Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:РОЛЬ ИММУНОКОМПЛЕКСНОЙ ПАТОЛОГИИ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКЕ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ

На правах рукописи

ИВАНОВА МАРИЯ ВИКТОРОВНА

РОЛЬ ИММУНОКОМПЛЕКСНОЙ ПАТОЛОГИИ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКЕ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ

14.01.09-инфекционные болезни 14.03.09 —клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 АПР ¿013

Санкт-Петербург, 2013.

005051986

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

ВОРОБЬЕВА Наталья Николаевна

доктор медицинских наук, Официальные оппоненты:

ШМАГЕЛЬ Константин Владимирович

Сологуб ТамараВасильевна доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по клинической и научной работе ФГБУ« Научно-исследовательский институт Гриппа» МЗ РФ

Симбирцев Андрей Семенович доктор медицинских наук, профессор, директор ФГУП «Государственный НИИ особо чистых препаратов» ФМБА России

Ведущая организация - Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «

/9 »£/.2013 г. в «/3 » час. на заседании диссертационного совета Д 208.090.Q2 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» в научно-исследовательском институте пульмонологии (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Рентгена, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова)) по адресу: 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 6/8.

Автореферат разослан « ^ г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

Альберт Леонидович Алексащров

Актуальность работы.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - широко распространенная по всему миру природно-очаговая инфекция. Возбудителями заболевания являются РНК-содержащие вирусы, относящиеся к семейству Bunyaviridae и принадлежащие к самостоятельному роду - Hantavirus. На сегодняшний день известно более 25 серологически и генетически отличающихся друг от друга хантавирусов [Lee, 1999]. Многообразие возбудителей и их различная эпидемиологическая значимость обусловливают развитие разных клинических вариантов ГЛПС [Бондаренко, 2007; Иванис, 2004; Коробов и соавт., 2001; Образцов, 2005; Самонина и соавт., 2007; Сатаров и соавт., 2008; Файзуллина, 2009; Юдинцева, 2009; Clement ei al, 1995; Schmaljohn & Hjelle, 1997]. Генерализованный характер инфекции с поражением многих органов и систем способствует полиморфизму ее симптоматики. Тем не менее, общим для клинического течения ГЛПС, вызванной любым из серотипов хантавирусов, является частое повреждение почек, что нашло отражение в самом названии заболевания [Бондаренко, 2007; Морозов и соавт., 2003; Иванис, 2004; Юдинцева, 2009; Krüger et al., 2001; Kim et al., 2004; Lee, 1999].

В настоящее время не существует адекватной лабораторной модели инфекции, что существенно затрудняет изучение закономерностей развития патогенеза при ГЛПС. В связи с этим механизмы вовлечения почек в патологический процесс при данном заболевании все еще остаются не выясненными. Известно, что появление противовирусных антител приводит к формированию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), повышенный уровень которых в сыворотке крови больных регистрируется в течение всего заболевания [Рощупкин, 1990; Морозов, 1993; Иванис, 2004; Максема, 2006; Penttinen et al., 1981]. Ряд исследователей, проводивших оценку значения ЦИК при хантавирусной инфекции, предполагают, что они могут вносить свой вклад в повреждение почек при ГЛПС [Рощупкин, 1990; Penttinen et al., 1981; Lahdevirta, 1982]. Другие авторы [Иванис, 2004, Максёма и соавт., 2006] напротив, считают, что образование ЦИК при ГЛПС является защитным механизмом, способствующим выведению возбудителя из организма.

Учитывая неясность причин формирования почечной патологии при ГЛПС, нами была предпринята попытка изучения роли гуморальных факторов иммунитета в повреждении почек при данном заболевании.

Цель исследования - оценить роль иммунных комплексов в поражении почек при ГЛПС.

Задачи исследования

1. Выявить взаимосвязь тяжести течения, клинических проявлений и уровней специфических антител у больных с ГЛПС.

2. Определить концентрации ^М, ^А, СЗ- и С4-компонентов комплемента в сыворотке крови в динамике развития ГЛПС. Установить размеры циркулирующих иммунных комплексов и содержание в них иммуноглобулинов различных изотипов у больных в разные периоды заболевания.

3. Установить взаимосвязь клинических проявлений ГЛПС с показателями гуморального иммунитета с позиций проявления гиперчувствительности III типа.

Научная новизна работы.

Впервые на основе корреляционного анализа охарактеризованы факторы, определяющие тяжесть течения инфекционного процесса при ГЛПС. Доказано, что тяжесть заболевания, проявления воспалительной реакции, клинические и лабораторные показатели, отражающие степень нарушения функции почек, непосредственно связаны с уровнем специфических антител.

