Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое изучение сабельника болотного, сухого экстракта на его основе и их стандартизация

На правах рукописи

□□3053913

Жукова Ольга Леонидовна

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО, СУХОГО ЭКСТРАКТА НА ЕГО ОСНОВЕ И ИХ СТАНДАРТИЗАЦИЯ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2007 г

003053913

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Даргаева Тамара Дарижаповна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Кандидат фармацевтических наук

Дементьева Наталья Николаевна Кашникова Марина Вадимовна

Ведущая организация:

Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора

Защита состоится « &» — 2007 г в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г.Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук А.И.Громакова

Актуальность темы

Хронические воспалительные и дегенеративные заболевания опорно-двигательного аппарата (ОДА), принося страдание людям и огромные экономические потери обществу во многих странах мира, являются одной из важнейших медико-социальных проблем. В России за последние 10 лет заболеваемость по этой группе патологий возросла более чем на 40 %. Ревматические заболевания даже без учета остеопоретических переломов -вторая (после респираторных болезней) причина временной нетрудоспособности и самая частая причина инвалидизации у лиц старше 65 лет. Широкая распространенность указанных расстройств обусловливает необходимость разработки новых эффективных средств их профилактики и лечения.

Все группы противовоспалительных средств, применяемых для лечения заболеваний ОДА считаются в той или иной степени эффективными средствами устранения симптомов воспалительной реакции и улучшения состояния больного. Однако их применение зачастую связано с развитием побочных эффектов, требующих либо снижения терапевтической дозы, либо полной отмены препарата и в ряде случаев приема дополнительных лекарственных средств.

В отличие от синтетических, препараты растительного происхождения обладают малой токсичностью и лучшей переносимостью, что позволяет гораздо шире использовать фитопрепараты для симптоматического, профилактического и продолжительного лечения, а также противорецидивной терапии хронических воспалительных заболеваний. Ассортимент растительных противовоспалительных лекарственных средств и биологически активных добавок к пище в настоящее время весьма ограничен.

В связи с этим поиск новых видов лекарственных растений с целью создания на их основе фитопрепаратов, предназначенных для профилактики и лечения заболеваний ОДА, является актуальной задачей. Перспективными в этом отношении представляется сабельник болотный Comarum palustre L. Применение в народной медицине сабельника болотного при ревматических заболеваниях, а также наличие достаточной сырьевой базы для промысловых заготовок сырья этого растения представляет особый интерес для фитохимического и фармакологического исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является фитохимическое изучение подземной части сабельника болотного, разработка технологии получения сухого экстракта и их стандартизация.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- исследовать химический состав подземных органов сабельника болотного, провести наработку фракций отдельных групп биологически

активных веществ и индивидуальных соединений для биотестирования и фармакологического скрининга;

- разработать методики качественного и количественного определения суммы полифенольных соединений и других критериев качества подземных органов сабельника болотного; оформить технические условия (ТУ) на новый вид лекарственного растительного сырья (ЛРС);

- установить закономерности экстракции фенольных соединений и других экстрактивных веществ из указанного ЛРС; разработать технологическую схему получения сухого экстракта, позволяющую проводить максимальное извлечение БАВ, оформить лабораторный регламент;

- с учетом масштабирования осуществить наработку сухого экстракта в условиях завода для фармакологического и токсикологического изучения; составить опытно-промышленный регламент;

- исследовать химический состав, технологические свойства и разработать показатели качества для сабельника болотного сухого экстракта, разработать проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП).

Научная новизна работы

Информационно-аналитическими исследованиями показана

необходимость разработки лекарственного средства, применяемого для лечения заболеваний ОДА.

На основании макро- и микроскопического анализа установлены значимые диагностические признаки сырья сабельника болотного.

Адаптированным методом ВЭЖХ с использованием достоверных образцов охарактеризован качественный состав полифенольного комплекса сабельника болотного.

Проведена идентификация моносахаридов после гидролиза полисахаридного комплекса с помощью хроматографии в тонком слое сорбента.

Дана количественная оценка содержания аминокислот и микроэлементов, установлен качественный состав жирных кислот в исходном сырье и сухом экстракте.

Избирательной экстракцией с последующей перекристаллизацией выделен (+)-катехин, который охарактеризован по данным УФ-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, по температуре плавления и пробе смешения с аутентичным образцом.

Установлены закономерности извлечения экстрактивных веществ и полифенольных соединений из растительного сырья в зависимости от степени измельчения сырья, типа экстрагента, соотношения сырье-экстрагент, гидродинамических условий, позволяющих разработать способ получения сабельника болотного экстракта сухого. Проведено масштабирование процесса производства сухого экстракта в условиях реального производства.

