Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Экспериментальная фармакотерапия почечной патологии полифенольными комплексами клеточных культур растений

На правах рукописи

АЗАРОВА ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА

Экспериментальная фармакотерапия почечной патологии полифенольными комплексами клеточных культур

растений

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 9 АВГ '¿013

Томск-2013

005532289

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, Брюханов Валерий Михайлович

профессор

доктор биологических наук,

член-корреспондент РАН Булгаков Виктор Павлович

Официальные оппоненты:

Плотникова Татьяна Макаровна, доктор биологических наук, профессор, государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакологии, профессор кафедры

Толстикова Татьяна Генриховна, доктор биологических наук, профессор. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория фармакологических исследований отдела природных и биологически активных соединений, заведующая лабораторией

Шилова Инесса Владимировна, доктор фармацевтических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория фитофармакологии, старший научный сотрудник

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « i О » 2013 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совет доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полифенольные соединения являются одними из наиболее распространенных вторичных метаболитов высших растений [Чернов Ю.Н. и др., 2004; Pereira D.M. et al., 2009]. Широкий спектр фармакологической активности многообразных по структуре полифенолов, их распространенность определяют традиционный потребительский интерес к полифенольным фитопрепаратам для коррекции патологических состояний различной этиологии [Писарев Д.И. и др., 2012; Tsao R., 2010]. В этой связи актуальной задачей является разработка и поиск новых высокоэффективных лекарственных средств растительного происхождения на основе полифенолсодержащего сырья.

Флора российского Дальнего Востока отличается большим количеством реликтовых видов, содержащих уникальные биологически активные вещества (БАВ). Природные ресурсы данного региона предоставляют большие возможности для получения полифенольных соединений различных классов, которые долгое время были мало востребованы вследствие их недостаточной химической и биологической изученности [Максимов О.Б. и др., 2002]. В качестве перспективных источников ценных полифенолов можно рассматривать незабудочник шелковистый Eritrichium sericeum Lehm.; воробейник краснокорневой Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zucc. (семейство Boraginaceae); марену сердцелистную Rubia cordifolia L. (семейство Rubiaceae); маакию амурскую Maackia amurensis Rupr. et Maxim, (семейство Fabaceae). Данные растения продуцируют не менее 29 полифенолов различных классов: олигомеров кофейной кислоты, антрахинонов, изофлавоноидов, птерокарпанов и стильбенов [Bulgakov V.P. et al., 2001; Fedoreyev S.A. et al., 2005, 2008].

В настоящее время широкое использование полифенолов растений дальневосточной флоры ограничено недостаточной сырьевой базой и узким ареалом их распространения, а также низким содержанием ценных вторичных метаболитов в отдельных видах нативных растений. Изыскание путей компенсации дефицита растительного сырья привело к разработке принципиально новых методов получения БАВ на основе использования культуры клеток и тканей растений на искусственных питательных средах. Большие успехи в данной области достигнуты дальневосточной школой биотехнологии растений, возглавляемой Ю.Н. Журавлевым [Булгаков В.П. и др., 2004]. Неуклонный рост интереса к методу культивирования растительных клеток и тканей обусловлен их неоспоримыми преимуществами по сравнению с традиционными видами растительного сырья [Каухова И.Е., 2007; Носов A.M., 2010; Mulabagal V., Tsay H.-S., 2004]. В связи с этим, развитие биотехнолотческих способов получения полифенолов исследуемых растений не только создает надежную сырьевую базу БАВ специфической активности, но и в экологическом аспекте обеспечивает сохранение растительных популяций редких видов. Индивидуальные полифенолы клеточных культур маакии, марены и представителей семейства Бурачниковые, обладая специфической биологической активностью, могут обеспечивать этиопатогенетическое направление фитотерапии отдельных нозологических групп заболеваний почек.

Актуальность повышения эффективности фармакотерапии заболеваний почек определяется широкой распространенностью

нефропатий, особенно хронических форм, тяжестью течения и наличием осложнений, являющихся одной из причин инвалидизации и смертности [Аляев Ю.Г., 2010; Бикбов Б.Т., 2011; Шилов Е.М., 2007]. По данным официальной статистики Министерства здравоохранения РФ в период с 2005 по 2010 гг. в России прирост абсолютного числа пациентов с заболеваниями мочевыделительной системы составил 12,5 %; пациентов с гломерулярными и тубулоинтерстициальными болезнями почек — 3,5 %; с мочекаменной болезнью - 15,7 % [Аполихин О.И. и др., 2012]. Несмотря на значительные успехи в терапии отдельных нозологических единиц, проблема их профилактики и лечения остается актуальной, что обусловливает необходимость поиска новых отечественных высокоэффективных препаратов. Одним из путей решения данной проблемы является использование препаратов на основе полифенолов, полученных биотехнологическим способом. В рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности РФ на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» по разработке и производству отечественных инновационных препаратов, включая биотехнологические, кафедра фармакологии ГБОУ ВПО АГМУ осуществляет комплексное фармакологическое исследование вторичных метаболитов полифенольной природы, полученных биотехнологическим способом. Результаты этого исследования представлены в настоящей работе.

Работа выполнена в соответствии с комплексной целевой программой АГМУ «Исследование природных лекарственных ресурсов Алтая для совершенствования лекарственного обеспечения населения» (Приказ № 257 Минздравсоцразвития от 20.05.2009). Отдельные этапы работы выполнялись в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и неоднократно отмечались в числе основных достижений РАН и Отделения биологических наук РАН.

Цель исследования. Установить фармакотерапевтическую эффективность фитопрепаратов, полученных биотехнологическим способом, при экспериментальной почечной патологии различного генеза и выявить возможные механизмы их нефропротективного действия.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние полифенольных комплексов клеточных культур маакии амурской, марены сердцелистной, воробейника краснокорневого и незабудочника шелковистого на экскреторную функцию почек крыс в физиологических условиях.

2. Исследовать противовоспалительную активность полифенольных комплексов клеточных культур на моделях острого и хронического воспаления.

3. Изучить влияние полифенольных комплексов клеточных культур на процессы свободно-радикального окисления в условиях индуцированного окислительного стресса различного генеза.

4. Определить наличие антимикробного действия полифенольных комплексов клеточных культур в отношении отдельных возбудителей инфекции мочевыводящих путей.

5. Сравнить фармакологическую активность двух различных полифенольных комплексов, полученных из маакии амурской. Выявить возможную связь между составом полифенолов и особенностями их действия.

6. Оценить фармакотерапевтическую эффективность полифенольных комплексов клеточных культур при экспериментальном гломерулонефрите.

7. Сравнить фармакотерапевтическую эффективность полифенольных комплексов марены сердцелистной и маакии амурской при экспериментальном оксалатном нефролитиазе.

8. Выявить общие закономерности в механизме нефропротективного действия полифенольных комплексов клеточных культур маакии амурской, марены сердцелистной, воробейника краснокорневого и незабудочника шелковистого.

9. Обосновать перспективность использования нового вида фитосырья, полученного биотехнологическим способом с направленным синтезом полифенолов, в фитотерапии заболеваний почек.

Научная новизна и теоретическая значимость. Полифенольные комплексы, выделенные из клеточных культур маакии амурской, марены сердцелистной, воробейника краснокорневого и незабудочника шелковистого, обладают широким спектром фармакологической активности: диуретической, гипопротеинурической, противовоспалительной,

антиоксидантной и противомикробной. Впервые в экспериментальных условиях выявлена диуретическая активность полифенольных комплексов клеточных культур растений. Установлено, что их мочегонное действие обеспечивается сочетанием различных ренальных эффектов: увеличением скорости клубочковой фильтрации (клубочковый механизм), угнетением канальцевой реабсорбции электролитов (канальцевый механизм) и воздействием на почечную гемодинамику. Получены данные о влиянии полифенолов клеточных культур на про - / антиоксидантный статус организма в патологических условиях индуцированного оксидативного стресса различного генеза, ассоциированного с нефропатологией. Выявлены новые потенциальные антиоксиданты, обеспечивающие прямое антирадикальное действие и опосредованное действие, связанное с повышением активности ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты. Обнаружена противовоспалительная активность полифенольных комплексов клеточных культур растений на моделях острого и хронического воспаления, а также выявлены наиболее перспективные растительные антифлогистики на основе биотехнологического сырья. В результате сравнительного изучения фармакологической активности двух различных полифенольных комплексов, полученных из маакии амурской, установлен вклад отдельных групп полифенольных соединений — стильбенов маакии в реализацию специфических видов активности: угнетение экссудативной фазы острого воспаления, степени выраженности ренальных эффектов, активизации неферментативного звена антиоксидантной защиты. На основании микробиологических исследований выбраны наиболее эффективные уроантисептики из изученных

полифенольных комплексов. Впервые на доклиническом уровне установлена эффективность полифенольных комплексов клеточных культур растений Дальнего Востока в комплексной терапии и профилактике (метафилактике) таких нозологических групп нефропатологии, как мочекаменная болезнь и гломерулонефрит. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования нового вида фитосырья биотехнологического происхождения для расширения ассортимента растительных нефропротекторов.

Практическая значимость работы. Обосновано направление создания нефропротекторов на основе полифенольных комплексов, полученных из культур клеток растений. Результаты комплексного исследования нефропротективных свойств полифенольных комплексов клеточных культур растений маакии амурской, марены сердцелистной, воробейника краснокорневого и незабудочника шелковистого доказывают перспективность дальнейших исследований с целью создания инновационных лекарственных средств биотехнологического происхождения. Реализованный в работе методический подход к изучению фармакотерапевтической эффективности полифенольных комплексов клеточных культур растений может служить обоснованием для целенаправленного поиска веществ полифенольной структуры с нефропротективными свойствами. Полученные данные о преимущественном механизме действия полифенольных комплексов клеточных культур в реализации специфических видов фармакологической активности, в том числе противовоспалительной, диуретической, антиоксидантной и др., формируют этиопатогенетическое обоснование применения новых перспективных фитокомплексов на основе клеточных культур в других направлениях протекции органной дисфункции. Выявленные особенности воздействия полифенолов клеточных культур на активность процессов свободно-радикального окисления, детерминированного повреждающими факторами различного происхождения, расширяют представления о доминирующих механизмах действия полифенольных антиоксидантов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полифенольные комплексы клеточных культур маакии амурской, марены сердцелистной, воробейника краснокорневого и незабудочника шелковистого обладают диуретической, салуретической, противовоспалительной, антибактериальной активностью, а также регулируют интенсивность протекания процессов свободно-радикального окисления, проявляя избирательность действия к звеньям антиоксидантной защиты организма.

2. Полифенольные комплексы клеточных культур растений могут служить основой для создания инновационных фитопрепаратов, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний почек иммуно-воспалительной, инфекционно-воспалительной и токсико-метаболической этиологии.

3. Установленные общие закономерности в механизме нефропротективного действия полифенольных комплексов клеточных культур.

4. Новый вид фитосырья, получаемый биотехнологическим способом с направленным синтезом полифенолов, является перспективным сырьевым источником нефропротективных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывали и обсуждали на юбилейной конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета БГМУ «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования» (Уфа, 2006); международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию проф. Ш.М. Омарова «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы» (Махачкала, 2006); региональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики» (Курск, 2006); III и IV съездах фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007; Казань, 2012); III и IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007, 2009); республиканской научной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); межрегиональной научно-методической юбилейной конференции, посвященной 90-летию ВГУ «Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации» (Воронеж, 2008); шестом Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); международной научно-практической конференции «Pharmacy of Kazakhstan: integration of science, education and production» (Шимкент, 2009); научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Украина, 2009, 2011); Всероссийском конгрессе нефрологов (Санкт-Петербург, 2009); на научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (Барнаул, 2010); седьмом съезде научного общества нефрологов России (Москва, 2010); Всеукраинской научно-практической конференции «Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств» (Харьков, 2012); VIII международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 51 научной работе, из них - 20 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций и 1 - за рубежом.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 260 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы, в котором приведено 320 источников, из них 180 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 44 таблицами и 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 717 аутбредных белых крысах самцах сток Вистар в возрасте 2-3 месяца массой от 180 до 300 граммов, выращенных в питомнике ГУ НИИ Цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск, сертификат имеется), с соблюдением требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей (Страсбург, 1986 г.) и «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1977).

Объектами исследований являлись полифенольные комплексы, извлеченные из каллусной культуры клеток четырех растений дальневосточной флоры, созданной из вегетативных и репродуктивных органов дикорастущих растений в Биолого-почвенном институте ДВО РАН на питательных средах Wb/naa и Wk/iaa. Выделение, очистка и анализ полифенолов клеточных культур с использованием спектральных и хроматографических методов проведены в Тихоокеанском Институте биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН. Краткая характеристика исследуемых культур клеток представлена в таблице 1.

Экспериментальные препараты на основе клеточных культур, полученные в ТИБОХ ДВО РАН, представляли суммарные очищенные полифенольные комплексы установленного качественного и количественного состава, именуемые в дальнейшем полифенольные комплексы клеточных культур (ПФКК) воробейника, незабудочника, марены и маакии. Стандартизация исследуемых препаратов проведена по сумме полифенолов, указанных в таблице 1.

Исследуемые ПФКК растений животные получали внутрижелудочно через зонд на 2 % крахмальной слизи ежедневно в дозах, установленных в предварительных исследованиях в качестве наиболее эффективных. Дозы фитокомплексов и схемы их введения варьировали в соответствии с условиями эксперимента.

В качестве препарата сравнения использовали отвар листьев зимолюбки зонтичной Chimaphyla umbellata (L.) W. Barton (ТУ 9198-19321428156-04, ЗАО «Эвалар»; РФ), приготовленный по методике ГФ-XI в соотношении 1 + 10. Отвар листьев зимолюбки вводили внутрижелудочно в дозе 500 мг/кг массы тела экспериментальных животных в объеме 0,9 ... 1,5 мл.

