Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследование золпидема в химико-токсикологическом отношении

На правах рукописи

ЕГОРОВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛПИДЕМА В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 2 МАЙ 2011

ПЕРМЬ 2011

4845187

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждени высшего профессионального образования «Пермская государственна фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохраненш и социальному развитию».

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Хомов Юрий Александрович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ярыгина Татьяна Ивановна, ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава»

кандидат фармацевтических наук, доцент Захарова Людмила Андреевна, Управляющая компания «Медисорб Групп», г. Пермь

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Первый Московский

государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития РФ»

Защита состоится «17» мая 2011 г. в 13 часов на заседани Диссертационного совета Д 208.068.01 при Государственно образовательном учреждении высшего профессионального образовани «Пермская государственная фармацевтическая академия Федеральног агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермско государственной фармацевтической академии по адресу: г. Пермь, ул Крупской, д.46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФ http://www.pfa.ru «/¿Г» апреля 2011 г.

Автореферат разослан апреля 2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.068.01, кандидат фармацевтических наук,

доцент ^ И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема нарушений сна (инсомния) продолжает сохранять свое медицинское и социальное значение. Расстройства, вызванные инсомнией, лидируют по распространенности и влиянию на жизнедеятельность человека.

Некоторые авторы считают, что нарушениями сна страдает почти половина населения планеты. Поэтому снотворные средства (гипнотики) и способы лечения инсомний являются предметом постоянного внимания специалистов и врачей.

Появление нового третьего поколения снотворных препаратов, в том числе производных имидазопиридина, стало значительным шагом в лечении инсомний. Одним из главных представителей этого класса является золпидем, который широко и эффективно используется в медицинской практике за рубежом, а в последние годы и в России.

Препарат хорошо переносится, но в связи с нежелательными побочными явлениями со стороны центральной нервной системы (спутанность сознания, галлюцинации, эйфория, нарушение координации движений, антероградная амнезия), может быть использован в немедицинских целях. Побочные явления проявляются особенно сильно при превышении доз.

При одновременном применении с препаратами с угнетающим действием на ЦНС (другие снотворнные, седативные, антигистаминные средства, алкоголь) происходит взаимное усиление действия, что является причиной интоксикаций различной степени тяжести. При передозировке и длительном применении вызывает зависимость и привыкание. Известны случаи острых и смертельных отравлений.

В связи с этим золпидем имеет токсикологическое значение. Для своевременной и объективной диагностики интоксикаций, учитывая нехарактерность клинической картины, особое значение приобретают результаты химического анализа.

Критический обзор доступной литературы показал, что фармакологическому и клиническому изучению золпидема посвящена значительная часть литературы, информация же о его химико-токсикологическом анализе недостаточна. Все названное делает актуальным разработку методик выделения золпидема, идентификации и количественного определения его из биологических жидкостей и субстратов для целей клинической лабораторной диагностики и химико-токсикологического анализа при злоупотреблениях и экспертизе отравлений.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы является исследование по разработке и оптимизации методик изолирования, обнаружения и количественного определения золпидема для нужд его химико-токсикологического анализа.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Теоретически прогнозировать и экспериментально подтвердить оптимальные условия изолирования золпидема и применить полученные данные для разработки методик выделения его из биологических объектов.

- Предложить эффективные способы очистки золпидема, выделенного из биологических объектов.

- Провести изучение хроматографического поведения золпидема на различных сорбентах и в различных системах растворителей ВЭТСХ с целью введения в ХТС скрининг.

- Исследовать возможности идентификации золпидема в извлечениях из биосубстратов с помощью химических и современных инструментальных методов.

- Разработать чувствительные методики количественного определения золпидема с применением УФ-спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии - масс-спектрометрии.

- Изучить пригодность разработанных методик обнаружения и определения для химико-токсикологического анализа золпидема.

Научная новизна. Впервые разработана научно-обоснованная методология химико-токсикологического анализа биологических объектов при интоксикациях золпидемом.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность прогнозирования оптимальных условий экстрагирования золпидема в зависимости от рКа, рН среды и природы органического растворителя.

Изучены хроматографические параметры золпидема на пластинках ВЭТСХ, Сорбфил, Merck, Силуфол и разработаны условия его обнаружения при ХТС. Установлено, что золпидем укладывается в условия ХТС скрининга лекарственных соединений, имеющих токсикологическое значение.

Разработаны методики идентификации золпидема на основе реакций окрашивания и методов ВЭТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ИК- и УФ-спектроскопии.

Изучены спектральные характеристики золпидема в различных растворителях, разработаны методики его количественного определения на основе УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГХ/МС и приведены параметры валидационной оценки.

Разработаны схемы химико-токсикологического анализа биологических объектов при диагностике интоксикаций золпидемом.

Установлено влияние процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках хранения.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Разработанные методики пробоподготовки, изолирования, очистки извлечений, обнаружения и количественного определения золпидема

рекомендованы для использования в химико-токсикологических лабораториях для аналитической диагностики отравлений, а также в учебном процессе на кафедрах токсикологической и фармацевтической химии фармацевтических ВУЗов.

По результатам исследований подготовлен проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ золпидема в биологических жидкостях».

Методики химико-токсикологического анализа золпидема внедрены в практику работы судебно-химического отделения ГУЗОТ Краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы, г. Пермь; СХО Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Бурятия, г. Улан-Удэ; СХО ГУ Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Марий-Эл, г. Йошкар-Ола; Государственного клинического лечебно-профилактического учреждения «Бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Киров; а также в учебный процесс на занятиях интернов-аналитиков на кафедре фармацевтической химии ФДПО и ФЗО и токсикологической химии Пермской государственной фармацевтической академии.