Подобраны условия анализа полифенольных соединений в растительном сырье и сухом экстракте, которые позволили разработать сквозную методику стандартизации от сырья к лекарственному средству.

Приоритет научных исследований подтвержден оформлением заявки №2006127837 от 02.08.2006г на «Способ получения средства, обладающего противовоспалительной и диуретической активностью».

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- Технические условия ТУ 9377-158-04868244-2005 «Корневища с корнями сабельника болотного»;

- Проект ФСП «Сабельника болотного экстракт сухой» (Акт внедрения методики количественного определения суммы полифенольных соединений в сабельника болотного экстракте сухом в ГУЗ «ЦСиККЛ ДЗ»);

- Лабораторный регламент ЛР 04828244-50-05 и опытно-промышленный регламент ОПР 58171769-46-06 на производство сабельника болотного экстракта сухого (Акт внедрения на ЗАО «Фармцентр ВИЛАР);

- Заявка на патент № 2006127837 от 02.08.2006г «Способ получения средства, обладающего противовоспалительной и диуретической активностью».

Основные положения, выносимые на защиту

- результаты исследований по качественной и количественной оценки БАВ сабельника болотного и получаемого из него сухого экстракта;

- результаты исследований по разработке технологии получения сухого экстракта, включая установление закономерности выхода БАВ в зависимости от степени измельчения сырья, вида экстрагента, соотношения сырье-экстрагент, гидродинамических условий;

- результаты исследований по установлению критериев подлинности и норм содержания БАВ в сырье и сабельника болотного экстракте сухом, обеспечивающих сквозную стандартизацию от источника к лекарственному средству.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2005), Научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения д.м.н БазаронаЭ.Г. (Улан-Удэ, 2006), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Международной конференции, посвященной 75-летию образования ВИЛАР (Москва, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006), региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической промышленности» (Пятигорск, 2006)

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Работа выполнена по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ» на 2001-2005 и 2006-2010 гг.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, подана заявка на патент.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 145 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 135 источников, в том числе 34 иностранных, приложений. Работа содержит 33 рисунка и 28 таблиц.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании обзора данных литературы описан механизм возникновения воспаления и локализация действия противовоспалительных препаратов различных групп. Дана краткая характеристика номенклатуры лекарственных средств растительного происхождения и биологически активных добавок к пище (БАД), применяемых при воспалительных заболеваниях. Обоснована рациональность использования сабельника болотного в качестве основы для создания противовоспалительного лекарственного средства. Отражены особенности современного производства сухих экстрактов из растительного сырья.

В разделе «Объекты и методы исследования» приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Вторая глава посвящена фармакогностическому исследованию сабельника болотного корневищ с корнями, установлению показателей, позволяющих идентифицировать данное сырье и контролировать его качество.

В главе 3 представлены данные анализа состава биологически активных веществ подземной части сабельника болотного с использованием современных физико-химических методов.

В четвертой главе изложены результаты по подбору оптимальных условий и разработке рациональной технологии получения сабельника болотного экстракта сухого.

Пятая глава содержит сведения по изучению химического состава и установлению показателей качества сабельника болотного экстракта сухого.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили пробы от опытных партий корневищ с корнями сабельника болотного Comarum palustre L. сем. Розоцветные Rosaceae, заготовленные в фазу конца вегетации растения в Московской, Новгородской, Смоленской, Пензенской, Владимирской областях, республике Бурятия в 20032006 гг.

Отбор проб и анализ JIPC проводили по методикам ГФ XI и разработанными нами методами качественного и количественного определения полифенольных веществ. Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно статье «Техника микроскопического анализа» ГФ XI изд., вып.1с. 277-285. Поперечные срезы корневищ, укоренившихся стеблей, корней сабельника сделаны на салазочном микротоме, микрофотографии -камерой Axiocam IIRc на микроскопе Axiolmager Ml (объективы 2,5х - ЕС Plann-Neofluar).

Для выделения индивидуальных соединений использовали метод хроматографии на колонках с силикагелем Chemapol 40/100 ц (ЧССР). Для хроматографического контроля на этапах предварительной оценки элюатов и чистоты полученных веществ применяли метод хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) на пластинках «Silufol UV 254» размером 15x15 и пластинках «Sorbfil ПТСХ-ПА» размером 10x10 см. Обнаружение зон адсорбции полифенольных соединений производили после высушивания и обработки хроматограмм 1 % спиртовьм раствором железа окисного хлорида.