Впервые в сыворотках крови больных ГЛПС определены ЦИК, дифференцированные по размеру и содержанию в них изотипов иммуноглобулинов. Установлено, что у пациентов с хантавирусной инфекцией диаметр и объем ИК достоверно больше аналогичных значений в группе здоровых лиц (Р<0,05). Показано, что у больных уровни 1§М-, и ^А-содержащих ЦИК различных размеров

значительно превышают соответствующие показатели здоровых людей (Р<0,001). При этом, несмотря на повышенное содержание в сыворотках крови пациентов иммунных комплексов, существенной активации системы комплемента при ГЛПС не происходит.

Выявлена взаимосвязь уровней ^М-, и ^А-содержащих ЦИК с тяжестью заболевания, титрами специфических антител, а также с клиническими и лабораторными проявлениями острой почечной недостаточности (ОПН).

Показано, что основная роль в развитии почечных повреждений принадлежит ^А-ЦИК. Подтверждением этому являются установленные сильные корреляционные связи между содержанием иммуноглобулинов класса А в составе ЦИК и

концентрациями мочевины, креатинина в сыворотке крови, протеинурией и относительной плотностью мочи.

Практическая значимость работы. В настоящей работе дана клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика ГЛПС в эндемичном регионе. Выявлен характер ее течения, позволяющий улучшить диагностику в разные периоды заболевания. Представлена взаимосвязь тяжести инфекции с уровнем специфических антител и клинико-лабораторными критериями функционального поражения почек, что может быть использовано для прогнозирования течения ГЛПС.

Установлено, что широко применяемый в диагностике гиперчувствительности III типа метод определения ЦИК сыворотки крови на основе измерения концентрации белка в ПЭГ-преципитатах не информативен при оценке нарушений функции почек у больных хантавирусной инфекцией.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты клинико-лабораторной диагностики ГЛПС внедрены в практику врачей-инфекционистов ГБУЗ ПК «Пермская краевая клиническая инфекционная больница». Материалы работы используются в учебном процессе на кафедре инфекционных заболеваний и кафедре иммунологии ГБОУ ВПО «Пермской государственной медицинской академии имени академика Е. А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации».

Личное участие автора в получении результатов. Автором лично проведено клинико-лабораторное обследование 338 больных с подтвержденным диагнозом ГЛПС, поступивших в ГУЗ «ККИБ» г. Перми в 2008-2009 гг., выполнены основные иммунологические исследования совместно с к.м.н. Королевской Л.Б. в лаборатории экологической иммунологии Учреждения Российской академии наук «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» г. Пермь. Диссертантом сформирована база данных, выполнена статистическая обработка материала с обобщением полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Клиническое течение ГЛПС характеризуется полиморфизмом поражения органов и систем, с развитием ведущей патологии со стороны почек.

2. Тяжесть заболевания непосредственно связана с уровнем специфических антител, а также с клиническими и лабораторными показателями, отражающими степень

нарушения функции почек, что предполагает наличие в патогенезе ГЛПС иммунопатологического процесса.

3. У больных ГЛПС общий уровень ЦИК, их средние размеры, а также концентрации входящих в их состав иммуноглобулинов достоверно превышают соответствующие значения здоровых людей.

4. При ГЛПС отсутствует существенная активация системы комплемента. Основная роль в развитии почечной патологии может принадлежать 1^*А-содержащим ЦИК.

Апробация и публикация материалов работы. Материалы диссертации представлены на научной сессии молодых ученых ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития России (Пермь, 2011), 9-й конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011), межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей. Актуальные вопросы диагностики и профилактики» (Казань, 2011), IV Ежегодном всероссийском научном конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012).

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из которых 4 - в центральных изданиях, рекомендуемых ВАК.

Объем н структура диссертации.

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», двух глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 85 отечественных и 142 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 16 рисунками и 3 клиническими примерами.

Материалы и методы исследования

С целью характеристики эпидемиологической ситуации по ГЛПС в Пермском крае выполнен ретроспективный анализ заболеваемости этой инфекцией по данным официальной статистики ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» за период 1995-2009 гг.

Основой диссертационной работы явились результаты клинического наблюдения, лабораторного и инструментального обследования 338 человек с подтвержденным в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) диагнозом ГЛПС, поступивших на лечение в ГУЗ «Краевая клиническая инфекционная больница» г. Перми в 2008-2009 гг.

Все обследованные нами пациенты были распределены на группы по полу, возрасту и степени тяжести заболевания. Среди больных преобладали мужчины - 243 (71,8%), женщин было - 95 (28,2%). Возраст наблюдавшихся лиц колебался от 17 до 75 лет. Большинство составляли люди трудоспособного возраста - от 20 до 60 лет (271 человек - 80,4%). Тяжелая форма заболевания выявлена у 24 (7,2%) больных, среднетяжелая - у 285 (84,3%), легкая - у 29 (8,5%).

Клиническое обследование включало получение анамнестических данных и оценку объективного статуса.

Проводились клинические (общие анализы крови и мочи, анализ мочи по Нечипоренко, анализ мочи по Зимницкому), биохимические, серологические методы исследования.

Биохимические исследования (определение концентраций в сыворотке крови мочевины и креатинина, уровней активности трансаминаз (АЛТ и ACT), общего и прямого билирубина) выполняли на биохимическом анализаторе RALC/ima МС-15 (Испания) по общепринятым методикам.

Выявление специфических антител осуществлялось в РНИФ с культуральным, поливалентным диагностикумом геморрагической лихорадки с почечным синдромом ФГУП «ПИПВЭ им. М. П. Чумакова», согласно прилагаемой инструкции.

В 43 сыворотках крови, полученных от 28 больных ГЛПС (14 из них были взяты в разгар заболевания, 19 - в период полиурии) и 10 здоровых добровольцев было исследовано общее содержание иммуноглобулинов классов М, G и А, концентрации СЗ- и С4-компонентов комплемента, выделены циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), определены их размеры. В составе ИК исследовано количественное содержание протеина и иммуноглобулинов классов М, G и А.

Содержание белка в преципитатах, осажденных в 3% и 4% ПЭГ, определяли фотометрическим методом (Х=280 нм).

Концентрации IgM, IgG и IgA в ЦИК и в сыворотке крови исследовали методом иммунотурбидиметрии с наборами для количественного определения иммуноглобулинов классов М, G, А (Chronolab, Швейцария), согласно прилагаемым инструкциям.

Содержание СЗ- и С4-компонентов комплемента в крови устанавливали турбидиметрическим методом с помощью коммерческих наборов для

количественного определения СЗ- и С4-компонентов комплемента (Human, Германия).

Для калибрования использовали аттестованную нормальную сыворотку Human Serados (Германия) с известными значениями содержания IgM, IgG, IgA, СЗ-, C4-компонентов комплемента.

Выделение иммунных комплексов из сыворотки крови проводили методом преципитации в полиэтиленгликоле-6000 (ПЭГ).

Для оценки размеров иммунных агрегатов применяли спектротурбидиметрический анализ и осаждение белковых структур в различных концентрациях ПЭГ [Кленин и соавт., 1979; Королевская и соавт., 2010]. Концентрацию Ig в преципитате, полученном при 4% ПЭГ, оценивали как общий пул Ig-содержащих ЦИК; при 3% ПЭГ - как высокомолекулярный. Разницу показателей относили к низкомолекулярному пулу ЦИК.

Достоверность различий оценивали на основе t-критерия Стьюдента. В ситуациях, когда выборки не подчинялись закону нормального распределения, расчеты выполняли с логарифмированными величинами. Оценку связей проводили путем корреляционного анализа (R-коэффициент Спирмена).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эпидемиологическая ситуация по геморрагической лихорадке с почечным синдромом в Пермском крае

Пермский край является активным эндемичным очагом ГЛПС. Ее удельный вес в различные годы составляет от 20,1% до 45,9% всех регистрируемых природно-очаговых инфекций [Воробьева и соавт., 2005; Девятков и соавт., 2007; Малкова и соавт., 2008]. С 1995 года показатели заболеваемости ГЛПС в нашем регионе стабильно превышают аналогичные по Российской Федерации (рис. 1). При этом наиболее высокие уровни зарегистрированы в 2004 и 2008 гг. (31,2 и 16,6 на 100 тысяч населения, соответственно). Необходимо отметить, что заболевание регистрируется во всех ландшафтно-климатических зонах Пермского края. Однако территорией риска является подзона хвойно-широколиственных лесов, где заболеваемость значительно выше краевой (50,68 на 100 тыс. населения). В других климатических зонах региона показатель средней многолетней заболеваемости колеблется от 0,15 до 4,58. Исследования органов грызунов на наличие антигена

вируса ГЛПС, поведенное в нашем регионе с применением иммуноферментной тест-системы «Хантагност» показало, что процент

1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009

Рис. 1. Динамика показателей заболеваемости геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в Российской Федерации и в Пермском крае за 1995-2009 гг.

положительных находок составляет от 1,6 до 26,8. При этом наиболее часто вирус обнаруживался у рыжей полевки. Ранее была выявлена прямая зависимость между показателем заболеваемости ГЛПС с одной стороны, и относительной численностью рыжей полевки (коэффициент корреляции 0,76; Р<0,05) и ее зараженности хантавирусом (11=0,58; Р<0,05) - с другой [Девятков и соавт., 2007; Малкова и соавт., 2008].

Характеристика клинического течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Пермском крае

Результаты проведенного нами клинико-лабораторного обследования 338 пациентов с подтвержденным диагнозом ГЛПС свидетельствуют о преобладании среднетяжелых форм инфекции (84,3%) с благоприятными исходами и низкой летальностью (0,6%).

Начальный или лихорадочный период заболевания, средняя длительность которого составила 3,0±1,3 дня, у подавляющего числа больных (92,6%) характеризовался острым началом, которое сопровождалось повышением

температуры до 38,0-40,5°. В эту фазу ГЛПС преобладали проявления общетоксического синдрома Слабость зафиксирована у 73,1% больных, головная боль - у 57,9%, миапгии и артралгии - у 23,9%. Расстройство зрения зарегистрировано у 66 (19,5%) пациентов. Легкие катаральные явления со стороны верхних дыхательных путей наблюдались у 1/5 обследованных, гиперемия лица и шеи, инъекция сосудов склер - у 1/3. Увеличение размеров печени зарегистрированное у 157 (46,4%) пациентов, сохранялось в дальнейшем в разгар заболевания, сопровождаясь в 51,2% случаев повышением активности печеночных трансаминаз.

В олигурическом периоде ГЛПС ведущим проявлением было поражение почек, которое присутствовало у всех больных независимо от степени тяжести инфекции. Наличие изогипостенурии отмечалось у всех больных, протеинурия □ у 55,1% (максимальный уровень белка в моче составил 8,2 г/л), гематурия □ у 11,5%, умеренная лейкоцитурия - у 55,1%. Развитие ОПН отмечено у пациентов с тяжелыми формами инфекции, а также в ряде случаев при среднетяжелом течении ГЛПС. Оли гурия и анурия наблюдались у 25,7% и 5,9% больных, соответственно. Повышенное содержание мочевины в сыворотке крови выявлено у 26,3% человек, креатинина - у 49,7%. Реже встречались поражение органов дыхания (18,0%) и проявления геморрагического синдрома (5,4%).

Период полиурии характеризовался улучшением общего самочувствия больных и увеличением объема количества выделяемой мочи. При этом суточный диурез колебался от 2,0 до 6,0 л, составляя в среднем 3,1±0,14 л. В эту фазу заболевания пациентов беспокоили длительно сохраняющиеся слабость и сухость во рту. Характерным признаком - для 100% обследованных нами пациентов - явилась изогипостенурия (относительная плотность мочи 1,001-1,010).

Взаимосвязь между отдельными клиническими и лабораторным« показателями при геморрагической лихорадке с почечным синдромом

Результаты проведенного нами корреляционного анализа свидетельствуют о том, что тяжесть ГЛПС непосредственно связана с продолжительностью лихорадки (Р<0,05 в разгар заболевания и в период полиурии). В разгар инфекции была установлена прямая связь средней силы между тяжестью заболевания и выраженностью проявлений геморрагического синдрома (11=0,450; Р<0,05).

Увеличение размеров печени также было прямо пропорционально тяжести инфекционного процесса (R=0,793 и 0,615 в разгар заболевания и в период полиурии, соответственно; Р<0,001 в обоих случаях). В обе фазы ГЛПС выявлена зависимость между тяжестью инфекции и величиной СОЭ (значения R составили: 0,433 и 0,435, Р<0,05 в обоих случаях).

Кроме того, нами была установлена взаимосвязь тяжести заболевания с клиническими и лабораторными показателями, отражающими степень нарушения функции почек. Так, в разгар ГЛПС тяжесть течения инфекционного процесса прямо коррелировала с уровнями мочевины и креатинина в сыворотке крови, величиной протеинурии, а также выраженностью и длительностью олигоанурии. При этом значения R составили, соответственно: 0,574, 0,659, 0,692, 0,585 и 0,573 (R<0,05 для всех показателей). В периоде полиурии данные зависимости не сохранялись. В обе фазы инфекции тяжесть заболевания была обратно пропорциональна относительной плотности мочи (Р<0,001 в обоих случаях).

Важно отметить что, тяжесть течения инфекционного процесса оказалась прямо связана с уровнем противовирусных антител (R в разгар заболевания и в период полиурии составил: 0,749 и 0,821, соответственно; Р«0,001 в обе фазы инфекции). При этом в разгар заболевания титры специфических антител тесно коррелировали и с лабораторными показателями (содержание мочевины и креатинина в сыворотке крови, величина протеинурии, относительная плотность мочи), отражающими степень повреждения почек (R составил, соответственно: 0,449; 0,540; 0,529; -0,739; Р не более 0,01 для всех связей). Сильная обратная зависимость между уровнем антивирусных антител, с одной стороны, и относительной плотностью мочи - с другой, сохранялась и в фазе полиурии.

Известно, что антитела и формируемые ими иммунные агрегаты, играют важную роль при заболеваниях, обусловленных развитием гиперчувствительности III типа [Dixon et al., 1958; Germuth, 1953; Coombs and Gell, 1975; von Pirquet & Schick, 1905]. Кроме того, в ряде работ было продемонстрировано, что ИК могут вносить определенный вклад и в формирование почечной патологии [Benacerraf et al., I960; Waxman et al., 1986; Gonzalez & Waxman, 2000].

Выявленные нами тесные корреляционные связи между тяжестью течения инфекционного процесса, клинико-лабораторными показателями, отражающими

степень поражения почек, с одной стороны, и уровнем специфических антител, выявленных в РНИФ - с другой, предполагают возможным развитие иммунокомплексной патологии и при ГЛПС.

Детекция ЦИК с использованием стандартного метода определения концентраций белка в ПЭГ-преципитатах

Исследование ЦИК методом Б!§еоп е( а1. [1977] позволило установить следующее. В разгар заболевания у пациентов с ГЛПС концентрации белка в агрегатах, осажденных в 4% и 3% ПЭГ (общий пул ЦИК и ЦИК крупных размеров), оказались достоверно выше по сравнению с аналогичными показателями в группе здоровых добровольцев (табл. 1). Различий между количеством протеина в ЦИК небольших размеров (С4%-С3%) у больных и здоровых людей не обнаружено.

В периоде полиурии существенных изменений концентрации белка в ПЭГ-преципитатах, относительно аналогичных показателей периода разгара, не происходило. В тоже время содержание протеина в ЦИК, осажденных в 4% и 3% ПЭГ, оставалось достоверно повышенным в сравнении с соответствующими значениями в контрольной группе.

Какой-либо статистически значимой зависимости между содержанием общего протеина в ЦИК и показателями, отражающими функцию почек (концентрации в сыворотке крови мочевины, креатинина, величина протеинурии) мы не выявили.

Таблица 1

Содержание общего протеина в ПЭГ-преципитатах у здоровых люден и больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в разгар заболевания

Иммунные комплексы Содержание общего протеина в ПЭГ-преципигате (мг/л) Р

Здоровые люди (п=10) Больные ГЛПС (п=14)

Общий пул ЦИК (4% ПЭГ) Крупные ЦИК (3% ПЭГ) ЦИК малого размера (С4%-С3%) 838,63±97,43 354,25±43,41 484,38±71,01 1245,94±115,63 634,38±55,0 611,56±68,80 <0,05 «0,001 >0,05

На основании полученных результатов можно заключить, что у пациентов с ГЛПС имеет место повышенное, по сравнению со здоровыми людьми, образование ЦИК крупных размеров. На сегодняшний день известно, что ЦИК больших размеров

активно фиксируют комплемент и эффективно удаляются макрофагами, не откладываясь в тканях [Schifferli & Taylor; 1989]. Учитывая данный факт, а также опираясь на отсутствие корреляции между содержанием протеина в ПЭГ-преципитатах и лабораторными показателями, отражающими функцию почек, можно было бы отвергнуть патологическую роль ЦИК в патогенезе повреждения почек при ГЛПС. Однако необходимо подчеркнуть, что метод Digeon et al. [1977] основан на определении общего содержания белка в осажденных ПЭГ агрегатах без идентификации иммунного компонента в их составе. Последнее является необходимым условием для доказательства присутствия ЦИК в составе ПЭГ-преципитатов [WHO, 1977]. Следовательно, полученные при использовании данного метода детекции ЦИК, результаты не позволяют судить о наличии реакции гиперчувствительности III типа при ГЛПС.

Определение общего содержания иммуноглобулннов классов М, G, А в сыворотке крови здоровых людей и у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом

Учитывая выявленную взаимосвязь уровней специфических антител с тяжестью течения заболевания и клинико-лабораторными показателями функционального состояния почек, а также с целью выполнения рекомендаций ВОЗ, в качестве иммунного компонента, присутствующего в составе ЦИК, нами были идентифицированы иммуноглобулины классов М, G и А. Вместе с тем необходимо было определить их общее содержание в сыворотке крови.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что концентрации сывороточных IgM и IgG в обе фазы заболевания у больных ГЛПС не отличались от соответствующих показателей в группе здоровых людей (Р>0,05 в обоих случаях) (рис.2а и 2Ь).

При этом нами было установлено, что в разгар инфекции концентрация сывороточного IgA у больных достоверно превышает аналогичные показатели контроля (3,58±0,37 и 2,40±0,26 г/л, соответственно; Р=0,01) (рис. 2с). В стадию полиурии отмечалось снижение содержания IgA до 2,76±0,28 г/л и их концентрация в крови уже не отличалась от контрольных значений (Р>0,05).

1дС

Рис. 2. Содержание иммуноглобулинов классов М, О, А в сыворотках крови здоровых людей и больных ГЛПС в дигамике заболевания

По оси абсцисс: а - содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови здоровых людей, б -содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови больных в период разгара ГЛПС, с — содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови больных ГЛПС в период полиурии; по оси ординат: содержание иммуноглобулинов (г/л); * - Р<0,05

Изучение размерных характеристик ПЭГ-преципитатов у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом

В своей работе мы провели оценку размеров преципитатов, сформированных в различных концентрациях ПЭГ у пациентов с ГЛПС и здоровых людей. Анализ результатов показал следующее (табл. 2).

У здоровых людей концентрации ЦИК в 3% ПЭГ оказались настолько низкими, что это не позволило определить их размер и сравнить с данными, полученными у

Таблица 2

Размерные характеристики агрегатов, сформированных в 4% концентрации ПЭГ у больных геморрагической лихорздкой с почечным синдромом

Группы Диаметр (нм) Объем (мкм3)

Здоровые люди,

контроль 637,6±22,27 0,14±0,01

(п=10)

Больные в период

разгара 788Д0±56,69 0,31±0,08

(п=14)

Р к контролю Р<0,05 Р=0,05

Больные в период

полиурии (п=19) 835,01±56,05 0,38±0,07

Р к контролю Р<0,05 Р<0,05

больных с ГЛПС. При использовании 4% ПЭГ содержание иммунных комплексов в преципитатах у лиц обеих групп оказалось достаточным для установления размерных параметров ИК. При этом средний диаметр и объем последних у больных оказались достоверно больше соответствующих показателей здоровых добровольцев. Размеры ИК у пациентов в разные фазы ГЛПС достоверно не отличались.

В разгар заболевания количество белка в иммунных агрегатах, осажденных в 4% ПЭГ, оказалось прямо пропорционально их диаметру и объему. Аналогичная связь, хотя и менее выраженная, сохранялась и в периоде полиурии.

Определение концентраций иммуноглобулинов различных классов в составе циркулирующих нммунных комплексов, дифференцированных по размеру у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом

Исследование ЦИК методом Королевской и соавт. [2010] позволило получить следующие данные. Установлено, что в разгар инфекции содержание ^М, ^О и 1§А в ИК у больных значительно превышает соответствующие показатели контроля (Р<0,001) (табл.3).

Таблица 3

Характеристики циркулирующих иммунных комплексов у больных геморрагической лихорадкой с почечным сиидромом в пфнод разгара

Показатель Концентрации иммуноглобулинов в иммунных комплексах (мг/л)

Общий пул ЦИК (4% ПЭГ) Крупные ЦИК (3% ПЭГ) ЦИК малого размера (С«-С3%)

Здоровые люди (п-10) Больные (п=14) Здоровые люди (п=10) Больные (п=14) Здоровые люди (п=10) Больные (п=14)

^М-ЦИК Р ^в-ЦИК Р Р 273,5±41,1 784,1 ±75,0 «0,001 110,5±10,2 237,7±17,0 «0,001 0,4±0,3 23,9±4,6 «0,001 65,0±13,9 311,9±59,9 <0,001 24,0±4,4 111,5±13,3 <0,001 0,1 ±0,1 6,2±0,9 «0,001 208,5±28,8 472,2±40,3 «0,001 86,5±8,8 126,2±11,8 =0,01 0,3±0,3 17,7±3,7 «0,001

Р - показатель достоверности; п - число наблюдений

Следует отметить, что наиболее значительно увеличивалась концентрация ^А в ЦИК. Его уровень в составе крупных комплексов был увеличен относительно

аналогичного параметра здоровых людей в 62 раза, а в комплексах небольших размеров - в 59 раз (Р«0,001).

В периоде полиурии концентрации ^М, и ^А в составе ЦИК различных размеров у пациентов с ГЛПС оставались достоверно повышенными относительно соответствующих показателей в группе контроля (Р<0,001).

Концентрации ^М, и Г§А в ЦИК различных размеров прямо

коррелировали с тяжестью течения ГЛПС (Р<0,001 во всех случаях). Помимо этого, нами выявлена связь между содержанием ^М, ^О и ^А в иммунных агрегатах и лабораторными показателями (концентрации мочевины и креатинина в сыворотке крови, величина протеинурии), отражающими степень поражения почек. В обе фазы ГЛПС количество ^М, и 1§А в ИК оказалось обратно пропорционально относительной плотности мочи (Р<0,001). В разгар заболевания были установлены прямые корреляционные связи между содержанием иммуноглобулинов всех трех классов в составе ЦИК и величиной протеинурии (Р<0,01 для всех показателей). Особенно следует отметить, что в фазе олигурии содержание ^А в ЦИК разных размеров тесно коррелировало с концентрациями мочевины и креатинина в сыворотке крови (Р<0,001). Аналогичные связи, хотя и меньшей степени выраженности установлены и для высокомолекулярных ^й-содержащих иммунных агрегатов (Р<0,05). В периоде полиурии корреляций между указанными выше показателями не наблюдалось.

Необходимо подчеркнуть, что титр специфических антител, выявленных в РНИФ, оказался прямо связан с уровнями ^М-, ^О- и ^А-содержащих ЦИК различных размеров (Р<0,01 для всех связей). Следовательно, синтез противовирусных антител, их дальнейшее взаимодействие с вирусными антигенами с формированием ИК может являться патогенетическим механизмом развития гиперчувствительности III типа при ГЛПС.

Определение СЗ- и С4-компонентов комплемента в сыворотке крови здоровых людей и больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в динамике заболевания

Уровень СЗ-компонента комплемента в сыворотке крови здоровых людей составил 0,83±0,05 г/л, С4-компонента-0,18±0,1 г/л.

У больных в период разгара инфекции было обнаружено повышение содержания как СЗ- (1,06±0,05 г/л; Р<0,01), так и С4- (0,23±0,02 г/л; Р<0,05) компонентов комплемента (рис. 3), относительно соответствующих значений, полученных у здоровых добровольцев. В периоде полиурии концентрации СЗ- и С4-компонентов комплемента в сыворотке крови больных сохранялись повышенными относительно соответствующих показателей в группе контроля (Р<0,01).

2.0 ..........---------------------------

а

1,5--«----

«

1,0--е1----

£ 1 = ■

0,5---!—

* *

0,0 -,-,—

О 1 2

Рис. 3. Содержание СЗ- и С4-компонентов комплемента в сыворотке крови здоровых людей и больных ГЛПС в разгар заболевай™

По оси абсцисс: 1 — больные ГЛПС, 2 — здоровые люди; по оси ординат: содержание СЗ- и С4-компонентов комплемента (г/л).

а) Концентрация СЗ-компонента комппемента; ** - Р<0,01

б) Концентрация С4-компонента комплемента; * - Р<0,05

При этом различий в концентрациях СЗ- и С4-компонентов комплемента в динамике ГЛПС не обнаружено.

Опираясь на полученные нами данные можно заключить, что при ГЛПС, несмотря на повышенное образование ЦИК, явного потребления СЗ- и С4-компонентов комплемента не наблюдается. Следовательно, существенной активации системы комплемента при данном заболевании не происходит.

Таким образом, применение метода, основанного на количественном определении иммуноглобулинов различных классов в составе ЦИК, дифференцированных по размерам, позволило получить новые данные, которые значительно расширяют представления о роли гиперчувствительности III типа в развитие ГЛПС. Оказалось, что уже в период разгара болезни в ответ на хантавирус в кровотоке синтезируются антитела и формируются комплексы разных размеров, в

состав которых входят иммуноглобулины всех трех классов. При этом содержание 1?М, [дО и в ЦИК у больных было значительно выше, чем у здоровых людей. У пациентов с ГЛПС установлено многократное увеличение уровня 1дА-ЦИК, который прямо коррелировал с биохимическими показателями поражения почек. Кроме того установлено, что несмотря на повышенное образование ЦИК у больных не происходит существенного потребления, ни СЗ-, ни С4-компонентов комплемента. Все указанные выше данные могут свидетельствовать о вероятном иммунокомплексном поражении почек при ГЛПС.

На основании результатов, полученных в данной работе, роль ЦИК в общей схеме развития патологии почек при ГЛПС можно представить в следующем виде (рис. 4).

Легкие

Хантавирус

Поражение эпителия респираторного тракта (взаимодействие с СР55/ОАР)

Размножение вирусов, их миграция в регионарные лимфатические узлы

Поражение незрелых дендритных клеток (ДК) в респираторном тракте (взаимодействие с Рз-интегринами)

Трансформация незрелых ДК в антиген-презентриующие

клетки, их миграция в регионарные лимфоузлы

Миграция вирусов в кровоток через лимфатическую систему

Презентация антигена в комплексе с МНС наивным Т-лимфоцитам

Размножение клонов антивирусных С08* Т-лимфоцитов

Поражение

сосудистого

эндотелия

*

Миграция С08* Т-лимфоцитов в кровоток

Нарушение проницаемости, проникновение иммунных компонентов

Повышение уровня про воспалительных цитокинов в крови, плазморрея, развитие системного воспаления

Развитие почечной недостаточности

Рис. 4 Схема иммунопатогенеза геморрагической лихорадки с почечным синдромом

20

ВЫВОДЫ

1. Течение ГЛПС характеризуется полиморфизмом клинической симптоматики. Ведущими проявлениями заболевания являются: поражение почек, зарегистрированное у 100% больных, увеличение размеров печени, сопровождаемое повышением активности трансаминаз (51,2%), расстройство зрения (19,5%), поражение органов дыхания (18,0%). Тяжесть заболевания непосредственно коррелирует со степенью нарушения функции почек.

2. Уровень противовирусных антител у больных определяет тяжесть ГЛПС и функциональное состояние почек: чем больше концентрация специфических антител в крови, тем тяжелее протекает заболевание и выше степень нарушения функции почек.

3. У больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом наблюдается повышение концентраций иммуноглобулина А, СЗ- и С4-компонентов комплемента в сыворотке крови. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов М и в не превышает соответствующих значений здоровых лиц.

4. При хантавирусной инфекции средние размеры ЦИК у больных больше аналогичных показателей здоровых людей. Концентрации ^М-, ^О-, Г§А-содержащих иммунных комплексов у пациентов с ГЛПС достоверно превышают соответствующие значения в группе здоровых лиц. При этом содержание иммуноглобулина А в иммунных агрегатах увеличено в десятки раз.

5. Данные корреляционного анализа демонстрируют выраженную связь между концентрациями иммуноглобулинов в иммунных комплексах, присутствующих в крови больных, и показателями, отражающими нарушение функции почек. Развитие почечной дисфункции преимущественно связано с повышением ^А-ЦИК. Полученные результаты свидетельствуют о развитии реакции гиперчувствительности III типа при геморрагической лихорадке с почечным синдромом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Охарактеризованные на основе корреляционного анализа факторы, определяющие тяжесть ГЛПС могут быть использованы врачами-инфекционистами в качестве критериев для прогнозирования течения заболевания.

2. Полученные в результате проведенного исследования данные о развитии реакции гиперчувствительности III типа при ГЛПС могут использоваться для разработки адекватной патогенетической терапии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Воробьева H.H., Мышкина O.K., Рысинская Т.К., Шмакова М.И., Иванова М.В. Клиника геморрагической лихорадки с почечным синдромом у жителей г. Перми И Материалы научной сессии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия МЗ РФ». - Пермь, 2002 - С. 6.

2. Иванова М.В., Воробьева H.H., Шмагель К.В., Голикова Е.В. Клиническая характеристика течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Пермском крае // Пермский медицинский журнал. - 2010. -Том XXVII, №6. - С. 5-11.

3. Иванова М.В., Воробьева H.H., Шмагель К.В., Малкова A.M., Костарев A.A. Клинико-эпндемиологнческие особенности течения геморагической лихорадки с почечным синдромом в Пермском крае II Журнал инфектологни. - 2011.-Том 3,№3.-С. 66-73.

4. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Иванова М.В., Воробьева H.H. Особенности гуморального иммунного ответа при геморрагической лихорадке с почечным синдромом. // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -№2/1, (35).-С. 151-152.

5. Иванова М.В., Воробьева H.H., Шмагель К.В. Трудности в диагностике геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Пермском крае // Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 28-30 марта 2011. - Инфекционные болезни. - Том 9 (приложение №1). - С. 144.

6. Иванова М.В., Шмагель К.В., Воробьева H.H. Возможная роль иммунных комплексов в повреждении почек при геморрагической лихорадке с почечным синдромом. // Тезисы докладов I Съезда терапевтов Приволжского федерального округа России — Пермь, 20-21 октября 2011. - С. 50.

7. Иванова М.В., Шмагель К.В., Воробьева H.H., Королевская Л.Б. Патогенетическое значение отдельных факторов гуморального иммунитета в повреждении почек при геморрагической лихорадке с почечным синдромом. // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 26-28 марта 2012. - Инфекционные болезни. - Том 10 (приложение №1). - С. 159.

8. Иванова М.В., Шмагель К.В., Воробьева H.H., Королевская Л.Б. Иммунопатогенез геморрагической лихорадки с почечным синдромом // российский иммунологический журнал. - Том 6(15), №2. - 2012 - С. 107118.

9. Королевская Л.Б., Иванова М.В., Шмагель К.В., Воробьева H.H. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: возможная роль гуморальных факторов иммунитета в поражении почек // Инфекционные болезни. - Том 10, №2. - 2012 - С. 33-38.

Подписано в печать 29.01.2013 г. Формат 60*84/16 Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ 19

Типография Пермского государственного национального исследовательского университета. 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15