35. - (XIII Междунар. конгр. по реабилитации в медицине и иммунореабилитации ; Всемир. форум по астме, Дубай (ОАЭ), 26-29 апр. 2008 г.)

4. Разработка методики количественного определения резвератрола в жидкой лекарственной форме для наружного применения / Т. С. Киселёва, Д. И. Писарев, О. О. Новиков[и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. тр. / Пятигор.гос. фарм. акад. ; под ред. М. В. Гаврилина. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. -С. 265-267.

5. Разработка методики идентификации резвератрола в креме / Д. А. Фадеева, Д. И. Писарев, О. О. Новиков [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. тр. / Пятигор.гос. фарм. акад.; под ред. М. В. Гаврилина. - Пятигорск. 2008. - Вып. 63. -С. 348-351.

6. Виды родов Padus Mill и Amelanchier Medik в условиях города Белгорода / Н. А. Мартынова, А. В. Анциферов, Д. И. Писарев [и др.] // Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновац. решения : материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 10-летию образования Ботан. сада Белгор. гос. ун-та, Белгород, 18-21 мая 2009 г. / БелГУ, Гл. Ботан. сад им. Н. В. Цицина, Белгор. отд-ние рус. ботан. о-ва ; редкол.: В. К. Тохтарь, В. Н. Сорокопудов, О. О. Новиков [и др.]. - Белгород, 2009.-С. 329-331.

7. Разработка методики количественного определения ацетилирован-ного 3,5,4'-тригидроксистильбена методом косвенной нейтрализации в жидкой лекарственной форме / Т. С. Полухина, О. О. Новиков, ... Д. И. Писарев [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : [материалы 65-й регион, конф. по фармации и фармакологии, Пятигорск, 18-22 янв. 2010 г. : сб. науч. тр.] / Пятигор. гос. фарм. акад. ; под ред. М. В. Гаврилина. - Пятигорск, 2010. - С. 373-375.

8. Изучение антоцианов черёмухи поздней - Padus serótina (Ehrh.) Agardh / О. О. Новиков, Е. А. Томчаковская, Д. И. Писарев [и др.] // Традиции и инновации фармацевтической науки и практики : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 45-летию фармац. фак. КГМУ, Курск, 27 окт. 2011 г. / Курск, гос. мед. ун-т [и др.] ; [под ред. В. А. Лазаренко и др.]. - Курск, 2011. - С. 327-330.

ТЕХНИЧЕСКИЕ РЕШЕНИЯ, ПРЕДЛОЖЕННЫЕ

В ДИССЕРТАЦИИ, ЗАЩИЩЕНЫ ПАТЕНТАМИ И НОУ-ХАУ:

1. Способ количественного определения резвератрола : пат. 2390772 Рос. Федерация : МПК G01N30/90 / Г. В. Васильев, О. О. Новиков, ... Д. И. Писарев [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО БелГУ. -№ 2009113845/28 ; заявл. 13.04.2009 ; опубл. 27.05.2010.

2. Способ идентификации резвератрола : пат. 2385457 Рос. Федерация : МПК GO 1 N30/94 / О. О. Новиков, Г. В. Васильев, ... Д. И. Писарев [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО БелГУ. - № 2008143376/28 ; заявл. 31.10.2008 ; опубл. 27.03.2010.

3. Способ количественного определения органических соединений: пат. 2469315 Рос. Федерация : МПК G01N 30/72/ Новиков О. О., Писарев Д.И., Жилякова Е.Т. [и др.] ; заявитель и патентообладатель ФГАОУ ВПО БелГУ №2011119370/28, заявл. 13.05.2011 ; опубл. 10.12.2012.

4. Способ выделения и идентификации флавоноидов : свидетельство № 42 о регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности / О. О. Новиков, Е. Т. Жилякова, ... Д. И. Писарев [и др.] : правообладатель ФГАОУ ВПО НИУ БелГУ. - заявл. 16.06.2011 ; зарегистр.

17.06.2011.

5. Способ количественного определения органических соединений методом масс-спектроскопии с лазерной десорбцией/ионизацией : свидетельство № 72 о регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности / О. О. Новиков, М. Ю. Новикова, ... Д. И. Писарев [и др.] : правообладатель ФГАОУ ВПО НИУ БелГУ. - заявл. 15.02.2012 ; зарегистр.

24.02.2012.

МОНОГРАФИИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОСОБИЯ

1. Дикорастущие лекарственные растения юго-запада Среднерусской возвышенности: ареал, морфология, фитохимия, применение, препараты / В. Н. Сорокопудов, О. О. Новиков, ... Д. И. Писарев [и др.] ; под ред. В. Н. Сорокопудова. - М. : Рос. акад. мед. наук, 2009. - 228 с.

2. Методическое пособие для студентов к практическим занятиям и самостоятельной работе по фотохимическому анализу курса фармакогнозии для студентов фармацевтического факультета : учеб. пособие / О. О. Новиков, Н. Н. Нетребенко, ... Д. И. Писарев [и др.] - Белгород : ПОЛИТЕРРА, 2009,- 149 с.

3. Учебно-методическое пособие для самостоятельной подготовки студентов к практическим занятиям по курсу фармакогнозии / Н. Н. Нетребенко, Д. И. Писарев, В. Н. Сорокопудов [и др.] - Белгород : НИУ «БелГУ», 2011. -120 с.

Список сокращений

БАВ биологически активные вещества

ГЖХ газожидкостная хроматография

ГФ государственная фармакопея

ИК инфракрасная

МАЛДИ или матрично активированная лазерная десорбция/ионизация МАЬШ/Т0Р/М8 или тШпх-аз$1з(ес11а5егс1езогриоп/ют2аНоп

ОФ ВЭЖХ обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография

ОФС общая фармакопейная статья

СО стандартный образец

ТАГ триацилглицериды

ТСХ тонкослойная хроматография

УФ ультрафиолетовая

ФС фармакопейная статья

Подписано в печать 06.03.2013. ГарнитураТ1тезКе\уЯотап Формат 60х84/16.Усл. п. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 87. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован вИД «Белгород»НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85