Идентификацию методом ТСХ моносахаридов осуществляли после обработки хроматограмм анилиновым реактивом. Все значения Необнаруженных соединений являются средними из пяти измерений.

При разработке методик качественного и количественного определения биологически активных веществ использован стандартный образец (+)-катехин гидрата фирмы «Sigma», кат. № С1251.

Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляли на приборе Gilson (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов анализа с помощью программы «Мультихром» для «Windows».

Изучение аминокислотного состава сырья и сухого экстракта сабельника болотного проводили на аминокислотном анализаторе LC-2000 Biotronik (Германия).

Исследование липофильной фракции сырья и экстракта сабельника проводили методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) на приборе Carlo Erba 5360 (Италия) с пламенно ионизационным детектором.

Спектры поглощения снимали на саморегистрирующем спектрофотометре Сагу 100 Sean Varían (США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Масс-спектр электронного удара получали на масс-спектрометре SSQ-710 Finnigan-MAT (США) с энергией ионизирующих электронов 70 эВ, нагревом ионизационной камеры до 150 °С и нагревом образца до 350 °С.

'Н-ЯМР-спектр метанольных растворов веществ снимали на приборе Gemini 200 Varian (США) с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилан фирмы «Мегск».

Температуру плавления индивидуального вещества определяли на блоке Кофлера.

Определение минерального состава, включая микроэлементы проводили на спектрографе ДФС-8 с плоской дифракционной решеткой методом эмиссионного спектрального анализа.

Оптимизацию технологии получения сабельника болотного экстракта сухого осуществляли на оборудовании цеха фитохимии ЗАО «Фармцентр ВИЛАР». В работе использовали экстрактор вместимостью 100 л с мешалкой лопастного типа, с подогревом и охлаждением, ротационный вакуум-выпарной аппарат, производительностью 20 л/ч, сепаратор, вакуумная сушилка.

Фармакологические и токсикологические исследования сабельника болотного экстракта сухого проводили в отделе медицины ВИЛАР и отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.

1. Фармакогностическое изучение сырья сабельника болотного и разработка методов контроля его качества

Обоснование наименования исследуемого сырья сабельника

Сырье сабельника болотного, используемое в народной медицине и для производства БАД, до сих пор не получало статуса официнального и системному фармакогностическому изучению не подвергалось. Особенности жизненной формы сабельника болотного, морфология его надземных побегов и корневищ, различные фазы развития растения, выбираемые для заготовки сырья, вызывало необходимость обоснования названия сырья этого растения. Для получения сухого экстракта предполагалось использовать подземные побеги сабельника болотного, которые соответствуют морфологической группе «Корневища с корнями». Однако при изучении внешних признаков образцов опытных партий цельного сырья установлено, что массовая доля кусков собственно корневищ с корнями составляла в среднем около 52 % сырья, а около 36 % представляли укоренившиеся стебли сабельника. Кроме того, хроматографическая картина зон адсорбции на ТСХ и УФ-спектры из частей растения, составляющих сырье, показывают, что состав фенольных веществ в укоренившихся стеблях растения аналогичен таковому в корневищах и корнях сабельника.

В связи с этим, новый вид лекарственного растительного сырья сабельника болотного, целесообразно назвать «Сабельника болотного корневища с

корнями - Comari palustris rhizomata cum radicibus», а укоренившиеся стебли сабельника следует считать естественной фракцией такого сырья.

Исследование морфологических и микроскопических признаков сырья

На основании изучения морфологических характеристик сырья 11 опытных партий нами составлено описание внешних признаков сырья сабельника болотного.

При микроскопическом исследовании выявлены диагностические признаки в анатомическом строении поперечных срезов корневища, укоренившегося стебля и корня: наличие перидермы с многослойной пробкой, аэренхимы, вторичной коры, древесины, сердцевинной паренхимы; определены признаки в микропрепаратах измельченного сырья сабельника. Кроме того, изучены микроскопрепараты остатков оснований черешков отмерших листьев, располагающихся в узлах укоренившихся стеблей. Диагностические признаки (клетки эпидермиса со слабо извилистыми стенками, устьица аномоцитного типа; простые одноклеточные волоски, места их прикрепления на эпидермисе, друзы оксалата кальция, располагающиеся рядами) предложено использовать для определения подлинности измельченного сырья.