С целью выявления вклада отдельных групп полифенолов маакии в реализацию специфических видов активности проведено сравнительное изучение фармакологической активности ПФКК маакии амурской и препарата полифенольной фракции ядровой древесины, представляющего сумму изофлавонов, птерокарпанов, мономерных и димерных стильбенов. Препарат из ядровой древесины разработан в совместных исследованиях ТИБОХ ДВО РАН (г. Владивосток) и Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск); зарегистрирован под торговым названием «Максар®» (регистрационный номер Р№ 003294/01).

При изучении влияния ПФКК растений на экскреторную функцию почек в физиологических условиях в моче, собранной за сутки (суточный диурез), определяли содержание креатинина унифицированным методом

Таблица 1 - Клеточные культуры растений, использованные для получения полифенольных комплексов

Штамм или клеточная линия Производящее растение, семейство Источник получения, место заготовки растения Условия культивирования Полифенольные соединения* Сумма полифенолов, % от сухой клеточной культуры

RC-1 (ВККК-ВР №60) Rubia cordifolia L. (Rubiaceae) стеблевые апексы, Анучинский район Приморского края питательная среда Wb/naa [Mischenko N.P., 1999] антрахиноны: муньистин, пурпурин, руберитриновая кислота, ализарин, ксантопурпурин, метиловый эфир муньистина, этиловый эфир ксантопурпурина 2,14±0,24

ВК-39 (ВККК-ВР № 36) Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zücc. (Boraginaceae) корень, Партизанский район Приморского края метод селекции окрашенных агрегатов каллусов, питательная среда Wk/iaa, [Bulqakov V.P., 20011 олигомеры кофейной кислоты: розмариновая кислота, рабдозиин 1,92±0,12

Ег-1 Eritrichium sericeum Lehm. (Boraginaceae) проростки семян, Камчатка питательная среда Wb/naa, [Fedoreyev S.A., 2005] олигомеры кофейной кислоты: розмариновая кислота, рабдозиин, эритрихин 6,11 ±0,84

А-18 Maackia amurensis Rupr. et Maxim. (Fabaceae) проростки семян, Партизанский район Приморского края питательная среда Wb/naa [Fedoreyev S.A., 2000] изофлавоны: формононетин, деррон, каликозин, псевдобаптигенин, даидзеин, генистеин; моно- и диглюкозиды изофлавонов: 7 наименований малонилмоноглюкозиды изофлавонов: малонилононин, малонилгенистин птерокарпаны: маакиаин, медиакарпин малонилмоноглюкозиды птерокарпанов: 2 наименования 2,08±0,35

Примечания

1 'Индивидуальные полифенолы перечислены в порядке уменьшения их количественного содержания

2 ВККК-ВР - Индекс депонирования в Каталоге коллекционных штаммов Всероссийской коллекции культур клеток высших растений (ВККК-ВР) Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН»

Поппера [Меньшиков В.В. и др., 1987]; ионов натрия и калия методом пламенной фотометрии. Мониторинг данных показателей проводили в течение двух недель на фоне ежедневного введения фитокомплексов.

Противовоспалительную активность исследовали на модели острого экссудативного воспаления, индуцированного субплантарным введением 0,1 мл 1%-ного раствора каррагенина [Winter С.А. et al., 1962]. Моделью пролиферативного хронического воспаления служила модель «хлопчатобумажной» гранулемы [Руководство ..., 2005].

Антиоксидантные свойства ПФКК растений оценивали по их влиянию на интенсивность функционирования про - /антиоксидантной систем организма, используя в качестве биологических объектов кровь и гомогенат почечной ткани животных в условиях окислительного стресса, стимулированного нефропатиями иммуно-воспалительной и токсико-метаболической этиологии. Кроме того, для определения воздействия ПФКК на процессы свободно-радикального окисления применяли экспериментальные модели окислительного стресса, основанные на воспалительной реакции, вызванной формалиновым отеком задних конечностей крыс [Арбузова Я.С., 2006; Замятина C.B., 2006] и на четырехчасовой окклюзии почечной артерии животных [Талалаева О.С., 2006]. Общую прооксидантную активность - суммарный показатель концентрации всех прооксидантов и свободно-радикальных метаболитов, оценивали по накоплению продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), реагирующих с тиобарбитуровой кислотой [Галактионова Л.П. и др., 1998]. Концентрацию тиобарбитурат-чувствительных продуктов перекисного окисления определяли спектрофотометрически [Uchiyama M., Michara M., 1978]. Характеристикой антиоксидантного статуса являлся суммарный показатель общей антиоксидантной активности (ОАА), отражающий активность неферментных антиоксидантов и внутриклеточных антиоксидантных энзимов организма [Благородов С.Г. и др., 1987]. В гемолизате эритроцитов и гомогенате почечной ткани определяли фотометрически активность антиоксидантных ферментов: каталазы [Королюк М.А. и др., 1988], супероксиддисмутазы [Дубинина Е.Е. и др., 1983], глутатионпероксидазы [Моин В.М., 1986].

Экспериментальный гломерулонефрит крыс индуцировали двукратным введением нефротоксичной сыворотки, полученной от кроликов при их иммунизации почками крыс, в дозе 8 мл/кг по модифицированной методике Masugi [Никифорова Н.В. и др., 1985], что обеспечивает развитие мезангиопролиферативного гломерулонефрита, представляющего самую распространенную морфологическую форму гломерулопатий [Пальцева Е.М., 2009]. Введение фитокомплексов осуществляли тридцатидневным курсом спустя два дня после первой иммунизации.

Экспериментальный оксалатный нефролитиаз воспроизводили с использованием «этиленгликолевой модели», отражающей основную клиническую форму мочекаменной болезни [Parmar M.S., 2004]. Подопытные животные на протяжении трех недель получали в виде питья вместо воды ad libitum 1 % раствор этиленгликоля, метаболизм которого сопровождается образованием оксалат-ионов [Khan S.R., 1997]. Антилитогенное действие фитокомплексов изучали при профилактической и лечебной схемах введения. В группе профилактики крысам одновременно с потреблением литогена вводили ПФКК растений. Крысы из группы печения после инициирования мочекаменной болезни, развивающейся в результате трехнедельного потребления этиленгликоля, получали ПФКК растений на протяжении трех последующих недель, начиная с 22 дня эксперимента.

Нефропротективную активность ПФКК растений в условиях экспериментальной нефропатологии устанавливали по их влиянию на экскрецию белка, содержание которого определяли унифицированным методом, основанным на реакции взаимодействия с сульфосалициловой кислотой [Рябов С.И. и др., 1979], и биохимические показатели мочи. Показателем степени повреждения структурно-функциональных элементов нефрона служила активность мембранно-ассоциированных ферментов у-глутамилтрансферазы (ГГТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ); ферментов цитолитического синдрома лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и аминотранфераз (аспартатаминотрансферазы АсАТ и аланинаминотрансферазы АлАТ); почечно-специфического маркера канальцевых повреждений лизосомального энзима 1М-ацетил-/3-Д-глюкозаминидазы (НАГ). Активность ферментов определяли с использованием коммерческих наборов реагентов «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Санкт-Петербург): ГГТ - «по конечной точке»; ЛДГ - кинетическим методом, а также реагентов фирмы «Human» (Германия): ЩФ и аминотрансфераз - кинетическим методом. Активность НАГ установлена фотометрически по модифицированной методике Maruhn. В моче определяли концентрацию ионов, формирующих нефролиты: оксалатов - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе «Милихром-А02» по запатентованной методике [Способ ..., 2010]; фосфатов - фотометрическим способом, основанным на фотометрической реакции образования молибдено-ванадиевофосфорного комплекса [Методические ..., 2009]; ионов кальция - с помощью коммерческого набора реагентов «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Санкт-Петербург). Для оценки функционального состояния почек крыс в условиях экспериментальной нефропатологии: мочекаменной болезни и гломерулонефрита - определяли показатели суточного диуреза и экскреции креатинина.

Индикацию антимикробной активности проводили методом культивирования тест-культур бактерий на средах с добавлением исследуемого ПФКК (метод репликаций) по стандартной методике ГФ-ХІ с использованием в качестве тест-культур стандартных штаммов бактерий международной коллекции.

Для патоморфологических исследований срезы коры почек толщиной 6 ... 8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а затем гистохимическим методом Косса импрегнацией серебром идентифицировали кальциевые депозиты [Prophet E.B. et al., 1992]. Морфометрические

исследования проводили на микроскопе ЛОМО МИКМЕД-6, оснащенном фотонасадкой (ОАО «ЛОМО», Санкт-Петербург), с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.4 LE (Carl Zeiss, Германия).

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием пакета программ SigmaStat 3.5 (Systat Software Inc., США) для Windows. Для выбора критериев оценки значимости (параметрических и непараметрических) средних проверяли соответствие формы выборочных определений нормальному, используя критерий Колмогорова - Смирнова, а также контролировали равенство генеральных дисперсий в сравниваемых группах с помощью F-критерия Фишера [Лакин Г.Ф., 1990]. Для оценки значимости различий в группах с нормальным распределением количественных показателей использовали параметрический t-критерий Стьюдента. В случае распределения, отличного от нормального, данные сравнивали с помощью непараметрических критериев: критерия Вилкоксона для связных выборок при равном числе элементов в сравниваемых выборках, соответствующих одному и тому же объекту; и U-критерия Манна - Уитни для несвязных выборок при межгрупповом сравнении. Во всех процедурах статистического анализа рассчитывали достигнутый уровень значимости (р), при проверке статистических гипотез критический уровень значимости принимался равным 0,05 [Хафизьянова Р.Х. и др., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индивидуальные полифенолы клеточных культур растений дальневосточной флоры: незабудочника шелковистого, воробейника краснокорневого, марены сердцелистной и маакии амурской, с позиций зависимости «химическая структура полифенола - фармакологическое действие» обеспечивают этиопатогенетическое направление фитотерапии отдельных нозологических групп заболеваний почек. По данным Писарева Д.И., доля растительных полифенольных препаратов для коррекции уропатий составляет всего 7 % от общего числа фенольных фитопрепаратов в структуре российского рынка. Возможности расширения ассортимента фитопрепаратов в нефрологической практике реализуются далеко не полностью, в том числе, из-за неэффективной переработки растительного сырья, дефицита некоторых его видов. Кафедра фармакологии ГБОУ ВПО АГМУ в сотрудничестве с научно-исследовательскими центрами ДВО РАН осуществляет комплексное исследование вторичных метаболитов полифенольной природы, полученных биотехнологическим способом. Медико-биологический блок данного исследования охватывает базовые направления ренопротекции при поражениях почек иммуно-воспалительного и токсико-метаболического генеза: изучение диуретической, противовоспалительной, антиоксидантной и противомикробной активности. Выявленные эффекты экспериментальных фитокомплексов на основе клеточных культур, имеющие патогенетическое значение в фармакокоррекции дисфункций почек, определили дизайн исследований фармакотерапевтической эффективности с использованием моделей повреждения почек воспалительной, иммунной, токсико-метаболической этиологии, представленный на рисунке 1.

я

Рисунок 1 - Схема исследования ГТФКК растений

Воздействие полифенольных комплексов клеточных культур растений на ренальные функции изучено в динамике в физиологических условиях. В результате сравнительного исследования фитокомплексов клеточных культур семейства Бурачниковые: воробейника и незабудочника -в дозах 250 и 100 мг/кг соответственно, установлено мягкое мочегонное действие воробейника. Более мощным диуретическим эффектом обладал ПФКК незабудочника, активность которого, начиная с шестого дня применения, не уступала таковой препарата сравнения. В момент манифестации полиурии уровень мочеотделения, стимулированного полифенольными комплексами, превышал исходный на 64 % (р<0,05) - для ПФКК воробейника и на 104 % (р<0,001) - для ПФКК незабудочника, что позволяет рассматривать последний в качестве перспективного фитодиуретика (табл. 2). Для фитокомплексов характерно постепенное наступление диуретического эффекта и длительное действие, сохраняющееся после их отмены. Спустя два дня после окончания курса введения фитокомплексов индекс диуреза оставался высоким: 1,56 (р<0,05) -для ПФКК воробейника и 1,82 (р<0,001) - для ПФКК незабудочника.

Существенные различия зарегистрированы со стороны вызванного изученными фитокомплексами салуреза (рис. 2). Прием ПФКК незабудочника характеризуется более высокой активностью натрийуреза по сравнению с ПФКК воробейника. Напротив, калийуретическая активность воробейника превышала таковую незабудочника.

