Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов

На правах рукописи

00461« сь

КОРОЛЕВСКАЯ Лариса Борисовна

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ, ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ПО РАЗМЕРАМ И КЛАССАМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 1 НОЯ 2010

Пермь-2010

004612576

Работа выполнена в лаборатории экологической иммунологии Учреждения Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Шмагель Константин Владимирович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Юшков Владимир Викторович доктор медицинских наук Гейн Сергей Владимирович

Ведущая организация: ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА РФ, Москва

Защита состоится « ^^ » 2010 г. в часов на заседа-

нии диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс (342) 280-92-11

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан « && » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических

наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Образование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) является естественным процессом завершения гуморального иммунного ответа организма на антиген. Вместе с тем, существует группа заболеваний, объединенная общим названием «болезни иммунных комплексов» или «гиперчувствительность III типа» (по классификации Gell-Coombs (Coombs, Gell, 1975)). В их основе лежат воспалительные эффекты, индуцированные комплексами антиген-антитело. Повышение уровня ЦИК отмечено при многих заболеваниях: аутоиммунных, инфекционных, онкологических и т.д. (Сгосе et al., 1985; Floege, Feehally, 2000; Janear, Crespo, 2005; Krapf et al., 1990; Mok, Lau, 2003; Muratsugu, 2005; Nydegger, 2007; Song, Kang, 2010; Vlock, Kirkwood, 1985; Wang et al., 2003). Нередко они играют важную патогенетическую роль в развитии этих заболеваний, оказывая повреждающее воздействие на различные органы и ткани. Одним из существенных факторов, имеющих значение для проявления патогенности ЦИК, является их размер (Nangaku, Couser, 2005; Oda et ai, 2009; Schrieber, 1984; Sedlacek, 1980; Theofilopoulos, Dixon, 1980). От размера иммунного комплекса зависят его важнейшие биологические свойства - способность активировать комплемент и взаимодействовать с Fc-рецелторами, что в конечном итоге определяет безопасное удаление агрегатов системой мононуклеарных фагоцитов. Кроме того, разные классы иммуноглобулинов формируют различные по свойствам иммунные комплексы (Floege, Feehally, 2000; Lucisano Valim, Lachmann, 1991; Peng et al., 2005). Поэтому оценка размерности и состава ЦИК представляет собой несомненный интерес.

Следует отметить, что, несмотря на довольно большое количество методов определения иммунных комплексов, среди них до сих пор отсутствует универсальный, позволяющий оценить весь спектр ЦИК и их характеристики. Кроме того, широко распространенный в отечественной клинической практике турбидиметрический метод оценки преципитации сыворотки крови при определенной концентрации полиэтиленгликоля-6000 (Digeon et al., 1977; Haskova et al., 1978), вообще обходится без определения иммунного компонента, идентификация которого, согласно рекомендациям ВОЗ, является необходимой при детекции ЦИК (WHO Scientific Group, 1977). Вместе с тем, методы, позволяющие определять размеры агрегатов - микроскопические, хроматографические, седиментационные, электрофоретические, светорассеяния и др. (Константинова и соавт., 1986; Easterbrook-Smith, 1993; Haakenstad et al., 1982; Kelly et al., 1980; Khlebtsov et al., 2004; Cooper, Moore, 1983; Stachura et al., 1981; Szabo et al., 1977; Tung et al., 1981), - мало адаптированы для клинической практики. Возможно, одним из подходов на пути появления относительно информативного и доступного для лабораторной практики метода определения ЦИК, учитывающего физико-химические характеристики комплек-

сов и идентифицирующего его составляющие, является комбинирование методов, основанных на различных свойствах иммунных агрегатов.

Цель работы - разработка и обоснование простого и доступного для клинической лабораторной практики метода определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов.

Основные задачи исследования:

1. На основе создания модельных иммунных комплексов и использования стандартизованных по размерам латексных частиц оценить возможность применения спектротурбидиметрического метода для определения размеров нерастворимых иммунных комплексов.

2. Провести спектротурбидиметрическое исследование размеров агрегатов модельных иммунных комплексов, образованных в присутствии полиэти-ленгликоля-6000 различных концентраций, для переноса полученных результатов в область клинических исследований.

3. Апробировать метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов. С помощью данного метода оценить отличия в их качественном и количественном составе у здоровых и больных людей.

4. Адаптировать предлагаемый метод определения циркулирующих иммунных комплексов для использования в клинической лабораторной практике, представить протокол проведения анализа.

Научная новизна

Впервые на основе спектротурбидиметрического метода определены размеры иммунных комплексов, преципитированных в полиэтиленгликоле-6000 (ПЭГ). Представлена закономерность формирования преципитатов в среде с ПЭГ. Показано, что с возрастанием концентрации ПЭГ в растворе увеличение среднего размера преципитируемых частиц обусловлено включением более мелких по размерам комплексов в состав первичного агрегата, осаждаемого при меньшей концентрации ПЭГ. Установлено, что использование двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) позволяет дифференцировать иммунные комплексы по размерам. На основе разработанного метода показана возможность определения содержания иммуноглобулинов классов М, в и А в составе дифференцированных по размерам ЦИК, выделенных из сывороток крови здоровых доноров, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями. Впервые метод спектротурбиди-метрии применен для непосредственного исследования нативных сывороток крови. В результате у пациентов с ревматоидным артритом установлена прямая связь между уровнем ревматоидного фактора и размером преципитируемых из сыворотки крови частиц.

Теоретическое и практическое значение работы

Представлена новая концепция поведения иммунных комплексов в растворе ПЭГ. На основе данной концепции и метода спектротурбидиметрии обосновано применение двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) для дифференцирования иммунных комплексов по размерам. Показано, что ПЭГ в возрастающих концентрациях увеличивает размер иммунных агрегатов за счет включения дополнительно осаждаемых белковых структур в первичный надмолекулярный комплекс. Создан доступный для лабораторной практики метод определения ЦИК, отражающий размерные характеристики комплексов и количественное содержание иммуноглобулинов в их составе. Получены новые данные о содержании иммуноглобулинов классов М, в и А в составе дифференцированных по размерам ЦИК у здоровых добровольцев, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями. При этом выявлены существенные различия в составе ПЭГ-преципитатов при разных заболеваниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метод спектротурбидиметрии относительно прост и достаточно информативен в оценке размеров иммунных комплексов при соблюдении определенных условий.

2. На основе спектротурбидиметрии получено обоснование применения двух концентраций полиэтиленгликоля-6000 для выделения из сыворотки крови иммунных агрегатов разных размеров.