Установление подлинности и разработка методики количественного определения полифенольных соединений в сырье

Для установления подлинности корневищ с корнями сабельника нами предложено использовать качественные реакции и метод ТСХ. Качественные реакции проводили на две группы БАВ: полифенольные соединения (с раствором железа окисного хлорида) и полисахариды (реакция осаждения 96 % спиртом). Для установления наличия (+)-катехина использовали хроматографию в тонком слое сорбента со стандартным образцом.

Учитывая, что соединения фенольного характера, являясь основой многих фитопрепаратов, обладают выраженным противовоспалительным действием, которое присуще представителям всех классов и групп растительных фенолов -от фенолокислот до конденсированных фенолов и в соответствии с поставленной задачей нами разработана методика количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин в сырье сабельника. В ходе исследований нами подобраны оптимальные условия экстракции этих БАВ: аналитическую пробу сырья измельчают до частиц, размером не более 3 мм, экстракцию ведут при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч, в качестве экстрагента используют 50 % спирт при соотношении сырье:экстрагент 1:50.

При сравнении УФ-спектров спиртового раствора (+)-катехина и извлечения из сырья сабельника болотного видно, что при длине волны 279 нм наблюдается интенсивный максимум поглощения (рисунок 1) Эти данные позволяют использовать в качестве аналитической длину волны 279 нм и проводить количественное определение суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин.

Wavelength (nm)

Рис. 1. УФ-спектры поглощения раствора (+)-катехина (1) и 50 % спиртового извлечения из сырья сабельника (2)

Расчет содержания суммы полифенолов осуществляли с использованием удельного показателя поглощения, значение которого установлено нами экспериментально на стандартном образце (+)-катехина фирмы «Sigma». Для подавления ионизации фенольных гидроксилов и установления определенного значения рН при количественном определении измерение оптической плотности проводили в спирте этиловом 50 %, подкисленном 1 % раствором кислоты хлористоводородной.

Метрологические характеристики разработанной методики свидетельствуют об удовлетворительной ее воспроизводимости (таблица 1).

Таблица 1

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин в корневищах с __ корнями сабельника болотного __

f X ' S S Р,% t(f,P) АХ Е,%

9 13,62 0,7889 0,8882 95 2,23 0,6263 ±4,6

Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были поставлены эксперименты с добавками (+)-катехина непосредственно в навеску сырья пред началом экстракции. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты опытов с добавками (+)-катехина в навеску сырья

Найдено Добавлено Должно Найдено, Относительная

полифенольных (+)-катехина, быть, г г ошибка, %

соединении в сырье, г г

0,2360 0,0024 0,2384 0,2459 + 3,13

0,2433 0,0039 0,2472 0,2468 -0,16

0,2495 0,0059 0,2554 0,2505 - 1,90

Относительная ошибка результатов опытов с добавками не превышает относительную ошибку единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки в предлагаемой методике анализа.

Изучение динамики накопления в сырье суммы полифенольных соединений в зависимости от фазы вегетации растения и места сбора сырья При изучении динамики накопления суммы полифенольных соединений в зависимости от фазы вегетации растения установлено, что наибольший уровень их в сырье отмечается в фазу плодоношения и увядания растения, поэтому заготовку сырья следует проводить осенью. Содержание полифенольных веществ в сырье из разных географических зон его произрастания колеблется от 10,19 % до 14,2 %. В связи с этим норму по этому показателю нормативном документе на новый вид сырья предлагается установить не менее 10 %

Разработка нормативной документации на сырье сабельника болотного На основании проведенных исследований оформлены и утверждены технические условия ТУ 9377-158-04868244-2005 на новый вид лекарственного сырья «Корневища с корнями сабельника болотного». В данном НД установлены следующие показатели: содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин не менее 10 %; влажность не более 13 %; содержание золы общей не более 6 %; содержание золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 2 %; содержание других частей растения (зеленых стеблей, черешков, листовых пластинок, соцветий, плодов), в т.ч. отделенных при анализе, не более 12 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм не более 5 %, содержание органической примеси не более 3 % и минеральной примеси не более 1 %. Установлен срок годности сырья - 2 года.

2.Фитохимическое изучение сырья сабельника болотного

Изучение качественного состава биологически активных веществ На основании данных литературы и предварительного фитохимического анализа нами установлено наличие следующих групп БАВ: полифенольных соединений, полисахаридов, аскорбиновой кислоты и сапонинов.

Изучение состава полифенольного комплекса проводили методом ВЭЖХ на колонке «А1Шта С-18» размером 4,6x250 мм в системе - метанол-вода-фосфорная кислота (конц.) (40:60:0,5).