Таблица 2 - Показатели диуретической активности полифенольных комплексов клеточных культур и максара

Показатель, в сутки Контроль Дни введения ПФКК 16 день

2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14

Полифенольный комплекс клеточной культуры воробейника краснокорневого в дозе 250 мг/кг (п=11)

Диурез, мл 5,9+0,47 5,5±0,68 6,4+0,86 6,9±1,00 9,1 ±1,34* 9,7±1,59* 9,4+1,54* 9,5±1,16* 9,2±1,32*

Диуретический индекс - 0,93 1,09 1,17 1,54 1,64 1,59 1,61 1,56

Диуретическая активность - 0,64 0,60 0,66 0,87 0,91 0,92 0,95 1,44

Полифенольный комплекс клеточной культуры незабудочника шелковистого в дозе 100 мг/кг (п=12)

Диурез, мл 7,4±0,52 10,1±1,32 12,0±1,34* 13,1 ±1,49* 15,1 ±1,58* 13,8±1,28* 14,6±1,60* 14,1 ±1,72* 13,5±1,22*

Диуретический индекс - 1,37 1,62 1,77 2,04 1,86 1,97 1,91 1,82

Диуретическая активность - 0,94 0,90 1,00 1,15 1,03 1,14 1,13 1,69

Полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской в дозе 100 мг/кг п = 14)

Диурез, мл 3,3±0,24 7,5±0,73* 1,3±0,42* 3,1 ±0,35 4,4±0,68 4,1±0,44 4,0±0,48 4,6±1,40 4,7±1,06

Диуретический индекс - 2,27 0,39 0,94 1,33 1,24 1,21 1,39 1,42

Диуретическая активность - 1,55 0,22 0,53 0,75 0,69 0,70 0,82 1,32

Максар (полифенолы яд| эовой древесины маакии амурской) в дозе 100 мг/кг (п = 12)

Диурез, мл 3,1+0,36 5,1+0,81* 5,1±0,90 5,5 ±0,82* 5,4+0,79* 6,9±0,89* 6,1+0,66* 5,0±0,71* 4,6±0,98

Диуретический индекс - 1,65 1,65 1,77 1,74 2,23 1,97 1,61 1,48

Диуретическая активность - 1,13 0,91 1,00 0,98 1,23 1,14 0,95 1,37

Полифенольный комплекс клеточной культуры марены сердцелистной в дозе 100 мг/кг (п =13)

Диурез, мл/сутки 2,3±0,18 3,7±0,52* 7,4±0,80* 6,5±0,57* 6,7±1,10* 5,3±0,47* 6,4+1,06* 5,7±0,39* 5,5+0,78*

Диуретический индекс - 1,61 3,22 2,83 2,91 2,30 2,78 2,48 2,39

Диуретическая активность - 1,10 1,78 1,60 1,64 1,27 1,61 1,47 2,21

Отвар листьев зимолюбки зонтичной в дозе 500 мг/кг (п = 12)

Диурез, мл 2,6±0,30 3,8±0,71 4,7±0,62* 4,6±0,74* 4,6±0,63* 4,7±0,48* 4,5±0,57* 4,4±0,49* 2,8±0,34

Диуретический индекс - 1,46 1,81 1,77 1,77 1,81 1,73 1,69 1,08

Примечания

1 Отвар листьев зимолюбки зонтичной - препарат сравнения; п - количество животных

2 Здесь и далее обозначены * статистически значимые различия по сравнению с контролем при р<0,05

10 12 14 16

Дни эксперимента

□ Ыа - индекс незабудочника

— К-индекс воробейника

Рисунок 2 - Влияние полифенольных комплексов клеточных культур растений семейства Бурачниковые на показатели салуреза у крыс

На пике активности уровень калийуреза под действием фитокомплексов незабудочника (+48 %, р<0,01) уступал аналогичному показателю фитокомплексов воробейника (+76 %, р<0,01). Уменьшение реабсобции ионов Ыа+, сформировавшееся в течение второй недели эксперимента под действием ПФКК незабудочника, сопровождалось ростом калийуретического индекса, величина которого до конца эксперимента превышала контрольный уровень на 40 ... 48 % (р<0,02). Для данного периода наблюдения отмечено прогрессирование калийуретического ответа на введение ПФКК воробейника, подтвержденное увеличением экскреции ионов калия на 47 ... 76 % (р<0,05) по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы. Более низкие показатели салуретического индекса ионов К+ для ПФКК незабудочника, стабилизировавшиеся к концу первой недели эксперимента по сравнению с аналогичными показателями для ПФКК воробейника, делают фитокомплексы незабудочника более привлекательными диуретиками в отношении риска развития гипокалиемии. Отсутствие определенного параллелизма влияния полифенолов двух растений на натрий- и калийуретический эффекты может свидетельствовать об отсутствии воздействия данных полифенолов на реабсорбцию ионов Ыа+, К+ и СГ в восходящем отделе петли Генле, характерного для петлевых диуретиков, в том числе растительного происхождения [ЬаЫои Б. е1 а\., 2007].

I Ма-индекс воробейника II ■ К- индекс незабудочника -

Роль олигомеров кофейной кислоты как фармакофора диуретической активности фитокомплексов подтверждается данными о мочегонном действии извлечений, содержащих розмариновую кислоту. Экстракты шалфея лекарственного Salvia officinalis L. продемонстрировали диуретическую активность, сопровождающуюся увеличением экскреции воды и ионов натрия. Как и в случае незабудочника, извлечения шалфея не оказывали существенного влияния на реабсорбцию калия [Bhadoriya U. et al., 2011].

Зарегистрированная тенденция к усилению экскреции креатинина под действием полифенольных комплексов клеточных культур растений семейства Бурачниковые свидетельствует о стимулирующем влиянии на процесс клубочковой фильтрации. Фитокомплекс незабудочника обеспечивал более выраженный рост показателей креатининуреза, превышающий исходный уровень на 50 ... 59 % (р<0,01), начиная со второй недели эксперимента.

Сравнительное изучение полифенольных комплексов маакии в дозе 100 мг/кг: клеточной культуры и ядровой древесины (максара) -свидетельствует о неравноценности воздействия полифенолов растения на функцию почек в эксперименте. Максар продемонстрировал более выраженное диуретическое действие, характеризующееся постепенным нарастанием эффекта к десятому дню эксперимента, когда величина суточного диуреза превышала исходный уровень в 2,2 раза (р<0,001), и последующим медленным падением активности (табл. 2). Выраженная диуретическая активность максара без существенных изменений уровня экскреции креатинина и натрия свидетельствует о наличии механизмов избирательного угнетения канальцевой реабсорбции воды, относительно независимых от натрийуреза, что может быть локализовано в тонком нисходящем отделе петли Генле и направлено на ингибирование аквапоринов, в первую очередь одну из изоформ AQP1, которая является главным водным каналом, обеспечивающим трансцеллюлярную реабсорбцию воды в данном отделе нефрона [Гоженко А.И. и др., 2008; Nielsen S. et al., 2002]. Данное предположение находит косвенное подтверждение в характере изменений экскреции калия с мочой в ходе эксперимента, когда при отсутствии воздействий на уровень креатининуреза рост мочеотделения превышал показатели калийуреза (рис. 3).

Полифенольные комплексы ядровой древесины

продемонстрировали в эксперименте такой феномен растительных диуретиков, как отсутствие параллелизма влияния на гидро- и салурез, отличающий их от синтетических диуретиков. Согласно опыту изучения растительных диуретиков, в частности, портулака волосистого Portulaca pilosa L., мягкое мочегонное действие некоторых растительных диуретиков не сопровождается натрийурезом [Rocha M.Y.A. et al., 1994]. Аналогичные результаты получены при изучении полифенолов ядровой древесины максара.

ПФКК маакии, качественный и количественный состав которого существенно отличается от официнального препарата древесины растения, продемонстрировал менее выраженную мочегонную активность по сравнению с препаратом нативного растения. Для ПФКК маакии свойственно сложное многокомпонентное воздействие, проявившееся в формировании скачкообразных изменений ренальных эффектов.

1,97 *

2,22

О 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25

Величина индекса

■ Диуретический индекс 0 Na -индекс □ К-индекс

Рисунок 3 - Влияние максара (100 мг/кг) на показатели салуреза и

диуреза у крыс

Стимулированный изофлавонами клеточной культуры маакии рост показателей функции почек на второй день эксперимента сопровождается развитием компенсаторной реакции организма с последующим падением всех исследуемых параметров ренальных функций (рис. 4).

После максимума диуретической активности, сформировавшегося на второй день введения ПФКК маакии, отмечено ослабление диуретической реакции: диуретический индекс ПФКК маакии на протяжении всего эксперимента не превышал величины 1,42, уступая по активности препарату сравнения (табл. 2). Зарегистрированное ударное воздействие на ренальные процессы можно рассматривать в качестве более выраженного сосудистого компонента действия полифенолов, реализовавшегося посредством расширения приводящих почечных артерий и повышения почечного кровотока. Предположение о системном сосудистом действии подтверждается данными о вазодилатирующих свойствах генистеина и даидзеина, для которых характерно высокое содержание в клеточных культурах маакии в свободном виде и в виде их моно, ди- и малонилгликозидов (43,6 % от общего количества изофлавонов маакии) [Si Н., Liu D., 2007]. К концу периода наблюдения удалось зафиксировать менее выраженный компонент действия ПФКК маакии, заключающийся в угнетении

процессов реабсорбции в почечных канальцах, что обеспечивает формирование некоторого диуретического, натрий- и калийуретического эффектов.

—■— Экскреция креатинина по отношению к контролю, % ------- Суточный диурез по отношению к контролю, %

—— Экскреция натрия по отношению к контролю, % —*— Экскреция калия по отношению к контролю,%

Рисунок 4 - Динамика ренальных показателей при длительном введении ПФКК маакии амурской в дозе 100 мг/кг

При изучении фитокомплексов клеточных культур марены (100 мг/кг) зарегистрировано самое мощное воздействие на выведение почками воды, подтвержденное высокими показателями суточного диуреза, превышающими на пике активности исходный уровень в 3,2 раза (р<0,001). Закономерность полученных результатов прогнозируема многочисленными данными о диуретической активности галеновых и новогаленовых препаратов данного растения аюрведической медицины. Экстракты корней растения продемонстрировали мощные диуретические свойства, подтвержденные существенным ростом диуретического и салуретических индексов [Ра\лгаг А.Т. е1 а1., 2009]. Влияние антрахинонов марены можно рассматривать как многофакторное воздействие на ренальные функции. С одной стороны, высокие показатели диуретического индекса, отличающегося быстротой развития, достигнуты параллельно с увеличением показателей креатининуреза и салуреза. К четвертому дню исследования сформирован максимум креатининуреза, превышающий исходный уровень в 1,4 раз (р<0,001) и соответствующий увеличению экскреции ионов натрия на 68 % (р<0,05) и калия на 77 % (р<0,01). Быстрота развития и степень выраженности

эффекта может являться признаком усиления скорости клубочковой фильтрации за счет сосудистого эффекта, обусловливающего увеличение почечного кровотока. Следующий этап воздействия полифенолов марены сопровождался стабилизацией повышенной экскреции воды на фоне более высокого уровня натрийуреза по сравнению с калийуретической реакцией, что предполагает угнетение канальцевой реабсорбции воды и натрия без существенного воздействия на экскрецию калия.

Впервые выявлена диуретическая активность ПФКК растений дальневосточной флоры при физиологических условиях с установленными различиями в ходе формирования диуретического ответа на введение фитокомплексов. Лидирующее положение среди изученных потенциальных диуретиков занимают полифенольные комплексы клеточной культуры марены сердцелистной. Ярко выражена диуретическая активность полифенолов ядровой древесины маакии (максар). ПФКК растений, оказывающие воздействие на ренальные функции, располагаются в порядке снижения выраженности мочегонного действия следующим образом: марена (100 мг/кг) -незабудочник (100 мг/кг) - воробейник (250 мг/кг) - маакия (100 мг/кг) (рис.5).

■ препарат сравнения Ш ПФКК маакии И ПФКК воробейника

□ ПФКК незабудочника О максар

□ ПФКК марены

Диуретический

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 индекс

Рисунок 5 - Диуретический индекс исследуемых фитокомплексов на пике диуретической активности

Среди изученных фитокомплексов наиболее существенное воздействие на экскрецию ионов Ыа+ отмечено для ПФКК маакии. Реабсорбция ионов натрия не претерпевала значимых изменений при применении препарата ядровой древесины маакии. Большие перспективы для применения в качестве диуретика имеет незабудочник шелковистый, продемонстрировавший значительную натрийуретическую активность. Анализ динамики реабсорбции калия почками животных под действием фитокомплексов позволяет отметить клеточные культуры марены, незабудочника и максар как фитодиуретики, сдерживающие потерю калия при угнетении канальцевой реабсорбции, что определяет интерес к их использованию в патогенетической фитотерапии гипертонической болезни.

В настоящее время подтверждено комплексное влияние биологически активных веществ растений в реализации их мочегонного

действия. Диуретический эффект усиливается за счет аддитивного действия или потенцирования индивидуальных действующих веществ [Товчига О.В., Штрыголь С.Ю., 2009; Gupta V.K., Arya V., 2011]. На отмеченную специфичность многофакторного действия растений указывает многообразие и сложность зарегистрированных ренальных эффектов изученных фитокомплексов.

При исследовании влияния полифенольных комплексов клеточных культур растений на процессы клубочковой фильтрации и канальцевый транспорт получены данные о преимущественном механизме диуретической активности, которые позволяют предложить следующую классификацию изучаемых мочегонных фитокомплексов на основе клеточных культур по локусу действия и наблюдаемому эффекту (рис. 6).

клубочек

незабудочник

Собирательная ірубка

марена

маакия

Петля Генле

Мочегонные

средства

___ ПФКК растений

Действующие на —"""

нефрон Сосудистый Проксимальный-^ воробейник

___ ^ Дистальна

Действующие вне нефрона

Усиление почечного кровообращения

Угнетение реабсорбции

Увеличение фильтрации

Рисунок 6 - Классификация диуретиков на основе клеточных культур растений по локусу действия и наблюдаемому эффекту

Изофлавоноиды маакии оказывают наиболее многофакторное воздействие на функцию почек. С одной стороны, это сосудистое воздействие, реализующееся посредством расширения почечных артерий и повышения почечного кровотока. Менее выражено прямое угнетающее действие на процессы реабсорбции в почечных канальцах. Аналогичное действие оказывают антрахиноны марены. Для полифенольных комплексов клеточных культур незабудочника и воробейника развитие мочегонного

эффекта обусловлено преимущественным усилением скорости клубочковой фильтрации с дополнительным угнетением канальцевой реабсорбции воды, главным образом, в нисходящем отделе петли Генле, проницаемом для воды, которая диффундирует без сопутствующей реабсорбции электролитов.

