Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии при анализе золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях для экспертных целей

ДИССЕРТАЦИЯ
Метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии при анализе золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях для экспертных целей - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии при анализе золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях для экспертных целей - тема автореферата по медицине
Крылова, Елена Анатольевна Пермь 2013 г.
Ученая степень
кандидата фармацевтических наук
ВАК РФ
14.04.02
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии при анализе золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях для экспертных целей

КРЫЛОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

МЕТОД ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ - МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ПРИ АНАЛИЗЕ ЗОЛПИДЕМА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Д ЛЯ ЭКСПЕРТНЫХ ЦЕЛЕЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

17 ОКТ 2013

Пермь-2013

005535106

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

Хомов Юрий Александрович профессор ГБОУ ВПО «Пермская

государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

Белоногова Валентина Дмитриевна профессор ГБОУ ВПО «Пермская

государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Гейн Людмила Федоровна доктор фармацевтических наук, доцент

ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «12» ноября 2013 г в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА МЗ РФ по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru <<££» октября 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА МЗ РФ http://www.pfa.rii октября 2013 г.

Автореферат разослан «^гоктября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного , „

совета, кандидат фармацевтических наук ¿/ Ц,— н. В. Слепова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Объектом исследований настоящей работы является снотворный препарат, золпидем (производное имидазопиридина), обладающий короткой продолжительностью действия и быстрым наступлением фармакологических эффектов. Золпидем облегчает засыпание перед сном, а также среди ночи у больных с интрасомническими расстройствами. Токсикологическое значение золпидем имеет, во-первых, в связи с широким применением, во-вторых, из-за доказанной способности вызывать явления привыкания и лекарственной зависимости (психической и физической) при длительном приеме (более 4 недель). При этом формируются благоприятные условия для немедицинского применения золпидема. Данный препарат не является наркотическим средством, но нередки случаи парентерального введения золпидема с целью получения эйфории (Вепуатша А., 2007). В-третьих, способность золпидема снижать скорость психической и мышечной реакции делает несовместимым прием этого лекарства с управлением всех видов транспортных средств и работой с приборами и автоматами, требующих точности движений. Препарат не раз применялся для осуществления преступных действий против личности, при этом использовались такие его свойства как потенцированное фармакологическое действие при совместном приеме с алкоголем, а также быстрое наступление седации (Ьеуше В., 1999; МагауеНав С., 2009; СЬёге М., 2010). В РФ золпидем является контролируемым лекарственным средством в целях уголовного законодательства: он внесен в Список сильнодействующих веществ, согласно Постановлению Правительства №964 от 29 декабря 2007 года.

Вследствие способности золпидема интенсивно метаболизироваться в организме человека, его обнаружение в моче может быть затруднительно, т.к. лишь 0,2-1,3 % нативного вещества выводится с мочой в неизменном виде (Нетре1 С., 1996). Поэтому идентификация его метаболитов в моче может стать необходимым условием для получения корректных результатов ХТА.

Для изучения метаболитов золпидема в настоящей работе применялся метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ/МС). Он обладает высокой чувствительностью по отношению к описываемым соединениям, обеспечивает их селективное детектирование и снабжает структурной информацией. На сегодняшний день газовыми хроматографами с масс-селективным детектированием оснащены многие судебно-химические и токсико-химические лаборатории на территории РФ, и они широко применяются для рутинных исследований. Поэтому получение новых масс-спектральных данных о метаболитах золпидема, разработка и внедрение новых методик анализа с применением метода ГХ/МС является весьма актуальной задачей.

Целью настоящей работы явилось изучение биотрансформации золпидема в организме человека, разработка методики совместного изолирования золпидема и его метаболитов из биологических жидкостей при оптимальных условиях и последующее количественное определение золпидема в цельной крови и моче.

Реализация цели осуществлялась путем решения следующих задач:

1) Исследовать особенности метаболических превращений золпидема в организме человека путем идентификации его метаболитов с получением их различных производных, изучением масс-фрагментации, обобщением и описанием полученных газохроматографических и масс-сцентральных характеристик.

2) Определить оптимальные условия экстракции золпидема и его метаболитов из мочи при совместном присутствии.

3) Разработать методики количественного определения золпидема в цельной крови и моче методом ГХ/МС.

4) Составить по совокупности данных схему ХТА золпидема, адаптированную к практической деятельности судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий как для скрининговых исследований на лекарственные и наркотические вещества, так и в случаях направленного анализа на золпидем.

Научная новизна работы:

- с помощью метода ГХ/МС идентифицированы метаболиты золпидема, получены и описаны газохроматографические и масс-спектральные характеристики различных их дериватов;

- с помощью метода математического планирования эксперимента (МПЭ) определены оптимальные условия для совместной экстракции золпидема и его метаболитов из мочи методом ТФЭ;

- доказана необходимость проведения ферментативного гидролиза мочи для последующего обнаружения метаболитов золпидема;

- разработаны ГХ/МС методики количественного определения золпидема в крови и моче, дана оценка возможности использования методик анализа в лабораторной практике путем их валидации.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Разработанные методики пробоподготовки крови и мочи для качественного и количественного определения золпидема и его метаболитов внедрены и используются в практике судебно-химического отделения ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (акты внедрения от 24 декабря 2008 г.; от 27 января 2011 г.; от 24 февраля 2011 г.); в химико-токсикологической лаборатории ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» (акт внедрения от 27 января 2011 г.; от 07.05.2013 г.); в судебно-химическом отделении ГУ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Республика Марий Эл» (акт внедрения от 10 ноября 2011 г.). Отдельные фрагменты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры токсикологической химии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ» (акт внедрения от 27 января 2009 г.) и кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ» (акт внедрения от 12 апреля 2012 г.). По материалам исследования подготовлено информационное письмо «Применение методов ТФЭ и ГХ/МС для химико-токсикологического

определения золпидема, его метаболитов и продукта гидролиза в биологических жидкостях». (19 е.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417).

Личное участие автора. Для получения результатов, изложенных в диссертации, автор лично провел комплекс лабораторных исследований крови и мочи, включающий пробоподготовку образцов методом ТФЭ, проведение реакций дериватизации и выполнение ГХ/МС анализа с применением необходимого оборудования. Автором проведена разработка и валидация методик количественного определения золпидема в крови и моче, а также интерпретация всех полученных результатов исследований. Автором лично выполнено написание публикаций по данной теме и написание всех глав диссертации.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют формуле диссертации 14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (Пермь, 2007); на Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009); Российской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов животного происхождения» (Пермь, 2010); межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы в Кировской области «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» (Киров, 2010); XII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии, качество и безопасность лекарственных средств» (Москва, 2011); III Международной научно-практической конференции «Аналитическая токсикология, перспективы и современные тенденции развития» (Москва, 2012); Российской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Современные проблемы фармацевтической науки», посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2012); I Международной научно-практической конференции «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности» (Пермь, 2012); отчетной научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Пермь, 2013); II Международной научно-практической конференции «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности» (Пермь, 2013).

б

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 15 статей, из которых 8 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 глав), общих выводов, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, включает 32 таблицы и 39 рисунков и имеет приложение в объеме 52 страниц. Список использованной литературы содержит 174 наименования, из них 51 отечественных и 123 - зарубежных авторов. В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований: акты внедрения, информационное письмо, таблица, содержащая обзор методов и методик исследования биологических объектов на предмет обнаружения и/или количественного определения золпидема и его метаболитов, а также таблицы, включающие блок информации по полученным методом ГХ/МС количественным данным, которые применялись на этапе математического планирования эксперимента (МПЭ).

На защиту диссертации выносятся следующие положения:

1) Результаты теоретических и экспериментальных исследований по установлению оптимальных условий экстракции золпидема совместно с его метаболитами из биологических жидкостей.

2) Данные о способах дериватизации метаболитов золпидема для их идентификации методом ГХ/МС.

3) Полученные и систематизированные данные о газохроматографических и масс-спектральных характеристиках метаболитов золпидема.

4) Схемы метаболизма золпидема и масс-фрагментации его метаболитов.

5) Методики ГХ/МС количественного определения золпидема в крови и моче.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В обзоре представлена информация о физико-химических свойствах золпидема, его фармакодинамике и фармакокинетике, подробно описано его немедицинское применение. Обобщены данные о метаболитах золпидема и их фармакинетических параметрах. Описаны применяемые в ХТА способы изолирования и физико-химические методы для идентификации и количественного определения золпидема и его метаболитов в биологических объектах.

Глава 2. Объекты и методы исследования

В эксперименте были использованы объекты исследований: ^ Золпидема тартрат (порошок-субстанция, Испания, НД 42-13447-05). ^ Модельные смеси биологических жидкостей - моча и цельная кровь с различной концентрацией золпидема. Для приготовления модельных образцов использовались кровь и моча здоровых доноров, не употреблявших в течение месяца лекарственных и наркотических средств. ^ Биологические объекты - а) моча, полученная от добровольцев после пероралыюго приема разовой терапевтической дозы золпидема тартрата;

б) образец реальной крови, который был направлен на исследование в XTJI ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» от лица после приема токсической дозы золпидема тартрата. Оборудование. Для ГХ/МС использовали: а) газовый хроматограф Agilent 6850, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой HP-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Масс-селективный детектор Agilent 5973N (Agilent, США); б) газовый хроматограф Agilent 7820, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой HP-SMS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Масс-селективный детектор Agilent 5975 (Agilent, США). Для ТФЭ применяли: систему с вакуумной камерой (манифолд) на 12 позиций (Supelico), насос низкого вакуума (AIR CADET, США); картриджи: а) SPEC МРЗ - 30 мг (Varian, Inc); б) AccuBond II EVIDEX- 200 мг-3 мл (Agilent, США); в) Sampli Q Evidex - 200 мг-3 мл (Agilent, США). Для выполнения реакции гидролиза и процедур дериватизации использовали термоблок ПЭ-4030 (ОАО «Экрос», Россия) и микроволновую печь Rolsen MS 1770 SA (Россия). При выполнении работы также применялись: микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия), полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4-40, 40-200, 200-1000 мкл и 1-5 мл.

Глава 3. Изучение метаболизма золпидема Золпидем подвергается в организме человека активному метаболизму с образованием гидрокси- и карбоксиметаболитов, обладающих полярными функциональными группами (-ОН, -СООН), придающими им свойства гидрофильных труднолетучих соединений, что затрудняет их выделение из мочи жидкость-жидкостной экстракцией и дальнейшее обнаружение методом газовой хроматографии. Поэтому для извлечения золпидема совместно с метаболитами использовался метод ТФЭ (Таблица 1), а для их успешной идентификации применялась дериватизация, которая позволила получить летучие, термостабильные производные со специфической масс-фрагментацией.

Таблица 1 - Протокол ТФЭ золпидема и его метаболитов из образцов мочи

Этап Процедуры

Подготовка образца (ферментативный гидролиз) К 2 мл мочи прибавляли 0,5 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН 6,0), ОД мл /?-глюкуронидазы (10 140 ЕД), перемешивали, герметично укупоривали и экспонировали в течение 2 часов при 45 °С. Полученный гидролизат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут. Центрифугат отделяли от осадка, прибавляли 2,5 мл 0,1 М буфера ацетатного (рН 4,6) и подвергали ТФЭ

Кондиционирование сорбента 2 мл этанола; 2 мл 0,1М буфера ацетатного рН 4,6

Загрузка образца со скоростью 1 мл/мин

Промывка 1 мл 0,1М буфера ацетатного рН 4,6; 1 мл 0,1М кислоты уксусной; 1 мл 10% раствора этанола в воде

Элюирование 2 х 2 мл элюента гексан-этилацетат (3:1) (элюат I); 2 х 2 мл дихлорметан-изопропанол-25% р-р аммиака (4:1:0,1) (элюат II)

s

Для определения гидроксипроизводных золпидема использовали ацилирование, карбоксипроизводные алкилировали, либо этерифицировали. Для обоих типов групп получали триметилсилильные эфиры.

Изучение структуры метаболитов золпидема было выполнено с помощью метода ГХ/МС, ионизация под действием электронного удара 70 эВ. Газохроматографические данные получены и описаны при следующих условиях разделения: температура инжектора и интерфейса 250 и 280°С, температура колонки: начальная 70°С в течение 2 мин и прогрев до 280°С со скоростью программирования 20 град/мин; выдержка при температуре 280°С в течение 12 минут, затем прогрев до 300°С со скоростью программирования 20 град/мин; выдержка при конечной температуре 5 мин. Ввод без деления потока газа-носителя. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования масс 35-700 а.е. В результате проведенных исследований были идентифицированы гидрокси- и карбоксиметаболиты золпидема в виде их различных производных (Таблица 2). На рисунке 1 представлен масс-спектр нативного золпидема.

i 23&l

• . ■ I : I > | 'Г" | | II ¿(V/Л

j M.ln ...I. - nil и I. iii:... LiJIii. '......... .iii..:, 11 и ,.... ..J ...i.. ; ..... J,. . Д.: . :.....J ... ,. J ...

" 1111111111 1111 I 1111 1111 M 11M и i M N p 11111 M I p 111 j 11 и i M 111M 1111 M I j M 1111 I M j I M I p N 111 M 111 M 11M M i M 111 M 111 и и 111 I 1111 1111 I 1111 111

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

m/z

Рисунок 1 - Масс-спектр золпидема

В результате проведенных исследований составлена обобщенная схема идентифицированных нами метаболитов золпидема с дополнениями, полученными из литературных источников (Klupsch F., 2006; Rohrig, Т.Р., 2010; Martínez-Ramírez, J.A.; 2012). Схема представлена на рисунке 2.

VI Vil

Рисунок 2 - Биотрансформация золпидема в организме человека (I - золпидем; II - продукт

деструкции; III - К-(гидроксиметил)-золпидем; IV - 4'-(гидроксиметил)-золпидем; V - 6-(гидроксиметил)-золпидем; VI - 4'-(карбокси)-золпидем; VII - 6-(карбокси)-золпидем; VIII -(гидрокси)-золпдием; IX - золпидем-Ы-оксид); X - 3'-(гидрокси)-золпидем

Таблица 2 - Газохроматографические и масс-спектральные характеристики производных гидрокси- и карбоксиметаболитов золпидема

R

_н,сх С".

Метаболит x lR, МИН Масс-спектр Характеристические ионы, m/z (интенсивность, %)

сн3с(оь 20,60 TS- во fi Ii 32 16 ' 81 -| 93- 14 141-, 233- 1 207-| 293-, 271-, 31B-, 365 293 (100); 233 (53); 294(19,7); 365(17,8); 271(19,7); 234(13,1); 219 (12,2); 92 (10)

IV: r,= -ch3 In' I I Л Uli iiü.iilLiiiiJt kill Ii U iL II. , ll ll.L Iii1 ll l.lliJ jLijjj

i'i'j (аа гоо 2zo ™.....ж.....-.....

r2=-ch2ox r3 = - "Sä 323 1

(CH3)3Si- 19,46 -7Г" Z тд- 24 73 108-| 135П 1 207-, 233-] в5Т I J| 293-| 3951 ,-339 323 (100); 324 (27,3); 73 (19,3); 233 (17,6); 395 (15,5); 234 (8,3); 249 (8); 154 (6,1); 293 (5,7); 396 (5,7); 219 (4,9); 92 (4,7); 380 (3,8)

60 ,оо lio 200 250 ЗОО

~ss— гвз-|

V: R,= -CH2OX r2=-ch3 r3 = - CH3C(0>- 19,41 1 234-1 .. ,T,i.."i .'"л —. . j. n 320-J 365-j I 293 (100); 294 (15,9); 365 (9,4); 234 (7,5); 72 (5,5); 233 (5,4); 251 (5,1); 249 (4,5); 219 (3,9)

(CH3)3Si- 18,39 t "SГ- - (é - 233-1 73-] 210-t I , „ .¿.ГтЛ'!Л i . 1 1 323 j-337 385 . I. 323 (100); 324(27,1); 73 (10,8); 395 (9,4); 325 (7); 234 (5,9); 219 (5,2); 233 (4,9); 72 (3,1); 218 (3,1); 396 (2,8)

eó too ISO aóo zdo ario 400

251 ^

VIII: ri= -CH3 r2=-ch3 R3 = -OH сн3с(оь 19,87 l ТГ 1-й 24 72 T 235-, Г 44 I 127-, 167-, 169-, I , I .. I.....i i i .!, „1. . i. -1 1. , .1 I , 293-| 313-| I. .. 365-| , I 251 (100); 293 (19,2); 252(16,8); 365(12); 235(11,2); 72(10,4); 250(5,6); 249(4,8); 236 (4); 313 (2); 366 (3)

40 во во loo i 20 140 liso 1 ¿O 200 220 240 ЗвО 3 00^=, ю эво

VIH:

Ri= -СНз R2=-CHJ R3 = -OH

(CH3)3Si-

18,93

CHjCHr

19,04

sai-, . ,

il M I il 1 I. I

'"eíj' "' "i¿¿.....' V¿¿>......i4ó......Yéó......V¿¿.....üo " 2¿Q..... ¿4ó.....3¿ó......z¿ó......üb 'äib '""aJ¿"'

323 (100); 324 (25,6); 73(11,2); 395(8,8); 325 (7,2); 307 (4); 72 (4); 251 (3,2); 321(3); 396 (3); 45 (2); 235 (2); 233 (1*308(2); 248 (1); 249 (1); 326 (1); 380(1)

279(100); 351 (26,4); 251(25,6); 280 (16); 301(11,2); 235(8); 72; 293

VI:

Ri= -CH3 R2=-COOX R3 = -

CH3-

20,00

2-1

-яг

Л

279 (100); 219 (29,1);

280 (21,5); 220 (15); 351 (13,1); 92 (4,7);

72(4,1); 65(4,1)

Tí" 397

CF3CF2CH2- 17,28 BÓ t -S3-SS— 210-, 397 (100); 219 (23,3); 398 (22); 220 (12,5); 469 (9,4); 72 (3,8); 92 (3,3)

VI: ^ 72 92 1 1 "j ,85-, 2H5q i 263 —, 320~l 377 1 469-] 1

ri= -снз tdo л4о 2ÓO 2ÍÓ 3ÓO 3¿o

r2= -coox r3 = - 56 -BS- Í37 -|

(ch3)3Si- 22,08 —35 —72 ё -и-—35 73-, 210-, . , I I , I . 1 2471 2931 138 409 -| 1 i 337 (100); 338 (26,7); 73 (24); 219 (17); 220 (14,3); 409(13); 161 (11,6); 221(8,4); 339 (7,8); 394 (7,8); 110 (7,7); 124(7,4)

' 'А" " ,¿0 200 me «0 ak> 300

ТГ- 279-|

VII: ri= -coox r2=-ch3 r3 = - ch3- 18,97 s — f- ÏZ-i2 57-, 72-, 127"1 r13e 174-. 2101 249-! , -..................1. ,J , . , .1.. 1 . .JL Tí.. IL i 320-] 351 -, 279(100); 280(20,3); 351 (11,1); 219 (6,4); 263 (4,5); 264 (3,9); 72 (3,5); 277 (3,2); 220 (2,9)

eo 1 do üó 1 ¿ó 1 ¿ó Veo гоо zio 2À0 гёо г X> 3¿Ó

VII: rr= -coox r2=-ch3 r3 = - 96 S5~ 80 -7T~ 3971

CF3CF2CH2- 16,52 l 1 ТВ- ïi 32 397(100); 398 (21,2); 469 (9,6); 219 (6,3); 72 (5,4); 381(4,6); 220 (4,5); 205 (2,7)

16 72-, j 103-,128-| 219-1 2051 ] »»п 320 т 3811 1 ■ 1 469 -[ , 1

'50.......ido....... iáo .......200 ' ' 2¿0 ' ' ' Э00 ' 3¿0 ¿do " ^0" " '

"96 337-|

(CH3)3Si- 19,96 sa ц- t f "бб-H "32 24 337 (100); 338 (26,5); 409 (8,7); 339(7,1); 219(6,4); 220 (6,1); 72 (5,6); 73 (5,5); 205 (3,2); 394 (3,1); 321 (2,8); 322 (2,8); 278 (2,5)

ié 75-, j 10аП 128-, 219-, 161п J 1 265-j p278 (-349 409 L L

• i........'i....... 50 100 táo..... 200..... 2^0 300 ' 3¿0..... 400

Глава 4. Моделирование оптимальных условий ТФЭ для совместного изолирования золпидема и его метаболитов из мочи

Для определения оптимальных условий совместного извлечения золпидема и его метаболитов, различающихся между собой физико-химическими свойствами, применялись методы планирования многофакторных экспериментов, статистической обработки полученных данных и поисковой оптимизации. Исследование проводилось в два этапа, при этом оценивалось влияние основных существенных факторов при проведении ТФЭ на эффективность совместного изолирования золпидема и его метаболитов из мочи: значение рН фосфатного буфера, используемого на многих этапах ТФЭ; концентрация уксусной кислоты, применяемой для промывки сорбента после загрузки образца - Сук; объем элюента — Уэ и соотношение компонентов в его составе - Е1; концентрация метанола - Сшон и его объем Умеон-Оптимизировали методику проведения ТФЭ, представленную в Таблице 2 (она применялась на первоначальном этапе идентификации метаболитов золпидема в образцах реальной мочи).

Для исследования применяли 3-факторный 3-уровневый план Бокса-Бенкена, позволяющий минимизировать число экспериментов, что привело к сокращению времени, потраченного на исследования, и уменьшению материальных затрат. Параметры искомой оптимизации находили путем построения поверхностей отклика, находящихся в пределах заданного нами факторного пространства, после математической обработки полученных результатов с помощью пакета прикладных программ БТАТ1БТ1СА 6.1. При этом выявлялись статистически значимые факторы, влияющие на величину аналитического сигнала (АС). Было установлено, что варьирование факторов проведения ТФЭ статистически значимо влияет на АС только золпидема и его кислотных метаболитов и индифферентно для его гидроксиметаболитов.

Полученные поверхности отклика позволили наглядно оценить наилучшее сочетание параметров проведения ТФЭ для исследуемых веществ, которое соответствует области поверхности, принимающей максимальное значение. Наглядно полученные значимые результаты представлены на рис. 3-8. Данные графические трехмерные изображения позволяют оценить взаимодействие двух различных факторов, которые влияют на АС, при фиксированной величине третьего фактора. В результате анализа построенных поверхностей отклика были сформулированы параметры искомой оптимизации:

> Кондиционирование сорбента патрона: 1/15М фосфатный буфер в диапазоне рН от 4.8 до 6.0;

> Промывка сорбента после загрузки образца:

• 1/15М фосфатный буфер в диапазоне рН от 4.8 до 6.0:

• 0.01-0.1 М уксусной кислоты;

• 3 мл 50% раствора метанола (данная манипуляция заменяет два этапа в исходной методике - Таблица 1).

> Элюирование смесью дихлорметан—2-пропанол-25% аммиак (2:1:0.1) по 2 мл (вместо элюироваиия этой смесью с соотношением (4:1:0,1) по 3 мл, таким образом, увеличение силы элюента позволило сократить его объем).

ш Ш

Рисунок 3 — Поверхность отклика для факторов рН и Рисунок 4 — Поверхность отклика для факторов объема элюента (метаболит VI) объема и концентрации метанола (золпидем)

ь

о

В1 б LZJ9" il

Рисунок 5 - Поверхность отклика для факторов Рисунок 6 - Поверхность отклика для объема

концентрации метанола и состава элюента (золпидем) метанола и состава элюента (метаболит VI)

ь

о

Рисунок 7 — Поверхность отклика для объема и концентрации метанола (метаболит VII)

Рисунок 8 - Поверхность отклика для концентрации метанола и состава элюента (метаболит VII)

По результатам нахождения оптимальных значений варьировавшихся в исследовании факторов (рН, Сук, Уэ, Е1, СМеон, Умеон) была сформулирована следующая методика ТФЭ золпидема и его метаболитов из мочи: к 2 мочи прибавляли 0,5 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 6,0, 0,1 мл ^-глюкуронидазы (10140 ЕД), перемешивали, герметично укупоривали и экспонировали в течение 2 часов при 45 °С. Полученный гидролизат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут. Центрифугат отделяли от осадка, прибавляли 2,5 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 5,4) и подвергали ТФЭ по схеме: кондиционирование сорбента осуществляли последовательным промыванием 2 мл 95 % этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4. Загрузку анализируемого образца мочи осуществляли со скоростью 1,0 мл/мин, после чего промывали сорбент последовательным пропусканием через него растворов объемами по 1 мл: 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4; 0,1 М раствора уксусной кислоты и 3 мл 50% раствора метанола в воде. Элюирование осуществляли в отдельный флакон со скоростью 1,0 мл/мин смесью дихлорметан-2-пропанол-25% раствор аммиака (2:1:0,1) дважды порциями по 2 мл. Элюат испаряли досуха в токе азота при 60 °С.

Глава 5. Количественное определение золнндема в цельной крови и моче

Количественное определение золпидема проводили методом внутреннего стандарта (ВС), в качестве которого использовали имипрамина гидрохлорид (рисунок 9). Калибровочные стандарты были получены добавлением:

а) к 2 мл «холостой» пробы мочи этанольных растворов, содержащих по 50; 100; 200; 500 и 1000 нг золпидема;

б) к 0,5 мл «холостой» пробы цельной крови этанольных растворов, содержащих по 20; 75; 125; 250 и 750 нг золпидема.

Во все пробы добавляли имипрамина гидрохлорида в количестве 500 нг. Исследовались по две пробы для каждой концентрации. Все пробы мочи подвергались ТФЭ на патронах БатрН Q Е\чс1ех по оптимизированной нами методике. Пробоподготовку крови проводили по следующей методике: к калибровочным стандартам крови прибавляли по 3 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4 и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Далее проводили ТФЭ по схеме: кондиционирование сорбента осуществляли последовательным промыванием по 2 мл 95 % этанола и по 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4. Загрузку анализируемых образцов крови осуществляли со скоростью 1,0 мл/мин, после чего промывали сорбент последовательным пропусканием через него растворов объемами по 1 мл: 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4; 0,1 М раствора уксусной кислоты и 10% этанола. Элюирование первоначально осуществляли смесью этилацетат-н-гексан (1:3) дважды порциями по 2 мл (элюат I - отбрасываем) и далее промывали патроны по 2 мл метанола. Последующее элюирование проводили в отдельные флаконы со скоростью 1,0 мл/мин смесью дихлорметан-2-пропанол-25% раствор аммиака (4:1:0,1) дважды порциями по 2 мл (элюат II). Элюат II испаряли досуха в токе азота при 60 °С. Условия хроматографического разделения: температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора - 300 и 280°С.

Температура колонки: начальная 70°С в течение 1 мин и прогрев до 230°С со скоростью программирования 40 град/мин; затем прогрев до 300°С со скоростью программирования 20 град/мин; выдержка при конечной температуре 2,5 мин. Регистрация масс-спектров проводилась в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) по ионам с величинами m/z для золпидема - 235, 307, 219; для имипрамина (ВС) - 234, 235, 280. Для количественного определения были использованы величины площадей пиков ионных фрагментов со 100% интенсивностью в спектре (234 - для имипрамина и 235 - для золпидема). Ионные фрагменты m/z 307, 219 (золпидем) и 235, 280 (ВС) были использованы для подтверждения идентификации. Калибровочные графики представлены на рисунке 10.

•га-

1 07

Retention Time (min)

Рисунок 9 - Хроматограмма модельной смеси мочи, содержащей золпидем (9,736 мин -время удерживания) и внутренний стандарт имипрамин (7,394 мин) Эффективность экстракции золпидема из модельной крови и мочи определяли на трех уровнях концентраций для каждого объекта, при этом выход исследуемого вещества наблюдался в пределах 96-98,8% для крови и 98,6-108,4% для мочи.

Response Ratio

Zolpidem

Res pome Ratio

0.5 1

Concentration Ratio

Рисунок 10 - Калибровочные графики доя количественного определения золпидема в крови г2- 0,999 (слева) и в моче г2-0,998 (справа) Методики были валидированы, при этом была доказана их специфичность, проведено определение пределов обнаружения (ПО) и пределов количественного определения (ПКО) расчетным путем с использованием величин стандартного отклонении аналитического сигнала (5) и тангенса угла наклона (Ь) калибровочных прямых, построенных путем добавления калибровочных уровней к основным графикам вблизи

предполагаемых ПО и ПКО (Рисунок 11). Расчеты проводили по формулам: ПО = 3,3х —; ПКО = 10х —

ъ ь

Уаг2 \'аг I Уаг2 = -,0978 + ,00803 » Уаг1 Корреляция : г = ,99936

Уаг1 \'аг2 УаП = -,1326 + ,01740 * Уаг2 Корреляция : г = ,99845

Концентрация золпидема в моче, нг/мл Рисунок 11 - Калибровочные графики для крови и мочи (определение ПО и ПКО) ПО в крови составил 24,0 нг/мл; в моче - 13,2 нг/мл; ПКО в крови - 72,7 нг/мл; в моче - 40 нг/мл. Аналитическая область методики определения золпидема в моче - 40-500 нг/мл, в крови - 70-1500 нг/мл, при этом нижние уровни концентраций золпидема ограничиваются найденными для него ПКО, определенных для разных биожидкостей. Правильность и прецизионность (повторяемость и промежуточную прецизионность) методик определяли на трех уровнях концентраций золпидема в биожидкостях (150-1500 нг/мл для крови и 50-400 нг/мл для мочи). При статистической обработке определено, что результаты, полученные по описанным методикам, являются правильными, т. к найденные значения концентраций, принимаемые за истинные, лежали внутри доверительного интервала соответствующего среднего результата анализа, и находятся в пределах приемлемости, т.к. при оценке прецизионности коэффициент вариации был менее 15%.

На основе проведенных экспериментальных исследований по разработке условий изолирования, идентификации и количественного определения нами составлена схема для ХТА золпидема и его метаболитов с применением методов ТФЭ и ГХ/МС (рисунок - 12).

Рисунок 12 - Схема ХТА золпидема и его метаболитов с применением методов ТФЭ и ГХ/МС

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Для извлечения золпидема и его метаболитов из биологических жидкостей применен метод ТФЭ, который позволил эффективно изолировать аналиты, значительно различающиеся по физико-химическим характеристикам.

2. На основе изучения характера масс-фрагментации полученных различных дериватов основных метаболитов золпидема (мстильных, этильных, ацетильных, пентафторпропионильных и триметилсилильных) под действием электронного удара (70 эВ), обработаны и описаны их масс-спектральные характеристики, дополненные газохроматографическими данными. Полученные сведения суммированы и приведены в единую систему, что ранее не встречалось в отечественной и доступной зарубежной литературе.

3. Составлена схема метаболизма золпидема в организме человека.

4. Проведена в два этапа оптимизация процедур ТФЭ методом математического планирования эксперимента с применением 3-х факторного 3-х уровневого плана. Компьютерное моделирование Бокса-Бенкена позволило определить оптимальные значения варьировавшихся в исследовании факторов, а также оценить эффекты их взаимодействий при минимальной затрате времени и лабораторных ресурсов.

5. На основе полученных оптимизационных данных предложена методика для количественного определения золпидема в крови и моче методом ГХ/МС с применением в качестве внутреннего стандарта имипрамина гидрохлорида.

6. Установлены валидационные характеристики предложенных методик по показателям специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, аналитическая область методики, правильность, прецизионность (повторяемость и внутрилабораторная прецизионность), показано их соответствие требованиям валидации.

7. Доказано, что применение предложенных методик количественного определения золпидема в образцах цельной крови и мочи, позволяет с высокой степенью эффективности (близкой к 100%) проводить экстракцию данного вещества из биологических жидкостей.

8. Составлена схема определения золпидема, его метаболитов и продукта гидролиза в образцах цельной крови и мочи с применением ТФЭ и ГХ/МС. Она может быть применена в практике клинико-диагностических и судебно-химических лабораторий, имеющих соответствующее приборное оснащение.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Исследование экстракции золпидема из водных растворов / Е.А. Шилова, С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств. Рос. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА: материалы... - Пермь, 2007. -С. 236-241.

2. Шилова, Е.А. Изучение условий совместной экстракции золпидема и его главного метаболита // Вестник ПГФА. - Пермь. - 2008. - №4. - С. 200-201.

3. Изолирование золпидема и его основного метаболита методом твердофазной экстракции / Е.А. Шилова, С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // Проблемы экспертизы в медицине. -

2008. - Т. 8. - №1. - С. 37-40.

4. Шилова, Е.А. Количественное определение золпидема в моче методом газовой хроматографии масс-спектрометрии / Е.А. Шилова, Е.И. Егорова // Вестник ПГФА. - Пермь. - 2009. - №5. - С. 165-167.

5. Химико-токсикологический анализ золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова, Е.А. Шилова // Вестник РУДН, серия Медицина. -

2009. - №4. - С. 469-473.

6. Крылова, Е.А. Исследование золпидема в образцах реальной мочи на уровне терапевтических доз / Е.А. Крылова, Ю.А. Хомов, С.С. Катаев // Вестник РУДН, серия Медицина. - 2010. - №6. - С. 269-272.

7. Крылова, Е.А. ГХ/МС определение золпидема в крови / Е.А. Крылова, Ю.А. Хомов, С.С. Катаев // Вестник РУДН, серия Медицина. - 2010. - №6. -С. 264-268.

8. Определение золпидема в моче пациентов с использованием методов ВЭТСХ, ВЭЖХ, УФ-, ГХ/МС спектрометрии / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Ю.Н. Карпенко, Е.А. Крылова // Вестник ПГФА. - Пермь. - 2010. - №7. - С. 272-275.

9. Идентификация золпидема и его основных метаболитов в моче методом газовой хроматографии масс-спектрометрии / Е.А. Крылова, С.С. Катаев, Ю.А. Хомов, Н.В. Кокшарова // «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» Материалы науч.-практ. конф. с международным участием: материалы... - Киров, 2010. - С. 288-392.

10. Крылова, Е.А. Способы доказательства метаболитов золпидема в моче // «Здоровье и образование в XXI веке». XII Международный конгресс: материалы... -М., 2011.-С. 102.

11. Крылова, Е.А. Определение золпидема в образцах мочи при различных сроках хранения / Крылова Е.А., Харири В., Хомов Ю.А. // «Современные проблемы фармацевтической науки». Российская науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых, посвящ. 75-летию ПГФА: Материалы... - Пермь, Вестник ПГФА. - 2012. - №9. - С. 141-142.

12. Hariri, В. L'influence du processus de putrifaction sur l'identification du Zolpidem dans les bio-liquids / B. Hariri, E.A. Krylova, Y.A. Khomov // «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной детельности». I Международн. науч. конф.: тез. докл. - Пермь, 2012. - С. 106107.

13. Крылова, Е.А. Золпидем и его метаболиты как объекты химико-токсикологического анализа и исследований для экспертных целей / Е.А. Крылова, С.С. Катаев, Ю.А. Хомов // Наркология. - 2012. - №4. - С. 43-47.

14. Хомов, Ю.А. Изолирование, обнаружение и количественное определение золпидема в биологических жидкостях / Ю.А. Хомов, Е.А. Крылова, Е.И. Егорова // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №2 (Электронный журнал) - URL: www.science-education.ru/102-5868

15. Крылова, Е.А. Изучение влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче / Е.А. Крылова, Ю.А. Хомов // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №3 (Электронный журнал) - URL: www.science-education.ru/103-6105

16. Крылова, Е.А. Фармакокинетика и биотрансформация золпидема: анализ главных метаболитов (научный обзор) / Е.А. Крылова, Ю.А. Хомов // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №2 (Электронный журнал) - URL: www.science-ecUication.ru/108-8576

17. Крылова, Е.А. К метаболизму золпидема / Е.А. Крылова, Н. Деркауи, Ю.А. Хомов // Вестник ПГФА. - 2013. - С. 82-84.

18. Krylova, Е.А. Gas chromatography mass-spectrometry for the identification of Zolpidem hydroxylic and carboxylic metabolites in urine / E.A. Krylova, N. Derkaui // «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности». II Международн. науч. конф.: тез. докл. - Пермь, 2013. - С. 7576.

19. Krylova, Е.А. Determination of Zolpidem and its metabolites by Chromatography Mass-Spectrometry / E.A. Krylova, S.S. Kataev, Y.A. Khomov // Journal of Analytical Chemistry. - 2013. - Vol. 68, №8. - P. 724-731.

Автор выражает признательность и глубокую благодарность заведующему судебно-химического отделения Пермского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы к.х.н. Катаеву С.С. за оказанную помощь на всех этапах работы над диссертацией, а также сотруднику ГКУЗОТ «ПКБ СМЭ» Зелениной Н.Б. за помощь при выполнении экспериментальной части работы.

Крылова Елена Анатольевна (Россия)

Метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии при анализе золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях для экспертных целей

В результате проведенных исследований изолированы и идентифицированы основные метаболиты золпидема в виде их производных с помощью методов ТФЭ и ГХ/МС. Подробно описаны их газохроматографические и масс-спектральные характеристики. Составлена схема метаболизма золпидема. Определены оптимальные условия ТФЭ золпидема совместно с его метаболитами из мочи с применением 3-х факторных 3-х уровневых планов Бокса-Бенкена. Разработаны методики количественного определения золпидема в цельной крови и моче. Данные методики были валидированы по показателям специфичности, предела обнаружения, предела количественного определения, линейности, аналитической области методики, правильности, прецизионности. Предложена схема химико-токсикологического анализа золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях.

Krylova Elena (Russia)

The gas chromatography - mass spectrometry for analysis of Zolpidem and its metabolites in biological fluids for expert perposes

As a result of conducted research the basic metabolites of Zolpidem were extracted and identified in the form of their derivates with the help of SPE and GC/MS. The gas chromatographic and mass spectral characteristics are detailed described. The scheme of the metabolism of Zolpidem is drawn up. The optimal conditions of SPE of Zolpidem combined with its metabolites from urine are determined by the application of three-factors and three-levels Box-Behnken design. The methods of quantitative determination of Zolpidem in whole blood and urine ate developed. These methods were validated on specificity, limits of determination and quantification, linearity, analytical range, accuracy, precision. The scheme of chemical and toxicological analysis of Zolpidem and its metabolites in biological fluids is also suggested.

Подписано в печать 30.09.2013. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 2047/2013.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства Пермского национального исследовательского политехнического университета. Адрес: 614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113. Тел. (342) 219-80-33.

 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 2013 года, Крылова, Елена Анатольевна

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской

Федерации

П1 <5Л4

ичси I ¿.и

Крылова Елена Анатольевна

На правах рукописи

МЕТОД ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ПРИ АНАЛИЗЕ ЗОЛПИДЕМА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ДЛЯ

ЭКСПЕРТНЫХ ЦЕЛЕЙ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, , профессор Хомов Юрий Александрович

Пермь-2013

СПИСОК ТЕРМИНОЛОГИЧЕСКИХ СОКРАЩЕНИЙ

Метаболиты золпидема и продукт деструкции: 4'-ГМЗ - 4'-(гидроксиметил)-золпидем 4'-КЗ - 4'-(карбокси)-золпидем 6-ГМЗ - 6-(гидроксиметил)-золпидем 6-КЗ - 6-(карбокси)-золпидем

ГЗ -гидроксизолпидем (-ОН в положениях 5, 7 или 8 в структурной формуле золпидема)

ЗГ - золпидем гидролизованный (продукт деструкции золпидема) N-ГМЗ - Ы-(гидроксиметил)-золпидем

Аналитические методы:

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГХ/МС - газовая хроматография - масс-спектрометрия ГЖХ - газо-жидкостная хроматография ЖЖЭ - жидкость-жидкостная экстракция

ЖХ-МС/МС - жидкостная хроматография тандемная масс-спектрометрия

РИА - радиоиммуноанализ

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФЭ - твердофазная экстракция

УЭЖХ-МС/МС - ультраэффективная жидкостная тандемная масс-

спектрометрия

ЭУ - электронный удар

SIM - селективный ионный мониторинг

Дериватизация:

БСТФА - ]Ч,0-бис(триметилсилил)трифторацетамид ПФПА - 2,2,3,3,3-пентафторпропионовый ангидрид ПФПол - 2,2,3,3,3-пентафторпропанол

ТМС эфир - триметилсилиловый эфир; УА - уксусный ангидрид УК - уксусная кислота Ас - ацетилирование

Математическое планирование эксперимента: АС - аналитический сигнал

МПЭ - математическое планирование эксперимента

Сук - концентрация уксусной кислоты

Смеон - концентрация метанола

Уэ - объем элюента II

Умеон - объем метанола

El - элюент

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ВС - внутренний стандарт ГАМК (GABА) - у-аминомасляная кислота ИПС - изопропиловый спирт

СХО ГКУЗОТ «ПКБ СМЭ» - судебно-химическое отделение Государственного

казенного учреждения здравоохранения особого типа «Пермское краевое бюро

судебно-медицинской экспертизы»

ФГ - функциональная группа

ФБ - фосфатный буфер

ХТА - химико-токсикологический анализ

XTJI - химико-токсикологическая лаборатория

CYP - цитохром

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................13

1.1. Общая характеристика и физико-химические свойства золпиденма.......13

1.2. Фармакологическая характеристика золпидема.........................................15

1.3. Немедицинское применение золпидема......................................................23

1.4. Особенности пробоподготовки и аналитеческие методы, используемые в ХТА для определения золпидема и его метаболитов........................................27

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 1...........................................................................................35

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.........................................................................36

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................36

2.1. Объекты исследования...................................................................................36

2.2. Оборудование и материалы...........................................................................37

2.3. Методики проведения пробоподготовки.....................................................38

2.4. Математическое планирование эксперимента............................................41

2.5. Обработка результатов исследования..........................................................41

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ЗОЛПИДЕМА....................................42

3.1. Расчет физико-химических констант золпидема и его метаболитов........42

3.2. Идентификация метаболитов золпидема, выделенных из мочи, в виде их производных...........................................................................................................46

3.3. Изучение влияния деконъюгации на определение метаболитов золпидема в моче......................................................................................................................61

3.4. Получение, изолирование и идентификация продукта гидролиза золпидема...............................................................................................................64

3.5. Схема метаболизма золпидема.....................................................................72

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3...........................................................................................76

ГЛАВА 4. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ТФЭ ДЛЯ СОВМЕСТНОГО ИЗОЛИРОВАНИЯ ЗОЛПИДЕМА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ ИЗМОЧИ...................................................................................................................78

4.1. Первый этап оптимизации.............................................................................78

4.2. Второй этап оптимизации..............................................................................93

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4.........................................................................................109

ГЛАВА 5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗОЛПИДЕМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ МЕТОДОМ ГХ/МС..................................110

5.1. Построение калибровочных прямых для количественного определения золпидема в крови и моче...................................................................................112

5.2. Метрологическая оценка методик количественного определения золпидема в крови и моче...................................................................................116

5.3. Эффективность экстракции золпидема из крови и мочи.........................117

5.4. Валидация методик количественного определения золпидема в цельной крови и моче.........................................................................................................120

5.5. Схема определения золпидема, его метаболитов и продукта гидролиза в биологических жидкостях с применением методов ТФЭ и ГХ/МС..............135

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5.........................................................................................137

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ..................................................................................................138

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................140

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................................157

ПРИЛОЖЕНИЕ 1................................................................................................157

ПРИЛОЖЕНИЕ 2................................................................................................167

ПРИЛОЖЕНИЕ 3................................................................................................187

ПРИЛОЖЕНИЕ 4................................................................................................195

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

На сегодняшний день инсомния - это серьезная проблема общественного здоровья [11, 12, 14, 26, 28], распространенная не только среди пожилого населения, но и у молодых лиц, чему весьма способствует чрезмерно интенсивный образ жизни, ставший характерной чертой современности. Для медикаментозной терапии инсомнии в настоящее время применяется широкий круг лекраственных средств, обладающих седативным действием. Объектом исследований в настоящей работе является снотворный препарат, золпидем, являющийся производным имидазопиридина, обладающий короткой продолжительностью действия и быстрым наступлением фармакологических эффектов.

Золпидем доказано позитивно влияет на качество жизни [3, 4, 13, 96], облегчая засыпание не только перед сном, но и среди ночи у больных с интрасомническими расстройствами. По данным [125], во Франции золпидем входит в тройку наиболее часто применяемых психотропных лекарств, наряду с бромазепамом и пароксетином, а согласно исследованиям [115], 2-лекарства, к которым относится и золпидем, являются препаратами выбора для лечения бессонницы в США. Российские клиницисты [27] ставят золпидем по значимости в один ряд с такими известными и широко распространенными лекарственными средствами в нашей стране как производные 1,4-бензодиазепина (с коротким и средним периодом полувыведения - мидазолам, триазолам).

Золпидем имеет токсикологическое значение связанное, во-первых, с широким применением, во-вторых, из-за доказанной способности вызывать явления привыкания и лекарственной зависимости (психической и физической) при длительном приеме (более 4 недель) [1, 9, 10, 91, 140]. При этом формируются благоприятные условия для возможного немедицинского применения золпидема и его бесконтрольного приема. Данный препарат, не

является наркотическим средством, но тем не менее встречаются случаи внутривенного введения золпидема с целью получения эйфории [97].

В-третьих, способность золпидема снижать скорость психической и мышечной реакции (эти эффекты сохраняются и на следующий день после употребления его внутрь на ночь) [107] делает несовместимым прием этого лекарства с управлением всех видов транспортных средств и работой с приборами и автоматами, требующих точности движений и исключающих любые ошибки. Кроме того, описано множество случаев применения препарата для осуществления преступных действий против личности, при этом использовались такие свойства золпидема как потенцированное фармакологическое действие при совместном приеме с алкоголем, а также быстрое наступление седации [59, 74, 102].

В РФ золпидем является контролируемым лекарственным средством в целях уголовного законодательства: он внесен в Список сильнодействующих веществ, согласно Постановлению Правительства №964 [35] от 29 декабря 2007 года. 15 июля 2002 г. ВОЗ приняла решение включить золпидем в Список IV Конвенции психотропных веществ 1971, т.к. частота случаев развития зависимости и злоупотреблений препаратом сопоставима с таковой у 1,4-бензодиазепинов [79].

При проведении ХТА важно учитывать, что из-за способности золпидема интенсивно метаболизироваться в организме человека, его обнаружение в моче может быть затруднительно, т.к. лишь 0,2-1,3 % нативного вещества выводится в неизменном виде [85]. Поэтому идентификация его метаболитов в биологических жидкостях является актуальной задачей для получения объективной и полной оценки химико-токсикологических исследований, а для этого необходимо своевременно готовить теоретическую и практическую базу. Ранее в работе Егоровой Е.И. [18] были представлены методики ХТА золпидема в биологических жидкостях с применением различных инструментальных методов. Но вопросы обнаружения метаболитов золпидема в биологических объектах в литературе не освещены, нет единой схемы биотрансформации данного лекарственного вещества в организме человека.

Для изучения метаболитов золпидема в настоящей работе применялся метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ/МС) [7]. Он обладает высокой чувствительностью по отношению к описываемым соединениям, обеспечивает их селективное детектирование и снабжает структурной информацией. На сегодняшний день газовыми хроматографами с масс-селективным детектированием оснащены многие судебно-химические и токсико-химические лаборатории на территории РФ, и они широко применяются для рутинных исследований. Поэтому получение новых масс-спектральных данных о метаболитах золпидема, разработка и внедрение новых методик анализа с применением метода ГХ/МС является весьма актуальной задачей.

Целью настоящей работы явилось изучение биотрансформации золпидема в организме человека, разработка методики совместного изолирования золпидема и его метаболитов из биологических жидкостей при оптимальных условиях и последующее количественное определение золпидема в цельной крови и моче.

Реализация цели осуществлялась путем решения следующих задач:

1) Исследовать особенности метаболических превращений золпидема в организме человека путем идентификации его метаболитов с получением их различных производных, изучением масс-фрагментации, обобщением и описанием полученных газохроматографических и масс-спектральных характеристик.

2) Определить оптимальные условия экстракции золпидема и его метаболитов из мочи при совместном присутствии.

3) Разработать методики количественного определения золпидема в цельной крови и моче методом ГХ/МС.

4) Составить по совокупности данных схему ХТА золпидема, адаптированную к практической деятельности судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий как для скрининговых исследований на лекарственные и наркотические вещества, так и в случаях направленного анализа на золпидем.

Научная новизна:

- с помощью метода ГХ/МС идентифицированы метаболиты золпидема, получены и описаны газохроматографические и масс-спектральные характеристики различных их дериватов;

- идентифицирован продукт деструкции золпидема, получены его производные, описаны их газохроматографические и масс-спектральные характеристики.

- с помощью метода математического планирования эксперимента (МПЭ) определены оптимальные условия для совместной экстракции золпидема и его метаболитов из мочи методом ТФЭ;

- доказана необходимость проведения ферментативного гидролиза мочи для последующего обнаружения метаболитов золпидема;

- разработаны ГХ/МС методики количественного определения золпидема в крови и моче, дана оценка возможности использования методик анализа в лабораторной практике путем их валидации.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Разработанные методики пробоподготовки крови и мочи для качественного и количественного определения золпидема и его метаболитов внедрены и используются в практике судебно-химического отделения ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (акты внедрения от 24 декабря 2008 г.; от 24 февраля 2011 г.; акт апробации от 14 октября 2010 г.); в химико-токсикологической лаборатории ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» (акты внедрения от 27 января 2011 г.; 07 мая 2013 г.); в судебно-химическом отделении ГУ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Республика Марий Эл» (акт внедрения от 10 ноября 2011 г.).

Отдельные фрагменты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры токсикологической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России (акт внедрения от 27 января 2009 г.) и кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России (акт внедрения от 12 апреля 2012 г.).

■ По материалам исследования подготовлено информационное письмо «Применение метода ГХ/МС для химико-токсикологического определения золпидема, дериватов его метаболитов и продукта гидролиза в биологических жидкостях после твердофазной экстракции» (19 е.), утвержденное Ученым советом ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России от 30 мая 2013 г.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (Пермь, 2007); на Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009); Российской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов животного происхождения» (Пермь, 2010); межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы в Кировской области «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» (Киров, 2010); XII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии, качество и безопасность лекарственных средств» (Москва, 2011); III Международной научно-практической конференции «Аналитическая токсикология, перспективы и современные тенденции развития» (Москва, 2012); Российской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Современные проблемы фармацевтической науки», посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2012); I Международной научно-практической конференции «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности» (Пермь, 2012); отчетной научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Пермь, 2013); II Международной научно-практической конференции «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности» (Пермь, 2013).

Личный вклад автора. Для получения результатов, изложенных в

диссертации, автор лично провел комплекс лабораторных исследований крови и мочи, включающих пробоподготовку образцов методом ТФЭ, проведение реакций дериватизации и выполнение ГХ/МС анализа. Автором проведена разработка и валидация методик количественного определения золпидема в крови и моче, а также интерпретация всех полученных результатов исследований. Автором лично выполнено написание публикаций по данной теме и написание всех глав диссертации.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 глав), общих выводов, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, включает 32 таблицы, 39 рисунков и 52 страниц приложения. Список использованной литературы содержит 174 наименований, из них 51 отечественных и 123 - зарубежных авторов. В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований: акты внедрения, проект информационного письма, таблица, которая содержит обзор методов и методик исследования биологических объектов на предм