В сырье сабельника болотного обнаружены следующие вещества фенольной природы, идентифицированные по времени удерживания достоверных образцов: гесперидин, лютеолин, лютеолин-7-гликозид, галловая, цикориевая, эллаговая, хлорогеновая, салициловая и коричная кислоты, а также танин, пирогаллол.

ВЭХЖ-анализ полифенолов на колонке Zorbax ODS 4.6x250 мм, в подвижной фазе ацетонитрил-0.1 % фосфорная кислота (15:85) позволил установить наличие в сырье (+)-катехина и (-)-эпикатехина.

Путем осаждения 96 % спиртом из водного извлечения сырья нами выделен полисахаридный комплекс (с выходом 1 % от сырья), в гидролизате которого методом ТСХ в системе этилацетат-ацетон-вода (5:4:1) установлено наличие галактозы (Rf ~ 0,24), глюкозы (Rf ~ 0,28); арабинозы (Rf ~ 0,36) и ксилозы Rf ~ 0,44.

На аминокислотном анализаторе определено наличие и содержание свободных и связанных аминокислот, а также суммарное содержание аминокислот после гидролиза водного извлечения из сырья.

Таблица 3

Содержание свободных и связанных аминокислот в сырье сабельника

болотного

Аминокислота Содержание Содержание суммы

свободных свободных и связанных

аминокислот в 100 г аминокислот в 100 г сырья,

сырья, мг мг

Аспарагиновая кислота 3,25 59,56

Треонин+глутамин+ 5,85 -

аспарагин

Треонин - 1,82

Глутаминовая кислота 2,81 1,87

Пролин 2,00 13,13

Глицин 0,30 4,36

Алании 2,95 2,95

Цистеин 0,54 4,99

Валин 4,60 1,14

Метионин 2,24 1,21

Изолейцин 2,35 0,51

Лейцин 1,77 0,69

Тирозин 0,41 0,97

Фенилаланин 0,18 0,92

Лизин 3,11 1,02

Гистидин 0,29 4,01

Аргинин 0,88 1,25

Серин - 33,74

Суммарное содержание 33,53 134,14

Таким образом, обнаружено 18 аминокислот, из которых 9 являются незаменимыми для организма человека. Преобладающими аминокислотами по количественному содержанию, как в свободном состоянии, так и в связанном

виде являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты, пролин, аргинин, валин (таблица 3).

Методом ГЖХ установлено, что липофильная фракция сабельника болотного корневищ с корнями представлена жирными кислотами, стеринами и триглицеридами. Для установления качественного состава жирных кислот нами получено гексановое извлечение (с выходом 0,86 % от сырья), проведен его гидролиз с последующим отделением неомыляемых веществ и получением метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК).

№ пика Время удерживания, мин Метиловые эфиры ЖК Содержание в сумме, % Условное обознач.

1 3,72 Додекановая (Лауроновая) 1,95 12 0

2 4,38 Тридекановая 0.12 13:0

3 5,20 Тетрадекановая (миристиповая) 1,87 14-0

4 6,35 Пентадекановая 0,57 15:0

5 6,57 Транс-З-пентадекановая 0,14 15:1

6 7,87 Пальмитиновая 24,93 16:0

7 8,34 Транс-3 -гексадекановая 0,98 16:1

8 9,73 Гептадекановая (Маргариновая) 0,85 17.0

9 12,00 Октадекановая (Стеариновая) 4,28 18:0

10 12,56 Транс-9-октадекановая (Элаидиновая) 24,88 18:1

11 12,70 Олеиновая кислота 0,47 18:1 изо

12 13,76 Линолевая кисло га 18,73 18:2

13 15,37 Линоленовая кислота 0,59 18:3 а

14 17,58 Эйкозановая (Арахиновая) 1,58 20.0

15 20,75 Генейкозановая 0,16 21:0

16 24,09 Докозановая (Бегеновая) 0,46 22:0

17 30,70 Тетракозановая (Лигноцериновая) 0,33 24:0

Рис.2. Хроматограмма МЭЖК сабельника болотного

В работе использована колонка OMEGA WAX размером 0,2 мм х 3 м, температура колонки 180 - 260 °С, температура детектора 265 °С и температура инжектора 250 °С. Газ носитель гелий, скорость подачи элюента 2 мл/мин. В результате сопоставления пиков (времен удерживания) стандартных образцов метиловых эфиров кислот и веществ исследуемого образца в сырье сабельника идентифицированы 17 жирных кислот, в том числе эссенциальные - линолевая и линоленовая кислоты (рисунок 2).