Фармакологическая регуляция воспалительного процесса как неспецифической реакции на различные патогенные раздражители остается важной проблемой фармакотерапии заболеваний почек. В свете концепции современной ренопротективной стратегии нормализация уродинамики, достигнутая с помощью растительных диуретиков, эффективна на фоне их противовоспалительного действия, что определяет целесообразность изучения флоголитического потенциала полифенольных комплексов исследуемых растений. Кроме того, перспективность поиска антифлогистиков среди фитокомплексов определяется имеющимися данными о противовоспалительной активности отдельных полифенолов в их составе. Противовоспалительную активность розмариновой кислоты per se и в составе галеновых препаратов связывают с ингибированием СЗ и С5 фракций комплемента, выступающих в качестве либераторов гистамина, а также с уменьшением выработки медиаторов воспаления, секретируемых макрофагами [Inoue К. et al., 2006; Peake P.W. et al., 1991; Sanbongi C. et al., 2004]. Рабдозиин, один из тетрамеров кофейной кислоты в составе клеточных культур растений семейства Бурачниковые, обладает способностью к удалению активных частиц кислорода и к подавлению активности гиалуронидазы [Ito H. et al., 1998]. В составе полифенолов клеточной культуры маакии, продуцирующей до 19 индивидуальных изофлавонов и птерокарпанов в свободном и гликозидированном виде, обнаружены изофлавоны, продемонстрировавшие выраженную противовоспалительную активность за счет ингибирования биосинтеза и высвобождения монокинов воспалительной реакции: генистеин и его О-гликозид генистин - интерлейкина IL5 [Min B.G. et al.,1999]; даидзеин и его О-гликозид даидзин - интерлейкина IL-1a [Yun I.U. et al., 2001]. В исследованиях на моделях острого асептического, хронического пролиферативного и иммунного воспаления доказана противовоспалительная активность извлечений марены сердцелистной, связанная с торможением процессов, промотирующих воспаление: неселективное ингибирование циклооксигеназной активности, ограничение высвобождения медиаторов воспаления и свободно-радикальных частиц кислорода и азота и т.д. [Charde R.M. et al., 2010; Kasture V.S. et al., 2001 ; Tailor C.S. et al., 2010].

С учетом фазности воспалительных изменений и значения различных процессов в развитии этих фаз исследование флоголитической активности проводили с использованием различных моделей воспаления, среди которых традиционно используется индуцированный каррагенином отек конечности крыс [Di Rosa M. et al., 1971]. Оценка влияния полифенольных комплексов клеточных культур в дозах 250 мг/кг (воробейник) и 100 мг/кг (маакия, марена, максар) на экссудативную фазу острого воспаления показала, что существенно (противовоспалительная активность более 30 %) ослабляют флогогенное действие каррагенина фитокомплексы марены, максар и, в меньшей степени, фитокомплексы незабудочника и воробейника (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние полифенольных комплексов растений на развитие каррагенинового отека конечностей крыс

Группа исследования Число животных Доза, мг/кг Часы наблюдения

1 2 4

средний прирост объема конечности, см3 противовоспалительная активность, % средний прирост объема конечности, см3 противовоспалительная активность, % средний прирост объема конечности, см3 противовоспалительная активность, %

ПФКК растений семейства Бурачниковые

Контроль 15 - 0,49±0,04 - 0,55±0,04 - 0,67±0,05 -

Отвар зимолюбки 14 500 0,33±0,03* 32,7 0,43±0,04* 21,8 0,57±0,02 14,9

Незабудочник 15 100 0,35±0,03* 28,6 0,35±0,04* 36,4 0,50±0,05* 25,3

Воробейник 12 250 0,38±0,03* 22,4 0,38±0,04* 30,9 0,55±0,06 17,9

Маакия, марена

Контроль 14 - 0,52±0,05 - 0,84±0,05 - 1,06±0,04 -

Максар 20 100 0,30±0,03' 42,3 0,63±0,03* 25,0 0,73±0,04* 31,1

ПФКК маакии 14 100 0,46±0,02 11,5 0,78±0,03 7,1 0,96±0,03 9,4

ПФКК марены 17 100 0,29±0,03* 44,2 0,52±0,04* 38,1 0,71±0,03* 33,0

Примечание - Звездочками * обозначены статистически значимые различия по сравнению с контролем при р<0,05

На пике противовоспалительной активности полифенольные комплексы незабудочника и воробейника продемонстрировали угнетение выраженности отека на 36,4 % (р<0,05) и 30,9 % (р<0,05) соответственно по сравнению с контрольными животными. Использование препарата сравнения ослабляло флогогенное действие каррагенина на 21,8 % (р<0,05). Выраженное угнетение экссудативной фазы воспаления под их влиянием может быть связано с наличием в составе фитокомплексов дериватов кофейной кислоты, что подтверждается взаимосвязью между степенью выраженности действия и содержанием олигомеров кофейной кислоты: для ПФКК незабудочника, характеризующегося более высоким содержанием полифенольных соединений, отмечено более активное угнетение экссудативной фазы воспаления.

Сопоставимое по степени выраженности и по фазности антиэкссудативное действие ПФКК марены и препарата ядровой древесины маакии (максар) проявлялось в торможении развития каррагенинового отека на ранних стадиях развития воспаления на 44,2 % (р<0,05) и 42,3 % (р<0,05) соответственно. Изучаемые фитокомплексы маакии, имеющие различия в химическом составе, продемонстрировали различную

противовоспалительную активность, что может служить свидетельством определяющей роли отдельных полифенолов в реализации исследуемой активности. В отличие от препарата ядровой древесины, который проявил себя антифлогистиком на модели острого каррагенинового отека, ПФКК маакии не вызывал существенного ослабления воспалительного отека. Учитывая различия в химическом составе полифенольного комплекса из нативного источника маакии и клеточной культуры растения, которая не содержит моно- и димерные стильбены [Fedoreyev S.A. et al., 2008], можно предположить, что угнетение экссудативной фазы воспаления, свойственное полифенолам нативного растения, обусловлено наличием в них стильбенов.

Оценка влияния полифенольных комплексов растений на экссудативную фазу острого воспаления показала, что фитокомплексы, существенно ослаблявшие флогогенное действие каррагенина (противовоспалительная активность более 30 %), можно расположить в следующей последовательности уменьшения активности: ПФКК марены > максар > ПФКК незабудочника > ПФКК воробейника.

Антипролиферативные свойства фитокомплексов изучены на модели хлопчатобумажной гранулемы, для которой характерно устойчивое коррелирование между количеством образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани и массой гранулемы в сухом виде [Single K.F., Shideman F.E., 1972]. Развитие гранулемы является фазным процессом и происходит путем экссудации и пролиферации [Чернух A.M., 1979; Adams D.O., 1976].

Как следует из данных, представленных в таблице 4, интенсивность воспалительной инфильтрации в патологическом очаге снижалась при профилактическом применении ПФКК маакии и марены; 26,8 % (р<0,01) и 29,3 % (р<0,001) угнетения процесса соответственно. При этом антиэкссудативный эффект ПФКК марены не уступал активности препарата сравнения. На фоне развития пролиферативных процессов у крыс с хлопчатобумажной гранулемой выявлена антипролиферативная активность ПФКК маакии, марены и максара в дозах 100 мг/кг, заключающаяся в эффективном уменьшении массы грануляционно-фиброзной ткани на 26,4 % (р<0,001); 26,5 % (р<0,01) и 27,7 % (р<0,001) соответственно. Следует отметить, что полифенолы ядровой древесины, содержащиеся в препарате максар, вызывали достоверное уменьшение массы сухого компонента на 27,7 % (р<0,001) и практически не оказывали воздействия на массу экссудата. Различия в химическом составе новогаленового и биотехнологического фитопрепаратов маакии позволяют предположить вклад суммы изофлавоноидов маакии в реализации антиэкссудативного действия на данной модели воспаления. При примерно одинаковом содержании суммы полифенолов в обоих фитокомплексах маакии отсутствие в составе полифенолов клеточной культуры маакии одной из фракций - стильбенов, определяет абсолютное превалирование изофлавоноидов в клеточной культуре маакии.

Таблица 4 - Влияние полифенольных комплексов растений на развитие воспалительной гранулемы у крыс

Группа исследования Количество животных Доза, мг/кг Масса гранулемы, мг Угнетение пролиферации, % Разность масс гранулемы во влажном и сухом виде, мг Угнетение экссудации, %

во влажном виде в сухом виде

Полифенольные комплексы маакии

Контроль 14 - 84,6+1,96 14,8+0,47 - 69,9+1,77 -

Макса р 19 100 76,7±2,23* р<0,01 10,7+1,15* р<0,001 27,7 66,0±1,73 5,6

ПФКК маакии 14 100 63,9+5,4* р<0,02 10,9±0,65* р<0,001 26,4 51,2±5,10* р<0,01 26,8

ПФКК марены сердцелистной

Контроль 14 - 90,0±4,51 18,9±1,35 - 71,0+4,80 -

Отвар листьев зимолюбки (1:10) 15 500 72,8±3,84* р<0,01 15,7+1,32 16,9 57,0±2,57* р<0,02 19,7

ПФКК марены 33 100 63,6+3,71* р<0,001 13,9+1,09* р<0,01 26,5 50,2+2,18* р<0,001 29,3

ПФКК растений семейства Бу рачниковые

Контроль 11 - 97,0±5,81 28,0±1,92 - 69,0±4,73 -

Отвар листьев зимолюбки (1:10) 14 500 77,4±2,18* р<0,01 22,4±1,29* р<0,05 20,0 55,1 ±2,73* р<0,02 20,2

Незабудочник 15 100 109,0±5,42 30,7+1,83 9,7 75,1±5,92 м

Воробейник 12 250 102,0±6,22 29,0±1,40 3,6 73,0±6,81 М

Примечания

1 Звездочками * обозначены статистически значимые различия по сравнению с контролем при р<0,05

2 Подчеркнуты значения, соответствующие приросту определяемых показателей

Исследуемые ПФКК растений семейства Бурачниковые в дозах 250 мг/кг (воробейник) и 100 мг/кг (незабудочник) не оказывали статистически достоверного противовоспалительного эффекта, незначительно стимулируя процессы экссудации и пролиферации (3,6 ... 9,7 %).

На модели хлопчатобумажной гранулемы наибольшей противовоспалительной активностью, характеризирующейся угнетением процессов экссудации и пролиферации более чем на 26 %, обладали полифенольные комплексы клеточных культур марены и маакии, а также максар (рис. 7).

80 -

°-120 Си О О О)

3-100 о о. с S I-

о о

X

ш *

га

CL 1 ш л

I

Щ

с

ф

I-

О

60 -

3 40 -

20

0 ->

Пролиферация

100

Экссудация

100

72,3 73,6*73,5*

- — -

»1

--- Л ' ш

—

—.-_

VV

.94,4

■ контроль □ максар □ ПФКК маакии Н ПФКК марены Рисунок 7 - Влияние максара и полифенольных комплексов клеточных культур маакии и марены (100 мг/кг) на процесс хронического воспаления у крыс

Данные фитокомплексы достоверно уменьшали массу грануляционно-фиброзной ткани на 26 ... 28 % (р<0,01) в ранний период пролиферативной фазы воспаления. Два полифенольных комплекса клеточных культур из отмеченных нами в качестве перспективных для ослабления развития хронического пролиферативного воспаления - ПФКК маакии и марены, существенно угнетали процесс экссудации на 27 ... 29 % (р<0,01).

Процессы свободно-радикального окисления (СРО), сопровождающиеся снижением активности системы антиоксидантной защиты (АОЗ) и последующим развитием каскада нарушений, рассматриваются как общее ключевое звено патологических процессов, протекающих в почке, вне зависимости от характера повреждающих факторов: ишемические, токсические, инфекционные, иммунные, воспалительные и др. [Мондодоев А.Г., 2009; Тугушева Ф.А., Зубина И.М., 2009]. Полифенольные соединения являются эффективными антиоксидантами, формирующими вторую линию антиоксидантной защиты согласно существующей классификации антиоксидантов [Burda S., Olesze W„ 2001; Gupta V.K., Sharma S.K., 2006]. В связи с этим, следующий этап

исследований был посвящен изучению воздействия полифенольных комплексов клеточных культур растений на процессы свободно-радикального окисления при воспроизведении различных моделей оксидативного стресса.

Разработанные кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО АГМУ модели активации свободно-радикального окисления позволяют оценить стимулированный редокс-дисбаланс как взаимодействие про - / антиоксидантных процессов [Арбузова Я.С., 2006; Замятина C.B., 2006; Талалаева О.С., 2006]. Экспериментальное воспроизведение окислительного стресса, вызванного ишемическим повреждением почки и экссудативным воспалительным отеком, сопровождалось активацией процессов СРО разной степени интенсивности, подтвержденной ростом суммарного показателя концентрации прооксидантов и свободно-радикальных метаболитов (ОПА) и продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Выраженная стимуляция процессов пероксидации липидов при ишемической нефропатологии происходила на фоне увеличенного потребления эндогенных антиоксидантов, приводящего к понижению их содержания в тканях, что соответствует данным литературы [Мондодоев А.Г., 2009]. При развитии окислительного стресса в условиях нефропатологии наблюдался более выраженный редокс - дисбаланс, сопровождающийся высокой интенсивностью процессов ПОЛ с преимущественным образованием вторичных продуктов пероксидации и угнетением факторов антиоксидантной защиты на уровне высокомолекулярных эндогенных антиоксидантов.

Дисбаланс системы ПОЛ — АОЗ в условиях окислительного стресса воспалительного генеза характеризовался стимулированной индукцией факторов первой линии АОЗ и менее выраженным накоплением продуктов пероксидации липидов. Поскольку профиль изменения активности антиоксидантных ферментов зависит от интенсивности образования активных форм кислорода, закономерно получение разнонаправленного ответ со стороны факторов ферментативной системы АОЗ при формировании экспериментального окислительного стресса различной природы [Кения М.В. и др., 1993; Чеснокова Н.П. и др., 2006].

Изучение антиоксидантной активности фитокомплексов маакии и марены в дозах 100 мг/кг проведено на модели окислительного стресса, вызванного субплантарным введением формалина с последующим формированием воспалительного отека задних конечностей крыс.

При курсовом профилактическом введении полифенольных комплексов маакии отмечено подавление активности прооксидантной системы (показатель ОПА) в 1,4 ... 1,9 раза (р<0,001) по сравнению с группой животных с оксидативным стрессом (рис. 8). Действие препарата ядровой древесины максар и ПФКК маакии сопровождалось снижением накопления вторичных продуктов пероксидации на 45 % (р<0,001) и на 43 % (р<0,001) соответственно, что может свидетельствовать о радикалперехватывающей активности полифенолов маакии. Наличие антирадикального механизма согласуется с данными об антиоксидантной активности изофлавонов, в частности, генистеина, даидзеина, формононетина и их гликозидов, в отношении первичных АФК и вторичных липидных радикалов, посредством чего обеспечивается ингибирование липидной пероксидации [Cassidy A. et al., 2003; Mitchell J.H. et al., 1998]. Данные полифенолы, а также их 4'-0- и 7-

О-глюкозиды составляют 49,7 % от общего содержания изофлавонов клеточной культуры маакии, а также являются мажорными компонентами максара [Fedoreyev S.A. et al., 2008]. Установленная Arara А. с соавторами зависимость между антиоксидантной активностью и структурой изофлавонов позволяет прогнозировать повышение специфической активности полифенолов маакии за счет наличия изофлавонов, содержащих такой фармакофор антиоксидантной активности, как дополнительная ОН - группа в положении С5. Вместе с тем, нельзя исключить определенную роль превентивного действия вследствие хелатирующей способности в отношении катионов переходных металлов, обнаруженной для генистеина и даидзеина [Cassidy A. et al., 2003].

s н о о

X

и

S

£

л л с ф н л п я

о с

90 80 70 60 50 40 -30 -20 -10 0

73,7

45,1

I

І

І

87,8

■ї-

60,1

І

61,4

54.6 ї-

43.6

Ші і

» ß

ЛИ І

11.6 i

75.9 -t

311

І

№

77.9

45.8

оксидатавный ПФ К маакии ПФ К марены стресс

максар

препарат сравнения

ЗОПА □ АОА

Рисунок 8 - Влияние ПФКК марены, маакии и максара в дозе 100 мг/кг на показатели общей прооксидантной и антиоксидантной активности в условиях окислительного стресса у крыс

Примечания

1 Звездочками * обозначены статистически значимые различия по сравнению с фуппой интактных крыс при р<0,05

2 Подчеркнуты статистически значимые различия по сравнению с группой контрольных крыс с окислительным стрессом при р<0,05

При одинаковой ориентированности антирадикального действия двух изученных фитокомплексов маакии амурской установлен разнонаправленный ответ со стороны ферментативного звена АОЗ. Как следует из результатов, представленных в таблице 5, действие максара развивалось без вмешательства полифенолов в механизм регуляции накопления ферментов антиоксидантной защиты: ферментативная активность не отличалась статистически значимыми изменениями по сравнению с показателями в условиях окислительного стресса.

Таблица 5 - Изменение показателей про - / антиоксидантного статуса под действием попифенольных комплексов в условиях окислительного стресса, в %

Показатель Полифенольные комплексы

максара клеточной культуры

маакии марены воробейника незабу-дочника

воспалительный стресс острая ишемия почки

Содержание ТБРП, м км оль/л 54,76 57,14 80,95* 145,83* 144.44*

ОПА, % 51.75* 72,55 102,16* 99,46* 108,08*

Активность каталазы, % 91,52* 63,84 81,70* 172,25* 182,20*

Активность глутатион-пероксидазы, Ед/мг НЬ 102,88 86,01 80,25* 185,77* 188,26*

Активность супероксиддисмутазы, % 106,01* 68,55 95,76* 170,86 136,42

ОАА, % 86.45 62.19* 47,38* 150,60* 151,57*

Примечания

1 За 100% принято значение показателя с моделью окислительного стресса

2 Звездочками * обозначены статистически значимые различия по сравнению с интактной группой при р<0,05

3 Подчеркнуты статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой с окислительным стрессом при р<0,05

Данный факт, помимо участия максара в механизме реализации второй линии защиты (антирадикальном), можно интерпретировать активацией неферментативных механизмов АОЗ. На участие факторов данной линии защиты, представленных низкомолекулярными гидрофильными антиоксидантами плазмы крови (аскорбиновая кислота, глутатион, мочевая кислота и др.) и липофильными компонентами клеточных мембран (токоферол, ретинол и др.), указывает уменьшение интегративного показателя общей антиоксидантной активности на 13,6 % (р<0,001) на фоне введения максара (рис. 8). Значимость низкомолекулярных антиоксидантов повышается в условиях быстрого истощения конститутивного пула ферментов антиоксидантной системы свободными радикалами, что

обусловлено значительным временем, необходимым для индукции их синтеза de novo [Зенков Н.К. и др., 2001; Кения М.В. и др.,1993]. Отсутствие стимулированной активности антиоксидантных ферментов под действием ПФКК маакии может свидетельствовать о предотвращении развития окислительного стресса за счет мощного антирадикального эффекта полифенолов клеточной культуры маакии в условиях эксперимента.

Установленные особенности в характере и степени выраженности ответной реакции на профилактическое введение полифенольных комплексов маакии обусловлены существенными различиями в их химическом составе. Определенный вклад в реализацию модулирующего действия по отношению к линии АОЗ, представленной низкомолекулярными антиоксидантами, может быть обеспечен моно - и димерными стильбенами максара, которые являются специфичными полифенолами нативного растения и не найдены в клеточной культуре даже в минорных количествах [Федореев С .А., 2010]. Данный факт подтверждается коррекцией окислительного стресса под действием полифенолов максара, не сопровождающейся некомпенсированным повышением расхода антиоксидантных ферментов, зарегистрированным для полифенолов клеточной культуры данного растения. В пользу предположения об участии стильбенов максара, в частности резвератрола, в содействии второй (антирадикальной) линии защиты организма от последствий окислительного стресса свидетельствует снижение показателей активности свободно-радикальных процессов, более выраженное по сравнению со стильбен-дефицитным комплексом полифенолов клеточной культуры маакии. Стильбен-содержащий полифенольный комплекс маакии в собственных экспериментах продемонстрировал выраженную антирадикальную активность, что является закономерным результатом присутствия в составе полифенолов фракции, выступающей в роли скавенджера свободных радикалов [Lastra С.А. et al., 2006; Martínez J„ Moreno J.J., 2000; Leonard S. et al., 2003].

Многочисленные сведения об антиоксидантной активности извлечений растительного сырья марены сердцелистной, в особенности корней марены [Deshkar N.A. et al., 2008; Saddiqui A. et al., 2012; Sharma B.A. et al., 2012], делают обоснованным прогноз о влиянии доминирующей группы БАВ марены, выделенной из клеточной культуры растения, на про - / антиоксидантный статус. Вызванное антрахинонами клеточной культуры марены падение концентрации токсичных перекисных продуктов на 19 % (р<0,001) по сравнению с оксидативным стрессом не приводило к деградации показателя ОПА, что минимизирует вклад прямого антирадикального механизма в реализацию антиоксидантного действия (табл. 5). Отсутствие выраженной активации ферментативного звена АОЗ под действием фитокомплексов марены на фоне истощения суммарного показателя ОАА предполагает более эффективное протекторное действие низкомолекулярных антиоксидантов, стимулированное данной группы полифенолов, по сравнению с ферментативной защитой.

Олигомеры кофейной кислоты, доминирующие в составе ПФКК растений семейства Бурачниковые, рассматриваются в качестве мощных антиоксидантных агентов, наиболее изученных из которых является розмариновая кислота [Буданцев А.Л., Лесиовская Е.Е., 2012; Bulgakov V.P. et al., 2012]. В экспериментах было изучено влияние олигомеров кофейной

кислоты, содержащихся в клеточных культурах растений, на окислительно-восстановительный баланс организма животных в условиях окислительного стресса, вызванного ишемическим повреждением почки. ПФКК воробейника в дозе 250 мг/кг и ПФКК незабудочника в дозе 100 мг/кг продемонстрировали примерно равное по степени выраженности прооксидантное действие, приводящее к активации образования вторичных продуктов ПОЛ на 44 ... 46 % (р<0,05) по сравнению с группой животных в условиях патологии (табл. 5).

В настоящее время многочисленные подтверждения нашел тот факт, что в некоторых условиях растительные полифенолы наряду с антиоксидантной обладают прооксидантной активностью [Middleton Е. et al„ 2000; Simic A. et al., 2007], причем проявление последней зависит не только от структурных особенностей полифенолов, но и от их концентрации [Cao G. et al., 1997; Galati G. et al., 2002], а также от характера распределения в гетерофазных системах [Ивлева Т.Н. и др., 2009]. Так, флавоноловые антиоксиданты, в структуре которых присутствует катехольное кольцо, становятся аутооксидабельными в присутствии переходных металлов и могут генерировать не только семихиноны и другие прооксидантные интермедиаты, но и АФК [Черняковский Е.М. и др., 2009; Chan T.S. et al., 2003]. Для доминирующего полифенола воробейника и незабудочника — розмариновой кислоты, Muracami К. с коллегами обнаружено прооксидантное действие с металл-зависимой генерацией АФК. Выявленная способность полифенолов клеточных культур растений к стимулированному накоплению ТБРП, не подтвержденная адекватным достоверным ростом показателя ОПА по сравнению с таковой для ишемизированной почки, может свидетельствовать о накоплении прооксидантных интермедиатов, образующихся при аутоокислении полифенольных субстратов.

Существенные изменения в балансе про - / антиоксидантной системы почек животных под воздействием полифенолов воробейника и незабудочника характеризовались достоверным ростом активности антиоксидантных энзимов, наиболее выраженным со стороны глутатионового звена антиоксидантной защиты на 86 ... 88 % (р<0,001) по сравнению с аналогичным показателем в условиях нефропатологии. Повышенный ферментативный фон, по-видимому, связан со стимулированной полифенольными прооксидантами активацией первой линии антиоксидантной защиты, осуществляющей детоксикацию активных форм кислорода каталазой, ГП и СОД. Накопление в условиях эксперимента данных ферментов, выработка которых регулируется по типу субстратной индукции, можно рассматривать как ответную реакцию системы АОЗ на прооксидантное действие интермедиатов полифенолов. Дефицит ферментов, развивающийся при ишемии почки, компенсируется под влиянием фитокомплексов воробейника за счет повышения ферментативной активности на 71 ... 86 % (р<0,001). При коррекции окислительного стресса фитокомплексами незабудочника со стороны ферментативной линии защиты установлена аналогичная ответная реакция, наиболее выраженная в отношении каталазы и ГП, обеспечивающая увеличение пула антиоксидантных ферментов на 82 ... 88 % (р<0,01) по сравнению с показателями активности данных ферментов в условиях нефропатологии. Выявленная способность фитопрепаратов к стимуляции первой линии антиоксидантной защиты подтверждается закономерным ростом

интегративного показателя ОАА. Кроме того, аналогичный профиль изменения показателей про - / антиоксидантного статуса, в частности, содержания ТБРП, активности ГП и общего показателя ОАА в ишемизированной почке под действием фитокомплексов незабудочника и воробейника определяется родственным составом полифенолов клеточных культур данных растений, среди которых превалируют розмариновая кислота и тетрамер кофейной кислоты - рабдозиин.

Использование клеточных культур, содержащих различные полифенолы, способствует коррекции окислительного стресса. Механизмы и степень их корригирующего действия зависят от природы полифенольного антиоксиданта, генеза окислительного стресса и степени возникающего дисбаланса между процессами пероксидации липидов и антиоксидантной защиты при окислительном стрессе. Анализ влияния ПФКК растений на исследуемые показатели про - / антиоксидантной активности позволяет предложить следующую схему предполагаемого механизма действия фитокомплексов на про - / антиоксидантный статус (рис. 9).

АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ

Н еферментативное звено АОЗ

ПФКК

вороб емника и незлоудочника

Содержание МДА и ТБРП

Уменьшение активности СОД, каталазы, ГП

Первая линия АОЗ (ферментативная)

Увеличение активности СОД, каталазы, ГП

максар

Вторая линия АОЗ (антирадикальная)

1 Интермедиаты

^^^полиф енолов

ПРООКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ

<2

ПФКК марен

Рис. 9 - Предполагаемый механизм действия ПФКК растений и максара на показатели про- /антиоксидантного статуса

Примечание - Синими стрелками обозначено снижение величины показателя, красными стрелками - увеличение величины показателя

Полученные данные свидетельствуют об активном участии полифенолов исследуемых растений в окислительно-восстановительном балансе организма экспериментальных животных. При этом группы полифенолов, представленные в объектах исследования, оказывают различное влияние на звенья патологических процессов, связанных с нарушением в системе «прооксидант — антиоксидант», что определяет дискуссионность однозначных выводов о выборе более эффективного антиоксиданта среди изученных фитокомплексов.

Выявленные в эксперименте видоспецифические особенности бактерицидной (бактериостатической) активности исследуемых ПФКК растений открывают перспективы таргетной антимикробной фитотерапии с учетом спектра наиболее вероятных возбудителей. По эффективности противомикробного действия полифенольные комплексы клеточных культур можно расположить в ряд: марена сердцелистная (маакия амурская) > воробейник краснокорневой > незабудочник шелковистый. Учитывая обнаруженную в эксперименте выраженную бактерицидную активность отдельных фитокомплексов, в частности, в отношении грамотрицательной флоры, в качестве наиболее перспективных растительных уроантисептиков можно рассматривать полифенольные комплексы клеточных культур марены и маакии.

Дальнейшее направление исследований в области фармакокоррекции нефропатологии иммуно-воспалительного генеза и оксалатной нефропатологии было сформировано с учетом патогенетического значения таких установленных фармакологических эффектов изученных полифенольных комплексов клеточных культур, как противовоспалительная, антиоксидантная, противомикробная и диуретическая активность, в лечении заболеваний почек.

Экспериментальный нефрит Масуги моделировали введением нефротоксической сыворотки, полученной от кроликов при их иммунизации почками крыс. Данная модель по морфологической картине воспроизводит мезангиопролиферативный гломерулонефрит (ГН), который является самой распространенной морфологической формой гломерулопатий - 60 ... 70 % всех случаев ГН [Пальцева Е.М., 2009]. Введение НТС сопровождалось последовательным развитием патологического процесса, клиническим проявлением которого является повышение прохождения белка через поврежденный гломерулярный фильтр при нарушении клубочковой фильтрации. Вторичными по отношению к клубочковой дисфункции являются повреждения канальцевого эпителия, проявляющиеся развитием гиперферментурии на поздних стадиях патологического процесса. При экспериментальном гломерулонефрите повышалась активность как ранних маркеров повреждений проксимального тубулярного эпителия (ЩФ, ГГТ), так и цитозольных энзимов (ЛДГ, АсАТ, АлАТ), что указывает на значительное повреждение канальцевого аппарата. Развитие нефропатологии отмечено активацией процессов СРО с одновременным снижением мощности АОЗ организма.

ПФКК исследуемых растений при курсовом введении на фоне экспериментального гломерулонефрита обладают фармакотерапевтической эффективностью, характеризующейся улучшением морфофункционального

состояния почек. Под влиянием исследуемых фитокомплексов отмечено снижение уровня протеинурии и ферментурии, повышение диуретической функции почек, увеличение скорости клубочковой фильтрации. Важным звеном нефропротекторного действия фитокомплексов является наличие гипопротеинурической активности, поскольку известно, что протеинурия ассоциирована с повреждениями как базальной мембраны клубочков, так и канальцевого аппарата нефрона [Бобкова И.Н., 2007; Rodríguez-lturbe В., García García G., 2010] и относится к факторам, вызывающим ремоделирование тубулоинтерстиция почки [Мухин Н.А., 2005].

По степени снижения протеинурии, а также по последовательности нарастания данного эффекта исследуемые ПФКК растений можно расположить в следующем порядке: марена > воробейник > незабудочник > маакия (табл. 6). На пике протеинурической реакции зарегистрировано снижение показателей экскреции белка по сравнению с уровнем нелеченных животных под действием ПФКК маакии и марены в дозе 50 мг/кг на 50,7 % (р<0,02) и на 56,8 % (р<0,02) соответственно. Массивное снижение протеинурии, отмеченное для фитокомплеков марены, становится особенно ценным свойством потенциального нефропротектора при зарегистрированном замедлении потери клубочковой фильтрации в условиях гломерулонефрита. Максимум гипопротеинурической активности ПФКК растений семейства Бурачниковые: незабудочника в дозе 100 мг/кг и воробейника в дозе 200 мг/кг, сформировавшийся к окончанию эксперимента, соответствовал снижению экскреции белка на 37,7 % (р<0,05) и на 39 % (р<0,05) соответственно.

Учитывая аутоиммунную этиологию индукции гломерулонефрита, а также роль мезангиальных клеток в его прогрессировании, логично предположение о благоприятном влиянии розмариновой кислоты, доминирующей в составе ПФКК семейства Бурачниковые, на некоторые патогенетические звенья заболевания. Установлено, что розмариновая кислота оказывает иммунодепрессивное воздействие на конвертазы классической и альтернативной системы комплемента; ингибирует комплемент-зависимые воспалительные реакции, уменьшая выработку некоторых макрофагов воспаления; а также подавляет пролиферацию мезангиальных клеток и препятствует отложению депозитов в гломерулярном матриксе [Englberger W. et al.,1988; Peake P.W. et al.,1991; Makino T. et al., 2002]. Сведения о фармакологической активности компонентов, входящих в состав изучаемых фитокомплексов, хорошо согласуются с полученными данными о замедлении развития клубочковой дисфункции под влиянием ПФКК воробейника и незабудочника при экспериментальном гломерулонефрите.

В последнее время расширяются представления о значении неиммунных молекулярных механизмов патогенеза гломерулонефрита: гемодинамических и метаболических. Одним из ведущих звеньев патогенеза гломерулонефрита являются мембранно-деструктивные процессы в почечной ткани, характеризующиеся усилением процессов перекисного окисления липидов и истощением факторов антиоксидантной защиты.

Таблица 6 - Показатели экскреции белка в условиях экспериментального гломерулонефрита (ГН) под влиянием ПФКК растений

Дни после начала эксперимента Показатель экскреции белка (мг/сутки) и группа наблюдения

интактные (п=10) Контроль (ГН) (п=14) ГН + маакия (п=15) ГН + марена (п=15) интактные (п=10) контроль (ГН) (п=14) ГН + воробейник (п=14) ГН + незабудочник (п=13)

0 0,5±0,13 0,7±0,09 0,7±0,19 1,0±0,27 2,3±0,22 2,3±0,22 2,6±0,28 2,7±0,54

10 0,9±0,21 3,8±0,64 'р<0,001 5,0±0,79 ♦р<0,001 2,7±0,79 *р<0,05 1,7±0,34 46,9±5,97 *р<0,001 43,4±11,76 •р<0,001 30,1±9,51 *р<0,01

15 0,6±0,18 5,7±0,54 "р<0,001 6,5±1,14 •р<0,001 3,9±0,71 *р<0,001 "р<0,05 1,4±0,20 64,4±6,55 *р<0,001 51,0±12,00 *р<0,001 63,0±13,11 •р<0,001

20 1,2±0,26 12,0±1,48 •р<0,001 9,9±2,00 'р<0,001 7,1±1,42 *р<0,001 **р<0,05 2,4±0,61 86,6±13,86 *р<0,001 62,1±14,67 *р<0,001 67,1 ±16,21 *р<0,001

25 0,7±0,12 14,0+2,85 *р<0,001 9,6±1,52 'р<0,001 6,6±0,56 *р<0,001 *'р<0,02 2,0±0,22 71,4±11,95 *р<0,001 54,8±12,00 *р<0,001 50,4±12,97 'р<0,01

30 0,8+0,18 14,6±2,64 *р<0,001 7,2±0,89 •р<0,001 "р<0,02 6,3±0,62 *р<0,001 "р<0,02 0,9±0,34 68,0±11,24 *р<0,001 41,5±6,24 *р<0,001 "р<0,05 42,8±10,96 *р<0,001

Примечания

1 'Различия статистически значимы (р<0,05) по сравнению с показателями интакгных животных

2 "Различия статистически значимы (р<0,05) по сравнению с показателями контрольной группы

Дисбаланс между окислительным воздействием на клетки почек и их антиоксидантной защитой, играющий определенную роль в механизме патологии гломерулярных заболеваний [Куликова А.И. и др., 2000; Тип Б. е1 а1., 1997], подтвержден в эксперименте установленной неадекватностью функциональных возможностей ферментативной системы защиты скорости продукции АФК в условиях гломерулонефрита, о чем свидетельствует снижение ферментативной активности на фоне оксидативного стресса, вызванного нефритом Масуги. Оценка баланса в системе «антиоксидант -прооксидант» под воздействием изучаемых полифенольных комплексов клеточных культур семейства Бурачниковые демонстрирует смещение в сторону оксидантов, подтвержденное ростом коэффициента ОПА/ОАА по сравнению с интактной группой. Данное смещение обеспечивает стимуляцию ферментативного звена защиты, в первую очередь, каталазной и глутатионпероксидазной активности.

Мониторинг активности некоторых мембранно-связанных (ГГТ, ЩФ) и цитозольных ферментов эпителиальных клеток извитых канальцев нефронов (АсАТ, АлАТ, ЛДГ) позволяет оценить степень повреждения структурно-функциональных элементов нефрона и уточнить преимущественную локализацию процесса с учетом определенной специфичности в распределении энзимов в различных отделах нефрона [Дронова В.И., 1980]. Показателем нефропротективной активности исследуемых ПФКК растений является динамика экскреции маркеров повреждения цитомембран почечного эпителия на фоне лечения фитокомплексами. На пике ферментативной активности щелочной фосфатазы ПФКК воробейника и незабудочника замедляли высвобождение фермента в мочу больных животных в 7,6 раз (р<0,01) и в 6,8 раз (р<0,01) соответственно. Наиболее сильный гипоферментурический эффект в отношении активности ГГТ продемонстрировал фитокомплекс незабудочника, снижавший показатели ферментуреза в 1,9 (р<0,05); 3,9 (р<0,01) и 6,9 раз (р<0,01) на 10, 20 и 30 сутки эксперимента соответственно. Нарастающее снижение мочевой экскреции данных мембранно-ассоциированных ферментов позволяет определить локализацию действия полифенолов клеточных культур растений семейства Бурачниковые при экспериментальной патологии на уровне клеточных мембран почечных канальцев. ПФКК марены на тридцатый день развития заболевания, характеризующийся пиком протеин- и ферментурии в отношении всех изучаемых энзимов, примерно в одинаковой степени уменьшал активность в моче ферментов: АсАТ - на 71 % (р<0,01), АлАТ - на 67 % (р<0,01), ЛДГ - на 69 % (р<0,01), ГГТ - на 66 % (р<0,05) и ЩФ - на 73 % (р<0,02). Снижение показателей энзимурии в отношении цитозольных ферментов (ЛДГ и аминотрансфераз), зарегистрированное на фоне применения ПФКК марены, указывает на ослабление процессов цитолиза клеток почечных канальцев. Выраженный в меньшей степени гипоэнзимурический эффект ПФКК маакии, свидетельствующий о частичном восстановлении нарушенных функций цитомембран почечного эпителия, подтверждается профилем гипопротеинурического спектра фитокомплексов маакии, согласно которому снижение экскреции белка формируется только во вторую стадию эксперимента.

Важным фактором в реализации нефрозащитного действия ПФКК марены является наличие флоголитической активности, установленной с использованием различных модельных систем. На фоне воспалительного процесса, рассматриваемого в качестве одного из неиммунных факторов прогрессирования пролиферативных нефритов, в том числе воспроизведенного мезангиопролиферативного ГН [Тареева И.Е., 1996], закономерно обнаруженное в эксперименте позитивное влияние на функциональное состояние почек фитокомплекса марены, способного к угнетению воспалительного процесса.

По результатам проведенных исследований полифенольные комплексы клеточных культур растений можно отнести к мягко действующим средствам патогенетической терапии гломерулонефрита, влияющим на неиммунные механизмы прогрессирования патологии. Полифенольные комплексы клеточных культур растений обладают гипопротеинурической активностью, выраженной в разной степени для соединений различной химической природы. Определенную роль в реализации гипопротеинурического эффекта ПФКК растений семейства Бурачниковые играют кпеточно-протективные свойства полифенолов, обусловленные стимуляцией ферментативных факторов антиоксидантной защиты, а также мембранно-стабилизирующим эффектом, приводящим к восстановлению нарушенных функций, в частности, за счет проницаемости почечного фильтра. Коррекция внутрипочечной динамики под действием ПФКК марены и воробейника приводит к улучшению фильтрационной функции клубочков и тем самым замедляет прогрессирование поражений почек в условиях экспериментального гломерулонефрита.

Учитывая доминирование оксалатных уролитов при мочекаменной болезни [Parmas M.S., 2004; Нигматулина E.H. и др., 2005], для воспроизведения основной клинической формы МКБ использовали модель оксалатного нефролитиаза, индуцированного введением этиленгликоля, метаболизм которого сопровождается образованием оксалатов [Khan S.R., 1997]. Увеличение литогенного потенциала крови при хронической интоксикации этиленгликолем проявлялось в явлениях вторичной оксалатной гиперсатурации мочи. Пересыщение мочи литогенными агентами, в первую очередь, оксалатами характеризуется сниженной реабсорбцией и увеличенной фильтрацией, что подтверждается в условиях эксперимента незначительным ростом диуретической реакции на фоне высокого уровня креатининуреза. Доказательства формирования кристаллических отложений оксалата кальция получены при проведении морфологических исследований срезов коркового и мозгового вещества почек литогенизированных крыс. Установленная локализация депозитов преимущественно в интерстиции почечного сосочка в области его вершины многократно подтверждена в клинических исследованиях и экспериментах in vivo [Khan S.R., 1985; Kok D.J., 1997].

Признаком клеточного повреждения паренхимы почек при воспроизводимой модели нефролитиаза является усиленный выход в просвет почечных канальцев ферментов с различной внутриклеточной локализацией: маркера мембранодеструкции ГГТ, фермента цитолитического синдрома ЛДГ и почечно-специфического индикатора

канальцевых повреждений лизосомального фермента Ы-ацетил-Р-О-глюкоаминидазы.

Формирование патологии сопровождалось усилением процессов пероксидации на стадии образования вторичных продуктов ПОЛ, о чем свидетельствует накопление тиобарбитуратреактивных продуктов, стимулирующее рост общей прооксидантной активности гомогената почечной ткани и крови больных животных. Сопоставимые показатели интенсивности процессов ПОЛ в крови и нефроцитах демонстрируют системный характер дезинтеграции прооксидантно - антиоксидантного баланса. Характер изменений в крови аналогичен таковым в гомогенате ткани, однако зарегистрированы различия в степени активации СРО и угнетения ферментативного звена АОЗ.