3. Разработан метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов, проведена его адаптация для применения в клинической лабораторной практике.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции», Сочи, 2007; VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007; II Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008. Основные результаты проведенных исследований представлены в 10 печатных работах, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 220 источников, из них 20 отечественных и 200 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена на модельных иммунных комплексах (ИК), созданных на основе столбнячного анатоксина и противостолбнячного у-глобулина (реагенты любезно предоставлены проф. A.M. Николаевой). Антитела подвергали дополнительной очистке путем аффинной хроматографии (данный фрагмент работы выполнен д.б.н. М.Б. Раевым). Зону эквивалентного соотношения антиген/антитело (Аг/Ат) определяли по максимальному значению оптической плотности (длина волны 340 нм) при смешивании различных концентраций Аг и Ат (разведения готовили на 0,1 М борат-ном буфере (рН=8,4). Ей соответствовало разведение Аг 1:32 и Ат 1:2. Для исследования влияния соотношения Аг/Ат на размер формируемых ИК, кроме оптимального, были выбраны следующие соотношения реактантов, соответственно: 1:32/1:8; 1:32/1:4; 1:16/1:2 и 1:64/1:2. Выбранные разведения Аг и Ат смешивали в равных объемах (по 250 мкл), инкубировали в течение 30 мин при 37°С и определяли размеры сформированных комплексов.

Для оценки размеров иммунных агрегатов применяли спектротурбиди-метрический анализ и осаждение белковых структур в различных концентрациях ПЭГ. Метод спектротурбидиметрии основан на определении спектральной зависимости интенсивности прошедшего через дисперсную систему света, ослабленного за счет рассеяния. Для этого регистрировали показатели оптической плотности (OD) на пяти длинах волн (А.): 470 нм, 510 нм, 550 нм, 570 нм и 630 нм. В двойных логарифмических координатах (IgOD - IgA.) получали экспериментальную прямую, тангенс угла наклона которой называется волновым экспонентом. Исходя из существования обратной зависимости между размером частиц в суспензии и значением волнового экспонента (Heller et al., 1962), рассчитывали средний диаметр ИК. В качестве калибратора использовали латексные частицы с паспортными размерами 100 нм, 240 нм, 520 нм и 1000 нм (НИИ синтетического каучука им. С.В.Лебедева, г. Санкт-Петербург). Объемы исследуемых частиц ИК вычисляли как объем шара, поскольку метод спектротурбидиметрии достаточно надежно определяет экви-объемный диаметр несферических частиц или агрегатов (Khlebtsov et al., 2004; Shchyogolev et al., 1992).

Клинические исследования проводили с использованием сывороток крови, полученных от 47 здоровых добровольцев, 10 пациентов с ревматоидным артритом (РА) и 16 больных лимфопролиферативными заболеваниями. Осаждение ИК из сыворотки крови проводили методом преципитации в ПЭГ, при этом для дифференцирования комплексов по размерам использовали две концентрации ПЭГ (3% и 4%). Преципитаты дважды отмывали растворами ПЭГ соответствующей концентрации. В осаженных фракциях устанавливали содержание IgM, IgG и IgA методами ИФА (наборы ИФА-БЕСТ-стрип, ЗАО «Вектор-БЕСТ», г. Новосибирск) или иммунотурбидиметрией (наборы

СЬгопо1аЬ, Швейцария) согласно прилагаемым инструкциям. Далее производили следующие расчеты: содержание ^ в преципитате, полученном при 4% концентрации ПЭГ, оценивали как общий пул ^-содержащих ЦИК; при 3% концентрации ПЭГ - как высокомолекулярный. Разницу показателей относили к низкомолекулярному пулу ЦИК. Для определения ревматоидного фактора (РФ) в сыворотках крови здоровых добровольцев и пациентов с РА использовали коммерческие наборы «Ревматоидный фактор. Латекс-тест» (Ольвекс Диагностикум, г. Санкт-Петербург).

Достоверность различий между группами оценивали на основе /критерия Стьюдента. В ситуациях, когда выборки не подчинялись закону нормального распределения, расчеты выполняли с логарифмированными величинами. В дальнейшем вычисляли среднюю геометрическую и ее границы в диапазоне (± 1о). Оценку связей проводили путем корреляционного анализа (Л-коэффициент корреляции Пирсона).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение калибровочной кривой для спектротурбидиметрической

оценки размеров иммунных агрегатов

В результате спектротурбидиметрического тестирования суспензий стандартизованных по размерам латексных частиц были получены значения волновых экспонентов для каждого размера латексов. На основании этих характеристик была построена калибровочная кривая, отражающая зависимость волнового экспонента от диаметра частиц, что позволило определять размеры ИК (рис. 1).

Рис 1. Экспериментальное установление зависимости между диаметром латексных частиц и значением волнового экспонента.

По оси абсцисс - значение волнового экспонента; по оси ординат - диаметр латексных частиц (нм).

При этом следует иметь в виду, что получаемые размеры частиц нерастворимых ИК имеют только относительный смысл. В первую очередь это связано с тем, что реальный показатель преломления нерастворимых ИК отличается от такового для частиц латекса. Кроме того, средний показатель преломления частиц нерастворимых ИК является плохо определенным параметром. Вместе с тем, для целей данной работы была важна не столько оценка абсолютных значений размеров частиц ИК, сколько относительные изменения этих величин, связанные с различными процессами. С этих позиций для решения обратных задач определения среднего размера частиц из спектра мутности вполне допустимо использование в качестве калибратора монодисперсных сферических латексных частиц с известным показателем преломления.

Спектротурбидиметрия в оценке размеров модельных иммунных

комплексов

Возможность использования метода для оценки размеров иммунных агрегатов выясняли на примере модельных ИК. Размер моделировали путем изменения соотношения Аг/Ат (рис. 2). Полученная экспериментальная кривая соответствовала классической кривой преципитации Гейдель-бергера (Heildelberger, Kendall, 1935). Наиболее крупные комплексы формировались в зоне эквивалентного соотношения Аг/Ат (1:32 и 1:2, соответственно). При этом средний диаметр агрегатов составил 524,5±11,5 нм. Изменение оптимального соотношения в системе вызывало существенное уменьшение размера комплекса. Снижение уровня Ат в 4 раза при одной и той же концентрации Аг (разведение 1:32) приводило к уменьшению объема комплекса в 76 раз (диаметр агрегатов уменьшался до 121,6+5,6 нм, Р<0,001). При постоянной концентрации Ат (разведение 1:2) как двукратное увеличение содержания Аг, так и двукратное его снижение, сопровождалось достоверным падением величины объема формируемых агрегатов. Необходимо отметить, что, если в первом случае объем снижался лишь в два раза, то во втором - в восемь раз; диаметры агрегатов, соответственно, - 408,9±34,1 нм (Р<0,05) и 245,0±38,6 нм (Р<0,001). Полученные результаты показывают, что метод спектротурбидиметрии отражает основные закономерности формирования размера ИК в зависимости от молярного соотношения Аг и Ат, что согласуется с результатами, полученными для других систем модельных ИК (Кленин и соавт., 1979; Khlebtsov et al., 2004). Использование латексных частиц в качестве калибратора позволяет достаточно объективно оценить относительные размеры ИК, формируемых при различных соотношениях Аг и Ат.

Рис. 2. Изменение размера модельных иммунных комплексов в зависимости от концентраций антител, антигена и соотношения антиген/антитело.