Поскольку микроэлементы обладают высокой биологической активностью, оказывая многостороннее влияние на организм человека, находясь в тесном взаимодействии с другими БАВ нами установлено присутствие и оценено содержание микро- и макроэлементов в корневищах с корнями сабельника болотного. Определение проводилось в зольном остатке, полученном по методике ГФ XI изд. вып. 2, с.24. В результате установлено, что преобладающим по содержанию в золе является магний, кальций, фосфор, натрий, марганец.

Выделение (+)-катехина из подземных органов сабельника болотного и его

идентификация

Согласно данным литературы преобладающей группой БАВ сабельника болотного являются конденсированные дубильные вещества ряда катехина. Ранее установлено наличие трех веществ, относящихся к данной группе, одно из которых идентифицировано как L-эпигаллокатехингаллат. Для изучения и установления структуры других представителей катехинов сабельника нами использована избирательная экстракция этих веществ этилацетатом с последующим разделением этилацетатного экстракта на колонке с силикагелем. В результате отбора фракций элюата и кристаллизации из водно-спиртового раствора выделено индивидуальное вещество с температурой плавления 174176 °С.

УФ-спектр раствора выделенного соединения имеет максимум поглощения при 279±1 нм, что характерно для катехинов. Сравнительный анализ масс-спектра полученного вещества и спектров соединений из электронной базы данных показал, что картина пиков молекулярного распада соответствует спектру катехина (Ci5Hi406), а молекулярная масса равна 290.

Для установления структуры выделенного вещества был получен 'Н-ЯМР-спектр его метанольного раствора (рисунок 3).

Катехин является оптически активным веществом, молекулы которого содержит два асимметрических атома (Сг и С3). Таким образом, для катехина известно четыре оптических изомера и две рацемические смеси. Изучение оптической активности выделенного вещества показало, что [а]™ (ацетон-вода 1:1) составляет +14°, следовательно, данное соединение является правовращающим изомером.

«им 5г-з рш-а паю 1мэ-«з в-гос «

Рис.3 'Н-ЯМР-спектр выделенного вещества

При сравнении данных полученного спектра со спектрами катехинов зеленого чая установлено, что данное вещество является (+)-катехином (рисунок 3, таблица 4)

Таблица 4

Кольцо С Кольцо А Кольцо В

С,Н С3Н С4Н СбН СнН С2 ■ г, Н С} Н

Выделенное вещество 4,57 (<1) 3,98 (ш) 2,50-2,86 (т) 5,85 (ф 5,93 (ф 6,70-6,84 (т)

(+)-катехин 4,57 (ф 3,97 (ш) 2,48-2,88 (ш) 5,86 (ф 5,93 (с1) 6,71-6.84 (т)

Таким образом, разработана принципиальная схема получения (+)-катехина из корневищ с корнями сабельника болотного. Содержание данного вещества в сырье составляет 0,02 %

Рис. 3 Структурная формула (+)-катехина

3. Разработка способа получения сабельника болотного экстракта сухого

Разработка способа получения сухого экстракта При разработке противовоспалительного средства на основе сабельника болотного предложено получение сухого экстракта, поскольку данный способ переработки ЛРС является наиболее рациональным, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата.

Технологическая схема получения сухого экстракта сабельника болотного предусматривает стадии твердофазной экстракции, упаривания полученного извлечения, очистку и сушку концентрированного экстракта (рисунок 5).

Для определения оптимальных условий стадии экстракции нами изучено влияние экстрагента, температурного режима, соотношения сырье-экстрагент, времени и кратности экстракции на выход биологически активных веществ. Таким образом, экспериментально установлено, что оптимальным является проведение трехкратной экстракции сырья с размером частиц не более 5 мм, в соотношении 1:10 при использовании в качестве экстрагента 40 % спирта и нагревания до (60±5) °С. Все подобранные оптимальные параметры процесса экстракции были положены в основу проведения серии балансовых загрузок в лабораторных условиях. Анализ готового и полупродуктов, а также отходов производства (шрота, осадка балластных веществ) осуществляли по сумме полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин.

На основании данных по проведенным загрузкам оформлен и утвержден лабораторный регламент на производство сабельника болотного экстракта сухого ЛР 04868244-50-05.

Отработку технологии получения сухого экстракта сабельника болотного проводили на оборудовании цеха фитохимии «ЗАО ФармцентрВИЛАР», при этом способ очистки был заменен на сепарирование (в лабораторных условиях очистку проводили центрифугированием). В результате проведенных исследований разработан и утвержден опытно-промышленный регламент ОПР 58171769-46-06 на производство сабельника болотного экстракта сухого.

