Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изолирование, обнаружение и определение новокаина и П-аминобензойной кислоты при судебно-химических исследованиях

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМ. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 615.917:615.211:577.112.387

САДИКОВ Закиржан Кабилович

ИЗОЛИРОВАНИЕ, ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ НОВОКАИНА И П-АМИНОБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ ПРИ С УД Е Б Н О - X И М И Ч Е С К И X ИССЛЕДОВАНИЯХ

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Ташкентском фармацевтическом институте.

Научный руководитель

кандидат фармацевтических наук, профессор

Л. Т. Икрамов.

О ф и ци а л ь н ы е о п п о н е н;т ы:

доктор фармацевтических наук, профессор А. С. Квач, кандидат фармацевтических наук А. Н. Лощинин.

Ведущее учреждение: Львовский ордена Дружбы Народов государственный медицинский институт.

Защита состоится « . . . ».........199 г.

в « . . . » час. на заседании специализированного совета Д-074.05.06. при Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (Москва, Суворовский бульвар, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И. М. Сеченова (Москва, Зубовская пл., 1).

Автореферат разослан . » 199г.

Ученый секретарь специализированного совета

Д-074.05.06 кандидат фармацевтических

наук, доцент Н. П. Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

•" - ' Актуальность темы исслепования. Новокаин широко используется как местноанестезирущее средство в хирургии и других областях медицины, а также при лечении язвскиой болезни желудка, атероскле- • роза, бронхиальной астмы и других заболеваний. Но вместе с тем он нваидиффереятен по отношению к организму -человека, особенно в случаях повышенной •чувствительности к нему. Об этом свидетельствует ряд.случаев отравления людей новокаине»!.

Особый интерес ври химико-токсикологическом исследовании представляют вопросы метаболизма новокаина. После ¿ведения в организм' человека он быстро гидролизуется, образуя метаболиты - п-ами-нобензойную кислоту (ПАШ) и диэтиламнноэтанол. Следовательно при химико-токсикологическом исследовании биологических объектов яа-наличие новокаина проводить целенаправленный поиск только одного метаболита - ПАЕК - будет нецелесообразно, так как ПАБК является . естественной составной частью многих органических веществ организма. В связи с этим для более точного доказательства отравления но-вокалом необходим параллельный анализ биологического объекта на налячао новокаина и его метаболитов - ПАБК и даэтиламичоэтанола. Такой подход к исследованию расширит граница судебно-химической экспертизы при решении вопроса об отравлении новокаином.

. До' настоящего времени новокаин в химико-токсикологическом . отношении был изучен в радо работ. Однако предложенные для исследования объектов биологического происхождения метода анализа новокаина и ПАБК являются недостаточно чувствительными и избире :елыш-.мл, з. также'требуют большого расхода времени. По'анализу даэтил-аминоэтанс ;а при химико-токсикологических ■ исследованиях. оредошя практически отсутствуют. Таксе в недостаточной мере изучены воз- : " можности применения физических и'физико-химических методов для

идентификации и количественного определения новокаина и ПАБК, выделенных из биологического материала. Методики ввделения даэтиламино-этанола из объектов биологического происхождения ез описаны, а даэ-ициеся методики выделения новокаина и ПАБК из биологических объектов на позволяют изолировать их в достаточно убедительных количествах. Не разработаны эффективные метода очистки новокаина и ПАБК, выделенных из биологического материала. Недостаточно изучены сохраняемость новокаина в биологическом материале и влияние на этот процесс консерванта.

Учитывая широкое применение новокаина в медицинской практике и возмакнута токсичность для людей, а также недостаточно полную раз-;работку методов его выделения,, идентификации и количественного определения в объектах биологического происхождения, изучение новокаина и его метаболитов - ПАБК и даэтиламиноэтанола - в химико-токсккодо-гяческом отношении является- одной из актуальных з'адач современной токсикологической (судебной) химии.

Цель работы и основные задачи исследования. Весьма широкое применение новокаина в медицинской практике,' а также его токсичность и отсутствие достаточно надежных методов его химико-токсикологического исследования явились основанием; душ разработки методики доследования объектов биологического происхождения на наличие новокаина и его метаболитов - ПАЕК и диэтиламиноэтанола,-позволяющих с наибольшей доказательностью решать вопросы экспертной практики.' .

Исходя из сказанного,мы поставили перед собой следующие задачи:!

- Разработать чувствительные и специфичные' методики обнаружения новокаина й его метаболитов -ПАБК и даэтилашноэтансша - с применением современных-.физико-химических методов, которые оказались, бы пригодными для доказательства -гахкчля указанных воцеста в объек- | тах хш.кко-токсикологического .анализа;-;;. "':. л; , ■ *■ ■ ; л {

-. Продладаьччуаст!^ определения ¡'

новокаина и его метаболитов - ПАБК я дизтилашшоэтанола - в объек- ■ тах химико-токсикологического анализа;

Изучить условия экстракции новокаина, ПАБК и диэтиламиноэта-нола органическими растворителями в зависимости от различных факто-. ров: природа органического растворителя, рН среды, наличия электролитов, продолжительности экстракции; ■

- Разработать эффективные метода выделения новокаина и его метаболитов - ПАБК и-дизтилашшоэтанола - из объектов химико-токсикологического исследования;

- Изучить сохраняемость новокаина и его метаболитов в процасог гнилостного разложения биологического материала и влияние на этот процесс консерванта; •

- Изучить■ориентировочное распределение новокаина и ого мета-, болитов в органах экспериментальных животных и установить пригод- . ность разработанных методов анализа на экспертном материале и на отравленных животных.

• Цаучцад новизну. .,,..,--•■

' - Для идентификации новокаина и ПАБК,' выделенных из биологпче-■ ского материала, впервые систематически изучены имеющиеся методы обнаружения и предложена комплексная методика доказательства наличия этих веществ, включающая обнаружение с помощью микрокристалло-: 'скопических реакций, методов хроматографии в тонком слое сорбента, . спектроскопии в УФ-области спектра и гаао-жидкостной хроматографии, масс-спектроскопии; для идентификации магабоетта новокаина - даэтил-аминоэтанола - впервые .разработаны методики хроматографии, в, ройком , ', слое, сорбента и газо-щдкостиой хроматографии;; ' •

' Подвергнуты сравнительному"изучению некоторые методы количеЧ ' ственного определения новокаина и ПАБК (УФ-спектрофотометрический, . . метод газо-жидкостной хроматографии) и предложены для количествен-., него определения новокаина при химико-токсикологических исследова-

лиях методы УФ-спектрофотометрии и газо-жидкостной- хроматографии. Для количественного определения метаболитов новокаина - ПАБК - предложен метод УФ-спектрофотометрии, для диэтилашноэтанола, выделенного из биологического объекта, разработана методика газохроматографи-ческого количественного определения;

- Изучены условия экстракции метаболита новокаина - диэтилашноэтанола - органическими растворителями из водных растворов, а также

' влияние на. степень экстракции новокаина и ПАШ из водных растворов отдельных факторов;,

- Разработана оптимизированная методика выделения новокаина и его метаболитов - ПАЕК и диэтилашноэтанола - из объектов химико-токсикологического исследования;

- Изучена сохраняемость новокаина, а такие его метаболитов -ПАБК и диэтиламиноэтанола - при гнилостном разложении биологического материала и влияние на этот процесс консерванта;

- Изучено ориентировочное распределение новокаина, а также его метаболитов - ПАБК и диэтилашноэтанола - в органах отравленных животных. • • .' " '

Практическая значимость работы. Разработанная матодака судебно-химического анализа новокаина и ПАБКв биологичаскш трудней материале и биологических жидкостях позволяет; достоверно рашата задачи су- . дебно-медицинской экспертизы при отравлении новованном, Предвокенные методики определения новокаина и ПАБК обобщены и подготовлены к выпуску в виде "Методических рекомендаций по определению новокаина и п-аминобензойной кислоты при судебно-химическом исследовании трупного материала". "';'

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были; доложены и обсуждены:, , , ;- , . . .;

- на.научной конференции молодых ученых:и,специалистов Ташкентского фармацевтического института (1989; 1990 гг.); I

- на семинаре-совещании судебно-медицинских экспертов-химиков Бюро судебно-медицинской экспертизы Уз.ССР (1989 г.);

- па расширенном заседании Бюро Главной судебно-медицинской экспертизы Минздрава Уз.ССР я Узбекского отделения Всесоюзного общества судебных химиков (1989 г.);

- на объединенной конференции кафедр фармацевтической я токсикологической химии Ташкентского фармацевтического института (1990г.)

- ш объединенной конференции кафедр токсикологической и фармацевтической химии фарлацевтического факультета Московской медицинской академии юл. М.М. Сеченова (1990 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических ; наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Ташкентского фармацевтического института и является фрагментам комплексной темы исследования кафедры ток-, онкологической химии "Изучение некоторых ядохимикатов и лекарственных средств в химико-токсикологическом отношении",которая входит во Всесоюзную проблем "Фармация", № госрегистрации 01827022869.

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликованы ; 3 научные работы и подготовлены "Методические рекомендации по опре-, делении нозонанна и п-аминобензойной кислоты при судебао-хглтте а сих исследованиях биологического материала". , . -.

V ■ ■ На защиту выносятся следующие результаты зкепершлентальных ' исследований:

- датодаки-идентификации и количественного определения новока-' има и его метаболитов - ПАБК и диэтилашноэтанола - в малых количе- ■ ствах; . ■ ,,.'■' •'''.'.'' л ,

'/ - результаты изучения условий экстракции Новокаина,: ПАБК и да- ; '• этилашшоэтанола органическими растворителями из водных растворов; .' • - метода выделения новокаина и его метаболитов - ПАБК и диэтил-1 аминоэтакола из объектов химико-токсикологического' анализа;

- влияние гнилостных процессов на сохраняемость новокаина в ■"-биологическом материале и влияние консерванта на этот процесс;

- ориентировочное распределение новокаина, а .также его метабо-;. литов - ПАБК и даэтиламиноэтанола - в органах, отравленных животных.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена . ;на 196 страницах машинописного текста,- состоит из, введения, шести 'глав, общих выводов, списка^литературы, включающего 204 источника, .. из которых 94 на иностранных языках. Работа содержит 62 таблицы и

• 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и зада ' че исследований, их научная новизна и практическая значимость. В главе I приводится обзор литературы, посвященной физико-химическим свойствам новокаина, его применению в медицине, метаболизму новока-. ина в организме человека и животных и токсичности, методам анализа и изолирования лз объектов химико-токсикологичаского исследования.

. В экспериментальной части работы, в глава П приведены методы

• идентификации новокаина и его метаболитов - ПАБК и даэтиламиноэтанола - при химико-токсикологических исследованиях; глава Ш посвящена разработке методов количественного определения новокаина, ПАБК

•и диэтиламиноэтанола. В главе 17 рассмотрены результаты изучения . оптимальных условий .экстракции новокаина, ПАБК и даэтяламиноэтанолг ж водных растворов в. зависимости от различных факторов (влияние .. рН среды и природы-органического растворителя, влияние электрода- , тов, продолжительности и кратности экстракции). Глава У посвящена разработке оптимальных методов изолирования новокаина, .ПАБК и даэтиламиноэтанола из объектов' хшико-токслкологического исследовани а также методам счистки их' от соэкстрактивных веществ.

В главе УГ приведены результаты исследований сохраняемости не вокашщ в биологическом материале, ориентировочного.распределения

новокаина и его метаболитов - ПАБК и диэтиламиноэтанола - в организме экспериментальных животных.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЯЗДОВАШЯ

I. Идентификация новокаина и его метаболитов - ПАБК и диэтиламиноэтанола

Применительно к обнаружению новокаина, ПАБК и диэтиламиноэтанола в трупном материале нами изучались реакции микрокристаллоско-. пичостше, условия хроматографнрозання в тонком слое сорбента, а также УФ-, масс-спектроскопия, газо-жидкостная хроматография.

1. Обнаружение новокаина и ПАБК с помощью

микрокри сталлоснопических-реакций- -. ,

Для обнаружения новокаина, выделенного из трупного материала, ' рекомендованы микрокристаялоскопические реакции: с 2^-ным водным раствором метилового оранжевого (микрокриоталлы в виде снезышок келтого цвета; предел обнаружения 15 мкг,'предельная концентрация 1:2700); с 1/и-ньсл водшш раствором соли Рейнеке (микрокристаляы'в • виде сростков из тонких палочкообразных кристаллов; предел обнару-. женин 12 мкг, предельная концентрация 1:3000); о Ю^-ным раствором бромной воды (сростки из палочкообразных кристаллов,напоминающих :: форму звезд; предел обнаруления 48 мкг, предельная концентрация.. ' ' 1:800); с насыщенным водним раствором пикриновой кислоты (микрокриоталлы в виде тонких длинных палочек и их скопления; предел обнаружения 8 мкг, предлаьная концентрация 1:5000); с реактивом КР'Ь1 в раствора тиосульфата натрия (микрокристаллы в виде длинных палочек' красного цвета; предел обнаружения 2,5 мкг, предельная-концентрация' . 1:8000). Для обнаружения ПАБК рекомендован меднбпиридиновцй реакт^тз.

(гаЖрокристаллы в виде палочек голубого цвета; предел . 5 мкг, предельная концентрация 1:3000). ' '

2. Обнаружение новокаина,/ДАБК и диэтиламиноэтанола методом хроматографии в тонком слое сорбента

С целью идентификации новокаина, ПАБК и диэтиламиноэтанола, выделенных из объектов химико-токсикологического исследования, нами были изучены условия хроматографдческого обнаружения и разделения их в различных системах растворителей и на пластинках с различными ■сорбентами.

Для обнаружения новокаина, ПАБК и диэтиламиноэтанола на пластинках "Силуфол" предложены системы растворителей: для новокаина -система растворителей, состоящая из диэтилового эфира и 25^-ного рас-« твора аммиака (100:0,5), в которой его значение нг .составляет 0,50, ' а значение н* его метаболитов - ПАБК и диэтиламиноэтанола - 0,00 и 0,27, соответственно. Данная система растворителей позволяет отделить' новокаин от других соединений из группы местноанастезиругадах средств: анестезина, дикаина,. лвдокайна, тримекаина, совкаина, кокаина. Для ПАБК предложена система растворителей этилацетат-хлороформ (6:4) (значение г.* 0,52; в этой системе растворителей значение новокаина и диэтиламиноэтанола составляет 0,00). Для- диэтиламиноэтанола предложена система растворителей даоксан-25#-ный раствор ашна- . ■на (100:0,5) (значение 0,32; в этой системе растворителей значе- ' ние иг новокаина и ПАБК составляет 0,65 и 0,00, соответственно). Данная система растворителей является оптимальной для отделения ново-! каина от диэтиламиноэтанола,после выделения их из объектов химико-токслкологического исследования, поскольку значение иг новокаина и диэтиламиноэтанола составляет 0,65 и 0,32, соответственно.

Детектирование хроматограш производили 1^-ным раствором нитрита натрия в 0,1 н растворе соляной кислоты с последующим 'опрыскиваний ем 0,2/2-нш раствором р-нафтола в /I н. растворе натрия.гидроксида; новокаин и ПАБК образуют пятна оранжево-красного цвета.. При детекти-

рованлп реактивом Драгендорфа, модифицированного по Мунье, содержащего аскорбиновую кислоту, пятна новокаина и диэтиламиноэтанола окрашены в оранжевый цвет»

3. Обнаружение новокаина я ПАБК методом УФ-спектроскопии

Для идентификации новокаина и ПАБК в биологическом материале моамо использовать УФ-спектроскопию, что было установлено после изучения, аровед-.зного на этанольных-растворах этих соединений. Макси. мумы светопоглехцения новокаина наблюдаются при длинах волн 221 и' . , 295 ни, ПАБК - при длинах волн 221 и 290 нм. ,

4. Обнаружение новокаина и ПАБК методом масс-спектроскопии

Для идентификации новокаина и ПАБК, выделенных вэ объектов хи-: . мико-токсиколотического исследования, использовали метод селективно-■ ■•го детектирования ионов (масс-фрагментография), специфичных для ■.'• указанных.соединений.

Получали шсс-спектры электронного удара (Т'С—ЭУ) 'новокаина и; ПАБК на масс-спектрометре "Varian мат-зиа." .снабженном, компьютерной системой SS-1&6 "(США). Пробы исследуемых соединений поступали'методом прямого ввода в источник ионов. 1 ';. 1 ' V '; . На рис.1 приведен масс-спектр электронного удара стандартного •образца новокаина, из которого видно, что. в качестве аналитических .ионов следует признать осколочные ионы, отвечающие фрагментам струй туры молекулы новокаина (m/z)164 - /'I-ti(c2h5)¿/',\ 137 - (H2n- . .. .. п-с6н4-соон)4 (миграция водорода к'карбоксильной группе осутцествля ется по механизму' Мак-Дафферти),-120 -'(н2к-п'-с6н5с0), "99, ^./н2с = • ;cH-K-(c2ii5)2/+, SS - /h2c=n+(С2Н5)2/,. -.которыми/хорошо характеризуется и контролируется! структура лЬвораина..' V,.' '.'■•'■ "V Масс-спектр электронного удара новокаина.выделенного из биол'о-,, гического материала . приведен на рис.2,' из которого видно', .'что и ' здесь присутствуют все. пики ионов,, характеризующие -новокаин (m/z: ' '164, 137,- 120, 99, 86). ' '

100

8060 40

20 0

5В

9-J

120

IJ7

IÜ4

" 100

—i—

200

100

80 60

40

20 j

0

S6

58

99

120

164

100

200

Рио.1. Масс-спектр стандартного образца' новокаина

Рис.2. Масс-спектр новокаина, выделенного из биологического объекта

На рис. 3 приведен масс-спектр электронного удара ПАБК (стандартного образца), из которого видны следующие пики ионов (m/z): 137 - (м) + ,' отвечающий молекулярной массе ПАБК, 120 - (м-он)+, у2 - (н2м-сбн4)+, очевидно, имеющий азотропиниевую структуру, 65 - (с5и5)\ которыми хороио характеризуется и контролируется структура ПАБК. Масс-спектр электронного удара ПАБК, выделенной из биологического материала, приведен на рис.4, из которого видно, что в масс-спектре ПАБК, выделенной из биологического материала,присутствуют все пики ионов, характеризующие ПАБК

100 806040

20

92

05

j2

137

100-] .80' 604020-

120

92

65

52

137

60 80 . 100 120 I4ü Рис.3. ;,;асс-спектр стандартного образца ПАБК .

60 ■ 80 100 1<с0. 140 Рис. 4. • Ма сс-спектр ПАБК, вы-' деленной из биологического объекта .

5. Обнаружение новокаина , ПАЕК и диэ тиха мин оэ тан ола методом газо-жидкостной хроматографии

Идентификацию новокаина, ПАБК и диятилампноэтанола, выделенных из объектов химико-токсикологического исследования, методом газожидкостной хроматографии осуществляли на отечественном газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором, содержащем сталы!ув колонку размером 100 х 0,3 см, заполненную зе-зо на зире1сорогг (80-120 мот).

Обнаружение новокаина методом ИХ проводили в следующих условиях хроматографирования: температура термостата колонок 190 °С, испарителя 250 °С. Б качестве газа-носителя использовали азот, который пропускали со скоростью 60 мл/мин; скорость пропускания водорода 40 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. Скорость бумажной диаграммной ленты во всех опытах составила 720 ;,тм/ч.

Идентификацию новокаина проводили по относительным временам -удерживания. В качестве внутреннего стандарта использовали фенацетин.- Относительное время удерживания новокаина, рассчитанное ко времени удерживания фенацетина, составляет 2,69 относительной единицы. Граница обнаружения новокаина 0,5 мкг/мкл.

С целью изучения влияния других соединений из группы мэстноане-стезирукщнх средств на обнаружение новокаина газохроматографическим методом «<ы проводили исследование в этих условиях дикаина, анестезина, лид'окаина, тримекаина, пиромекаина; установлено, что изученные вещества не мешают обнаружению новокаина, так как тлеют другие времена удерживания.

ПАБК относится к слаболетучим веществам и поэтому не обнаруживается прямым газохроматографическим методом.'В'связи с этим для обнаружения ее методом ХЧХ с^целыо уменьшения ее полярности переводили ПАБК в летучее производное - метиловый эфир ПАБК. Для этого после

полирования ПАБК из биологического материала по разработанной наш методике проводили очистку от соэкстрактивных веществ методом ТСХ. Элюировали ПАБК из сорбента хроматографической пластинки с помощью этанола. Оставшуюся после упаривания элюенга ПАБК переводили в метиловый офир np'i нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение I ч с помощью метанола в присутствии концентрированной серной кислоты. Обнаружение метилового эфира ПАБК методом ГНХ произво-'дили в следующих условиях хроматографирования: температура термостата колонок 180 °С, температура испарителя 250 °С,. скорость пропускания газа-носителя азота 20 мл/мин, водорода 25 мл/мин, воздуха -300 мл/мин.'Качественное обнаружение проводилось по"относительнее времени удерживания, рассчитанному ко времени удерживания фенацетина (0,41 относительной единицы). Нижний предел обнаружения метилового эфира ПАБК 2,5 мкг/мкл раствора.

Обнаружение диэтиламиноэтанола методом ГШ проводила в следующих условиях хроматографирования: температура термостата колонок 75°С, испарителя 100 °С; скорость пропускания газа-носителя азота 60 ия/шя, ■ водорода 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. " '

Качественное обнаружение диэтиламиноэтанола проводили по относительному времени удерживания, рассчитанному ко времени удерживания .'диметиланилина (0,37 относительной единицы). Нижний предел обнаружения диэтиламиноэтанола 0,6 мкг/мкл раствора.

П. Количественное определение новокаина и его метаболитов -ПАБК и диэтиламиноэтанола

Для количественного определения новокаина и ПАБК предложен УФ- j спектрофотометряческий метод, основанный.на измерении оптической • j плотности этанолъных растворов лри длинах волн 295 нм для новокаина j (3^ы 862,8) и 290 нм для ПАЕК = ,1275,16). Подчинение закону ;

Бугора-Ламберто-Бара наблюдается,в пределах концентрации новокаина ".

2-22 мкг/мл, в случае ПАБК - 2 - 16 мкг/мл. Относительная ошибка составляет 1,81;? при определении новокаина л 2,41;3 - при определении ПАБК. Данный метод количественного определения применим в тех случаях, когда искомые вещества выделены из свежего биологического материала, , после очистки их. методом ТСХ от соэкстрактивных соединений.' В тех же случаях, когда новокаин и ПАБК изолированы из -загнившего биологического материала, после очистки их от соэкстрактшлшх веществ методом'ТСХ, мы рекомендуем проводить количественное определение методом произвол-' .1 ной спектрофотометрии, так как с его помощью получаются более точные, . экспериментально доказанные результаты. , ' .;

Помимо УФ-спектрофотометряческого метода, для количественного определения новокаина рекомендован метод газо-кидкостной хроматографии.-Количественное определение новокаина методом Г2Х проводили в условиях хроматографлрования, описанных выше в п. 5. В качестве внутреннего стан-' дарта такие использовали фенацетин. Линейный диапазон при методе.,определения газо-нидкостной хроматографией наблюдается в области концентра-, ций новокаина 2-10 мкг/мкл. Относительная ошибка метода 1,78$.

Для количественного определения дазтиламияоэтанола напет разработан метод ПСХ; определение проводится в условиях хроматографирования, описанных в п.5, по методу внутреннего стандарта (внутренним стандартом также служил диметиланилин). Линейный диапазон наблюдается в области концентраций диэтиламшоэтанола 2-8 мкг/мкл. Относительная ошибка метода 3,27%. . '

III. Изучение условий экстракции новокаина и его метаболитов -ПАБК и диэтиламиноэтанола - из водных растворов

3 качестве экстрагентов были испытаны диэтиловый эфир, хлороформ, ; 1,2-дихлорэтан, гексан, ацетон. Значение рЧ растворов, из которых экс- • трагироваля новокаин, ПАБК и дкэтиламиноэтаиол, создавали о помощью универсальной буферной смеси.-Количество экстрагировяиного но^окагьй

и ПАБК определяли УФ-спектрофотометрическим методом, а даэтиламино этанола - гаэохроматографическим методом.

Результаты исследований показали, что наибольшее количество новокаина и диэтиламиноэтанола экстрагируется при pli 10 диэтиловым эфиром, а наибольшее количество ПАБК - при рН 4,0 rose диэтиловым эфиром.

Изучение влияния электролитов показало, что 10%-ms и насыщен mie растворы натрия хлорида и аммония сульфата повышают степень экстракции новокаина 1.3 водных растворов при использовании даэтило вого эфира и 1,2-дихлорэтана,- но понижают ее при экстракции хлороформом. Степень экстракции ПАБК.в присутствии.10#-ных и насыщенных растворов натрия хлорида повышается, а диэтиламиноэтанола - повиша ется в присутствии растворов натрия хлорида; при использовании рас творов аммония сульфата степень его экстракщш понижается.

Наибольшее количество исследуемых веществ экстрагируется орга ническими- растворителями из водных растворов после 15-20-минутного взбалтывания при трехкратной (выделение новокаина) или четырехкрат ной экстракщш (выделение ПАБК и диэтиламиноэтанола). <

1У. Выделение новокаина и его метаболитов - ПАБК и диэтилт аминоэтанола - из биологического материала

Навеску биологического материала вносят в колбу, заливают 100 мл.смеси экстрагентов, состоящей из ацетона и воды (3:1), ус-таьавливают в аппарат для встряхивания жидкостей и содержимое колбы взбалтывают в теченче 30 мин. Затем объект и жидкость переносят на фильтр, находящийся в_ воронке Бюхнера, заранее соединенной'с колбой Вюрца и вакуумным устройством (водоструйным nacocçM). Над воронкой Бюхнера устанавливают делительную воронку, содержащую сыесь ацетона и вода (3:1). Открывают кран делительной воронки, и объект, находящийся в воронке, постепенно промывают указанной сме-

сью со скоростью 5-6 мл/мин. Контроль полноты элшрования новокаина, ПАБК и диэтиламиноэтанола из биологического материала периодически проверите реакцией образования азокрасителя и реактивом Драге ндорфа." . Для этого 0,5-1 мл вытекакцего элюата наносят на фильтровальную бумагу, проявляют новокаин и ПАБК 1%-аш раствором нитрита натрия в 0,1 н соляной кислоте с последующим опрыскиванием 0,2^-нам раствором р -нафтола в I н растворе натрия' гидроксида (красно-оранжевое окрашивание). Дизтиламиноэтанол проявляют реактивом Драгендорфа, модифицированным по Мунье (оранжевое окрашивание).

Собранный такшл образом элюат переносят в колбу и добавляют кристаллический натрия хлорид до насыщения жидкости (для разделения фаз).

I

Верхний ацетоновый слой отделяют с помощью делительной воронки в фарфоровую чашку и ацетон упаривают при температуре 50 °С на водяной бане. Водный остаток в фарфоровой чашке прибавляют к водно-солевому извлечению, находящемуся в колбе, подщелачивают 25$-ным раствором аммиака до рН 10,0 и экстрагируют'диэтиловым эфиром (4 х 40 мл) новокаин и дизтилашшоэтанол.

Полученные эфирные экстракты объединяют и упаривают растворитель « досуха. Остаток растворяют в небольшом объеме (0,5-1 мл) ацетона и подвергают хроматографической очистке в тонком слое сяликагеля марки , ЛС 5/40. Для этого на стартовую линию хроматографической пластинки наносят ацетоновый раствор в виде полосы, а рядом наносят по I капле (по 50 мкг) стандартных растворов новокаина и диэтиламиноэтанола. Хроматографирование проводят в системе растворителей диоксан-25#-ный раствор аммиака (100:0,5). После высушивания пластинок.на воздухе метчики проявляют реактивом Драгендорфа, модифицированного по Мунье. При этом образуются два пятна оранжевого цвета: значение пг первого пятна 0,32 (дизтиламиноэтанол),.второго -0,65 (новокаин).

Элюирование новокаина и диэтиламиноэтанола'по отдельности про-

ьодят-этанолом. Полученные элюаты используют для идентификации и ко, ллче стие'идого определения новокаина и диэтиламиноэтанола (см. Прило-■ жи'ле). -.,.-.

; -'Для выделения ПАБК поступают следущим образом. Оставшийся в кодбо вбдний остаток подкисляют концентрированной соляной кислотой .до рП 1-2 и нагревают на водяной бане в течение I ч с целью гидролизу • связанной ПАБК. Затем кислотность водного извлечения усредняют •до рН'4,0, добавляя 25%-шй раствор аммиака, и экстрагируют диэтило-вым офиром,(4 х 40 мл). Эфирные экстракты объединяют и упаривают в . фарфоровой' чашке досуха. Для очистки ПАБК от соэкстрактивных веществ остаток,в' фарфоровой-.чайке растворяют в небольшом объеме ■ (0,5-1 мл) ■.ацетона и проводят хроматографическуга очистку в тонком слое силика-голя ¡Арки ЛС 5/40, в оистаме растворителей этилацвтат-хлороформ (6:4) ' Злипровацие ПАБК проводят этанолом, затем этот раствор используют для обнаружена»*'я количественного определения ПАБК (см. Приложение). •'. результаты этих' исследований продставлены в табл. I.

' :. ;' " ' ' .- Таблица I ■ ..'

, 'Определение новокаина, ПАЕК и диэтиламиноэтанола, выделенных' ' •.г '., при созксстяом присутствии из биологического материала (добав-' лено.по Ю да каждого вещества) , ,

, 'Онрй'доле-:Иотрологи- :Опраделе-:!натрологи-;Опраделе:!Аетродоги-''но ново- :ческая • : но ПАБК :ческая :но диэтшческая • каина' :характерно-: . • :характерно:ламино- :характерис-

' '■ ' тика ' :_J_ :тика : этанола :тика ■ ';

мг ■ :■. i _-' : мг :■ :_: мг ;.Г~:_■ ■ '

• 5,45 54,6 ''.х'=/ 58,44 5,04 5.0,4 х- = 49,12 4,01 40,1 х = 41,68 0,41:64,3 • S = 4,08 ■ 4,^3 47,3 5 = 1,64 4,32 43,2 ' £ = 2,65 •' ,' 5,67 56,7 : S;=', 1,82 4.30 48,0 0,73 4,54 45,1 S;= 1,18 ■ 6,1.3 61,3 5,07 ''. ,5,12 51,2: 1,66 3,87 38,7 *><= 3,28-, -5','56 55,6'.'A -±8,68 .',4,87-46,7 A =+3,46 4,10 41,0 A =+7,87 , *—;--—~—1-;--—!——-'—:—•—:----т--—^—

lía. Выделение, новокаина и его метаболитов - ПАБК и диэтил-'..'. ' ашшоэта'цола из' биологических' жидкостей.

. Основываясь на результатах эксперимент шъных данных,, полученных '■ярк окстракциц новокаина, ПАБК и диэтиламиноэтанола из водных раст-

воров, мы выбрали диэглловый эфир в качестве экстраганта для выделения искомых веществ из крови и мота. Экстракцию из 5 мл крови или ■ 10 мл мочи проводили диэтиловым эфиром (новокаин и дкэтиламиноэта- . цол при рН 10,0, ПАБК при р!1 4,0). Прежде чем выделять ПАБК из крови и мочи, объект подвергали нагреванию в течение I ч при значении рН среды, равном 1-2, для гидролиза связанной'ПШ. Затем проводили экстракцию диэтиловым эфиром при 'значения рЯ 4,0.

Перед проведением анализа на нозокаш, ПАБК и диэтиламиноэта- '

I ■

нол в полученных экстрактах подвергали их предварительной хромато-графической очистке в тонком слое силикагеля марки ЛС 5/40. Крличе-ственное определение выделенных и'з биологических жидкостей новокаи- ' на и ПАБК проводили методом производной спектрофотометрии, a диэтиламиноэтанола - методом газо-явдкостной хроматографии.

Результаты этих исследований представлены в табл. 2. .

Таблица 2

Определение новокаина, ПАБК и диэтиламиноэтанола, выделенных ' при совместном присутствии из биологических жидкостей (кровь,, - моча)

К биожидкости', прибавлены

.На й д

д*:' А ; £ : s*; лк: А

Новокаин '87,18 0,98 2,72 3,12 68,85 0,89 2,47 3,37 ПАБК 76,6 1,08 3,00 3,91 63,44 0,93 2,59 4,08

Диэтиламино-

этанол 61,96 0,82 2,28 3,68 54,2 1,24 3,45 6,37

У. Сохраняемость новокаина и его метаболитов - ПАБК и

диэтиламиноэтанола -в биологическом"материале и '.• ориентировочное распределение в органах отравленных

животных ■ '

Проведенные наш эксперименты показали, что новокаин сохраняется в объектах.биологического происхождения в течение 5 сут. Исходя

■ из полученных данных, мсием отметить, что при исчезновении новокаи-

■ па, ''роляадогося лостюйким сложным эфиром, под влиянием гнилостных процессов образуются метаболиты - ПАБК и дпэтиламиноэтацол, - которые., дольша сохраняются в загнившем материале: ПАБК до 180 сут., даэтгламииозтанол - до 30 сут. Исследования, проведенные при изучении сохраняемости новокаина в биологическом материале при консервации его этанолом, показали, что при этом сохраняемость новокаина увеличивается до 270 сут. На основании полученных результатов считаем'целесообразном проводить консервацию труйного материала этано-;ло.м, еолн .предполагается проводить хишко-токсикологический анализ веэдетвйннж доказательств спустя несколько дней после изъятия трупного 'материала. ■

■ f Исследования до ориентировочному распределению новокаина и ег .метаболитов (П.АЕК к диэтиламшюэтанол), проведенные нами, в органа 'тканях.« биологических жидкостях кроликов, отравленных новокаином ":(в.чутри,1,точное введение), показали, -что после поступления в орга-•'¡ новокаин, бистро гидролпзуется, и его удается определять толы* В-почках, ;ыоче, иногда в мышечной ткани в участка введения. Один е .-метаболитов - ШШК - определяется в моче, почках, мышечной ткани s • други'. органах, второй изученный «зми метаболит - диэтиламиноэтанс - определяется в.основном в почках и моче.

: ; ' "'.' ОБЩИЕ вывода ' .

• ' *!.• Для обнаружения новокаина, а такие его метаболита - п-амш

'бензойной .кислоты в одаюй навеске биологического объекта рекомонд< ' » -

вяны из зимяческих методов идентификации: для новокаина микрокрис ; таллоскоп'ич'йслие реакции с растворами метиловогб оранжевого, бром .нол воды, соли Рейнске, 'пикриновой слоты, КРЫ3 в тиосульфате н рля; для 'ПАБК 7'реакция с меднопиридиновым реактивом. 1 '.

Новокаин и его метаболиты - п-амияобензойная кислота и.дизтиламиноэтанол, - выделенные из объектов хииико-токсикологнчаского •' ■ исследования, могут быть обнаружены физико-химическими методами:' ' тонкослойной хроматографией (новокаин, ПАБК, дизтиламиноэтанол),' спектроскопией в УФ-области спектра, масс-спектроскошгей (новокаин, ПАБК), газо-жидкостной хроматографией (новокаин, ПАБК, диэтилашшо-этанол. ' ' 1 '

2. Тдя количественного определения новокаина и п-аминобензой-ной кислоты, выделенных из объектов химико-токсикологического исследования, рекомендован спектрофотометрический метод в УФ-области спектра, основанный на измерении оптической плотности этанолышх растворов новокаина и п-аминобензойной кислоты при длинах волн 295 и 290 нм, соответственно. Относительная ошибка метода составляет при определении новокаина 1,81$, при определении п-аминобензойной кис-' лоты - 2,415?. При исследовании загнивших биологических объектов рекомендовано проводить количественное определение новокаина и п-аминобензойной кислоты методом производной слектрофогометрии пос- ■ ле очистки подученных вытяжек методом-хроматографии в тонком слое сорбента.

Рекомендовано проводить определение новокаина методом гаэо-жлдкостной хроматографии. Линейный диапазон наблюдается в области концентраций новокаина 2-10 мкг/мкл. Относительная ошибка метода 1,78.3. .

Для количественного„определения метаболита новокаина - диэтиламиноэтанола - разработан метод газо-яидкостной хроматограф™. Опре- ; деление проводят после предварительной очистки выделенного даэтил- ; ■ амяноэтанола методом хроматографии в тонком слое сорбента. ЛипеШшй диапазон наблюдается з области концентраций диэтилг-миноотаполл 2-8 мкг/мкл. Относительная ошибка метода 3,27/4.

, 3. Изучены условия экстракции новокаина и ого метаболитов (п-'аминобензойной кислоты и диэтиламиноэтанола) из водных растворов ■орпаничес:иаи растворителями в зависимости от различных факторов: рН среда, природы растворителя, присутствия электролитов, продол-• жительности' и кратности экстракции.

! ' .'• Устако'злоно, что для экстракции изучаемых соединений из вод-

г '

'■них расглороз целесообразно использовать диэглловый эфир в качество экстрад'снта при значении рН 30,0 (для новокаина и даэтшшпшо-; этанола) или рП 4,0 (^ля л-аыинсбензойной кислоты).,

• 4.' Проведено сравнительное изучение способов изолирования но-'вокапна, п-аюшобеизоШой кислоты и диэтиламиноэтанола из биологического материала общепринятыми метода!.« к установлена низкая степень 'выделения ш из внутренних органов: по методу В.Ф.Крамаренко новокаин,' ПАБК и дпйтшшииноэтанол изолируются на 23,74; 9,26 и ,32,9$;. по мот оду А.А. Васильевой - на 13,5; 2,96 и 30,56,«; по мето-17 ,Стаса-0тто на 1.4,18; 22,84 и 22,44$, соответственно.

• 5. Разработа'па методика изолирования новокаина, п-аминобензой-ной'Кислоты и диэтиламиноэтанола из одной навески биологического . материала при их одновременном присутствии' с использованием в каче< ' отче экстраген.та вода ого ацетона. Методика позволяет выделить ново, канн, п-аминобеизойную кислоту и диоткдаииноэтанол соответственно ■ на 58,44; 49,^.2 и. 42,8$. При этом нижний предел определения новокЗ иг'и п-аминобонзойной кислоты составляет I мг в 100 г органа, да-.'•этплашшоэтанолэ - 5 до? в 100 г органа.

6,. Разработаны способы изолирования новокаина и его метаболи-; ?ов,'-..п-аминобензойной кислоты и диэтиламиноэтанола - из ^овр и . копи, которые пезаодяэт выделить иг крови 87,1 новокаина,'' 76$ п-ами нобрнзойной'кислоты и" 61$ диэтиламиноэтанола; из. мочи - 89$ новока .кна, 63$,п-аминобеизойцоМ кислоты-и 54$ -тдетилашшоэтанола, - и

установлены их пределы обнаружения и определения. ; '

4 j

7. Разработана методика очистки методом хроматографии вг тон- ■ ком слое сорбента (силикагель) новокаина, п-аминобензойяой кисло-' ты и дизтиламинозтанола, выделенных из биологического материала в

и биологических жидкостей. '

8. Изучены вопросы сохраняемости новокаина и его'метаболитов -п-аминобензойной кислоты и дизтиламинозтанола - в биологическом' • материале. Установлено, что при хранении биологического материала • новокаин быстро разлагается и определяется в течение 5 суток в среднем около 2%, а его метаболиты п-аминобензойная кислота и ди-

этиламиноэтанол, образующиеся в результате гидролиза новокаина, сохраняются в биологическом материале дольше (соответственно 180 и 30 суток) и определяются в-течение этого времени на 2,16 и 2,51$. Консервация объекта этанолом пролонгирует сохраняемость новокаина до 270 суток, после этого периода он определяется в среднем на 8,22$.

Изучение ориентировочного распределения новокаина в организме' отравленных животных показало, что новокаин после поступления в организм быстро расщепляется и в нативной форме определяется в почках,", моче, мышцах в участке введения. Метаболиты (п-аминобензойная кислота и диэтиламиноэтанол) определяются в моче, почках, крови и других органах, что должно учитываться при направлении объектов на судебно-химическое исследование при подозрении на отравление новокаином.. , ■ •..■•'. -•'• •' По теме -диссертации'опубликованы следующие работы:_

: I. Садшсов З.К., Ташпулатов А.КЗ., Муминов A.A. К вопросу о доказательстве новокаина в химико-токсикологическом исследовании ; биологического объекта // Современные лабораторные метода исследования 'судебно-медицинских объектов. Сборник научных трудов. -Ташкент, 1989. - С.65-71.

2'.Садиков З.К. Сравнительное изучение методов изолирования V новокаина и п-ашшобензойной кислоты из биологического материала //.'Тез. докл. 1Д научной коис^еревдш молодшс ученых и специалистов ■Ташкентского.- фарм. ин-та, посвященной 90-летию со дня рождения пр'о^ессора А.М.Муртазаева, февраль 1990. - Ташкент. - С;82.

", 3.,,Садиков, З.К. Изучение экстракции новокаина и п-аминобен-■ .зси-аюй кислоты органическими растворителями // Там же. - С.83. "

Приложение I

СХЕМ

хяшко-токсикологлчсского исследования . биологического штеинала на новокаин и его метаболиты (ПАБК, диэтиламшгоэтанол)

¡Биологически»; I объект

(Изолирование смесью растворителей ■_аде тон-вода (3:1)__

Насыщение подио-пце тоновол вытя.-скл! кристалличоскю.; натрия хлоридом I

)тделение и упаривание1 ацетоновой вытяжш

Водный остаток поело упаривания ацетона

Пода'слачлваш1о~вода1о-со.71езого раствора .до рЯ 10 и, экстракце.»'

Отдаление эфирного экстракта и"ого упаривание досуха IНОЗОКЛШ!, ЙЮТШШ.'ГИ-ИОЭТДНСУЛ)

Эчистка и разделение методом ТОХ

Злтаирование -ЮЗОХМНА

|Эдшоонание I ЩИЭТ&ШКНО-ЭТА1ГОДА

Подкяслзшго водно-солевого извлечения до рЛ 2,нагроззш:е в течение Г часа .

У'Средненио раствором аммиака до рН 4, экстракция даэтило-1

ВНМ Э-'ОИРОМ _ 1

Количе с тв екное определение методом 1Т-;Х

'Огдалоние эшряого экстракта и"его упа-]зивание' досуха (ПАБК)

Очистка остатка мо-тодом ТСХ.элкмроза-диб из сорбента

Качественное! эбнару.секив | Количественное определение методом производной спектро-оото-метряи

[икрохри- ••кошчос-■¡те реакгт 1/5-спакт"П0СХ0ПИ21

Количественное ¡опоз деление [методом произ-1 ¡водной спект- ; |р0;Т)0Т0г,:с-?р:гя 1.

с медне-щрзддаоннм реактивам

1 [Насц-.спект рометрия