На оси абсцисс представлены варианты проведения реакции взаимодействия антител с антигеном. Левая ось ординат - линейный размер иммунных комплексов (нм), правая - их объем (нм3х106). Точки, соединенные линией, соответствуют диаметру комплексов антиген-антитело, размер шаров и цифры на них - объему иммунных комплексов.

Вместе с тем, следует отметить, что возможность применения метода спектротурбидиметрии для измерения размеров модельных ИК определяется их нерастворимостью. Это обусловлено высокой концентрацией реактантов и отсутствием стабилизаторов в системе in vitro. С оптической точки зрения сыворотка крови относительно прозрачна, содержание ИК в ней невелико. Кроме того, они находятся в растворенном состоянии, что связано с солюби-лизирующими свойствами комплемента (Miller, Nussenzweig, 1975; Schifferli et al., 1985). Следовательно, этап перевода ИК сыворотки крови в нерастворимое состояние является необходимым условием проведения спектротурби-диметрического анализа. С этой целью нами был использован ПЭГ. Спектро-турбидиметрический метод определения размеров иммунных агрегатов, образованных в ПЭГ, в данной работе был применен впервые.

Оптические свойства модельных иммунных комплексов в присутствии полиэтиленгликоля-6000

Механизм взаимодействия ПЭГ с белками в растворе заключается в сте-рическом исключении молекулы ПЭГ из белковой зоны за счет отнятия воды полимером (Annunziata et al., 2002; Bhat, Timasheff, 1992; Lee, Lee, 1981; Shulgin, Ruckenstein, 2006). В результате растворимость белков уменьшается, следствием чего является их неспецифическая агрегация и осаждение. Степень преципитации зависит от многих параметров, одним из которых является концентрация ПЭГ (Atha, Inghamg, 1981; Johansen et al., 1980; Middaugh et al., 1979). Считается, что при низких концентрациях ПЭГ происходит преципита-

ция преимущественно макромолекулярных ИК, а при увеличении его концентрации осаждаются как крупные, так и меньшие по размерам комплексы (Насонов, 1987; Creighton et al., 1973; Johansen et al., 1980). Исходя из этого, рядом авторов были использованы две концентрации ПЭГ для получения ИК разных размеров (Константинова и соавт., 1986; Туманова, 1985). Однако оценка агрегатного состояния ИК, образованных в присутствии различных концентраций ПЭГ, проведена не была.

Изучение влияния ПЭГ на размеры модельных ИК в растворе проводили в зоне эквивалентного соотношения Аг/Ат (1:32 и 1:2, соответственно). Спектро-турбидиметрическое исследование ИК в присутствии 3%, 4% и 5% ПЭГ показало, что с увеличением концентрации ПЭГ углы наклона прямых, а, соответственно, и волновые экспоненты модельных ИК уменьшаются (рис. 3). Значения волновых экспонентов в присутствии 3%, 4% и 5% концентраций ПЭГ составили 1,98±0,02; 1,88+0,02 и 1,20±0,01, соответственно. Это свидетельствовало об увеличении размеров преципитируемых ПЭГ частиц. Вместе с тем, известно, что с ростом концентрации ПЭГ в нерастворимую форму переходит все большее число молекул, имеющих относительно меньшую молекулярную массу (Туманова, 1985; Johansen et al., 1980). Полученные нами данные свидетельствовали о том, что в преципитате они находятся не в виде отдельных фракций, а включаются в агрегаты крупных надмолекулярных образований, которые осаждаются при низких концентрациях ПЭГ. Поэтому, оценивая результаты определения размерности агрегатов, полученных после преципитации ИК различными концентрациями ПЭГ, можно заключить следующее. Действительно, чем выше содержание ПЭГ в растворе, тем большее число уменьшающихся по молекулярной массе белковых структур выпадает в осадок. Однако средний размер преципитируемых частиц при этом увеличивается.

Рис. 3. Волновые экспоненты модельных иммунных комплексов в различных концентрациях ПЭГ-6000.

По оси абсцисс - логарифм (^ю) длины волны; по оси ординат - логарифм (1о§ю) величины оптической плотности

То, что эти изменения волновых экспонентов и размеров иммунных агрегатов обусловлены влиянием ПЭГ на свойства белковых молекул в растворе, а не с простым аддитивным влиянием самого добавленного ПЭГ на оптические свойства системы, было установлено в исследованиях латексных частиц в присутствии ПЭГ. Результаты спектротурбидиметрии показали, что волновые экспоненты латексных частиц не изменялись при добавлении ПЭГ (Р>0,05).

Следует отметить, что использование ПЭГ для осаждения белковых структур сыворотки крови и последующее фотометрическое исследование проб недостаточно для идентификации именно иммунных комплексов. В сыворотке крови, кроме ИК, присутствуют сгустки фибрина, липопротеиды, фрагменты отмирающих клеток (Ardoin et al., 2007; Robinson et al„ 1989). Поэтому, как уже упоминалось, ВОЗ (WHO Scientific Group, 1977) рекомендовала определять в составе агрегатов хотя бы один из иммунных компонентов (Аг, Ат или компонент комплемента). Методов, позволяющих одновременно определять и размер, и иммунный компонент в дисперсной системе, ,не существует. Поэтому дальнейшее развитие разрабатываемого метода было направлено на определение концентраций иммуноглобулинов классов М, G и А в составе преципитатов сыворотки крови, выделенных и отмытых в растворах ПЭГ двух концентраций.

Определение концентраций иммуноглобулинов классов М, G и А в составе циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам

Исследование содержания IgM, IgG и IgA в составе преципитатов, полученных в 3% и 4% ПЭГ, потребовало использования чувствительного метода определения иммуноглобулинов, такого как ИФА. Его применение позволило установить уровни IgM, IgG и IgA в составе ПЭГ-преципитатов сыворотки крови у здоровых добровольцев, концентрации ЦИК у которых невысоки. В результате были получены «точки отсчета» для сравнения соответствующих параметров при различных заболеваниях. Однако для проведения ИФА необходимо достаточно большое количество проб, а постановка реакции требует временных затрат. Позднее ИФА был заменен на более удобный иммунотур-бидиметрический метод.

Полученные результаты показали, что у больных лимфопролифератив-ными заболеваниями увеличены концентрации IgG-содержащих ЦИК (табл. 1). Уровни IgM- и IgA-содержащих комплексов у здоровых и больных людей не отличались (Р>0,05). Значение концентрации IgG в преципитате, полученном в 4% ПЭГ (общий пул ЦИК), оказалось в 2,7 раза выше относительно соответствующего показателя в группе здоровых добровольцев (Р<0,05). Это повышение происходило, главным образом, за счет возрастания уровня IgG-содержащей низкомолекулярной фракции ИК. Ее увеличение по сравнению с соответствующим показателем здоровых людей было шестикратным (Р<0,01).

Таблица 1

Содержание и 1§Л в ПЭГ-иреципитата* сыворотки крови здоровых людей и боль_ньи с лимфопролиферативными заболеваниями_

Здоровые добровольцы Больные с онкопатологией

Показатели Сз%пэг С4% ПЭГ С4%-Сз% Сз% пэг Ст пэг С4%-Сз%

1 г 3 4 5 5

Уровень ^М (мг/л) 30,0* 81,9 42,6 37,9 94,1 48,6

его

границы 8,6-И 05,4 23,5-1-184,7 9,8-И 86,0 8,4+170,4 22,2+399,3 11,4+206,9

(±1с)

1ояю (М±т) п 3,4020^0,3045 4,4052±0,3022 3,7515±0,3575 3,6341±0,3884 4,5439±0,3733 3,8828+0,3743

17 Р,4>0,05 17 Р2-5>0,05 17 Рз-б>0,05 15 15 15

Уровень ДО (мг/л) 74,3* 114,6 27,2 93,0 310,7 162,8

его

границы 33,3+166,0 46,74-281,3 6,8-И 07,8 30,7+281,5 101,5+951,3 41,6+636,1

(±1о)

(М+т) 4,3082±0,2541 4,7412±0,2840 3,3021±0,4358 4,5322+0,3199 5,7388±0,3230 5,0923±0,3935

п 10 Р,^>0,05 10 Р2-5<0,05 10 Рз<<0,01 12 12 12

Уровень ^А (мг/л) 1,5* 5,5 3,8 1,4 4,4 2,3

его

границы 0,5+4,6 2,1+14,4 1,4+9,9 0,4+5,5 1,5+13,1 0,6+9,0

(±1о)

^Ю (М±т) 0,4271+0,2606 1,6980*0,2292 1,3281±0,2271 0,3426+0,2882 1,4831+0,2717 0,8451+0,3367

п 18 Р1л>0,05 18 Р2.5>0,05 18 Рз^>0,05 16 16 16

* - приведены средние геометрические величины; Р - показатель достоверности; 1,2,3,4,5,6 -группы сравнения (нумерация в оглавлении таблицы)

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у больных лимфопролиферативными заболеваниями в циркуляции присутствуют в основном ИК небольших размеров. Следует отметить, что не у всех пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями отмечалось повышение ЦИК. Однако в ряде случаев наблюдался весьма внушительный рост концентрации ^в-содержащих агрегатов, превышающий уровень 1 г/л.

Определение концентраций иммуноглобулинов в выделенных и отмытых в присутствии ПЭГ преципитатах из сывороток крови пациентов с РА обнаружило следующие закономерности (табл. 2). У больных РА отмечено повышение уровня 1{»М- и 1§0-содержащих ЦИК по сравнению с соответствующими показателями здоровых добровольцев.

Таблица 2

Содержание IgM и IgG в ПЭГ-преципитатах сыворотки крови здоровых доноров и пациен-

Показатели Здоровые добровольцы (п=29) Больные ревматоидным артритом (п=10)

Сз% пэг С« пэг С4%—Сз% С3* пэг ^4% ПЭГ

1 г 3 4 5 6

Уровснь IgM 23 215 453 5 (мг/л)

его границы 12,4+42,8 52,5-158,5 30,6+128,0 104,0+446,3 220,3+933,5 64,8+582,1 (±1с)

logio (M±m) 3,1360±0,1152 4,5131±0,1026 4,1363+0,1329 5,3726±0,2303 6,1170±0,2283 5,2692±0,3471

Ры<0,001 Р2.5<0,001 Рз-б=0,01

Уровень IgG 37,8* 131,4 89,1 194,9 306,5 89,9

(мг/л)

егограницы 20,6+69,3 97,3+177,4 68,0+116,7 103,4+367,1 183,5+511,9 41,2+196,1 (±1с)

logio (M+m) 3,6313±0,1128 4,8780+0,0558 4,4900±0,0501 5,2724±0,2003 5,7251 ±0,1622 4,4986+0,2466

_Рм<0,001 Р2.5<0,001 Рз-(,>0,05__

* - приведены средние геометрические величины; Р - показатель достоверности; 1,2,3,4,5,6 -группы сравнения (нумерация в оглавлении таблицы)

В осадках, полученных из сывороток крови больных при 3% ПЭГ (высокомолекулярные ЦИК), содержание 1сМ было в 9,4 раза выше, по сравнению с его уровнем, выявленным в аналогичных пробах здоровых людей (Р<0,001). После обработки сывороток крови 4% ПЭГ (полный состав ЦИК) соответствующее различие было пятикратным (Р<0,001). Для содержащих ЦИК разница была меньше: в 3% ПЭГ - в 5,2 раза, в 4% ПЭГ - в 2,3 раза (Р<0,001). Полученные данные подтверждают сделанный выше вывод о том, что высаж-даемые при больших концентрациях ПЭГ комплексы малых размеров не существуют самостоятельно, а включаются в состав крупных агрегатов, внося свой вклад в увеличение их размера. Следует отметить, что у пациентов с РА в циркуляции присутствуют в основном крупные ИК. Об этом свидетельствует повышение уровня высокомолекулярных 1§М- и ^в-содержащих ЦИК относительно соответствующего показателя здоровых добровольцев (Р<0,001). Концентрации ^А в составе ЦИК были невысоки, различий между больными и здоровыми не обнаружено.

Вместе с тем, у метода есть дальнейшее развитие: кроме иммуноглобулинов, в составе преципитатов можно попытаться определить уровни компонентов комплемента или исследовать антигенный состав.

Оптические свойства сыворотки крови в присутствии 3% и 4% ПЭГ

В работе впервые применен спектротурбидиметрический метод для исследования нативных сывороток крови. С этой целью к образцам проб свежей сыворотки крови добавляли ПЭГ в 3% и 4% конечной концентрации и оцени-

вали размеры сформированных агрегатов. Исследование проводили на сыворотках крови здоровых людей и пациентов с РА.

Полученные данные (табл. 3) свидетельствуют о том, что у здоровых людей при осаждении сывороток крови 3% ПЭГ диаметр частиц в преципитате был в 2,5 раза меньше по сравнению с диаметром частиц, образованных в сыворотках крови больных РА.

Таблица 3

Оптические свойства сыворотки крови здоровых и больных ревматоидным артритом людей в присутствии ПЭГ

Здоровые добровольцы (п=26) Больные ревматоидным артритом (п=10)

Показатели 3% ПЭГ 4% ПЭГ 3% ПЭГ 4% ПЭГ

1 2 3 4

Волновой экспонент 3,37+0,25 1,99+0,04 1,91+0,06 1,77±0,07

Р1-2< 0,001 Р,.з < 0,001 Р2л < 0,05 . Рз-4 > 0,05

Средний диаметр частиц в преципитате (нм) абсолютные значения* 170,6 579,4 617,9 701,9

их границы (±1о) 55,94-520,6 477,64-703,0 520,14-734,1 582,74-845,5

1о§ю (М+т) 2,2320±0,0950 2,7630±0,0159 2,7909±0,0237 2,8463±0,0256

Р,.2< 0,001 Р,.з< 0,001 Р24 < 0,01 Р3„ > 0,05

Средний объем частиц в преципитате (нм3) абсолютные значения* 2,6 101,9 123,5 181,0

их границы (±1о)х106 0,094-73,9 57,04-181,9 73,74-207,2 103,64-316,5

к^ю (М+т) 6,4151+0,2850 8,0080±0,0048 8,0918±0,0710 8,2578+0,0767

Р^С 0,001 Р,.з< 0,001 Рм<0,01 Рм > 0,05

* - приведены средние геометрические величины; Р - показатель достоверности; 1,2,3,4 - группы сравнения (нумерация в оглавлении таблицы).

При этом объемы ПЭГ-сформированных частиц различались почти в 50 раз. Эти различия оказались высокодостоверными (Р<0,001). В 4% ПЭГ размер частиц в суспензии еще больше возрастал, что подтверждало закономерность, установленную на модельных ИК. Различия в средних размерах преци-питированных частиц у больных и здоровых людей оказались статистически значимы, но менее выражены, чем, установленные в 3% ПЭГ. У пациентов с

РА средний объем агрегатов в суспензии 4% ПЭГ был в 1,8 раза больше по сравнению с таковым у здоровых добровольцев (Р<0,01). Вместе с тем, следует отметить, что проявленные в ПЭГ оптические свойства сывороток крови пациентов с РА и здоровых людей имеют существенные различия. То, что эти отличия обусловлены именно основным заболеванием, убедительно демонстрирует проведенный корреляционный анализ между уровнем РФ, обнаруженного в циркуляции и приведенными выше показателями оптических свойств сыворотки крови (табл. 4).

Таблица 4

Показатели корреляции между уровнями ревматоидного фактора и оптическими свойства-

ми сыворотки крови, обработанной ПЭГ-6000, у больных ревматоидным артритом

Концентрация -----........------------------,--- Показатели корреляционного анализа

ПЭГ Связь | Я' 1 * | N р

РФ' - волновой экспонент -0,881 0,776 10 <0,001

3% РФ - среднии диаметр частиц ПЭГ-преципитата 0,907 0,822 10 <0,001

РФ - средний объем частиц ПЭГ-преципитата 0,944 0,892 10 <0,001

РФ - волновой экспонент -0,923 0,853 10 <0,001

4% РФ - среднии диаметр частиц ПЭГ-преципитата 0,948 0,898 10 <0,001

РФ - средний объем частиц ПЭГ-преципитата _______ ,.2 ___ < <______ 0,975 0,950 10 <0,001

Я - коэффициент корреляции; К - квадрат коэффициента корреляции; N - число наблюдений; Р - показатель достоверности. * РФ - ревматоидный фактор; уровень оценивали по титру в ла-текс-аглютинации.

Все полученные коэффициенты корреляции оказались высокодостоверными (Р<0,001). Наиболее высокие коэффициенты корреляции были получены между концентрацией РФ в крови и объемом частиц в ПЭГ-преципитатах. Эти данные свидетельствуют о том, что при РА размер преципитируемых частиц и основной иммунопатогенетический компонент данного заболевания тесно связаны между собой.

Таким образом, исследование оптических свойств сывороток крови в присутствии ПЭГ различных концентраций показало, что метод спектротур-бидиметрии может быть применен для определения размеров ПЭГ-индуцированных белковых агрегатов. При этом установлены существенные различия в размерах частиц у здоровых и больных людей.

Оптимизация метода выделения иммунных комплексов. Исследование различных температурных условий хранения сывороток крови

В клинической практике часто возникает необходимость накопления и хранения образцов проб до проведения исследований. Для унификации метода оценивали влияние различных температурных условий хранения сывороток крови на концентрации ЦИК в образцах. В экспериментах использовали сыворотки крови, полученные от пяти здоровых добровольцев. Выделение

ЦИК проводили в присутствии 3% и 4% конечных концентраций ПЭГ. Содержание в полученных ПЭГ-преципитатах определяли методом ИФА.

Оценку влияния различных температурных режимов хранения сывороток крови, содержащих ЦИК, а также ЦИК, выделенных из свежей сыворотки крови, на воспроизводимость результатов проводили по следующей схеме:

вариант 1 - из свежей сыворотки крови выделяли ЦИК и немедленно определяли уровень ^в-содержащих комплексов;

вариант 2 - сыворотку крови хранили при -18°С в течение 8 суток, размораживали, затем выделяли ЦИК и устанавливали концентрацию в пробе;

вариант 3 - сыворотку крови хранили при +4°С в течение 8 суток, затем выделяли ЦИК и определяли в них содержание ^в;

вариант 4 - из свежей сыворотки крови выделяли ЦИК, которые хранили при -18°С в течение 8 суток, затем размораживали и устанавливали уровень ^в-содержащих комплексов.

В результате проведенных исследований было установлено следующее. Концентрации содержащих ЦИК в образцах, полученных в варианте 4, совпадали с результатами, полученными в варианте 1 (Р>0,05). Любая форма хранения биологического материала (варианты 2 и 3) приводила к повышению уровня в образцах. Эти данные свидетельствуют о том, что длительное хранение сыворотки крови при +4°С или ее предварительная заморозка при -18°С приводят к усилению процесса комплексообразования. Следовательно, для получения воспроизводимых результатов при проведении отсроченного определения иммунного компонента в преципитате необходимо выделять ЦИК из свежей сыворотки крови. Эти образцы допустимо хранить при низких температурах не более 8 суток (контрольное время проведения эксперимента).

Таким образом, спектротурбидиметрическое исследование поведения модельных комплексов Аг/Ат в присутствии ПЭГ позволило обосновать применение двух концентраций ПЭГ для дифференцирования ИК по размерам. На основе метода спектротурбидиметрии показана закономерность изменения агрегатного состояния белковых структур в возрастающих концентрациях ПЭГ. Установлено, что при повышении концентрации ПЭГ увеличение размера частиц ИК обусловлено включением дополнительно осаждаемых иммунных агрегатов меньшего размера в состав крупных надмолекулярных структур, преципитирующих при низких концентрациях ПЭГ. Исходя из этого, осаждение ИК сыворотки крови в присутствии двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) позволяет получать преципитаты, сформированные из агрегатов различных размеров. Последующее количественное определение иммунного компонента в составе преципитата дает возможность оценки общего пула ЦИК, высокомолекулярного пула и расчета доли низкомолекулярных ЦИК.

Предлагаемый метод определения ЦИК относительно прост, доступен, обладает достаточной информативностью и может быть рекомендован для

клинических лабораторных исследований. На группе здоровых добровольцев получены физиологические значения концентраций ЦИК, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов. Использование предлагаемого метода при различных заболеваниях показало его способность различать особенности иммунопатогенетических процессов. Так, у пациентов с РА в составе ЦИК, полученных в 3% и 4% ПЭГ, присутствуют иммуноглобулины классов Миб, концентрации которых в несколько раз превышают соответствующие показатели здоровых людей. Основная доля агрегатов при этом представлена высокомолекулярными ^М- и ^в-содержащими ЦИК. Вместе с тем, у больных с лимфопролиферативными заболеваниями отмечено повышение уровня низкомолекулярных ^в-содержащих ЦИК. При этом в ряде случаев зафиксировано многократное увеличение их концентрации по сравнению с показателями здоровых добровольцев.

Отметим, что в задачу данного исследования не входило глубокое изучение диагностического значения определяемых показателей при различных патологических состояниях. Однако полученные данные свидетельствуют об информативности метода, что в последующем может иметь прикладное значение. Основным достоинством предлагаемого метода определения ЦИК является объединение в нем двух подходов: разделение ЦИК по размерам и количественное определение в их составе иммуноглобулинов классов М, в и А. При этом метод фракционирования является довольно простым и не требует для своей реализации уникального или дорогостоящего оборудования.

Выводы

1. Впервые на основе метода спектрогурбвдиметрии показана возможность определения размеров иммунных комплексов, преципитированных в полиэтиленгликоле-6000.

2. Установлено, что при увеличении концентрации полиэтиленгликоля-6000 в растворах иммунных комплексов дополнительно высаждаемые белковые агрегаты находятся не в свободном виде, а включаются в состав более крупных надмолекулярных структур.

3. На основе спектротурбидиметрических исследований модельных иммунных комплексов обосновано использование двух концентраций полиэти-ленгликоля-6000 (3% и 4%) для дифференцирования по размерам иммунных комплексов сыворотки крови.

4. Показано, что иммуноглобулиновый состав ПЭГ-преципитатов, полученных из сывороток крови здоровых доноров, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями, имеет существенные различия.

5. Проведена адаптация метода определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов, для клинической лабораторной практики. Представлен протокол проведения анализа.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ

1. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Раев М.Б., Николаева A.M. Определение размера и концентрации циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по изотипам иммуноглобулинов // Вестник Уральской академической науки. - 2006. - № 3-1 (14). - С. 107-109.

2. Шмагель К.В., Шмагель А.К, Королевская Л.Б. Определение размеров и состава циркулирующих иммунных комплексов у больных ревматоидным артритом // Вестник Уральской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24).-С. 64-66.

3. Королевская Л.Б., Шмагель К.В. Определение размеров иммунных комплексов методом спектротурбидиметрии // Российский аллергологический журнал. -2010. -№ 1, вып. 1. - С. 87-88.

4. Королевская Л.Б., Шмагель К.В. Спектротурбидиметрическое определение размера иммунных агрегатов сывороток крови, образованных в поли-этиленгликоле // Иммунология. - 2010. - Том 31, № 2. - С. 108-111.

5. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Хлебцов Н.Г. Спектротурбидиметрическое определение размеров индуцированных полиэтиленгликолем частиц нерастворимых иммунных комплексов // Коллоидный журнал. - 2010. - Том 32, № 4. - С. 499-506.

Публикации в других сборниках и журналах

6. Королевская Л.Б., Шмагель К.В. Оригинальный метод определения концентрации циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размеру и изотипам иммуноглобулинов // Тезисы докладов VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды - 2005». -Пермь-Казань-Пермь, 20-25 сентября 2005 г. - С. 96.

7. Королевская Л.Б., Шмагель К.В. Разработка метода определения концентраций циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размеру и содержанию изотипов иммуноглобулинов // Материалы IV конференции иммунологов Урала. - Уфа, 2005. - Иммунология Урала. - 2005. - № 1 (4).-С. 190-191.

8. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Смолина Л.А. Спектротурбидимет-рия в оценке размеров иммунных комплексов: адаптация к клинической практике // Медицинская иммунология. - 2006. - Том 8, № 2-3. - С. 419-420.

9. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Николаева A.M. Оптимизация метода выделения иммунных комплексов // Материалы V конференции иммунологов Урала. - Оренбург, 2006. - Иммунология Урала. - 2006. - № 1 (5). - С. 162-163.

10. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Смолина Л.А. Определение размеров модельных иммунных комплексов методом спектротурбидиметрии // Тезисы докладов конференции РАН «Фундаментальные науки - медицине». -Москва, 27-29 ноября 2006 г. - С. 216-217.

Королевская Лариса Борисовна

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ, ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ПО РАЗМЕРАМ И КЛАССАМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 06.10.2010. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1. Формат 60x90/16. Набор компьютерный. Заказ № 46/2009.

Отпечатано в типографии издательства «Книжный формат». Адрес: 614000, г. Пермь, ул. Пушкина, 80

Образование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) является естественным процессом завершения гуморального иммунного ответа организма на антиген. Вместе с тем, существует группа заболеваний, объединенная общим названием «болезни иммунных комплексов» или «гиперчувствительность III типа» (по классификации Gell-Coombs [Coombs, Gell, 1975]). В их основе лежат воспалительные эффекты, индуцированные комплексами антиген-антитело. Повышение уровня ЦИК отмечено при многих заболеваниях: аутоиммунных, инфекционных, онкологических и т.д. [Croce et al., 1985; Floege, Feehally, 2000; Janear, Crespo, 2005; Krapf et al., 1990; Mok, Lau, 2003; Muratsugu, 2005; Nydegger, 2007; Song, Kang, 2010; Vlock, Kirkwood, 1985; Wang et al., 2003]. Нередко они играют важную патогенетическую роль в развитии этих заболеваний, оказывая повреждающее воздействие на различные органы и ткани. Одним из существенных факторов, имеющих значение для проявления патогенности ЦИК, является их размер [Cochrane, Hawkins, 1968; Nangaku, Couser, 2005; Oda et al., 2009; Schrieber, 1984; Sedlacek, 1980; Theofilopoulos, Dixon, 1980]. От размера иммунного комплекса зависят его важнейшие биологические свойства - способность активировать комплемент и взаимодействовать с Fc-рецепторами, что, в конечном итоге, определяет безопасное удаление агрегатов системой мононуклеарных фагоцитов. Кроме того, различные классы иммуноглобулинов формируют разные по свойствам комплексы антиген-антитело [Jefferis, Kumararatne, 1990; Peng et al., 2005; Waxman et al., 1986]. Поэтому оценка размерности и исследование роли иммуноглобулинового компонента ЦИК в формировании патогенных свойств иммунных агрегатов представляет собой несомненный интерес.

Следует отметить, что, несмотря на довольно большое число методических вариантов определения иммунных комплексов, до сих пор отсутствует универсальный метод, позволяющий оценить весь спектр ЦИК и их характеристики. Существующие методы детекции ЦИК основаны на разных принципах, поэтому имеют различную чувствительность и специфичность. Чаще всего определяют не размер, а идентифицируют иммунный компонент в составе комплекса, что, согласно рекомендациям ВОЗ, является необходимым при определении ЦИК [WHO Scientific Group, 1977]. Вместе с тем, методы, позволяющие определять размеры агрегатов — микроскопические, хроматографические, седиментационные, электрофоретические, светорассеяния и др. [Кленин и соавт., 1979; Константинова и соавт., 1986; Easterbrook-Smith, 1993; Haakenstad et al., 1982; Kelly et al, 1980; Khlebtsov et al., 2004; Cooper, Moore, 1983; Stachura et al., 1981; Szabo et al., 1977; Tung et al., 1981], - мало адаптированы для клинической лабораторной практики. Широко распространенный в отечественных исследованиях метод ПЭГ-преципитации ЦИК [Digeon et al., 1977; Haskova et al., 1978], несмотря на свою простоту, оказался малоинформативным, хотя рядом исследователей предпринимались попытки модификации метода для повышения его информативности [Константинова и соавт., 1986; Туманова, 1985]. Возможно, одним из подходов на пути появления относительно информативного и доступного для клинического применения метода определения ЦИК, учитывающего физико-химические характеристики комплексов и идентифицирующего его составляющие, является комбинирование методов, основанных на различных свойствах иммунных агрегатов.

Цель работы — разработка и обоснование простого и доступного для клинической лабораторной практики метода определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов.

Основные задачи исследования:

1. На основе создания модельных иммунных комплексов и использования стандартизованных по размерам латексных частиц оценить возможность применения спектротурбидиметрического метода для определения размеров нерастворимых иммунных комплексов.

2. Провести спектротурбидиметрическое исследование размеров агрегатов модельных иммунных комплексов, образованных в присутствии полиэтиленгликоля-6000 различных концентраций, для переноса полученных результатов в область клинических исследований.

3. Апробировать метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов. С помощью данного метода оценить отличия в их качественном и количественном составе у здоровых и больных людей.

4. Адаптировать предлагаемый метод определения циркулирующих иммунных комплексов для использования в клинической лабораторной практике, представить протокол проведения анализа.

Научная новизна. Впервые спектротурбидиметрический метод применен для определения размеров иммунных комплексов, преципитированных в полиэтиленгликоле-6000 (ПЭГ). Представлена закономерность формирования преципитатов в среде с ПЭГ. Показано, что с возрастанием концентрации ПЭГ в растворе увеличение среднего размера преципитируемых частиц обусловлено включением более мелких по размерам комплексов в состав первичного агрегата, осаждаемого при меньшей концентрации ПЭГ. Установлено, что использование двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) позволяет дифференцировать иммунные комплексы по размерам. На основе разработанного метода показана возможность определения содержания иммуноглобулинов классов М, О и А в составе дифференцированных по размерам ЦИК, выделенных из сывороток крови здоровых доноров, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями. Впервые метод спектротурбидиметрии применен для непосредственного исследования нативных сывороток крови. В результате у пациентов с ревматоидным артритом установлена прямая связь между уровнем ревматоидного фактора и размером преципитируемых из сыворотки крови частиц.

Теоретическое и практическое значение работы. Представлена новая концепция поведения иммунных комплексов в растворе ПЭГ. На основе данной концепции и метода спектротурбидиметрии обосновано применение двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) для дифференцирования иммунных комплексов по размерам. Показано, что ПЭГ в возрастающих концентрациях увеличивает размер иммунных агрегатов за счет включения дополнительно осаждаемых белковых структур в первичный надмолекулярный комплекс. Создан доступный для лабораторной практики метод определения ЦИК, отражающий размерные характеристики комплексов и количественное содержание иммуноглобулинов в их составе. Получены новые данные о содержании иммуноглобулинов классов М, в и А в составе дифференцированных по размерам ЦИК у здоровых добровольцев, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями. При этом выявлены существенные различия в составе ПЭГ-преципитатов при разных заболеваниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метод спектротурбидиметрии относительно прост и достаточно информативен в оценке размеров иммунных комплексов при соблюдении определенных условий.

2. На основе спектротурбидиметрии получено обоснование применения двух концентраций полиэтиленгликоля-6000 для выделения из сыворотки крови иммунных агрегатов разных размеров.

3. Разработан метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов, проведена его адаптация для применения в клинической лабораторной практике.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции», Сочи, 2007; VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007; II Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008.

Публикации. Основные результаты проведенных исследований представлены в 10 печатных работах, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 220 источников, из них 20 отечественных и 200 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Впервые на основе метода спектротурбидиметрии показана возможность определения размеров иммунных комплексов, преципитированных в полиэтиленгликоле-6000.

2. Установлено, что при увеличении концентрации полиэтиленгликоля-6000 в растворах иммунных комплексов дополнительно высаждаемые белковые агрегаты находятся не в свободном виде, а включаются в состав более крупных надмолекулярных структур.

3. На основе спектротурбидиметрических исследований модельных иммунных комплексов обосновано использование двух концентраций полиэтиленгликоля-6000 (3% и 4%) для дифференцирования по размерам иммунных комплексов сыворотки крови.

4. Показано, что иммуноглобулиновый состав ПЭГ-преципитатов, полученных из сывороток крови здоровых доноров, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями, имеет существенные различия.

5. Проведена адаптация метода определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов, для клинической лабораторной практики. Представлен протокол проведения анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований был разработан метод определения ЦИК, позволяющий идентифицировать два основных параметра: размер и содержание иммуноглобулинов. В его основе лежит использование двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) для дифференцирования комплексов по размерам и последующее количественное определение в составе преципитатов иммуноглобулинов классов М, G и А. Предлагаемый метод был адаптирован для применения в клинической лабораторной практике. По сравнению с седиментационными и хроматографическими методами определения размеров [Фрайфелдер, 1980; Cooper, Moore, 1983; Tung et al., 1981], фракционирование в ПЭГ не требует длительных временных затрат, а в отличие от динамического рассеяния света [Хлебцов, 2004] - наличия дорогостоящего оборудования. Следует отметить, что в отечественной лабораторной практике для определения ЦИК широко используется турбидиметрический метод оценки преципитации сыворотки крови в присутствии ПЭГ [Digeon et al., 1977; Haskova et al., 1978]. При этом, как правило, применяют одну концентрацию ПЭГ, а результаты выражают в условных единицах. Несмотря на простоту исполнения, клиническая информативность данного метода довольно невысока из-за низкой чувствительности и специфичности. Использование нефелометрии значительно повышает чувствительность метода, а исследование преципитатов, полученных при двух концентрациях ПЭГ, позволяет дифференцировать их по размерам [Туманова, 1985]. Однако при этом невозможно выявлять иммунный компонент в составе ПЭГ-преципитатов, идентификация которого является необходимой при детекции ИК [WHO Scientific Group, 1977].

Известно, что размер ИК является существенным фактором, имеющим значение для проявления их патогенных свойств [Mannik, 1980; Nangaku, 2005; Schrieber, 1984; Sedlacek, 1980]. Низкомолекулярные комплексы хуже, по сравнению с крупными комплексами, активируют комплемент [Horgan, Emlen, 1987; Waller et al, 1981]. Результатом этого является их длительное присутствие в циркуляции и, как следствие, повышается вероятность отложения агрегатов в различных тканях [Haakenstad et al, 1982; Mannik et al., 1971; Nangaku, 2005;]. Поэтому, определяя параметр размерности ЦИК, можно косвенно оценивать их биологические свойства и возможные негативные последствия.

Полиэтиленгликоль широко используется в биохимической практике для преципитации белковых молекул [Annunziata et al., 2002; Bhat, Timasheff, 1992; Digeon et al., 1977; Middaugh et al., 1979]. Считается, что при низкой концентрации ПЭГ осаждаются крупные ИК, а с увеличением его концентрации преципитируют как крупные, так и меньшие по размерам протеиновые структуры [Creighton et al, 1973; Johansen et al, 1980; Shulgin, Ruckenstein, 2006; Steensgaard et al., 1979]. Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные об оценке агрегатного состояния ИК в различных концентрациях ПЭГ. На основании результатов спектротурбидиметрических исследований нами предложена новая концепция поведения ИК в присутствии ПЭГ различных концентраций. Действительно, с ростом концентрации ПЭГ в растворе происходит дополнительное высаждение более мелких по размерам белковых молекул. Однако в растворе ПЭГ они находятся не в свободном виде, а включаются в состав более крупных агрегатов, формируя единый надмолекулярный комплекс. Исходя из этого, осаждение ИК из сыворотки крови в присутствии 3% и 4% ПЭГ позволяет получать преципитаты, состоящие из агрегатов различных размеров. Последующее определение иммунного компонента в их составе (иммуноглобулинов классов М, G и А) дает возможность количественной оценки уровня ЦИК. В отличие от существующих подходов для определения ЦИК, предлагаемый метод позволяет одновременно оценить и размер, и количественное содержание иммунных агрегатов. Кроме того, разные классы иммуноглобулинов формируют различные по свойствам ИК [Jefferis,

Kumararatne, 1990; Peng et al., 2005; Waxman et al., 1986]. Входящие в состав комплексов Ат классов M и G, в отличие от IgA, хорошо активируют комплемент по классическому пути [Jefferis, Kumararatne, 1990; Kerr, 1990; Peng et al., 2005]. Это свойство ИК лежит в основе Clq-тестов [Ahlstedt et al., 1976; Nydegger et al., 1974; Stanilova, Slavov, 2001], которые в отличие от предлагаемого метода позволяют определять только крупные комплементфиксирующие ЦИК. Следует отметить, что на данном этапе исследований нам не удалось выявить отличий по IgA-содержащим комплексам у здоровых и больных людей, их концентрации были невелики как у здоровых, так и у больных людей.

При исследовании состава ПЭГ-преципитатов у больных лимфопролиферативными заболеваниями отмечено повышение уровня IgG-содержащих ЦИК, которое происходило, в основном, за счет низкомолекулярной фракции. При этом не у всех пациентов наблюдалось увеличение содержания IgG-ЦИК, однако в ряде случаев отмечался существенный рост их концентрации. Известно, что изотипы IgG отличаются по способности активировать комплемент [Jefferis, Kumararatne, 1990] и по-разному элиминируются из кровотока [Gonzalez, Waxman, 2000]. Можно предположить, что у ряда таких больных в составе ЦИК присутствовали именно те изотипы, которые хуже активировали комплемент. Снижение эффективности выведения ИК из циркуляции сопровождалось их повышенным содержанием в кровотоке.

При определении концентраций иммуноглобулинов в ПЭГ-преципитатах, полученных из сывороток крови пациентов с РА, было установлено повышение уровня IgM- и IgG-содержащих ЦИК. При этом основную долю составляли высокомолекулярные агрегаты. Вместе с тем, известно, что крупные ИК хорошо фиксируют комплемент и эффективно выводятся из циркуляции [Cochrane, Hawkins, 1968; Mannik et al., 1971; Sedlacek, 1980]. Однако при данном заболевании наблюдается постоянная продукция аутоантител (РФ) [Mageed et al., 1991; Song, Kang, 2010]. В результате происходит непрерывное образование ИК, что в свою очередь, приводит к истощению очистительных механизмов [Haakenstad, Mannik, 1974], длительному присутствию комплексов в циркуляции и их отложению в суставах.

В заключение следует отметить, что в задачу данного исследования не входило глубокое изучение диагностического значения определяемых показателей. Вместе с тем апробация предлагаемого метода при различных заболеваниях показала его способность различать особенности иммунопатогенетических процессов. Полученные данные свидетельствуют об информативности метода, что в последующем может иметь прикладное значение. Таким образом, предлагаемый метод определения ЦИК может быть представлен в следующем виде.

Метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов

Реактивы и оборудование: ОДМ боратный буфер (рН=8,4); 3%, 4%, 6% и 8% растворы ПЭГ-6000, приготовленные на боратном буфере; забуференный фосфатами физиологический раствор (рН=7,4); пробирки типа Eppendorf; многоканальные пипетки; центрифуга для пробирок типа Eppendorf; коммерческие наборы для количественного определения иммуноглобулинов методами ИФА или иммунотурбидиметрии; спектрофотометр.

Протокол проведения анализа

1. Стандартная процедура забора венозной крови и получение сыворотки в объеме до 2 мл.

2. В две пробирки типа Eppendorf внести по 800 мкл исследуемой сыворотки крови. При перемешивании на вортексе в первую пробирку внести 800 мкл 6% раствора ПЭГ-6000, во вторую — 800 мкл 8% раствора ПЭГ-6000.

3. Осаждение ЦИК центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин. После осаждения надосадок из проб удалить, к осадкам добавить по 800 мкл растворов ПЭГ-6000 соответствующих концентраций. Осадок тщательно ресуспендировать и отмыть центрифугированием при отмеченных выше условиях. Процедуру отмывания осадка повторить еще раз. Надосадок удалить, к полученным ПЭГ-преципитатам добавить по 200 мкл физиологического раствора и тщательно ресуспендировать.

4. Определение концентраций иммуноглобулинов в составе ПЭГ-преципитатов с использованием коммерческих наборов согласно прилагаемым инструкциям.

5. Оценка результатов: для ЦИК, содержащих конкретный класс иммуноглобулина, получается три значения:

- общий пул ЦИК (содержание иммуноглобулина в пробе с 4% ПЭГ-6000);

- высокомолекулярный пул ЦИК (содержание иммуноглобулина в пробе с 3% ПЭГ-6000);

- низкомолекулярный пул ЦИК (разница концентраций иммуноглобулина в пробах с 4% и 3% ПЭГ-6000).

Следует отметить, что выделение ЦИК необходимо проводить из свежей сыворотки крови (этапы 1-3). Полученные образцы проб допустимо хранить при -18 С до проведения последующего анализа. Кроме иммуноглобулинов в составе полученных ПЭГ-преципитатов можно попытаться определить уровень компонентов комплемента или наличие антигена, используя соответствующие коммерческие наборы.