Изучение физических свойств сухого экстракта Готовый продукт - сабельника болотного экстракт сухой представляет собой аморфный порошок желто-коричневого цвета со специфическим запахом. С целью характеристика сухого экстракта сабельника как технологической субстанции изучены его технологические свойства: насыпная масса при свободном падении 0,58 г/см3, насыпная масса при уплотнении 0,87 г/см3, сыпучесть - 1,95 г/с. Угол естественного откоса 36°. Кроме того, установлена его гигроскопичность и температурные интервалы удаления различных типов содержащейся в образце воды.

Спирт этиловый

Вода

ВР 1 Подготовка персонала к работе

1

ВР 2 Подготовка производственных помещений

1

ВРЗ Подготовка оборудования

1

ВР4 Получение воды очищенной

Сырье

тп 6 1 , г Приготовление 40 % спирта этилового и экстракция измельченного сырья

тп 62 Фильтрация экстракта

гп 63 Концентрирование экстракта

тп 64 Сепарирование концентрированного экстракта

тп 65 Сушка очищенного экстракта '

тп 6.6 Измельчение сухого экстракта

ТП 5 Просмотр и измельчение рас гителыюго сырья

ТП 6 Получение

готового

продукта -

сухого

экстракта

УМ0 7 Фасовка,

упаковка.

маркировка

сухого

экстракта

Потери

В сборник НА иыброс

Шрот

Н сборник на выброс

Отгон спирта

Осадок балластных веществ

В сборник на выброс

Потери

В Сборник Н(1 выброс

Рис. 5 Технологическая схема производства сабельника болотного экстракта сухого

Сабельника болотного экстракт сухой, полученный нами согласно разработанной технологии, в фармакологических исследованиях, проведенных на различных моделях, показал выраженную противовоспалительную и диуретическую активность. По данным токсикологического исследования сухой экстракт отнесен к малотоксичным веществам согласно действующей классификации.

5. Разработка показателей качества сухого экстракта

Изучение качественного состава БАВ сухого экстракта В ходе исследования качественного состава БАВ в сухом экстракте с применением качественных реакций ТСХ и ВЭЖХ установлено наличие полифенольных соединений, полисахаридов, аскорбиновой кислоты, сапонинов. Состав моносахаридов экстракта аналогичен таковому в сырье. На аминокислотном анализаторе подтверждено присутствие аминокислот, в отличие от ЛРС в сухом экстракте помимо других аминокислот преобладает аланин. Содержание липофильного комплекса в сухом экстракте минимально, что связано с использованием в качестве экстрагента при получении экстракта 40 % спирта, извлекающего преимущественно гидрофильные вещества, а также проведением стадии очистки от липофильных веществ. Качественный состав жирных кислот представлен тетрадекаповой (миристиповой), пентадекановой, пальмитиновой транс-3-гексадекановой, гептадекановой (маргариновой), октадекановой (стеариновой), транс-9-октадекановаой (элаидиновой) и линолевой кислотами.

Состав микро- и макроэлементов существенно не различается в сырье и сухом экстракте.

Химическое изучение сухого экстракта показало, что состав БАВ экстракта аналогичен таковому в нативном сырье.

Установление показателей подлинности и разработка методики количественного определения Нами разработаны критерии подлинности для сухого экстракта: качественная реакция на присутствие полифенольных соединений и полисахаридов; ТСХ для подтверждения (+)-катехина. В ходе исследований подобранны условия анализа полифенольных соединений, и разработана методика количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчёте на (+)-катехин. Относительная ошибка методики не превышает ±2,04 % (таблицы 5 и 6).

Таблица 5

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы полифенольных соединений в сабельника болотного экстракте сухом в

пересчете на (+)-катехин

р X Б2 8 1 Р,% ДХ Е, %

9 53,25 2,3914 1,5464 1 95 2,23 1,084 ±2,04

1В

Таблица 6

Результаты опытов с добавками (+)-катехина в навеску сухого экстракта

Найдено суммы полифенольных соединений в сухом экстракте, г Добавлено (+)-катехина, г Должно быть, г Найдено, г Относительная ошибка, %

0,0512 0,0112 0,0624 0,0635 + 1,73

0,0560 0,0225 0,0785 0,0784 -0,13

0,0507 0,0349 0,0856 0,0846 -1,14

Установлен срок годности сухого экстракта - 2 года.

Разработка нормативной документации на сухой экстракт На основании проведенных экспериментов разработан и оформлен проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Сабельника болотного экстракт сухой». ФСП включает следующие разделы: описание, подлинность, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, количественное определение суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин, упаковка, маркировка, хранение срок годности.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фармакогностическое изучение корневищ с корнями сабельника болотного, установлены показатели качества сырья и их нормы. Разработана методика количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин (относительная ошибка методики не превышает ±4,6 %). В результате проведенных исследований разработаны и оформлены технические условия ТУ 9377-158-04868244-2005 «Корневища с корнями сабельника болотного».

2. В ходе фитохимического исследования в подземных органах сабельника болотного установлено наличие полифенольных веществ, полисахаридов, органических кислот, сапонинов. Разработана принципиальная схема получения (+)-катехина. Структура полученного вещества установлена методами УФ-, ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, по температуре плавления с аутентичным образцом и удельному вращению.

3. Установлены основные параметры экстракции БАВ из растительного сырья, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества. Оформлен и утвержден лабораторный регламент JIP 04868244-50-05 и опытно-промышленный регламент ОПР 58171769-46-06 на производства сабельника болотного экстракта сухого.

4. Проведена наработка сабельника болотного экстракта сухого, а также отдельных фракций БАВ для биотестирования, фармакологического скрининга и токсикологического анализа.

5. Исследован аминокислотный состав в сырье и сухом экстракте. Доминирующими в обоих образцах являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты, валин, аргинин. Однако в экстракте по содержанию также доминирует аланин, а в сырье - пролин. Установлен микро- и макроэлементный состав изучаемых объектов.

6. С использованием качественных реакций, метода хроматографии в тонком слое сорбента установлено наличие полифенольных соединений, полисахаридов и моносахаридов после гидролиза, органических кислот, сапонинов в сухом экстракте сабельника. Проведенные исследования подтверждают наличие групп БАВ, присущих исходному сырью, что указывает на рациональность выбранной технологии получения сухого экстракта.

7. Определены показатели качества и критерии подлинности сухого экстракта сабельника болотного; разработана методика количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин (относительная ошибка методики не превышает ±2,04 %) и установлена норма содержания данной группы БАВ в сухом экстракте не менее 40 %. На основании проведенных исследований составлен проект ФСП «Сабельника болотного экстракт сухой».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жукова О.Л., Азаркова А.Ф., Даргаева Т.Д. Изучение аминокислотного состава корневищ и травы сабельника болотного Comarum palustre L. / Сб. трудов «Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. - М„ 2005. - С.65-70.

2. Жукова О.Л. Биологически активные вещества подземных органов сабельника болотного Comarum palustre L. / Материалы научно-практической конференции посвященной 75-летию со дня рождения д.м.н. Базарона Э.Г. -Улан-Удэ, 2005.-С.42-43.

3. Жукова О.Л. Разработка методик качественной и количественной оценки полифенольных соединений в сабельника болотного экстракте сухом. / Сб. Пятигорской государственной фармацевтической академии. - Пятигорск, 2006. -С. 201-203.

4. Жукова О.Л., Абрамов A.A., Даргаева Т.Д., Маркарян A.A. Изучение фенольного состава корневищ сабельника болотного // Вестник Московского университета. Серия 2.Химия. - 2006. - № 5. - С. 342-345

5. Жукова О.Л., Стихии В.А. Исследование качественного состава полисахаридов корневищ с корнями сабельника болотного Comarum palustre L. / Тезисы докладов XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2006. - С. 701

6. Жукова О.Л., Стихин В.А., Шейченко В.И., Даргаева Т.Д. Выделение (+)-катехина из корневищ сабельника болотного Comarum palustre L. / Сборник трудов ВИЛАР. - М., 2006. С. 260-265.

7. Сабельник болотный - перспективное растительное сырье для разработки противовоспалительного лекарственного средства / Сокольская Т.А., Колхир В.К., Даргаева Т.Д., Мондодоев А.Г., Маркарян A.A., Жукова О.Л. // Материалы конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии». - Улан-Удэ, 2006. - С. 113-114

8. Сравнительное изучение количественного содержания полифенольных соединений в корневищах с корнями Comarum palustre L. в зависимости от местообитания и вегетационного периода / Жукова О.Л., Даргаева Т.Д., Вандышев В.В. и др. // Растительные ресурсы. - 2007. - т. - № 2. - С. (в печати).

Принято к исполнению 12/02/2007 Исполнено 13/02/2007

Заказ № 90 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru