Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Анализ и стандартизация полифенольного комплекса листьев и жома плодов черной смородины

На правах рукописи

0034006Ю

Редико Елена

АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ЛИСТЬЕВ И ЖОМА ПЛОДОВ ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

2 2 о к:

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2009

003480618

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская академия имени И.М. Сеченова.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Владимир Юрьевич Решетняк

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Доктор фармацевтических наук, профессор

Александр Семенович Берлянд Владимир Леонидович Белобородов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Защита состоится « ■/&» КОс&Л-Р_ 2009 г. в часов на

заседании Диссертационного Совета (Д 208.040.09) при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « /<&» 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор фармацевтических наук, профессор Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие современной медицины позволяет предотвращать и излечивать многие болезни. В то же время значительно возросло количество хронических заболеваний, заметно увеличилась частота аллергических и токсических явлений, связанных с применением аллопатических средств. В поисках новых эффекггавных и безопасных препаратов клиницисты и фармакологи обращаются к лекарственным растениям.

Вызвавший удивление «Французский феномен» заставил ученых обратить внимание на полифенольные соединения растений. Многообразные по своей структуре полифенолы оказывают разнонаправленное фармакологическое действие на организм человека. На сегодняшний день доказаны их антиоксидантные, противовоспалительные, адаптогенные, капилляроукрепляющие свойства.

Всеобщая заинтересованность и возможность широкого применения полифенольных соединений обусловливает актуальность поиска их новых недорогих и доступных сырьевых источников. Перспективной в этом плане является черная смородина.

Богатые флавоноидами, витаминами, минеральными веществами плоды и листья черной смородины издавна применяют в народной медицине в свежем виде и для приготовления настоев, отваров при лечении цинги, простуды, ревматизма, подагры, заболеваний печени, почек и мочевыводящих органов, гипертензии. Тем не менее до настоящего времени данные виды сырья не признаны лекарственными и не включены в Государственную Фармакопею, что можно объяснить недостаточностью исследований химического состава и биологической активности, отсутствием методов стандартизации. Комплексное изучение листьев и жома плодов черной смородины и экстрактов на их основе позволит обосновать возможность применения данного сырья в качестве нового источника полифенольных комплексов, расширяя базу лекарственных растений, и поэтому является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фитохимическое изучение листьев и жома плодов черной смородины и стандартизация, получаемых на ,их основе экстрактов и лекарственного средства, содержащих полифенольные комплексы.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести фармакогностический анализ листьев и жома плодов черной смородины как нового вида лекарственного растительного сырья - источника полифенольных соединений;

2. Разработать методику получения полифенольных комплексов из листьев и жома плодов черной смородины;

3. Исследовать химический состав листьев и жома плодов черной смородины и экстрактов на их основе;

4. Разработать методику стандартизации, показатели качества и их нормы для листьев и жома плодов черной смородины, экстрактов из них, а также создать нормативную документацию на новые виды лекарственного растителыюго сырья;

5. Изучить антиоксидантную и антимикробную активность сухих экстрактов;

6. Провести разработку состава, технологии получения и показателей качества лекарственной формы - геля - на основе сухого экстракта листьев черной смородины.

Научная новизна. Впервые изучены листья и жом плодов черной смородины как перспективные источники полифенольных комплексов, на основании анатомо-морфологичсского исследования установлены диагностические признаки, а также разработаны показатели качества и их нормы для лекарственного сырья.

Установлены оптимальные условия извлечения полифенольных соединений из растителыюго сырья с учетом концентрации экстрагента, продолжительности экстрагирования, соотношения сырье-экстрагент,

позволившие разработать технологию получения сухих экстрактов на основе листьев и жома плодов черной смородины.

С помощью хроматографии в тонком слое сорбента и ВЭЖХ охарактеризован качественный состав полифснольного комплекса листьев и жома плодов черной смородины и их сухих экстрактов. Методом абсолютной калибровки дана количественная оценка содержания доминирующих веществ в анализируемых объектах.

Подобраны условия и проведено количественное определение содержания нолифенольных соединений, суммы флавоноидов и антоцианов в растительном сырье и сухих экстрактах. Предложена методика стандартизации сырья и экстрактов на основе данных исследований.

Изучена антиоксидантная и антимикробная активность сухих экстрактов.

Разработан состав, технология получения и показатели качества лекарственной формы - геля - на основе сухого экстракта листьев черной смородины. Изучена стабильность данного средства при хранении.

Практическая значимость работы

Установлены показатели подлинности, качества и их нормы для листьев и жома плодов черной смородины, экстрактов из них, которые описаны в созданной нормативной документации на новые виды лекарственного растительного сырья.

Результаты диссертационной работы использованы в проекте «Методического руководства по контролю качества экстрактов из лекарственного растительного сырья, используемых в качестве лекарственных средств и для создания препаратов на их основе» (в Ташкентском фармацевтическом институте).

Приоритет проведенных исследований подчеркивается полученным патентом №2361600 от 20.07.2009 г. на изобретение «Средство для лечения заболеваний пародонта».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. результаты фармакогностического изучения листьев и жома плодов черной смородины;

2. результаты исследований по установлению оптимальных технологических условий получения сухих экстрактов из листьев и жома плодов черной смородины;

3. результаты качественного и количественного анализа полифенольных компонентов и данные по стандартизации листьев и жома плодов черной смородины и получаемых из них сухих экстрактов;

4. результаты по разработке состава и показателей качества лекарственной формы на основе сухого экстракта листьев черной смородины.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования были представлены на IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (2-5 июня 2007 г.), Всероссийской научно-методической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы садоводства в России и пути их решения» (2-5 июля 2007 г.), 8-ом международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции заболеваний цивилизации» (14-17 ноября 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 2 в печатных изданиях, рекомендованных ВАК; получен патент.

Связь темы диссертации с проблемным планом работ ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова: диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова по теме: «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические и экологические аспекты)», номер государственной регистрации 01.200.118796.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 таблицами, 30 рисунками и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), собственных исследований (главы 3-6), выводов, списка литературы и приложения. Список использованной литературы включает 153 источника, в том числе 57 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили листья черной смородины сортов Ядреная, Лентяй, Минай Шмырев и жом плодов черной смородины сортов Бурая, Нссравнснная, Диковинка. Материал заготавливали на коллекционном участке Государственного научного учреждения «Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии» (ГНУ ВСТИСП Россельхозакадсмии).

Отбор проб и анализ листьев и жома плодов черной смородины осуществляли в соответствии с требованиями общей статьи ГФ XI части 1 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб для анализа», «Листья», «Плоды». Микроскопическое изучение сырья проводили согласно статье ГФ XI «Техника микроскопического анализа».

Процесс оптимизации технологии получения полифенольных комплексов из листьев и жома плодов черной смородины проводили методом циркулярного экстрагирования. При производстве сухих экстрактов использовали перемешивающее устройство с подогревом, испаритель ротационный для сгущения вытяжек при пониженном давлении и контролируемой температуре и сублимационную установку для лиофилытой сушки.

Разделение и идентификацию полифенольных соединений экстрактов проводили методом ТСХ на пластинах «Sorbfil АФ-А-УФ» размером 10x10 см в двух хроматографических системах: н-бутанол - уксусная кислота - вода (40:12:28) и хлороформ - изопропанол - уксусная кислота - вода (20:20:5:5).

Хроматограммы осматривали в видимом и ультрафиолетовом (УФ) свете при длине волны 254 нм до и после обработки 1% раствором хлорида железа в 96% этаноле.

Изучение качественного состава полифенольных соединений листьев и жома плодов черной смородины и их сухих экстрактов проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSON» модель 305 (Франция), в последствии обработав результаты анализа с помощью программы «Мультихром» для «Windows».

Количественное определение содержания полифенольных соединений определяли спектрофотометрически с использованием реактива Фолина-Чикалтеу.

Суммарное содержание антоцианов в сухом экстракте жома плодов черной смородины устанавливали с помощью рН-дифференциальной спектрофотометрии.

Количественное содержание суммы флавоноидов определяли спектрофотометрически относительно раствора PCO рутина.

Определение антимикробной активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины проводили, руководствуясь указаниями общей статьи ГФ XI издания методом диффузии в агар на плотной питательной среде.

Уровень микробной загрязненности лекарственного сырья и сухих экстрактов устанавливали с помощью метода мембранной фильтрации, изложенного в статье ГФ XI издания, вып.2. и Изменениями к ней от 28.12.1995.

Определение общей антиокислительной активности (АОА) сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины проводили методом колориметрии с использованием DPPH радикала.

Разработку состава, технологию производства и качество созданного лекарственного средства для лечения заболеваний пародонта - геля проводили согласно требованиям, выдвигаемым к данной лекарственной форме. Руководствовались фармакопейной статьей «Мази», данными ГОСТа 7983-99 «Зубные пасты» и санитарными нормами СанПина 1.2.676.-97 «Гигиенические

требования к производству, качеству и безопасности средств гигиены полости рта».

Испытания по определению внешнего вида, цвета, запаха, однородности геля проводили согласно требованиям ГОСТ 29188.0-91 «Изделия парфюмерно-косметические. Правила приемки, отбор проб, методы органолептических испытаний». Водородный показатель (рН) измеряли в 10% растворе геля на рН метр-милливольтметре по методике ГФ XI.

Определение срока годности геля проводили методом ускоренного старения при повышенной температуре, руководствуясь Временной инструкцией И-42-2-82 от 1983 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Фармакогностнческое изучение листьев и жома плодов черной

смородины

Изучение микроскопических признаков сырья В ходе проведения микроскопического анализа установили особенности анатомического строения листьев черной смородины: многоугольные, сильноизвилистые, толстостенные клетки верхнего эпидермиса, палисадная паренхима, водяные устьица по краям лопастей, маленькие, тонкостенные, менее извилистые клетки нижнего эпидермиса, одноклеточные волоски, щитковидные железки, устьица аномоцитного типа, друзы. Описанные диагностические признаки предложено использовать для определения подлинности данного сырья.

Исследование морфологических особенностей сырья и определение основных числовых показателей сырья В ходе макроскопического анализа изучили морфологические особенности листьев и жома плодов черной смородины, как нового лекарственного сырья.

Цельное сырье. Листья цельные или частично измельченные, простые, черешковые, крупные, длиной до 8 см и шириной до 6 см, трех-пятилопастные, края грубопильчатые с изогнутыми к вершине зубцами. Поверхность голая, морщинистая; снизу по всей пластинке листа заметны железки. Черешки листьев длиной 4-5 см, округлые или полукруглые в сечении, с бороздкой на верхней стороне черешка. Цвет листьев и черешков - зеленый. Запах ароматный. Измельченное сырье. Кусочки листьев различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет зеленый. Запах ароматный.

Жом плодов черной смородины является порошком буро-красного цвета, проходящим сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм. Запах своеобразный, сладковатый. Вкус кисло-сладкий.

На основании проведенных исследований определили основные числовые значения для листьев и жома плодов черной смородины - содержание хлорогеновой кислоты не менее 0,40% и 0,60% соответственно, влажность не более 15% и 10%, зола общая не более 10% и 3%, зола, нерастворимая в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 5% и 1%, пожелтевшие листья не более 3%, другие части растения (для жома плодов) не более 0,5%, содержание частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм (для жома плодов), не более 3% и содержание частиц, проходящих сквозь сито, с диаметром отверстий 3 мм (для листьев), не более 3%.

2. Разработка методики получения полифенольнмх комплексов из листьев и жома плодов черной смородины

Определение оптимальных условий экстракции полифенольных комплексов га листьев и жома плодов черной смородины

С целью определения оптимальных технологических условий для извлечения максимального количества полифенольных соединений из растительного сырья исследовали влияние концентрации экстрагента, продолжительности экстрагирования, соотношения сырье-экстрагент,

температурного режима, позволившие разработать схему получения сухих экстрактов на основе листьев и жома плодов черной смородины.

Технология получения сухих экстрактов из листьев и жома плодов черной

смородины

Воздушно-сухое измельченное сырье экстрагировали 70% этанолом в соотношении сырье : экстрагент = 1:5 при постоянном перемешивании и подогреве (40°С) в течение 2 часов. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр. Полученную вытяжку 48 часов отстаивали при +8° С, затем фильтровали. Технологический процесс продолжался упариванием экстракта на роторно-вакуумном испарителе. Полученный густой экстракт подвергали лиофильной сушке. Первой стадией процесса стала заморозка на полках до -25° С, затем следовала сушка при +36° С и вакууме (100 мкн) в течение 24 часов.

Исследование физических свойств сухих экстрактов

Полученные сухие экстракты листьев и жома плодов черной смородины представляли собой порошки желто-коричневого и темно-коричневого цвета соответственно, с приятным запахом и вяжущим вкусом, хорошо растворимые в воде и этиловом спирте.

Согласно требованиям статьи «Экстракты» ГФ в полученных сухих экстрактах определяли влагу (2,34±0,03% в экстракте листьев и 3,09±0,03% в экстракте жома плодов) и содержание тяжелых металлов (менее 0,01%).

3. Фитохимическое изучение иолифенольных соединений сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины

Оценка подлинности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной

смородины

Оценку подлинности экстрактов проводили с использованием качественные реакций (реакции с 10% раствором алюминия хлорида в 95% этаноле, 10% спиртовым раствором натрия гидроксида и 10% раствором

ацетата свинца, 1% раствором желатина в 10% растворе натрия хлорида), хроматографии на бумаге, прямой спектрофотометрии, ТСХ.

На основании результатов, полученных при проведении качественных реакций, хроматографии на бумаге, прямой спектрофотометрии, сделали вывод о наличии в листьях черной смородины и их сухом экстракте флавоноидов, фенолокислот и дубильных веществ. В жоме плодов черной смородины и сухом экстракте на его основе доказали наличие флавоноидов, антоцианов, фенолокислот и дубильных веществ.

Методом хроматографии в тонком слое сорбента в разных системах растворителей в экстрактах были идентифицированы рутин, гиперозид, катехин и галловая кислота.

Исследование качественного состава полифенолъных веществ листьев и жома плодов черной смородины и экстрактов из та

При исследовании сухого экстракта листьев черной смородины методом ВЭЖХ при 254 нм обнаружили 13 соединений полифенольной природы, а в экстракте жома плодов - 14 соединений (рис. 1 и 2).

Рис. 1. Хроматограмма ВЭЖХ сухого экстракта листьев черной смородины Подвижная фаза: метанол : вода : фосфорная кислота конц. (400:600:5) Колонка: Кромасил С18 размером 4,6x250 мм. Длина волны -254 нм

12

(«V I 550. 500 45» 400350 МО 250 20» 150 100 50 \

?

о

*

е Е * 3 .•Ж..... гмЙ о. I 1 * | 1

Н В 1 Я 1 ? ;

1 \2 '"ГРг? 1" 8 э о X X X

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 'от.

Рис. 2. Хроматограмма ВЭЖХ сухого экстракта жома плодов черной

смородины

Количество неидентифицироваиных веществ в экстрактах листьев и жома плодов черной смородины составляет соответственно 6 и 9.

Среди идентифицированных полифенольных соединений в сухом экстракте жома плодов доминирует хлорогеновая кислота, в сухом экстракте листьев - хлорогеновая и галловая кислоты, поэтому провели количественную | оценку их содержания.

( Таблица 1

Метрологические характеристики результатов количественного определения хлорогеновой кислоты в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной

смородины методом ВЭЖХ

п Г Р% КР,0 х,% 8 8, ДХ Е,%

Экстракт листьев 5 4 95 2,78 6,45 0,0417 0,2042 0,0913 0,25 3,87

Экстракт жома 5 4 95 2,78 12,54 0,0979 0,3128 0,1399 0,39 3,11

плодов

Таблица 2

Метрологические характеристики результатов определения галловой кислоты в сухом экстракте листьев черной смородины методом ВЭЖХ

п Г Р °А 1(Р/) Х,% в2 8 ДХ Е,%

Сухой экстракт листьев 5 4 95 2,78 4,16 0,0029 0,0543 0,0240 0,07 1,68

Результаты анализа исходного сырья - жома плодов и листьев черной смородины методом ВЭЖХ показали, что в нативном сырье, также как и в сухих экстрактов из них преобладают идентичные полифенольные вещества из группы гидроксикоричных и гидроксибензойных кислот, флавоноидов (табл. 3, рис. 3, 4).

mV j ] *

10080- fg. 1 g

6» I 3, i ■ ■•

; § ie s 8 ¥ 1 I ä 1

Ii- il - le-:? * X P J а .

ch с 3 ( 7 о — 0 1 1 2 ) 3 ] — О 1 - i ) 6 1 -- 7 I 8 1 —,--1—r--1— 1—t. ,.....r -1.....t......I t i 1-19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 ЗЗмич

Рис. 4. Фрагмент хроматограммы ВЭЖХ листьев черной смородины

Таблица 3

Результаты исследования полифенольных веществ в листьях и жоме плодов

черной смородины и сухих экстрактах из них методом ВЭЖХ

Наименование PCO Сухой экстракт листьев Листья Сухой экстракт жома плодов Жом плодов

кверцстин +* + - -

рутин + + + +

лютеолин - - - -

лютеолина-7-гликозид +* + - -

гиперозид + +* - -

геспередин - - - -

галловая кислота + + + +

хлорогеновая кислота + + + +

кофейная кислота +* + +* +

феруловая кислота +* + +* +

кемпферол + +* - -

цикорисвая кислота + + + +*

дигидрокверцитин + + + +

эпикатехин + + + +

Примечание. * - следовые количества.

Доминирующим полифенольным соединением сырья является хлорогеновая кислота, также как и в ранее исследованных сухих экстрактах

листьев и жома плодов черной смородины. Количественное содержание хлорогеновой кислоты в жоме плодов составило 1,22±0,04%, а в листьях — 0,81±0,03%.

Таким образом, сухие экстракты, и сырье для их получения - листья и жом плодов черной смородины являются богатым источником хлорогеновой кислоты. Стандартизацию сухих экстрактов черной смородины можно проводить по показателю - количественное содержание хлорогеновой кислоты в препарате с использованием метода ВЭЖХ.

Определение суммы полифенолъных соединений в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины Поскольку сухие экстракты черной смородины содержат комплекс биологически активных веществ, включающий гидроксикоричные и гидроксибензойные кислоты, флавоноиды, дубильные вещества, провели суммарное определение полифенольных веществ.

Таблица 4

Метрологические характеристики результатов количественного определения суммы полифенольных соединений в сухих экстрактах листьев и жома плодов

черной смородины

п { Р% то Х,% Б2 Б Б* дх Е,%

Экстракт листьев 7 6 95 2,45 14,39 0,1823 0,4269 0,1614 0,40 2,78

Экстракт жома плодов 7 6 95 2,45 17,28 0,1604 0,4005 0,1514 0,37 2,14

Определение суммы антоцианов в сухом экстракте жома плодов черной

смородины

По результатам анализа сумма антоцианов в сухом экстракте жома плодов черной смородины составила 1,01% в пересчете на абсолютно сухой экстракт (табл. 5). Полученный результат согласуется с литературными данными о высоком содержании антоц'иановых пигментов в плодах изучаемого растения и свидетельствует о хорошем качестве экстракта.

Таблица 5

Метрологические характеристики результатов количественного определения суммы антоцианов в сухом экстракте жома плодов черной смородины

п f Р % t(P=f) X, % S' S S, ДХ Е, %

Экстракт жома плодов 5 4 95 2,78 1,01 0,0005 0,0224 0,01 0,03 2,97

Определение количественного содержания флавоноидов в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины В ходе количественного определения суммы флавоноидов в качестве стандарта использовали PCO рутина, максимум поглощения комплекса которого с хлоридом алюминия наиболее соответствует максимуму поглощения комплекса с хлоридом алюминия исследуемых экстрактов.

Таблица 6

Метрологические характеристики результатов количественного определения суммы флавоноидов d сухом экстракте листьев и жома плодов черной

смородины в пересчете на рутин

Сумма флавоноидов п f Р % t(P,f) X, % S1 S S* ДХ Е, %

Сухой экстракт листа относительно PCO рутина 7 6 95 2,45 5,32 0,0022 0,0469 0,0177 0,04 0,82

по калибровочн ому графику 7 6 95 2,45 5,08 0,0055 0,0744 0,0280 0,07 1,36

Сухой экстракт жома относительно PCO рутина 7 6 95 2,45 1,12 0,0004 0,0200 0,0535 0,02 1,78

по калибровочн ому графику 7 6 95 2,45 1,07 0,0005 0,0224 0,0085 0,02 1,87

Проведенный количественный анализ доказал присутствие флавоноидов в экстракте листьев черной смородины в количестве 5,08% (по калибровочному графику) и 5,32% (относительно PCO) в пересчете на рутин. В сухом экстракте

жома плодов обнаружено от 1,07% до 1,12% флавоноидов при определении разными методами.

Достоверность методики определения суммарного содержания флавоноидов подтвердили методом со стандартным добавлением рутина в исследуемый раствор экстракта. Ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения и свидетельствует об отсутствии систематичной ошибки.

На основании полученных данных экстракт листьев и жома плодов черной смородины целесообразно стандартизовать по показателю - сумма флавоноидов в пересчете на рутин.

Определение антимикробной активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины

В ходе исследования 1% растворов сухих экстрактов установили, что сухой экстракт листьев и сухой экстракт жома плодов черной смородины не обладают бактерицидной активностью в отношении Escherichia coli, Proteus vulgaris, Enterococcus spp, Streptococcus mutans, Neisseria sicca; не проявляют фунгицидную активность в отношении Candida utilis (рис. 5). С увеличением концентрации растворов проявляется слабая бактерицидная активность обоих экстрактов в отношении Staphylococcus aureus, в то же время сохраняется постоянная бактерицидная активность в отношении Pseudomonas aeruginosa.

[3St. aureus H E. coli

□ C. utilis

□ Pr. vulgaris HStr. mutans

□ Entfcroc. spp BN. sicca

□ Ps. aeruginosa

Рис. 5. Антимикробная активность сухих экстрактов листьев и жома плодов

черной смородины

Результаты испытаний экстрактов на антимикробную активность показали, что сухой экстракт листьев и сухой экстракт жома плодов черной смородины обладают слабой бактерицидной активностью в отношении Staphylococcus aureus и обладают бактерицидной активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa.

Микробиологическая чистота сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины

В процессе хранения и переработки лекарственного растительного сырья может произойти его микробное заражение. С целью исключения возможного инфицирования потребителей было проведено испытание на микробиологическую чистоту.

Данные проведенного исследования показали присутствие аэробных бактерий, не превышающее нормы общей статьи ГФ XI «Испытания на микробиологическую чистоту». Патогенные микроорганизмы и грибы не обнаружены (табл. 7).

Таблица 7

Результаты испытаний сухих экстрактов листьев и жома плодов черной

смородины на микробиологическую чистоту

Показатели Норма Сухой экстракт листьев Сухой экстракт жома плодов

Общее количество аэробных бактерий в 1 г не более 1,0 х ю7 <10 <10

Escherichia coli в 1 г отсутствие отсутствие отсутствие

Salmonella spp в 1 г отсутствие отсутствие отсутствие

Энтеробактерии в 1 г не более 1,0 х 102 отсутствие отсутствие

Общее число грибов в 1 г не более 1,0 х ю" <10 <10

Таким образом сухие экстракты листьев и жома плодов черной смородины соответствуют требованиям ГФ XI, вып.2. и Изменениям №1 Минздрава РФ к статье ГФ XI от 28.12.1995 по микробиологической чистоте, предъявляемой к лекарственным средствам данной категории.

Определение антиоксидаптной активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины

Методом ОРРН установили, что среднее значение тролоксового эквивалента на 1 г сухого экстракта листьев черной смородины составляет 312, а для экстракта жома плодов этот показатель равен 87 (табл. 8).

Таблица 8

Метрологические характеристики результатов определения антиоксидаптной

активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины

п Г Р% х,% Б' 8 Б* ДХ Е,%

Экстракт листьев 5 4 95 2,78 312 253,7500 15,9295 7,1239 19,80 6,35

Экстракт жома плодов 5 4 95 2,78 87 43,7500 6,6144 2,9580 8,22 9,45

По сравнению с экстрактом жома плодов черной смородины экстракт из листьев обладает наибольшей антиоксидантной активностью. Поскольку и антимикробные свойства экстракта из листьев высоки, именно этот экстракт решили использовать для создания лекарственного средства.

4. Получение лекарственной формы с экстрактом листьев черной смородины и разработка показателей качества

Технология получения геля с экстрактом листьев черной смородины

60,0 г воды очищенной нагревали до 50" С, добавляли 0,5 г сухого экстракта листьев черной смородины, 0,3 г натрия фторида, 0,2 г фруктозы, 0,3 г натриевой соли пропилпарабена, перемешивали до полного растворения веществ. Затем добавляли 2,0 г гидроксиэтилцеллюлозы и вели интенсивное перемешивание. Далее добавляли 7,0 г глицерина, в котором предварительно растворили 0,05 г масла мяты перечной и добавили 1,1 г кальция глицерофосфата, перемешивали и доводили до 100,0 г водой очищенной, перемешивали до образования однородной массы. Через час гель снова перемешивали и фасовали.

Разработка характеристик показателей качества и стабильности геля с сухим экстрактом листьев черной смородины Для стандартизации геля с сухим экстрактом листьев черной смородины предложили использовать два показателя - количественное содержание полифснольных соединений и содержание хлорогеновой кислоты. Выбор данных показателей для стандартизации геля обусловлен высоким содержанием полифенольных веществ, доминирующим из которых является хлорогеновая кислота, широким спектром их фармакологического действия, доступностью проведения анализа.

Определенный срок годности геля составил 180 суток при 20° С.

Таблица 9

Результаты изучения стабильности геля с сухим экстрактом листьев черной смородины

Наименование показателя Характеристики и нормы

После производства через 45 суток

Внешний вид, однородность Однородная масса, не содержит комков, механических включений, легко наносится и равномерно распределяется на деснах в полости рта Однородная масса, не содержит комков, механических включений, легко наносится и равномерно распределяется на деснах в полости рта

Цвет Светло-коричневый Светло-коричневый

Запах и вкус Мятный Мятный

Водородный показатель (рН) 5,94 5,86

Содержание полифенольных веществ 0,070% 0,067%

Содержание хлорогеновой кислоты 0,0335% 0,0321%

Микробиологическая чистота Присутствие аэробных бактерий, не превышающее нормы общей статьи ГФ XI, грибы и патогенные микроорганизмы не обнаружены Присутствие аэробных бактерий, не превышающее нормы общей статьи ГФ XI, грибы и патогенные микроорганизмы не обнаружены

На основании результатов оценки стабильности геля сделали заключение, что в течение рассчитанного срока годности гель остается стабильным, содержание входящего в его состав комплекса полифенольных веществ снижается незначительно (табл. 9).

Изучение сохранности полифенольных веществ в геле на основе сухом экстракте листьев черной смородины методом ВЭЖХ

Результаты проведенного анализа методом ВЭЖХ показали, что в экстракте листьев черной смородины и в геле на его основе обнаружены идентичные полифенольные соединения из группы гидроксикоричных и гидроксибензойных кислот, а именно - хлорогеновая и галловая кислоты. Данный факт свидетельствует о сохранности веществ и указывает на рациональность выбранной технологии производства геля.