Разработанные методики включены в практику судебно-медицинских и химико-токсикологических лабораторий через постоянно действующие курсы специализации и усовершенствования врачей-лаборантов и врачей судебно-медицинских экспертов в региональном учебно-методическом центре аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ Пермской государственной фармацевтической академии (2006-2009 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 11 статей, из которых - 2 в изданиях перечня ВАК.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены с опубликованием на 2-nd Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacology (Perm, 26-27 October 2006); на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)», Ростов-на-Дону, 16-17 октября 2006 г.; на XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2007, 2008 гг., Москва); на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (27-28 ноября 2007 г., Пермь); на научно-практической конференции «Фармация XXI века: достижения, проблемы и пути их решения» (25-26 апреля 2008 г., Санкт-Петербург); на Российской научно-практической конференции ПГФА, проводимой в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» (13-15 ноября 2008 г., Пермь); на Межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА (23-24 апреля 2009 г., Санкт-Петербург); на X Международном научном конгрессе «Здоровье

и образование в XXI веке. Инновационные технологии в биологии и медицине», посвященном 50-летнему юбилею РУДН, Москва, 9-12 декабря 2009 г.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава». Номер государственной регистрации 01.9.50 007417. Тема диссертации утверждена на заседании ученого совета протокол №4 от 28.12.2006г.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 26 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающего 170 источников, из них 82 — на иностранных языках, и приложения.

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе (обзор литературы) представлены общие сведения о золпидеме и способы его анализа.

В главе 2 дано краткое описание объектов и методов исследования.

В 3 главе представлены способы обнаружения и определения золпидема на основе методов ВЭЖХ, вариантов НФ- и ОФ- ХТС, ИК-, УФ-спектроскопии, ГХ, ГХ/МС.

4 глава посвящена изолированию, обнаружению и определению золпидема в трупном материале.

В 5 главе показана применимость разработанных методик для анализа биологических жидкостей, в том числе образцов реальной мочи (после принятия терапевтических доз золпидема) методами ХТС, УФ-спектроскопии, ВЭЖХ и ГХ/МС. Представлены параметры валидационной оценки методик определения. Проведено исследование по изучению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения проб. Составлена схема химико-токсикологического анализа золпидема в биологических жидкостях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение оптимальных условий изолирования золпидема из биологических объектов в зависимости от показателя ионизации, рН среды и природы органического растворителя.

2. Результаты экспериментальных исследований по разработке реакций окрашивания, ВЭТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопии и ГХ/МС. УФ-спектрофотометрическая, ВЭЖХ и ГХ/МС методики количественного определения золпидема, разработанные применительно к анализу биологических сред.

3. Данные по выяснению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках хранения.

4. Схема и общий методологический подход к химико-токсикологическому исследованию биологических субстратов при интоксикациях золпидемом.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Способы обнаружения н количественного определения

золпидема

При исследовании избрано направление комплексного использования современных физико-химических методов в сочетании с традиционными химическими реакциями с целью выявления наиболее чувствительных и специфичных к задачам химико-токсикологического анализа золпидема.

МКС и реакции окрашивания

Для обнаружения золпидема было изучено отношение его к 20 осадительным реактивам. Со многими (12 из 20) из исследованных реактивов золпидем дает аморфные осадки. Наиболее чувствительными являются реакции с реактивами Драгендорфа (0,57 мкг вещества в пробе) и золотохлористоводородной кислотой (0,50 мкг). Осадков с кристаллическим строением не наблюдалось ни с одним из примененных реактивов.

Далее изучалась возможность применения для обнаружения золпидема реакций окрашивания. Исследовано отношение к 10 реактивам (концентрированные азотная, серная, хлористоводородная кислоты, реактивы Марки, Фреде, Манделина, Эрдмана и др.).

Наиболее чувствительной является реакции с реактивом Марки, (наблюдается красно-оранжевое окрашивание, открываемый минимум — 13 мкг). Реакция была использована в дальнейшем для обнаружения зон локализации золпидема при ХТС. Предел обнаружения золпидема предлагаемой реакцией в хлороформных извлечениях, полученных при изолировании из биологического материала, составляет в моче - 0,22 мг, в печени - 0,30 мг.

Хроматография в тонком слое сорбента

Далее исследована возможность доказательства золпидема методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках ВЭТСХ, Сорбфил, Силуфол, Merck в нормально-фазном варианте и обращено-фазном варианте на пластинках плазмахром с привитой фазой СЗ в индивидуальных растворителях и различных системах комбинированных растворителей, применяемых при ХТА лекарственных и наркотических веществ.

Для детектирования зон локализации золпидема на хроматограмме использовали:

визуальное наблюдение пластинки в фильтрованном УФ-свете при X 254 и 365 нм. При X 254 нм (поглощение) наблюдали темно-фиолетовые пятна (предел обнаружения - 0,30 мкг); при X 365 нм (свечение) наблюдали пятна, проявляющиеся в виде сиреневой флюоресценции (предел обнаружения - 0,18 мкг);

- обработку реактивом общегруппового назначения - реактивом Драгендорфа по Молдаверу (коричневато-оранжевые пятна, предел обнаружения - 0,35 мкг);

- обработку наиболее специфичным реагентом - реактивом Марки (капельно, наблюдается красно-оранжевое окрашивание, предел обнаружения - 7,0 мкг).

Установлено, что в НФ варианте в исследованных 11 индивидуальных растворителях золпидем не обладает достаточной хроматографической подвижностью, оставаясь в основном вблизи стартовой линии.

При исследовании в комбинированных системах растворителей хроматографическая подвижность золпидема на пластинках ВЭТСХ проявляется в интервале от 0,38 до 0,77 при значении 0,64 в общей универсальной скрининговой системе толуол - ацетон - этанол - 25% раствор аммиака 45:45:7,5:2,5 и скрининговой для азотсодержащих соединений основного характера системе диоксан - хлороформ - ацетон

- 25% раствор аммиака 47,5:45:5:2,5 (ЯГ 0,67), которые были избраны нами в качестве базовых для Х'ГА золпидема в биологических объектах.

Системы хлороформ - 25% раствор аммиака 25:15 и этилацетат-метанол -25% раствор аммиака 17:2:1 можно считать оптимальными (ЯГ 0,54 и 0,38 соответственно) для золпидема и могут быть использованы при направленном анализе в качестве подтверждающих.

В обращенно-фазном варианте использовали водно-спиртовые смеси. Детектирование золпидема проводили теми же способами, что и в нормально-фазном варианте. В общей системе растворителей этанол -вода - 25% раствор аммиака 6:5,5:0,5 золпидема 0,56. При

подтверждающем исследовании в частных системах, отличающихся соотношением полярных компонентов, величина ЯГ золпидема колеблется от 0,39 до 0,69. Из частных систем при ОФ наиболее оптимальна для золпидема система этанол - вода - 25% раствор аммиака 8:1:0,5 (Н^0,61).

Четкие пятна и аналогичные значения наблюдались в обоих вариантах на каждом виде сорбента как в зоне метчика, так и в зонах хроматографирования исследуемых извлечений.

Исследование золпндема методом ГХ/МС

Исследование золпидема методом газовой хроматографии масс-спектрометрии проведено на газовом хроматографе, оборудованном кварцевой капиллярной колонкой с неполярной неподвижной фазой. Для обнаружения использован масс-селективный детектор (МСД).

Условия хроматографического разделения: хроматограф Agilent 6850; газохроматографическая колонка капиллярная HP-5MS с внутренним диаметром 0,25 мм, длиной 30 м; МСД Agilent 5973N. Газ-носитель гелий. Скорость потока газа-носителя 1,5 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса 250°С и 280°С соответственно. Температура колонки - градиент 70°С (2 мин) — 280°С, скорость программирования 20°С в минуту. Ввод пробы ручной, без деления потока газа-носителя. Объем пробы 1 мкл в спирте этиловом при концентрации в растворе 100 нг/мл. МСД работает в режиме электронного удара при 70 эВ.

Получена хроматограмма (время удерживания золпидема 9,65 мин), проведена регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования от 45 до 450 аем. Данные представлены на рисунках 1,2. Характеристические ионы при выделении фрагментограммы, со временем удерживания 9,65 мин — 235, 307, 219, 92 m/z (масс/заряд). Данные приведены в порядке уменьшения m/z. При сравнении с масс-спектрами библиотек совпадение времени удерживания и масс-спектра составляет 98%.

Abundance

Рисунок 1 - Хроматограмма золпидема ГХ/МС

Abundance

Scan 1380 (9.65 min) : 02149. D (-1392) (-)

eooo oooo 7000

eooo eooo

4000 ЭООО 2QOO' 1000 о

Abundance

es oz *

T

gte вяз вао доз ^

eo 100 120 1ЛО ISO -I во £00 220 2ДО 2вО 2flO ЭОО

sooo eooo

TOOO

eooo

HOOO ACOO

зооо 2000 IOOO

#5280: Zolpidem

10O 120 140 leo 100 200 Z20 2-40 280 2ÖO ЭОО

Рисунок 2 - Масс - спектр золпидема

Количественное ГХ/МС определение проводили в тех же условиях, применяя метод внутреннего стандарта (метиловый эфир налидиксовой кислоты).

Режим регистрации — селективный ионный мониторинг по ионам m/z 235, 307, 219 (золпидем) и 188, 215, 246 (внутренний стандарт). Калибровочный график был получен, исходя из соотношений площадей пиков наиболее интенсивных ионных фрагментов, т.е. ионов с величинами m/z 235 (золпидем) и 188 (внутренний стандарт). График линеен в интервале концентраций 0,1-10 мг/л. Предел обнаружения — 10 нг/мл. Предел количественного определения — 25 нг/мл.

Метод ГХ/МС был использован для качественного и количественного определения золпидема в моче.

УФ-спектрофотометрия

Для определения золпидема как соединения, имеющего в своей структуре хромофорные группы, исследована возможность использования метода УФ-спектрофотометрии.

Для снятия спектров готовили стандартные растворы золпидема в соответствующем растворителе с содержанием 18 мкг/мл. Спектры снимались на БресогсМО-М в 1 см кюветах в интервале длин волн 220-330 нм. Раствором сравнения служил соответствующий растворитель. В качестве растворителей использовали воду, 0,1М раствор кислоты хлористоводородной, спирты этиловый и метиловый, хлороформ.

Анализ электронных спектров в различных полярных и аполярных растворителях показал, что золпидем имеет УФ-спектры, характеризующиеся одной полосой поглощения с двумя максимумами для воды, 0,1М раствора кислоты хлористоводородной и спирта метилового (см. рис. 3).

- Спектр в воде, Ш

---Спектр в спирте метиловом, Х>2

---Спектр в НС10.1М, Ш

Рисунок 3 - Спектры поглощения золпидема в воде, спирте метиловом и 0,1М растворе кислоты хлористоводородной

Наличие ярко выраженного максимума абсорбции золпидема в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты при 295 нм (а также в связи с тем, что раствор хлористоводородной кислоты предполагалось далее применять в качестве элюента золпидема с хроматограммы), позволило нам использовать собственное поглощение вещества в разработке спектрофотометрической методики его количественного определения.

Подчинение основному закону светопоглощения при 295 нм наблюдается в интервалах концентраций золпидема от 4 до 32 мкг/мл. Коэффициент корреляции составил 0,9996. Удельный показатель 480. Чувствительность определения 0,21 мкг/мл.

Методика УФ-спектрофотометрического анализа была использована для изучения степени экстрагируемости золпидема органическими растворителями в зависимости от рН среды и для количественного определения золпидема, выделенного из биологических объектов, в том числе из образцов реальной мочи после принятия терапевтических доз.

Метод ВЭЖХ

Метод ВЭЖХ применен нами для идентификации и количественного определения золпидема в обращенно-фазном варианте на основе приборного комплекса «Милихром А-02» с УФ-детектором.

Для решения поставленной задачи использовалась стальная хроматографическая колонка диаметром 2 мм, длиной 75 мм, заполненная обращеннофазным сорбентом марки Силасорб 100-5С18, размер частиц 5 мкм.

При экспериментальной проверке в качестве подвижной фазы избрана смесь состава ацетонитрил-вода в соотношении 65:35 при рН 3 (добавление концентрированной фосфорной кислоты); скорость потока элюента 75 мкл/мин. Для выбора длины волны детектирования был снят спектр золпидема в подвижной фазе в диапазоне длин волн от 190 до 360 нм.

УФ-спектр золпидема в подвижной фазе (см. рис. 4) характеризуется одной полосой поглощения с тремя максимумами (205, 240 и 297 нм) и двумя минимумами (227 и 260 нм). Максимум при 240 нм избран в качестве аналитической длины волны.

Идентификация золпидема строилась на определении хроматографического параметра абсолютного времени удерживания — эта величина является характеристикой вещества в данной хроматографической системе и спектральных соотношений П — которые рассчитывали в режиме двухволновой детекции при 240/300 нм с опорной длиной волны 240 нм. Кроме того, идентификацию проводили по спектру поглощения в интервале длин волн 190-360 нм.

Длина волны, им

Рисунок 4 — УФ-спектр стандартного раствора золпидема в элюенте

Для определения времени удерживания золпидема снимали хроматограммы стандартного раствора 1 мг/мл в подвижной фазе при неизменных условиях:

- подвижная фаза: ацетонитрил - вода 65:35, рН 3;

- температура термостата колонки 35°С;

- постоянная времени детекции - 0,34 сек;

- постоянная скорость потока элюента - 75 мкл/мин;

- объем образца, взятого для анализа - 5 мкл.

В данных хроматографических условиях время удерживания золпидема составляет 2,80±0,014 мин (см. рис. 5), спектральное соотношение 240/300 - 0,538.

Для количественного определения золпидема методом ВЭЖХ использовали метод абсолютной калибровки. Линейная зависимость площади хроматографического пика от концентрации золпидема наблюдалась в интервале от 6,5 до 130 мкг/мл. Коэффициент корреляции составил 0,9998. Расчетная чувствительность обнаружения составила 31 нг/мл.

Время, мин

Рисунок 5 - Хроматограмма стандартного раствора золпидема

Метод ВЭЖХ был использован для качественного и количественного определения золпидема в биологических жидкостях.

2. Изолирование из биологических объектов

Для решения вопроса максимального изолирования соединения из объектов анализа важен процесс прогнозирования оптимальных условий его экстракции, который зависит от ряда факторов: показателя ионизации, коэффициента распределения и др.

По литературным данным рКа золпидема составляет 6,2, что подтверждает основные свойства соединения; log Р 3,85, что показывает наличие у соединения гидрофильных свойств.

При расчете степени ионизации золпидема в процентах при различных значениях рН (данные представлены в таблице 1) установлено, что при рН 1-2 исследуемое соединение полностью ионизировано. Начиная с рН 3, появляется его молекулярная форма, которая достигает 100% при рН 10. Поэтому сделано предположение, что при химико-токсикологических анализах максимальная экстракция золпидема органическими растворителями из водных извлечений должна достигаться при рН 9-10. Степень ионизации золпидема при данных рН минимальна. Однако, в связи с лабильностью соединения в щелочной

среде (наличие амидной группировки) следует предполагать как наиболее оптимальное значение рН среды 8.

Таблица 1 - Степень ионизации золпидема при заданных значениях рН

рН рН - рКа Концентрация катионной формы,%

1 -5,2 В области рН 1-2 золпидем полностью ионизирован

2 -4.2

3 -3,2 99,94

4 -2,2 99,37

5 -1,2 94,06

6 -0,2 61,31

7 0,8 13,68

8 1,8 1,56

9 2,8 0,16

10 3,8 0,02

11 4,8 В области рН 11-14 золпидем полностью неионизирован

12 5,8

13 6,8

14 7,8

Далее нами было проведено экспериментальное подтверждение предположений экстрагируемости золпидема в зависимости от рН среды различными органическими растворителями: хлороформ, метиленхлорид, эфир (как наиболее часто используемые в практике химико-токсикологических анализов). Растворители, имеющие величину диэлектрической проницаемости большую, чем у хлороформа, не исследовались в связи с их значительной смешиваемостью с водой.

Установлено, что золпидем экстрагируется органическими растворителями, достигая максимума экстракции хлороформом 99,50%, метиленхлоридом 99,85%, эфиром 98,43% при рН 8.

Таким образом, как показали экспериментальные данные, хлороформ может служить оптимальным экстрагентом для изолирования золпидема из биологических объектов в общей схеме изолирования при ненаправленных химико-токсикологических анализах. При направленных исследованиях в качестве оптимального экстрагента для золпидема могут быть использованы, кроме хлороформа, метиленхлорид или эфир.

Полученные результаты послужили основой для разработки методик определения золпидема в биосубстратах. Нами использовались приемы экстракции водой, подкисленной щавелевой кислотой при изолировании золпидема из трупного материала. Из крови и мочи изолирование проводили прямой дробной экстракцией метиленхлоридом (хлороформом) при рН 8.

3. Очистка и определение золпидема при химико-токсикологических исследованиях

Вопросы очистки золпидема от сопутствующих балластных веществ предполагалось решать использованием приемов центрифугирования, фильтрования через мелкопористый стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом и хроматографической очистки в тонких фиксированных слоях сорбента.

Хроматографический прием позволил сочетать очистку с предварительной идентификацией и делать последующее обнаружение и количественное определение специфичным.

При решении вопроса о возможности использования разработанных методик в практике ХТА для определения золпидема доказано, что балластные вещества не оказывают заметного влияния на определение и оптическая плотность экстрактов, полученных из контрольных проб, не содержащих золпидем, практически равна нулю.

Разработанные методики при УФ-спектрофотометрическом определении золпидема применены для исследования биологического материала. Анализу подвергались хлороформные экстракты, полученные из щелочного раствора в аликвотах 1/5-1/2 часть от извлечения при затравке 0,5 и 1 мг на 25 гр. печени.

Результаты количественного определения золпидема, изолированного из биосубстрата представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты количественного определения золпидема в печени

Добавлено, мг Найдено,в % Метрологические характеристики

76,82 х = 71,62

70,57 Б = 4,36

0,5 67,19 Эх= 1,95

68,01 еа = 5,42

75,52 Е = 7,57

78,32 х = 76,96

76,24 Б = 4,75

1 69,18 8х=2,12

81,46 еа = 5,89

79,59 Е = 7,65

Как видно из данных таблицы 2, предложенная методика изолирования и определения позволяет выделить в среднем 71,62% и 76,96% золпидема из 25 г органа (ткань печени) при содержании в нем 0,5 и 1 мг анализируемого вещества при относительной ошибке определения 7,57% и 7,65% соответственно.

При исследовании биологических жидкостей УФ-спектрофотометрическое определение проводили в аликвоте 1/5-1/2 часть при затравке 0,25 мг на 15 мл мочи или 5 мл плазмы.

При исследовании биологических жидкостей методом ВЭЖХ определение проводили при затравке 0,1 мг на 2 мл мочи или 2 мл плазмы. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты количественного определения золпидема в моче

и плазме

Добавлено золпидема, в мг Найдено золпидема в % Метрологические характеристики Добавлено золпидема, в мг Найдено золпидема в% Метрологические характеристики

При УФ-спектрофотометрии

На 15 мл мочи На 5 мл плазмы

0,25 89,92 х = 94,11 Б = 2,97 Эх = 1,33 еа - 3,70 Е=3,93 0,25 76,80 х = 78,73 Б = 2,60 Эх = 1,16 еа - 3,22 Е= 4,09

0,25 95,08 0,25 82,40

0,25 96,85 0,25 80,08

0,25 92,12 0,25 78,45

0,25 96,50 0,25 75,92

При ВЭЖХ-определении

На 2 мл мочи На 2 мл плазмы

0,1 94,06 х = 96,40 Б = 2,97 8х = 1,33 8а - 3,70 Е = 3,84 0,1 74,87 х=76,39 Б = 1,82 Бх = 0,81 £а - 2,25 Е = 2,95

0,1 96,73 0,1 77,48

0,1 92,73 0,1 77,70

од 99,00 0,1 73,99

0,1 99,49 0,1 77,90

Разработаны унифицированные методики определения золпидема в биологических жидкостях на основе дробной экстракции метиленхлоридом и хроматографии в тонком слое сорбента, УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ. Методика позволяет определять при УФ-спектрофотометрии: в моче (15 мл) — 89,92-96,85% золпидема; в плазме

18 I

(5 мл) — 75,92-82,40%. При ВЭЖХ определении (2 мл мочи) — 92,7399,49%, в плазме (2 мл) - 73,99-77,90%.

Установлена валидность методик определения золпидема по показателям линейность, специфичность, предел обнаружения и j определения, сходимость и правильность полученных результатов, при ВЭЖХ показана пригодность хроматографической системы. j

4. Исследование образцов реальной мочи после принятия терапевтических доз золпидема

Далее была показана применимость разработанных методик для | доказательства и определения золпидема в образцах реальной мочи после принятия терапевтических доз препарата (1 таблетка с содержанием золпидема 10 мг). Изолирование проводили прямой дробной экстракцией j метиленхлоридом при рН 8. Аликвоты извлечений из щелочного раствора после их концентрирования исследовали хроматографически в тонком слое сорбента (Merck).

А

В

А — метчик золпидема (стандартный раствор 1 мг/мл)

Б — 1/10 часть извлечения для предварительного хроматограф ического теста

В — 1/2 часть извлечения для УФ-спектрофотометрического исследования

Рисунок 6 - Хроматограмма золпидема, выделенного из мочи после принятия терапевтической дозы

ЯГ золпидема, выделенного из образцов реальной мочи, четко соответствует внешнего и внутреннего стандартов ( 0,64).

При анализе образцов реальной мочи помимо золпидема па хроматограммах (см. рис. 6) в исследованных извлечениях обнаруживаются дополнительно 3-4 пятна с меньшей хроматографической подвижностью (вблизи стартовой линии). С известной степенью вероятности появление некоторых из них можно отнести за счет продуктов биотрансформации золпидема в организме человека.

Количественное определение терапевтических уровней золпидема в реальной моче методом УФ-спектрофотометрии проводили после ХТС выделения и элюирования с хроматограммы 0,Ш раствором хлористоводородной кислоты (5 мл).

Спектр золпидема, выделенный из реальной мочи после принятия терапевтической дозы, был идентичен спектру стандартного раствора вещества.

Присутствие золпидема в реальной моче подтверждено также методами ВЭЖХ и ГХ/МС. (Вариант хромато-масс-спектрометрии был использован для исследования золпидема в образцах реальной мочи после выделения ТФЭ).

При изучении влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения проб показано, что золпидем сохраняется в незаконсервированной моче при замораживании проб в холодильнике не менее 12 месяцев. При замораживании проб снижение концентрации составляет до 26% через 1 год. При хранении при +4°С сохраняется до 78% через 2 месяца, при этом наблюдается смещение рН среды до 10-11, что может приводить к щелочному гидролизу и частичной деструкции определяемого вещества. В условиях хранения при комнатной температуре золпидем не обнаруживается уже через 3 месяца при смещении рН образцов мочи до 11-12, что ведет к разрушению лабильного определяемого вещества.

На основании проведенных экспериментальных исследований нами предложены схемы анализа золпидема, применяемых для химико-токсикологических целей.

Схема химико-токсикологического анализа трупного материала на

золпидем

Центрифугирование 2,5 тыс. об/мин, 20 минут Водное извлечение(центрифугат) 25% раствор ЫН4ОН, рН 8

Хлороформ - 3 раза по 10, 10, 5 мл по 10 минут на электровстряхивателе Хлороформный экстракт

Безводный Ыа2804 (фильтрация через стеклянный фильтр)

Объект исследования, печень 25 г

Настаивание с водой 1:2; 2 часа рН 2 (Н2С204)

Обнаружение:

Количественное определение: УФ-спектрофотометрия

ХТС

Реакции окрашивания УФ-спектр, ВЭЖХ ГХ, ГХ/МС

Рисунок 7 - Схема химико-токсикологического анализа трупного материала на золпидем

Схема химико-токсикологического анализа на золпидем в биологических

жидкостях

Моча (15-30 мл для УФ, Кровь (5 мл для УФ,

по 2 мл для ВЭЖХ и ГХ/МС) 2 мл для ВЭЖХ)

Трехкратно

е разбавление водой

25% раствор МН4ОН, рН 8-9 Экстрагирование метиленхлоридом (хлороформом)

Ор! аническая фаза

Фильтрование через

мелкопористый стеклянный фильтр с б/в Ка2804

часть

Обнаружение:

ХТС, УФ-спектр Реакции окрашивания ВЭЖХ, ГХ/МС

Количественное определение

ВЭЖХ-УФ ГХ/МС УФ-СФМ (моча, кровь) (моча) (моча, кровь)

Рисунок 8 - Схема химико-токсикологического анализа на золпидем в биологических жидкостях

ВЫВОДЫ

1. Исследовано отношение золпидема к осадительным реактивам. В 12 из 20 реакций наблюдались аморфные осадки. Наиболее чувствительной является реакция с реактивом Драгендорфа — 0,57 мкг вещества в пробе. При исследовании реакций окрашивания наиболее чувствительной оказалась реакция с реактивом Марки — 13,0 мкг.

2. Проведено углубленное изучение хроматографичеекого поведения золпидема методом ВЭТСХ. Избраны системы растворителей для последующего их использования при ХТА биологических объектов на золпидем. Избраны способы и реакции детектирования золпидема. Определена чувствительность каждого детектирующего реагента. Показано, что при ХТС исследовании золпидем легко идентифицируется по величине красно-оранжевому окрашиванию с реактивом Марки и собственной сиреневой флуоресценции в УФ-свете при 365 нм.

3. Установлена возможность использования методов УФ-, ИК-спектроскопии, ВЭЖХ, ГХ, ГХ/МС для доказательства золпидема.

4. Разработана методика количественного определения золпидема УФ-спектрофотометрией в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты при 295 нм. Определены параметры количественной оценки золпидема методом абсолютной калибровки ВЭЖХ на приборном комплексе «Милихром А-02». ГХ/МС количественное определение проведено методом внутреннего стандарта по наиболее важному ионному фрагменту золпидема 235 т/г.

5. Теоретически прогнозированы и экспериментально подтверждены оптимальные условия выделения золпидема с учетом рКа и рН среды. Показано, что оптимальными экстрагентами для золпидема при ЖЖЭ следует считать метиленхлорид, хлороформ, эфир при рН 8-9.

6. Разработаны условия очистки от соэкстрактивных балластных веществ при ХТА золпидема, заключающиеся в сочетании ХТС с центрифугированием и обязательной фильтрацией аналита через мелкопористый стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом.

7. Высокая чувствительность используемых методов анализа позволила значительно сократить количество исследуемого объекта (особенно при ВЭЖХ и ГХ/МС), минимизировать и оптимизировать процесс пробоподготовки, максимально снизить влияние соэкстрактивных веществ.

8. Продемонстрирована возможность применения разработанных методик для выделения золпидема из биосубстрата (ткань печени) до 7176% из 25 г органа при содержании в нем 0,5 и 1 мг анализируемого вещества; до 78,73% из 5 мл плазмы крови; до 94,11% из 15 мл мочи при содержании в обоих случаях по 0,25 мг золпидема в пробе. Показана применимость разработанных методик для анализа реальной мочи (после принятия терапевтических доз золпидема - 10,0 мг). Представлены параметры валидационной оценки методик определения.

9. Проведено исследование по изучению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения. Установлено, что замораживание проб мочи позволяет продлить сроки хранения объекта для анализа на золпидем до 1 года.

10. Составлены схемы химико-токсикологического анализа на золпидем в трупном материале и биологических жидкостях.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Khomov, Yu. Zolpidem: means of identification under chemical-toxicological analysis / Yu. Khomov, N. Kokcharova, E. Panteleeva, M. Dayech // Fundamental pharmacology and pharmacy - clinical practice / Materials of the 2-nd Russian-Chinese international scientific conferences on pharmacology, Perm. - 2006. -P.170-171.

2. Хомов, Ю.А. Варианты высокоэффективной тонкослойной хроматографии в анализе золпидема / Ю.А. Хомов, Н.В. Кокшарова, Е.И. Пантелеева // «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)», 16-17 октября 2006 г.: материалы ... - Ростов-на-Дону: изд-во ЮНЦ РАН, - 2006. - С. 101.

3. Определение золпидема в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Ю.А. Хомов, Е.И. Пантелеева. Ю.Н. Карпенко, Н.В. Кокшарова // Человек и лекарство: тез. докл. XIV Рос. нац. конгр. Москва, апрель 2007. - М., 2007. - С. 786.

4. Исследования по обнаружению золпидема при химико-токсикологических анализах / Ю.А. Хомов, Е.И. Пантелеева. Н.В. Кокшарова, М.В. Сединина // Вестник ПГФА. Научн.-практич. журнал, г. Пермь. - 2007. - №2 - С. 187-190.

4. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. Ю.Н. Карпенко, Н.В. Кокшарова, М.В. Сединина // «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств». Рос. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА (27-28 ноября 2007 г., Пермь): материалы ... -Пермь, 2007. - С. 222-227.

5. Исследование экстракции золпидема из водных растворов / Е.А. Шилова, С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. Н.В. Кокшарова // «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств». Рос. науч.- практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА (27-28 ноября 2007 г., Пермь): материалы ... - Пермь, 2007. - С.236-241.

6. Аналитическое изучение золпидема спектральными методами / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. Е.Б. Бабушкина, С.С. Катаев, Н.В. Кокшарова // Человек и лекарство: тез. докл. XV Рос. нац. конгр. Москва, апрель 2008. - М., 2008. - С. 567-568.

7. Хомов, Ю.А. К анализу золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // «Фармация XXI века: достижения, проблемы и пути их решения», 25-26 апреля 2008 г.: материалы ... - СПб, 2008. - С. 176-178.

8. Хомов, Ю.А. Количественное определение золпидема в биологических жидкостях с применением метода УФ-спектрофотометрии / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. Н.В. Кокшарова // Рос. науч.- практ. конф. ПГФА, в рамках 14-ой Междунар. выставки

«Медицина и здоровье» (13-15 ноября 2008 г., Пермь): материалы... -Пермь, 2008. - С. 386-389.

10. Егорова, Е.И. Золпидем: возможность зависимости, клиническая лабораторная диагностика / Е.И. Егорова // Межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых " Фармация в XXI веке : эстафета поколений", посвященная 90-летию СПХФА, 23-24 апреля 2009 г. - СПб, 2009. -С. 61-62.

11. Шилова, Е.А. Количественное определение золпидема в моче методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии / Е.А. Шилова, Е.И. Егорова // Вестник ПГФА. - Пермь. - 2009. - №5. - С. 165-167.

12. Химико-токсикологический анализ золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. Н.В. Кокшарова, Е.А. Шилова // Вестник РУДН, серия Медицина. -2009. № 4. - С.469-473.

13. Прогнозирование оптимальных условий экстракции золпидема из биологических проб / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. Н.В. Кокшарова, М. Дайех, М. Алабед // X Междунар. науч. конгресс "Здоровье и образование в XXI. Инновац. технологии в биологии и медицине", посвящ. 50-летн. юбилею РУДН; (09-12 декабря 2009 г.): материалы ... -М„ 2009. - С.155-157.

14. Хомов, Ю.А. Валидация методики ВЭЖХ определения золпидема в биологических жидкостях / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. М. Дайех // Вестник РУДН, серия Медицина. - 2010. - №3. - С. 123-125.

15. Определение золпидема в моче пациентов с использованием методов ВЭТСХ, ВЭЖХ, УФ- , ГХ/МС спектрометрии / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова. Ю.Н. Карпенко, Е.А. Крылова, JI. Мескини // Вестник ПГФА. - Пермь. -2010. - №7. - С. 272-275.

Подписано в печать 14.04.2011 Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,5 Заказ № 52/2011.

Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел./факс. 8-901-266-59-37, (342)282-57-92

Проблема нарушения сна имеет не только медицинские, но и социальные аспекты, важность которых трудно переоценить. С нарушениями сна связано наибольшее число жалоб при любых заболеваниях. Эти расстройства лидируют по распространенности, влиянию на жизнедеятельность, экономическим и временным потерям [38, 39]. У 28-45% популяции встречается инсомния [14]. Другие авторы считают, что нарушения сна отмечаются почти у половины населения планеты [13].

Поэтому снотворные средства (гипнотики) и лечение инсомний постоянно привлекают к себе внимание ' специалистов и практикующих врачей. Интерес к этим проблемам обусловлен высокой частотой нарушений сна у людей всех возрастных категорий, особенно людей пожилого возраста, большим разнообразием причин, вызывающих бессонницу, и проблемами, которые связаны с приемом гипнотиков, как при кратковременном, так и при длительном их применении [1].

Основным вопросом лечения инсомний в настоящее время является не столько недостаточная эффективность применяемых лекарственных средств, сколько недостаточная безопасность лечения этими препаратами [11, 12].

Появление нового третьего поколения снотворных препаратов, в том числе производных имидазопиридина, стало значительным шагом в лечении инсомний [106, 109, 110, 115, 116, 117, 126, 132, 143, 154]. Одним из главных представителей этого класса является золпидем, который широко и эффективно используется в медицинской практике за рубежом, а в последние годы и в России как средство фармакотерапии для лечения нарушений сна [3,4,17,18,36,130,133,144].

Однако любое неоправданное назначение и применение препарата может создавать значительные проблемы для больных. Так в связи с нежелательными побочными явлениями со стороны центральной нервной системы (спутанность сознания, галлюцинации, эйфория, нарушение координации движений, антероградная амнезия), золпидем может быть использован в немедицинских целях. Немедицинское применение препарата может приводить к тяжелой интоксикации, а значительное превышение рекомендованных доз золпидема способно вызывать лекарственный делирий [61]. Несмотря на сравнительно невысокий наркогенный потенциал [61], может вызывать пристрастия и присутствовать в сфере незаконного оборота психоактивных веществ. При одновременном применении с опийными и опиоидными анальгетиками, барбитуратами, антидепрессантами, седативными, антигистаминными средствами, алкоголем наблюдается взаимное усиление действия, что является причиной интоксикаций различной степени тяжести [136, 138, 163, 167, 168].

По данным зарубежных авторов и центра ВОЗ по мониторингу лекарственных препаратов зарегистрированы случаи привыкания, формирования психической и физической зависимости и злоупотреблений золпидемом [23, 90, 102, 168].

В соответствии с решением Постоянного комитета по контролю наркотиков Минздрава Российской Федерации золпидем внесен в список №1 сильнодействующих веществ.

Встречаются случаи острых и смертельных отравлений [118, 121, 128, 137].

В связи с этим золпидем имеет токсикологическое значение. Для своевременной и объективной диагностики интоксикаций, учитывая нехарактерность клинической картины, особое значение приобретают результаты химического анализа.

Критический обзор доступной литературы показал, что фармакологическому и клиническому изучению золпидема посвящена значительная часть литературы [10, 31, 82, 89, 90, 93, 94, 95, 96, 97, 103, 140, 159, 166], информация же о его химико-токсикологическом анализе недостаточна. Все названное делает актуальным разработку методик выделения золпидема, идентификции и количественного определения его из биологических жидкостей и субстратов для целей клинической лабораторной диагностики и химико-токсикологического анализа при злоупотреблениях и экспертизе отравлений.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы является исследование по разработке и оптимизации методик изолирования, обнаружения и количественного определения золпидема для нужд его химико-токсикологического анализа.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Теоретически прогнозировать и экспериментально подтвердить оптимальные условия изолирования золпидема и применить полученные данные для разработки методик выделения его из биологических объектов.

- Предложить эффективные способы очистки золпидема, выделенного из биологических объектов.

- Провести изучение хроматографического поведения золпидема на различных сорбентах и в различных системах растворителей ВЭТСХ с целью введения в ХТС скрининг.

- Исследовать возможности идентификации золпидема в извлечениях из биосубстратов с помощью химических и современных инструментальных методов.

- Разработать чувствительные методики количественного определения золпидема с применением УФ-спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии - масс-спектрометрии.

- Изучить пригодность разработанных методик обнаружения и определения для химико-токсикологического анализа золпидема.

Научная новизна. Впервые разработана научно-обоснованная методология химико-токсикологического анализа биологических объектов при интоксикациях золпидемом.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность прогнозирования оптимальных условий экстрагирования золпидема в зависимости от рКа, рН среды и природы органического растворителя.

Изучены хроматографические параметры золпидема на пластинках ВЭТСХ, Сорбфил, Merck, Силуфол и разработаны условия его обнаружения при ХТС. Установлено, что золпидем укладывается в условия ХТС скрининга лекарственных соединений, имеющих токсикологическое значение.

Разработаны методики идентификации золпидема на основе реакций окрашивания и методов ВЭТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ИК- и УФ-спектроскопии.

Изучены спектральные характеристики золпидема в различных растворителях, разработаны методики его количественного определения на основе УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГХ/МС и приведены параметры валидационной оценки.

Разработаны схемы химико-токсикологического анализа биологических объектов при диагностике интоксикаций золпидемом.

Установлено влияние процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках хранения.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Разработанные методики пробоподготовки, изолирования, очистки извлечений, обнаружения и количественного определения золпидема рекомендованы для использования в химико-токсикологических лабораториях для аналитической диагностики отравлений, а также в учебном процессе на кафедрах токсикологической и фармацевтической химии фармацевтических ВУЗов.

По результатам исследований подготовлен проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ золпидема в биологических жидкостях».

Методики химико-токсикологического анализа золпидема внедрены в практику работы судебно-химического отделения ГУЗОТ Краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы, г. Пермь; СХО Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Бурятия, г. Улан-Удэ; СХО ГУ Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Марий-Эл, г. Йошкар-Ола; Государственного клинического лечебно-профилактического учреждения «Бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Киров; а также в учебный процесс на занятиях интернов-аналитиков на кафедре фармацевтической химии ФДПО и ФЗО и токсикологической химии Пермской государственной фармацевтической академии.

Разработанные методики включены в практику судебно-медицинских и химико-токсикологических лабораторий через постоянно действующие курсы специализации и усовершенствования врачей-лаборантов и врачей судебно-медицинских экспертов в региональном учебно-методическом центре аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ Пермской государственной фармацевтической академии (2006-2009 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 11 статей, из которых - 2 в изданиях перечня ВАК.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены с опубликованием на 2-nd Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacology (Perm, 26-27 October 2006); на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)», Ростов-на-Дону, 16-17 октября 2006 г.; на XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2007, 2008 гг., Москва); на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (27-28 ноября 2007 г., Пермь); на научно-практической конференции «Фармация XXI века: достижения, проблемы и пути их решения» (25-26 апреля 2008 г., Санкт-Петербург); на Российской научно-практической конференции ПГФА, проводимой в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» (13-15 ноября 2008 г., Пермь); на Межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА (23-24 апреля 2009 г., Санкт

Петербург); на X Международном научном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии в биологии и медицине», посвященном 50-летнему юбилею РУДН, Москва, 9-12 декабря 2009 г.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 26 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающего 170 источников, из них 82 — на иностранных языках, и приложения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Исследовано отношение золпидема к осадителъным реактивам. В 12 из 20 реакций наблюдались аморфные осадки. Наиболее чувствительной является реакция с реактивом Драгендорфа — 0,57 мкг вещества в пробе. При исследовании реакций окрашивания наиболее чувствительной оказалась реакция с реактивом Марки — 13,0 мкг.

2. Проведено углубленное изучение хроматографического поведения золпидема методом ВЭТСХ. Избраны системы растворителей для последующего их использования при ХТА биологических объектов на золпидем. Избраны способы и реакции детектирования золпидема. Определена чувствительность каждого детектирующего реагента. Показано, что при ХТС исследовании золпидем легко идентифицируется по величине ИГ, красно-оранжевому окрашиванию с реактивом Марки и собственной сиреневой флуоресценции при 365 нм.

3. Установлена возможность использования методов УФ-, ИК-спектроскопии, ВЭЖХ, ГХ, ГХ/МС для доказательства золпидема.

4. Разработана методика количественного определения золпидема УФ-спектрофотометрией в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты при 295 нм. Определены параметры количественной оценки золпидема методом абсолютной калибровки ВЭЖХ на приборном комплексе «Милихром А-02». ГХ/МС количественное определение проведено медом внутреннего стандарта по наиболее важному ионному фрагменту золпидема 235 т/г.

5. Теоретически прогнозированы и экспериментально подтверждены оптимальные условия выделения золпидема с учетом рКа и рН среды. Показано, что оптимальными экстрагентами для золпидема при ЖЖЭ следует считать метиленхлорид, хлороформ, эфир при рН 8-9.

6. Разработаны условия очистки от соэкстрактивных балластных веществ при ХТА золпидема, заключающиеся в сочетании ХТС с центрифугированием и обязательной фильтрацией аналита через мелкопористый стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом.

7. Высокая чувствительность используемых методов анализа позволила значительно сократить количество исследуемого объекта (особенно при ВЭЖХ и ГХ/МС), минимизировать и оптимизировать процесс пробоподготовки, максимально снизить влияние соэкстрактивных веществ.

8. Продемонстрирована возможность применения разработанных методик для выделения золпидема из биосубстрата (ткань печени) до 71-76% из 25 г органа при содержании в нем 0,5 и 1 мг анализируемого вещества; до 78,73% из 5 мл плазмы крови; до 94,11% из 15 мл мочи при содержании в обоих случаях по 0,25 мг золпидема в пробе. Показана применимость разработанных методик для анализа реальной мочи (после принятия терапевтических доз золпидема 10,0 мг). Представлены параметры валидационной оценки методик определения.

9. Проведено исследование по изучению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения. Установлено, что замораживание проб мочи позволяет продлить сроки хранения объекта для анализа на золпидем до 1 года.

10. Составлены схемы химико-токсикологического анализа на золпидем в трупном материале и биологических жидкостях.

126