В комплексе консервативных мероприятий, направленных на коррекцию нарушений обмена литогенных веществ при нефролитиазе, привлекательными фармакологическими характеристиками обладают полифенольные клеточной культуры марены сердцелистной и маакии амурской, эффективность которых изучали при лечебной и профилактической схемах введения.

Длительное введение полифенольных комплексов обеспечивает ослабление интенсивности литогенных процессов в почках, что проявляется, в первую очередь, снижением мочевой концентрации оксалат-ионов. В группах профилактики отмечена тенденция к стабилизации уровня оксалурии на показателях, ниже контрольных на 15 ... 25 % - при введении ПФКК маакии в дозе 10 мг/кг и на 15 ... 45 % - при введении ПФКК марены в дозе 75 мг/кг. Концентрация оксалатов в группе лечения фитокомплексами маакии в дозе 10 мг/кг была вдвое (р<0,01) меньше показателя больных животных. Применение полифенолов марены в дозе 75 мг/кг к концу лечебного курса приводило к понижению уровня оксалурии в 3,7 раза (р<0,001). Минимум экскреции фосфатов был зарегистрирован на третьей неделе лечения ПФКК марены и маакии, когда степень насыщенности мочи фосфат-ионами снижалась по сравнению с показателем до начала лечения на 38 % (р<0,001) и 52 % (р<0,01) соответственно.

Зафиксированное ослабление гиперсатурации мочи является ключевым звеном в реализации антилитогенного действия полифенолов. В максимальной степени установленное действие проявляется в условиях лечебного применения как фитокомплексов маакии, так и марены. Ослабление гипероксалурии при лечении ПФКК растений обеспечивается сильной диуретической реакцией, приводящей к снижению насыщенности мочи литогенными ионами (табл. 7).

Эффективность проведенного лечения подтверждается регрессивной динамикой биохимических и морфометрических показателей. Профилактическая и, в большей степени, лечебная схема введения ПФКК растений обеспечивает снижение показателей ферментурии. Анализ спектра гипоэнзимурической активности ПФКК растений показывает, что фитокомплекс марены как в профилактическом, так в лечебном режиме введения препятствует росту активности маркеров клеточного повреждения почечных канальцев: лактатдегидрогеназы и у-глутамилтрансферазы. В то же время даже менее выраженный гипоферментурический эффект ПФКК маакии обеспечивает нормализацию данных показателей ферментурии до

уровня здоровых крыс после курса лечения. В отношении лизосомального фермента НАГ оба фитокомплекса продемонстрировали сопоставимый регресс показателей ферментурии. Динамика снижения активности мембранно-специфичного фермента ГГТ под действием полифенольных комплексов позволяет рассматривать мембранно-стабилизирующий эффект в качестве одного из возможных механизмов нефропротективного действия полифенольных комплексов клеточных культур.

Таблица 7 - Изменение некоторых показателей метаболического статуса и морфометрии почек больных животных на фоне применения ПФКК маакии и марены по отношению к уровню патологии, в %

Показатель Группа наблюдения

МКБ ПФКК маакии + МКБ ПФКК марены + МКБ

профилактика лечение профилактика лечение

Диурез 100 145 197* 200* 194*

Концентрация литогенных субстанций в моче

Оксалат 100 75 50* 55* 27*

Фосфат 100 62* 48* 93 62*

Показатель энзимурии

ЛДГ 100 58* 22* 27* 31*

НАГ 100 52* 21* 44* 32*

ГГТ 100 62* 37* 29* 25*

Морфометрические показатели

Размер депозитов 100 98 21* 81 35*

Количество депозитов 100 92 60* 44* 17*

Примечания

1 За 100 % принят уровень в группе с контрольным нефролитиазом

2 Расчет показателей в опытных группах произведен на пике проявления

эффекта

3 Звездочками * отмечены статистически значимые различия по сравнению с показателями литогенизированных животных при р<0,05

На фоне процессов литогенеза, сочетающихся с воспалительными нарушениями и активацией прооксидантных систем организма, мембраностабилизация почечных канальцев может быть ассоциирована с выраженной противовоспалительной активностью фитокомплексов, установленной на моделях острого и хронического воспаления. Оба фитокомплекса, ослабляя возникающий синдром цитолиза нефроцитов литогенизированных крыс, препятствовали поступлению в мочу цитолитического фермента ЛДГ в условиях нефролитиаза. При этом режим трехнедельного лечения обеспечивал более выраженное угнетение цитолитического синдрома и мембранодеструкции почечных канальцев по сравнению с профилактическим режимом введения ПФКК марены и маакии. Способность к стабилизации лизосом проявилась в уменьшении активности

НАГ в группах лечения фитокомплексами марены и маакии. Поскольку угнетение процессов гипероксалурии под действием ПФКК растений протекает на фоне интенсивного подавления активности ЛДГ, закономерно предположение об ингибирующем воздействии полифенолов клеточных культур на функциональную активность данного нефромаркера, результатом которого является ослабление синтеза оксалат-ионов. Как известно, данный фермент катализирует в митохондриях гепатоцитов превращение интермедиата - глиосалевой кислоты в конечный метаболит - оксалат [Рооге Я.Е. е! а1., 1997]. Замедление полифенолами процессов литогенеза, подтвержденное снижением мочевой концентрации оксалатов и уровня ферментурии, может быть обеспечено их воздействием на метаболизм оксалатов в гепатоцитах.

Морфологическим подтверждением эффективности лечебного применения ПФКК маакии является уменьшение количества кальциевых депозитов в 1,7 раз (р<0,01) и их размера почти в 5 раз (р<0,001) по сравнению с уровнем патологии (табл. 7). Формирование условий, препятствующих литогенезу, на фоне лечебного применения марены доказано уменьшением количества кальциевых депозитов почти в 6 раз (р<0,001), а их размера - почти втрое (р<0,05).

Эффективность профилактического сопровождения нефролитиаза фитокомплексами маакии в режиме эксперимента морфологически не подтверждена. Напротив, ПФКК марены в качестве средства профилактики при экспериментальном нефролитиазе препятствует образованию новых депозитов и формированию имеющихся: их количество уменьшено по сравнению с патологией на 56 % (р<0,01), а размер кальций-позитивных образований уменьшается до 81 % по отношению к 100 %-му показателю литогенизированных крыс.

Среди групп наблюдения именно лечебное сопровождение экспериментального нефролитиаза ПФКК марены обеспечивает максимальное снижение показателей активности процессов СРО. Подтверждением антиоксидантной активности ПФКК маакии, установленной ранее в ходе выявления специфических видов фармакологической активности, служит способность к ослаблению процессов ПОЛ в почках и крови литогенизированных крыс. Фармакологическая активность попифенолов маакии, обнаруженная в условиях оксидативного стресса воспалительного генеза, определяется антирадикальными и металл-хелатирующими свойствами изофлавонов маакии. Ответная реакция ферментативного звена АОЗ на воздействие изученных ПФКК была разнонаправленной и разноэффектной в зависимости от режима введения полифенольных комплексов клеточных культур и биологического объекта исследования. Фитокомплексы не устранили возникающее при патологии угнетение активности редокс-системы глутатиона, что подтверждается дисбалансом отдельных энзимов ферментативного звена антиоксидантной защиты.

В качестве вторичных факторов камнеобразования выделяют нарушение оттока мочи, что в условиях повышенной экскреции литогенных субстанций не только увеличивает уровень сатурации мочи, но и провоцирует вторичные инфекции мочевыводящих путей [Неймарк А.И. и др., 2011]. В связи с этим комплексное этиологическое лечение

предусматривает повышение диуреза и антибактериальную терапию. В эксперименте обнаружена бактерицидная активность ПФКК марены и марены, в частности, в отношении грамотрицательных уропатогенов, преобладающих среди возбудителей инфекций мочевыводящих путей. Установлено усиление выделительной функции почек под действием полифенольных комплексов клеточных культур, наиболее выраженное для марены (табл. 7). Возможность антибактериальной терапии на фоне восстановления нормальной уродинамики демонстрирует перспективность использования полифенольных комплексов биотехнологического происхождения в этиопатогенетической терапии МКБ.

Применение ПФКК растений в лечебном режиме препятствует образованию новых и имеющихся кальциевых депозитов в интерстиции почечного сосочка. Изученные фитокомплексы оказывают положительное влияние на некоторые показатели метаболического статуса литогенизированных животных, что проявляется снижением гипероксалурии и увеличением уровня диуреза с тенденцией к снижению литогенного потенциала мочи. Полифенольные комплексы сдерживают развития цитолитического синдрома и мембранодеструкции клеток нефротелия, а также способствуют восстановлению нарушенного в условиях оксалатной интоксикации окислительно-восстановительного баланса организма, что проявляется в снижении уровня ферментурии и интенсивности процессов ПОЛ, а также избирательном восстановлении систем антиоксидантной защиты. Профилактический режим введения препаратов маакии не оказывает выраженного воздействия на морфометрические показатели эффективности, поэтому может быть использован как компонент комплексной терапии нефролитиаза. В связи с вышеизложенным, полифенольные комплексы клеточных культур растений можно рекомендовать в качестве растительных нефропротекторов в консервативном комплексном лечении больных нефролитиазом.

Проведенное исследование экспериментальных фитокомплексов, полученных биотехнологическим способом, доказывает наличие большого фармакологического потенциала полифенольных комплексов клеточных культур маакии амурской, марены сердцелистной, незабудочника шелковистого и воробейника краснокорневого в фитотерапии нефрологических заболеваний. Гармоничное сочетание

противовоспалительного, диуретического, салуретического, антимикробного и антиоксидантного действий, выраженность которых связана с разнообразным представительством полифенолоа в фитокомплексах клеточных культур, обеспечивает эффективность фитотерапии заболеваний почек иммуно-воспалительной и токсико-метаболической этиологии. Использование инновационных технологий получения фитосырья на основе клеточных культур не только позволяет расширить номенклатуру импортзамещающих лекарственных фитопрепаратов нефрозащитного действия, что приобретает большое значение в силу распространенности и социально-экономической значимости нефрологической патологии, но и обеспечивает реализацию ресурсосберегающих технологий производства фитопрепаратов, направленных на сохранение растительных популяций.

выводы

1. Мочегонное действие полифенольных комплексов клеточных культур воробейника краснокорневого и незабудочника шелковистого обеспечивается их сочетанным воздействием на клубочковую фильтрацию и канальцевый транспорт электролитов. Диуретическая активность полифенолов марены сердцелистной и маакии амурской связана с усилением почечной гемодинамики.

2. Наиболее существенно развитие как острого, так и хронического воспалительного процесса подавляет полифенольный комплекс клеточной культуры марены. Противовоспалительная активность фитокомплексов клеточных культур марены и маакии ассоциирована с угнетением процессов экссудации и пролиферации.

3. При повреждениях почек различной этиологии ведущим механизмом нефропротективного действия полифенольных комплексов клеточной культуры маакии и марены является способность ингибировать процессы свободно-радикального окисления за счет прямого антирадикального действия (маакия) и повышения активности эндогенной антиоксидантной системы (марена). Действие полифенольных комплексов клеточной культур воробейника и незабудочника связано с повышением активности антиоксидантных ферментов.

4. Особенности фармакологической активности двух изученных полифенольных комплексов маакии амурской обусловлены различиями состава полифенолов.

5. Полифенольные комплексы клеточных культур растений обладают антимикробной активностью в отношении распространенных возбудителей инфекции мочевыводящих путей. Наиболее эффективными уроантисептиками являются полифенольные комплексы клеточных культур марены и маакии.

6. Терапевтическая эффективность фитокомплексов клеточных культур растений на фоне экспериментального гломерулонефрита обусловлена как ренальными, так и экстраренальными факторами.

7. Фитокомплексы клеточных культур марены и маакии на модели кальций-оксалатного нефролитиаза проявляют антилитогенное действие за счет комплексной коррекции основных патологических звеньев литогенеза.

8. Полифенольные комплексы клеточных культур маакии амурской, марены сердцелистной, воробейника краснокорневого и незабудочника шелковистого обладают диуретическим, салуретическим, противовоспалительным, антибактериальным эффектами, а также регулируют интенсивность процессов свободно-радикального окисления. Выраженность фармакологического действия определяется составом полифенольных соединений в фитокомплексах.

9. Новые альтернативные виды фитосырья, получаемого биотехнологическим способом с направленным синтезом полифенолов, являются перспективным источником для создания инновационных лекарственных средств нефропротективного действия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полифенольные соединения клеточных культур некоторых представителей семейства бурачниковые как потенциальный источник растительных антиоксидантов / В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. // Медицинский вестник Башкортостана. - 2006. - Т. 4, №1 (специальный выпуск) - С. 123-124.

2. Фармакологическая активность препаратов клеточных культур некоторых растений семейства бурачниковые / В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. II Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Т. 5, Приложение 2. - С. 60-62.

3. Сравнительное влияние растений семейства бурачниковых на функции почек у крыс / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Ю.В. Инюшкина и др. // Актуальные вопросы фармацевтической и медицинской науки и практики: сборник научных статей / Под ред. Ю.М. Колесника. - Запорожье, 2006. - Т.З, Вып. XV.-С. 571-574.

4. Диуретическое действие препарата незабудочника шелковистого в условиях длительного введения крысам / О.В. Азарова, С.А. Федореев, О.Н. Зяблова и др. // Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы: труды международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию профессора Ш.М. Омарова / Под ред. Ш.М. Омарова. - Махачкала,

2006.-С. 170-172.

5. Антиоксидантные свойства препарата клеточных культур Lithospermum erythrorhizon Siée, et Zucc. (Boraginaceae) в экперименте in vivo I В.М. Брюханов, С.А. Федореев, Я.Ф. Зверев и др. // Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики: материалы региональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ / Под ред. А.И. Лазарева. - Курск: КГМУ, 2006. - С. 335-337.

6. Влияние препарата воробейника краснокорневого на функцию почек в эксперименте / О.В. Азарова, С.А. Федореев, И.В. Макарова и др. // Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы: труды международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию профессора Ш.М. Омарова / Под ред. Ш.М. Омарова. - Махачкала, 2006. - С. 173-174.

7. Химический состав и фармакологическая активность антрахинонов из клеточной культуры Rubia cordifoiia / H.П. Мищенко, С.А. Федореев, В.М. Брюханов и др. // Химико-фармацевтический журнал. -

2007.-Т. 41, № 11.-С. 38-41.

8. Перспективы изучения фармакологической активности клеточных культур некоторых дальневосточных растений / О.В. Азарова, В.П. Булгаков, Брюханов В.М. и др. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (специальный выпуск), Ч. 1 (А-Л). - С. 1-1577 - 11578.

9. Диуретическое действие извлечений клеточных культур марены сердцелистной в эксперименте / Я.Ф. Зверев, О.В. Азарова, В.П. Булгаков и др. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (специальный выпуск), Ч. 1 (А-Л).— С. 1 -1703.

10. Антимикробная активность клеточных культур некоторых представителей дальневосточной флоры / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, С.А. Федореев и др. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов / Под ред. E.H. Вергейчика, H.H. Каревой. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 430-432

11. High rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum callus cultures and the effect of the calli on masugi-nephritis in rats / Yu.V. Inyshkina, V.P. Bulgakov., M.V. Veselova et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2007. - Vol. 71, № 5. - P. 1286-1293. (Web of Science: Bioscience, biotechnology and biochemistry; ISSN 0916-8451)

12. Клеточная культура растений как возможный источник новых лекарственных средств (опыт изучения каллусов некоторых представителей дальневосточной флоры) / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, С.А. Федореев и др. // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы III всероссийской конференции / Под ред. Н.Г. Базарновой, В.И. Маркина. - Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2007. - Кн. 2. - С. 378-382.

13. Влияние клеточных культур некоторых растений семейства бурачниковых на течение экспериментального гломерулонефрита / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, В.П. Булгаков и др. // Создание новых лекарственных препаратов: материалы республиканской научной конференции / Под ред. Е.Д. Гольдберга. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2007.-С. 81-83.

14. Влияние полифенольного комплекса маакии амурской на функцию почек крыс / Я.Ф. Зверев, О.В. Азарова, В.П. Булгаков II Создание новых лекарственных препаратов: материалы республиканской научной конференции / Под ред. Е.Д. Гольдберга. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2007. - С. 79-80.

15. Фармакологическая активность полифенольного комплекса клеточных культур Lithospermum erythrorhizon / О.В. Азарова, В.М. Брюханов,

B.П. Булгаков и др. // Растительные ресурсы.- 2007. - Т. 43, Вып. 4. - С. 102-109.

16. Влияние фитокомплексов клеточных культур дальневосточных растений на развитие экспериментального воспаления / О.В. Азарова, О.Н. Зяблова, И.В. Макарова и др. // Естествознание и гуманизм. Современный мир, природа и человек: межвузовский сборник научных трудов / Под ред. H.H. Ильинских. - Томск, 2007. - С. 82-83.

17. Влияние полифенольного комплекса маакии амурской на течение экспериментального гломерулонефрита / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев II Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации: материалы межрегиональной научно-методической юбилейной конференции, посвященной 90-летию ВГУ / Под ред. С.А. Боевой. - Воронеж: ВГУ, 2008. -

C. 7-9.

18. Антиоксидантные свойства фитокомплексов клеточных культур Eritrichium sericeum Lehm. (Boraginaceae) / В.М. Брюханов, В.П. Булгаков, Я.Ф. Зверев и др. Н Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов / Под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 387-389.

19. О фармакологической активности антрахинонов клеточной

культуры марены сердцелистной / В.М. Брюханов, О.В. Азарова, С.А. Федореев и др. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов / Под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 386-387.

20. Клеточная культура растений как перспективный источник новых лекарственных средств, влияющих на функцию почек / О.В. Азарова, И.В. Макарова, О.Н. Зяблова // Тезисы докладов шестого Сибирского физиологического съезда. - Барнаул: Изд-во «Принтэкспресс», 2008. - В 2 томах. - Т. 1. - С. 132.

21. Влияние на функцию почек фитокомплексов клеточных культур марены сердцелистной и маакии амурской / В.М. Брюханов, О.В. Азарова, Я.Ф. Зверев и др. II Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда. - Барнаул: Изд-во «Принтэкспресс», 2008. - В 2 томах - Т. 1. - С. 132-133.

22. Клеточная культура Eritrichium sericeum Lehm. (Boraginaceae) -источник полифенольных соединений, обладающих фармакологической активностью / В.М. Брюханов, В.П. Булгаков, Я.Ф. Зверев и др. II Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - Т. 42, № 6. - С. 32-35.

23. Опыт моделирования мочекаменной болезни у крыс / В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. // Тезисы докладов шестого Сибирского физиологического съезда. - Барнаул: Изд-во «Принтэкспресс», 2008. - В 2 томах - Т. 1. - С. 134-135.

24. Развитие мочекаменной болезни крыс на фоне длительного применения препарата марены сердцелистной / А.Ю. Жариков, О.В. Азарова, О.С. Талалаева // Тезисы докладов шестого Сибирского физиологического съезда. - Барнаул: Изд-во «Принтэкспресс», 2008. - В 2 томах,-Т. 1.-С. 135.

25. Сравнительная оценка влияния фитокомплексов клеточных культур дальневосточных растений на функцию почек у крыс / О.В. Азарова,

B.М. Брюханов, Булгаков В.П. и др. II Фармация из века в век: сборник научных трудов. - СПб: Изд-во СПХФА, 2008. - Часть V. (Синтез биологически активных веществ для создания фармацевтических субстанций. Фармакологические исследования). - С. 8-12.

26. Влияние фитокомплекса маакии амурской на систему гемостаза у крыс / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. II Проблемы и перспективы современной науки: сборник научных трудов / Под ред. H.H. Ильинских. - Томск, 2008. - Вып. 2. - С. 59.

27. Функция почек в условиях экспериментального оксалатного нефролитиаза / В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. // Нефрология.- 2008. - Т. 12, № 1. - С. 69-74.

28. Клеточная культура дальневосточных представителей Boraginaceae как источник полифенолов со специфической фармакологической активностью / О.Н. Зяблова, О.В. Азарова, В.М. Брюханов и др. II Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы IV Всероссийской конференции / Под ред. Н.Г. Базарновой, В.И. Маркина. - Барнаул: Изд-во Апт. ун-та, 2009. — Кн. 2. -

C. 234-236.

29. Сравнительная оценка влияния фитокомплексов клеточных культур марены сердцелистной и воробейника краснокорневого на функцию

почек у крыс / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, В.П. Булгаков и др. // Pharmacy of Kazakhstan: integration of science, education and production: papers of International research-practice conference. - Shymkent (Kazakhstan), 2009 - Vol. 2. - P. 263-265.

30. Клеточная культура Rubia cordifolia как новый источник антрахинонов с фармакологической активностью Мищенко Н.П., Федореев СЛ., Брюханов В.М., Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения: тезисы докладов научно-практической конференции. - Киев: Издатель B.C. Мартынюк, 2009. - С. 221222.

31. Влияние фитокомплексов клеточной культуры марены сердцелистной на течение экспериментального гломерулонефрита / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, В.П. Булгаков и др. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов / Под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 378-380.

32. Благоприятное влияние препарата клеточной культуры марены сердцелистной на течение экспериментальной патологии почек / В.В. Лампатов О.В. Азарова, В.М. Брюханов и др. // Нефрология. - 2009. - Т. 13, № 3. - С. 148-149.

33. Влияние фитокомплексов клеточной культуры марены сердцелистной на развитие экспериментального нефролитиаза у крыс / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Нефрология. - 2009. - Т. 13, № 2.-С. 81-85.

34. Ферментурия как признак экспериментального нефролитиаза / Я.Ф. Зверев, О.В. Азарова, В.М. Брюханов и др. // Нефрология. - 2009. - Т. 13, №3.-С. 149.

35. Морфологические изменения в почках крыс при экспериментальном нефролитиазе на фоне длительного применения клеточной культуры маакии амурской / Н.В. Мотина, В.М. Брюханов, О.В. Азарова и др. // Нефрология. - 2009. - Т. 13, № 4. - С. 75-79.

36. Азарова, О. В. Противовоспалительная активность попифенольных комплексов клеточных культур дальневосточных растений / О.В. Азарова, Я.Ф. Зверев // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 3. - С 146-151.

37. Сравнительная оценка антиоксидантных свойств полифенолов из ядровой древесины и клеточной культуры маакии амурской / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, В.П. Булгаков и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - № 1. - С. 17-20.

38. Азарова, О. В. Флоголитическая активность полифенольных комплексов клеточных культур дальневосточных растений / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Н.П. Мищенко // Фармация. - 2010. - №4. - С. 45-48.

39. Азарова, О. В. Сравнительная оценка противовоспалительной активности полифенолов клеточной культуры и ядровой древесины маакии амурской / О.В. Азарова, В.В. Лампатов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов / Под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 428-430.

40. Влияние культуры клеток маакии амурской на течение экспериментального нефролитиаза / В.М. Брюханов, В.П. Булгаков, А.Ю. Жариков и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 5. - С. 125-132.

41. Фармакологическая активность розмариновой кислоты / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 6. - С. 3-8.

42. Роль антиоксидантной терапии в фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза / А.Ю. Жариков, О.С. Талалаева, Я.Ф. Зверев и др. // Нефрология. - 2010. - Т. 14, № 4. - С. 53-58.

43. Фармакологическая коррекция оксидативного стресса при экспериментальном нефролитиазе / А.Ю. Жариков, О.С. Талалаева, О.В. Азарова и др. // Сборник тезисов седьмого съезда научного общества нефрологов России. - Москва, 2010. - С. 164-166.

44. Влияние фитокомплексов культур дальневосточных растений на течение экспериментальной почечной патологии / В.В. Лампатов, А.Ю. Жариков, A.B. Кудинов и др. // Сборник тезисов седьмого съезда научного общества нефрологов России. - Москва, 2010. - С. 173-175.

45. Азарова, О. В. Нефропротективная активность некоторых фитокомплексов клеточных культур при экспериментальном гломерулонефрите / О.В. Азарова // Вестник уральской медицинской академической науки: Тематический выпуск по фармации. - 2011. - № 3/1(37).-С. 20.

46. Сравнительная оценка влияния полифенолов из клеточной культуры растений семейства Бурачниковые на функцию почек у крыс / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения: тезисы докладов научно-практической конференции. - Киев: Издатель B.C. Мартынюк, 2011. - С. 221-222.

47. Азарова, О. В. Антиоксидантные свойства полифенольного комплекса маакии амурской в эксперименте / О.В. Азарова // Вестник уральской медицинской академической науки: Тематический выпуск по фармации. - 2011. - № 3/1(37). - С. 19.

48. Полифенольные комплексы клеточных культур дальневосточных растений как потенциальные диуретические средства / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты: материалы докладов VIII международного симпозиума / Отв. ред. Н.В. Загоскина - Москва: ИФР РАН; РУДН, 2012.-С. 513-516.

49. Нефропротективная активность полифенольных комплексов клеточных культур растений при экспериментальном гломерулонефрите / О.В. Азарова, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Инновации в современной фармакологии: материалы IV съезда фармакологов России. - Казань, 2012. -С. 7-8.

50. Изучение влияния полифенольных комплексов клеточных культур растений на экскреторную функцию почек / О.В. Азарова, В.В. Лампатов, В.М. Брюханов // Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств: материалы всеукраинской научно-практической конференции. - Харьков, 2012. - Т. 2. - С. 353.

51. Азарова, О. В. Флавоноиды: механизм противовоспалительного действия / О.В. Азарова, Л.П. Галактионова // Химия растительного сырья. — 2012. - № 4.-С. 61-78.

Список используемых сокращений

АлАТ аланинаминотрансфераза

АОЗ антиоксидантная защита

АО С антиоксидантная система

АсАТ аспартатаминотрансфераза

АФК активные формы кислорода

БАВ биологически активные вещества

БМК базальная мембрана клубочков

ГГТ у-глутамилтрансфераза

ГН гломерулонефрит

ГП глутатионпероксидаза

КАТ каталаза

лдг лактатдегидрогеназа

МДА малоновый диальдегид

МКБ мочекаменная болезнь

НАГ Ы-ацетил-р-О-глюкозаминидаза

НТС нефротоксическая сыворотка

ОАА общая антиоксидантная активность

ОПА общая прооксидантная активность

ПОЛ перекисное окисление липидов

ПФКК полифенольные комплексы клеточных культур

сод супероксиддисмутаза

СРО свободно-радикальное окисление

ТБРП тиобарбитурат-реактивные продукты

ЩФ щелочная фосфатаза

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д-ру мед. наук, проф. кафедры фармакологии Звереву Я.Ф. за критическое обсуждение результатов и поддержку; д-ру биол. наук, проф. Лампатову В.В. за постоянное внимание к работе. Автор благодарен за сотрудничество в области химико-биотехнологических исследований коллегам из Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН и Биолого-почвенного института ДВО РАН (куратор - д-р хим. наук Федореев С.А.); коллегам кафедр фармацевтического факультета ГБОУ ВПО АГМУ, принимавшим участие в обсуждении результатов. Автор признателен канд. мед. наук Мотину Ю.Г. за помощь при проведении морфологических исследований.

Подписано в печать 07.06.2013 Бумага офсетная. Усл. п. л. 2,7. Заказ 389. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО «АЗБУКА» г. Барнаул, пр. Красноармейский, 98а тел. 62-91-03, 62-77-25 E-mail: azbuka@dsmail.ru