Разработанная лекарственная форхма - гель с сухим экстрактом листьев черной смородины - расширяет арсенал средств для лечения заболеваний пародонта, является эффективным и безопасным, обладает высокими противовоспалительными, ранозаживлякицими и антимикробными свойствами. Средство насыщает зубы минеральными компонентами, помогает снизить микробную нагрузку на ткани пародонта.

ВЫВОДЫ

1. Проведен фармакогностический анализ листьев и жома плодов черной смородины как нового вида лекарственного растительного сырья - источника полифенольных соединений. Установлены показатели качества сырья и их нормы.

2. Установлены оптимальные условия экстракции полифенольных компонентов из листьев и жома плодов черной смородины. Разработана методика получения сухих экстрактов из растительного сырья.

3. С помощью качественных реакций, методов спектрофотометрии, тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ исследован химический состав листьев и

жома плодов черной смородины, а также экстрактов на их основе. Полифенольные соединения всех образцов представлены гидроксикоричными и гидроксибензойными кислотами, флавоноидами, дубильными веществами. Доминирующим соединением является хлорогеновая кислота.

4. Стандартизацию экстрактов из листьев и жома плодов черной смородины предложено проводить по показателям - содержание полифенольных веществ (14,39% и 17,28% соответственно), содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин (5,08-5,32% и 1,07-1,12%), содержание хлорогеновой кислоты (6,45% и 12,54%) и сумма антоцианов (1,01%).

5. Изучена антиоксидантная и антимикробная активность сухих экстрактов. Установлено, что антиоксидантное действие сухого экстракта листьев черной смородины в 3,5 раза выше, чем у экстракта жома плодов. Оба экстракта обладают бактерицидной активностью в отношении Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa Микробиологическая чистота соответствует нормам, предъявляемым нормативной документацией.

6. Проведена разработка состава, технологии получения и показателей качества лекарственной формы - геля - на основе сухого экстракта листьев черной смородины. Для оценки качества геля предложено использовать следующие показатели - внешний вид и однородность, цвет, запах, рН водной вытяжки, микробиологическая чистота. Подтверждена сохранность полифенольных соединений, присущих сухому экстракту. Стандартизацию геля целесообразно проводить по содержанию хлорогеновой кислоты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Редико Е.Э., Решетняк В.Ю., Нечаев Д.Н., Гребнева Е.В. Количественное определение флавоноидов в сухом экстракте листьев черной смородины // Материалы IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». - М., 2007. - С. 120.

2. Редико Е.Э., Решетняк В.Ю., Нечаев Д.Н., Гребнева Е.В. Количественное определение флавоноидов в сухом экстракте листьев черной смородины // Сборник научных трудов «Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты». - М., 2007. Выпуск 15. - С. 152-156.

3. Редико Е.Э., Гребнева Е.В. Черная смородина как перспективный источник флавоноидов // Материалы Всероссийской научно-методической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы садоводства в России и пути их решения». - Орел, 2007. - С. 362-367.

4. Редико Е.Э., Нестерова О.В., Гребнева Е.В. Антимикробная активность сухого экстракта черной смородины // Тезисы докладов VIII международный конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации». - М., 2007. - С. 539.

5. Редико Е.Э. Изучение полифенольных соединений черной смородины методом ВЭЖХ // Тезисы докладов VIII международный конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации». - М., 2007. - С. 539.

6. Редико Е.Э., Решетняк В.Ю., Гребнева Е.В. Исследование полифенольных соединений сухого экстракта жома плодов черной смородины // Естественные и технические науки. - 2008. - №5. - С. 130-132.

7. Редико Е.Э., Маркарян АА., Решетняк В.Ю., Гребнева Е.В. Получение и стандартизация состава полифенольных комплексов из черной смородины // Химическая технология. - 2008. - Т. 9. - №12. - С. 657-660.

Подписано в печать: 07.10.2009

Заказ № 2660 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru