Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Метаболизм липидов, структура сосудов головного мозга и миокарда при трансплантации неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии

у <1

На правах рукописи

Берина Алина Александровна

МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ, СТРУКТУРА СОСУДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА И МИОКАРДА ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НЕОНАТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ

14.00Л6. - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 2004

Работа выполнена в ГУ «Научный центр Реконструктивной и Восстановительной Хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН», Ангарском филиале ГУ «Научный центр медицинской экологии человека Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН» НИИ медицины труда и экологии человека

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Никифоров Сергей Борисович

Научный консультант:

Доктор медицинских наук,

профессор Бенеманский Виктор Викторович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

профессор Скворцова Раиса Григорьевна

Доктор медицинских наук,

профессор Семинский Игорь Жанович

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Защита состоится «_»_2004 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д. 001. 054. 01. при ГУ «Восточносибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, Иркутск. Тимирязева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «ВосточноСибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан «_»_2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук ^ Шолохов Л.Ф

2СО6 v

7 о 4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, смертность от заболеваний сердечно-сосудистой системы, в основе которых лежат атеросклеротические поражения, в развитых странах мира и России неуклонно увеличивается и составляет 52-65 % от общей смертности (Р. Г. Оганов, 2002).

Известно, что атеросклероз является в 84-90% случаев причиной окклюзии и стенозов магистральных артерий головного мозга с их ишемическим поражением (А. Н. Колтовер, 1975; W. S. Fields, 1968; J. Е. Thompson, 1976). Ишсмическая болезнь головного мозга (45-75 %) сопоставима с распространенностью ишемической болезни сердца, имеющей общие черты эшопатогенеза (X. Г Алиджанова, 1997; Е. И. Гусев, 2001). Инсульт является причиной более 50 % смертей в развитых странах, такие как США, Германия и Великобритания (А. А. Дзизинский, 1997). Россия по смертности от инсультов мозга занимает одно из первых мест в Европе (Ю. А. Карпов, 2002). Инсульт сегодня является не только причиной смерти, но и основной причиной инвалидности (Е. И. Гусев, 2002; Е. П. Панченко, 2002; С. J. L. Murray, 1997; L. Goldstein, 2001).

В современной медицине, имеющиеся методы коррекции гиперхолсстеринемии, как одного из основных факторов развития атеросклероза, включая хирургические вмешательства, эфферентную терапию, фармакологическое воздействие на различные звенья синтеза холестерина, дают временный эффект (Е. И. Чазов, 1998).

Сегодня одним из перспективных методов воздействия на многие патологические процессы является клеточная трансплантация (В. С. Репин, 1998; Д. М. Аронов, 2000). Важная роль гепатоцитов в регуляции липидного метаболизма открывает перспективы для их использования с целью коррекции нарушений липидного обмена.

Цель работы: оценить метаболизм липидов, морфологические изменения сосудов головного мозга и миокарда у животных под влиянием трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов в условиях экспериментальной г иперхолестеринемии.

Задачи исследования:

1. Изучить метаболизм липидов, показатели окислительной и антиокислительной систем, компоненты системы гемостаза при трансплантации неонатальных итов у

животных с экспериментальной гиперхолестеринемией

2. Оценить морфологические изменения в магистральных сосудах, сосудах головного мозга и миокарда под влиянием трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов у животных в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии.

3. Провести сравнительный анализ метаболического влияния внутривенной и внутрипеченочной трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов на морфологические изменения сосудов головного мозга и миокарда у животных при экспериментальной гиперхолестеринемии.

Научная новизна. Впервые представлены данные о метаболическом влиянии трансплантируемых неонатальных аллогенных гепатоцитов на морфологические изменения сосудов головного мозга у животных в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии, заключающееся в снижении числа капилляров с суженным просветом, в снижении интенсивности периваскулярного отека вокруг них, в ограниченном развитии гипертрофии и пролиферации астроцитов, дистрофии нейронов. Установлено, что трансплантация неонатальных гепатоцитов также способствует снижению степени сужения просвета сонных артерий, уменьшению степени сужения венечных артерий и снижению количества сосудов с суженным просветом в миокарде. Показано преимущество технологии внутрипеченочной трансплантации в реализации метаболических антиатерогенных механизмов трансплантируемых неонатальных гепатоцитов на морфологические изменения магистральных сосудов, сосудов головного мозга и миокарда.

Теоретическая и практическая значимость. Трансплантация неонатальных аллогенных гепатоцитов способствует восстановлению баланса различных классов липопротеинов, активации ферментов антиоксидантной системы, стабилизирует коагуляционное звено системы гемостаза, активирует фибринолитическую и антикоагуляционную активность крови.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о метаболическом влиянии клеточной трансплантации, проявляющегося в замедлении развития морфологических изменений в магистральных сосудах, сосудах головного мозга и миокарда в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии. Эти данные позволят расширить представление о саногенетических механизмах воздействия клеточной

трансплантации.

Положения, выносимые на защиту:

1 Трансплантация неонатальных аллогенных гепатоцитов животным с экспериментальной I иперхолестеринемией замедляет развитие морфологических изменений в магистральных сосудах, сосудах I оловного мозга и миокарда за счет устранения дисбаланса фракций липопротеинов, активации ферментов антиоксидантной системы и противосвертывающей системы гемостаза

2. Внутрипеченочная трансплантация неонатальных аллогенных гепатоцитов способствуют более эффективному сдерживанию агрессивности хечения экспериментальной гиперхолестеринемии.

Апробация. Материалы диссертации представлены на: второй объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине», г. Новосибирск, 18-19 июня 2002 г.; международном конгрессе «Практикующий врач», г. Сочи, 1-4 октября 2002 г.; всероссийской конференции «Новые направления в клинической медицине», г. Ленинск-Кузнецкий, 3-4 октября 2002 г.; всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии, Сингапур, 1-7 декабря 2002 г.; девятом международном конгрессе «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация», 27 апреля-3 мая 2003 г; Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии на современном этапе», Иркутск, 23-25 октября 2003 г.; Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», ноябрь 2003 г., Иркутск; научной конференции молодых ученых «Новое в реконструктивной хирур1 ии», Москва, март 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 статьи в отечественных журналах, 9 тезисов и статей в материалах международных и российских конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, включая введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 156 источников на русском и 66 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования

Работа выполнена в Научном Центре Реконструктивной и Восстановительной Хирургии ВСНЦ СО РАМН (директор, д м.н., профессор, член-корреспондент РАМН Е.Г Григорьев), г. Иркутск и НИИ Гигиены труда и экологии человека (директор, д.м н., профессор, член-корреспондент РАМН В. С. Рукавишников), г. Ангарск.

Анализировали биохимические показагели сыворотки крови: уровень общего холестерина и липогтротеинов, продукты ПОЛ, активность антиоксидангных ферментов плазмы, основные компоненты системы гемостаза. Осуществляли морфологический анализ сосудов и ткани головного мозга, миокарда.

1.1. Структура эксперимента

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов породы "шиншилла" весом 2.0 - 2.5 кг. Гиперхолестеринемию моделировали атерогенной диетой, по методике H. Н. Аничкова. Эксперимент проводился в течение 180 дней на 56 кроликах: группа К? 1(п~8. контроль) находилась на рационе вивария; группы № 2 (п=8) и № 3 (п=8) - (модель ГХС) находились на атерогенной диете с добавлением в пищу холестерина из расчета 250 мг/кг веса животного, также им проводили контрольные введения каждые 15 дней 0,9 % раствором NaCl внутривенно (№ 2) и внутрипеченочно (№ 3); группа № 4 (п=16) получала холестерин в аналогичной дозе, но кроме этого ей были трансплантированы неонатальные гепатоциты кролика (НГК) в ушную вену; группа № 5 (п=16) также находилась на атерогенной диете и получала трансплантации НГК внутрипеченочно. Курс введений НГК был с 6 дня диеты (Е. Д. Клименко, 1994) на фоне ГХС в группах № 4 и 5. НГК трансплантировали через каждые 15 дней в течение всего эксперимента (M. Douaire, 1993). Гепатоциты вводили в количестве 1x106 на кг/веса. Всего проведено 12 трансплантаций неонатальных гепатоцитов (ТНГ).

Липидный обмен, процессы ПОЛ, показатели системы гемостаза в крови у экспериментальных животных анализировали на 45, 90, 135 и 180 сутки эксперимента. Морфологические исследования сонных артерий, сосудов головного мозга и миокарда проводили на 180 сутки наблюдения.

1.2. Методы исследования

Метод получения изолированных аллогенных неонатальных гепатоцитов. Источником получения неонатальных гепатоцитов по методике Р. О. Seglen (1976 г.) служила печень 1-2 суточных кроликов, которая подвергалась перфузии in situ изотоническим раствором 0,005 М ЭДТА (БиоЛот, Россия) с помощью перистальтической установки фирмы LKB (Швеция). Печень фрагмептировали и ресуспендировали в растворе коллагеназы из Clostridium histoliticum тип III (Sigma, США), подвергали энзиматической дезагрегации при 37° С. Гепатоциты получали центрифугированием в градиенте перколла (1,076 г/смЗ).

Полученные гепатоциты оценивали на целостность клеточной оболочки по окраске трипановым синим в камере Горяева (80 % жизнеспособных клеток). Клеточную суспензию центрифугировали (1 мин при 1000 об/мин), ресуспендировали в среде Игла с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (Германия) и до трансплантации инкубировали в 90-мм чашках Петри в газовой среде 5 % С02 и повышенной влажности. В качестве кондиционной среды для трансплантации гепатоцит ов использовали 0,9 % раствор NaCl (витальность клеточно1 о трансплантата составляла 60 %)

Методы анализа липидного спектра. Биохимические исследования выполнены совместно с м.н.с. НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН Н. П. Судаковым. Липиды крови (холестерин, липопротеины высокой плотности, низкой плотности, очень низкой плотности, триглицериды) исследовали на анализаторе "Corona Clinicon" (Швеция) с использованием реагентов фирмы "Biocon" (Германия). Показатели сыворотки крови: ХС, ЛПВГТ, ТГ -определяли колориметрически, а ЛПНГ1, ЛПОН, Ка математически, рассчитывая в ммоль/л (А. Н. Климов, 2001). Гидроперекиси липидов (ГШ1) определяли по интенсивности поглощения коныогированных диеновых структур в области 232234 нм (В. Б. Гаврилов, 1983). Малоновый диальдегид (МДА) анализировали по реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (С. Д. Балаховский, 1953). Активность каталазы определяли титрованием 0,1Н раствором КМп04 (В. В. Меньшиков, 1987). Пероксидазную активность определяли фотометрически (С. Д. Балаховский, 1953). Активность процессов ПОЛ оценивали по коэффициенту пероксидации (Кп).

Кп = (МДА + ГПЛ) / (пероксидаза/100 + каталаза).

Методы анализа системы гемостаза. Определение гемостатической функции тромбоцитов проводили на агрегомечре «Солар» (Беларусь) по В. П Балуда и соавт. (1980). Количество фибриногена определяли микроме! одом основанным на преципитации сульфатом аммония П. С. Баркаган, 1999). Антикоагулянтную активность оценивали методом определения прогрессивной активности антитромбина III (К. М. Бышевский, 1994). Интенсивность процессов фибринолиза определяли по естественному лисизу фибринового сгустка (М А.Котовщикова, Б. И. Кузник, 1980 г.). При исследовании фибринолитической системы использовали метод определения плазминогена с применением хромогенного субстрата (В. Г. Лычев, 1993). Результаты выражали в процентах к норме. Концентрацию плазминогена (С) рассчитывали по формуле:

С и«., образца (%) = (а / Ъ) * С,

где а - поглощение пробы с исследуемым образцом плазмы; b -поглощение пробы со стандарт-плазмой; с - концентрация плазминогена в стандарт-плазме.

Методы морфологического анализа. Объектами гистологического исследования были участки общей сонной артерии и внутренней сонной артерии, срединные срезы головного мозга (область виллизиева круга) и срезы основания миокарда (область устья венечных артерий) в сроки 45, 90, 180 сутки. Фиксация материала проводилась в 10 % растворе формалина, рН-7. Проводка материала осуществлялась в автомате для вакуумной проводки VIP-E150F фирмы ''Sacura" (Япония). Заливка в системе для автоматической заливки материала "TEC-IV" фирмы "Sacura". Резка срезов на роторных микротомах СМ-502 фирмы "Microm" (Германия) с использованием одноразовых ножей. Покраска срезов гистологической методикой (гематоксилин-эозин) осуществлялась в автомате для покраски срезов DRS-601 А фирмы "Sacura". Покрытие срезов на предметных стеклах покровными стеклами в автомате Cover Tech фирмы "Microm".

При просмотре морфологических препаратов оценивали общее строение изучаемой ткани, а также проводили морфометрические исследования по следующим показателям: ■S Степень сужения просвета сосуда, S Отношение площади стенки сосуда к площади просвета, S Количество сосудов с суженным просветом на 1 мм2, •S Диаметр периваскулярных пространств вокруг сосудов, S Количество набухших эндотелиоцитов

Микроскопическое исследование препаратов проводилось с помощью компыоерной микроскопической видеосистемы "Quantimet 550 TW" фирмы "Leica" (Ашлия) для цифрового анализа патоморфологическо! о, цитологического материала и углубленной диагностики с камерой высокого разрешения, позволяющей проводить количественный анализ изображения по реальным цветам или оптическим плотностям с форматом изображения 6000 х 4000 пикселей.

Методы обработки полученных результатов. Статистические и корреляционные исследования проводились в программе Microsoft ® Excel 2000 (9.0 2812). Межгрупповые отличия анализировали, используя двухвыборочный t-критерий Стыодента с одинаковыми дисперсиями. Отличия считались достоверными при р<0.05. Корреляционные связи выявляли расчетом коэффициента Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Особенности липидного метаболизма при трансплантации неонатальных гепатоиитов в условиях атерогенной диеты

В течение 180 дней эксперимента в ipynne контроля (№ 1) значительных изменений в показателях липидного обмена не наблюдалось.

Гиперхолестеринемию отмечали во всех группах, находившихся на атерогенной диете. Регистрировали дисбаланс фракций липонротеинов: снижение концентрации в сыворотке крови ЛПВП и повышение ЛПНП. Отмечено, что достоверных различий между группами с моделью ГХС и различными способами введения физиологического раствора не было. Уровень ТГ увеличился на 67,2 %, в сравнении с контролем. Коэффициент атерог енности в этой группе соответствовал значению 62,0±4,56 ЕД, р<4).05 Минимальное значение Ка в группе № 2 (модель ГХС) отмечалось к 180 суткам эксперимента (73,1±1,69 ЕД, р<0,05). В этот срок в группе № 4 с внутривенной ТНГ Ка составил 38,5±1,14 ЕД, что на 42 % ниже, чем в группе № 2 (р<0,05). Меньшее увеличение Ка наблюдалось в группе № 5 (внугрипеченочная ТНГ), с группой № 3 разница составила 56 % (р<0,05). В результате увеличения уровня ЛПВП наблюдали менее высокие значения Ка. На 180 сутки эксперимент в сравнении с группой моделью ГХС концентрации ЛПВП максимально возросли в

группах с ТНГ: в группе № 4 - на 70 %, в группе № 5 - на 99 % (р<0,05). Уровень ТГ в этих группах максимально был ниже на 19 и 31% в сравнении с моделью ГХС (р<0,05).

2.2. Влияние трансплантации неонатальных гепатоцитов на ПОЛ при экспериментальной гиперхолестеринемии

С повышением концентрации ХС в группах, находящихся на атерогенной диете, наблюдалось увеличение содержания МДА и ГПЛ. С повышением МДА и ГПЛ в этих группах наблюдалась и активация ферментов антиоксидантной системы: катал азы и пероксидазы.

На 180 сутки эксперимента в сравнении с моделью ГХС активность каталазы в группе с внутривенной ТНГ увеличилась на 34 %, в группе с внутрипеченочной ТНГ - на 115 % (р<0,05). Активность пероксидазы была максимальной в группе с внутривенной ТНГ (16 %) Значения интегрального показателя Кп у животных с внутривенной ТНГ уменьшился на 23 % (группа № 4). Максимальное снижение Кп наблюдалось в группе с внутрипеченочной ТНГ на 34 % (р<0,05)

2.4. Особенности воздействия ТНГ на систему гемостаза в условиях экспериментальной ГХС

У животных с моделью ГХС (группа № 2 и 3) наблюдался эффект гиперкоагуляции в периферической крови, который характеризовался значительным повышением показателя функциональной активности тромбоцитов (ФАТ) и уровня фибриногена. В группах с ТНГ' отмечено незначительное повышение ФАТ на 180 сутки эксперимента в сравнении с моделью ГХС. У животных с внутривенной трансплантацией гепатоцитов ФАТ был ниже на 38 %, у животных с внутрипеченочной ТНГ - на 46 % в сравнении с моделью гиперхолестеринемии (р<0,05). Самый низкий уровень фибриногена был установлен в группе с внутривенной ТНГ на 180 сутки, при этом концентрация фибриногена в крови была менее выраженной, чем в группе № 2 на 69 % (р<0,05). Установлено, что ТНГ независимо от способа введения значительно повышала активность AT- III. Максимальное увеличение содержания AT-III отмечено в группе с внутрипеченочной ТНГ.

На 180 сутки в этих группах данный показатель возрос на 47 % (р<0,05). Уровень плазминогена увеличился во всех группах с ТНГ.

В группах с трансплантацией гепатоцитов концентрация плазминогена в динамике держалась на высоком уровне. Наблюдаемое увеличение концентрации плазминогена свидетельствовало о возрастании в вышеуказанных группах фибринолитического потенциала крови, что связанно, по-видимому, с восстановлением метаболической функции печени.

2.5. Морфологическое исследование структуры сосудов головного мозга

Установлено, что в течение всего эксперимента в группе контроля изменений в стенках сосудов головного мозга и сонных артерий не наблюдалось.

У животных с моделью ГХС (группа № 2 и № 3) наряду с нарушениями липидного обмена па 180 сутки наблюдали липидную инфильтрацию в интиме сонных артерий, сужение просвета средней и базилярной артерий, расширение периваскуляторных пространств вокруг сосудов.

Трансплантация неонатальных гепатоцитов замедляла развитие морфологических проявлений в сонных артериях и сосудах головного мозга. Наиболее выраженный эффект наблюдался при внутрипеченочной ТНГ.

Так, степень сужения просвета сонных артерий в группе с моделью ГХС составила в среднем 13 %. Под влиянием внутривенной трансплантации неонатальных гепатоцитов степень сужения просвета сонных артерий снизилась на 44 % в сравнении с группой № 2 (модель ГХС), в то время как с группой с внутрипеченочной ТНГ разница составила 92 % (рис 1).

В бассейне средней мозговой артерии в группе с моделью ГХС отношение площади стенки сосуда к площади просвета составило 2,34±0,19 ЕД. В группах с ТНГ этот показатель был ниже в сравнении с моделью ГХС на 55 % (р<0,05). В бассейне базилярной артерии этот показатель у животных группы с моделью ГХС был выше по сравнению с контролем (1,07±0,11 ЕД) и составил 2,0±0,22 ЕД, р<0,05. В группе с внутрипеченочной ТНГ составил 1,23^0,08 ЕД, (р<0,05), что было ниже, чем в группе № 3 (р<0,05).

Количество капилляров с суженным просветом в группе с моделью гиперхолестеринемии составило 2,34±0,12 на 1 мм2 (рис. 2). В группе с внутривенной трансплантацией неонатальных гепатоцитов данный показатель изменялся в пределах 1,89±0,10, что было меньше на 19 % (р<0,05), чем в группе № 2. В группе с внутрипеченочной трансплантацией неонатальных гепатоцитов

этот показатель составил 1,37±0,14 (р<0,05), достоверен в сравнении с группой № 4 (на 31 %) Диаметр периваскулярных пространств в этой группе был ниже, чем в группе с внутривенной ТНГ и моделью ГХС.

Таким образом, ТНГ способствовав замедлению развития морфологических изменений в сосудах головного мозга животных на фоне экспериментальной гиперхолестеринемии.

А) группа Jft 3 - модель ГХГ + физ р-р внутрипечеиочно;

Б) группа № 5 с внутрипеченочной ТНГ. 180 сутки. Окр Гем-*)Оч. х 400. ПК - пенистые клетки

12,32

ДО

13,32

Ш 1

Модель ГХС + В/в ТНГ В/п ТНГ Модель ГХС + в/в физ. р-р в/п физ. р-р

Рис 1 Влияние трансплантации неопаталъных аллогенных гепатоцитов на степень сужения общей сонной артерии в области бифуркации при экспериментальной гиперхолестеринемии на 180 сутки эксперимента.

2.6. Морфологическое исследование сосудов миокарда

Анализ результатов гистологического исследования миокарда у животных контрольной группы свидетельствовал о практическом отсутствии морфологических изменений крупных сосудов и капилляров миокарда.

У животных групп № 2 и 3, на 180 сутки эксперимента наблюдати сужение просвета венечных сосудов, вследствие

развившейся липидной инфильтрации интимы. По данным морфометрического анализа, степень сужения просвета венечных сосудов составила 16,59±5,22 %.

При внутривенной ТНГ на 180 сутки наблюдали сужение просвета венечных сосудов на 5,33±1,03 %. при этом количество сосудов с суженным просветом было ниже на 20 % в сравнении с моделью ГХС (р<0,05).

Отношение 5 стснки сосуда

к £ просвета си суда ел

к.

1!

Щ

Количество капилляров с суженным просветом на 1 мм1

Контроль М«ю>ьГХС + В/в ТНГ В/., ТНГ Модель ГХС + Модель ГХС ^ В/в ТНГ В/п ТНГ Модель |"ХС + в/в физ. Р Р в/лфщр-р в/.ф„1р.р д/пфю р-р

Бассейн средней мозговой артерии Бассейн базилярнои артерии

О Срединный разрез

головного мозга

Рис. 2 Влияние трансплантации неонаталъных аллогенных ?епатоцитов на морфологические изменения мозговых артерий при * экспериментальной гиперхолестеринемии

У животных с внутрипеченочной ТНГ сужение просвета венечных сосудов в сравнении со всеми группами животных было наименьшим и составило 2,36±0,82 %. Согласно результатам морфометрического анализа у животных с внутрипеченочной ТНГ количество сосудов с суженным просветом в ткани миокарда было меньше на 50 %, чем в группе с моделью ГХС и на 37 % в сравнении с внутривенной ТНГ (р<0,05).

Таким образом, ТНГ способствовала замедлению развития морфологических изменений в сосудах миокарда экспериментальных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Атерогенная диета у экспериментальных животных вызывала увеличение концентрации общего холестерина в крови, который к ] 80 суткам эксперимента достиг максимального уровня в группах с моделью ГХС в сравнении с контролем Его повышение сопровождалось увеличением концентраций атерогенной фракции липопротеинов, в то время как концентрация ЛПВП была снижена, что, по-видимому, свидетельствовало об угнетенности клиренса

лпнп.

Одним из основных механизмов лечебного воздействия трансплантированных клеток, возможно, является восстановление ЛПНП-рецепции гепатоцитов и усиление клиренса ХС через апоВ/Е - механизм (В. А. Косых, 1989: R. Abraham, 1993; М. Yokode, 1990; L. Goldstein, 2001). Известно, что выведение ХС из }

организма осуществляется преимущественно за счет его окисления в желчные кислоты, где ключевая роль принадлежит ферменту - 7-а-гидроксилазе (А. Н. Климов, 1999). Следовательно, снижение концентрации общего холестерина в крови животных с ТНГ может происходить при активации данного фермента.

Настоящее исследование показало, что ТНГ при дисбалансе липопротеинов, выражающимся в преобладании атерогенной фракции ЛП, сдвигает точку равновесия в сторону ЛПВП. Известно, что ЛПВП способны осуществлять обратный транспорт ХС из периферических органов и тканей в печень для окисления в желчные кислоты и выведения с желчью, что характеризует их антиатерогенную активность (В. Н. Титов, 1999,2001).

Показано, что добавление ЛПВП к инкубированным эндотелиальным клеткам во фракции ЛПНП задерживает развитие f

модификации последних за счет уменьшения их захвата при участии скевенджер-рецепторов, которые обладают ЛПВП, содержащие только апоА-1. ЛПВП и апоА-1 ингибируют способность ЛПНП к агрегации (X. А. Курданов, 1989; А. Н. Климов, 1995; М. Г. Творогова, 2001).

Известно, что ЛПВП способны снижать темпы процесса ПОЛ, что характеризуется уменьшением количества продуктов ПОЛ (В. 3. Ланкин, 1989; А. Нурмухаметова, 1998; К. Сергеев, 1998; Н. Hodis, 1996). Так, на 180 сутки значения Кп у животных с внутривенной ТНГ уменьшился на 23 %. Максимальное снижение Кп наблюдалось в группе с внутрипеченочной ТНГ.

Важная роль в снижении темпов ПОЛ помимо ЛПВП, по всей видимости, принадлежит активации антиокислительных ферментов

клеток. В нашем исследовании продемонстрировано повышение активности каталазы и пероксидазы на фоне ТНГ. Активация антиоксидантной защиты клеток за счет увеличения активности ферментов клеточных структур - каталазы и пероксидазы -способствует разрыву цепей молекул при реакциях свободнорадикального окисления, разрушает перекиси (О. М. Поздняков, 1997). Снижение темпов перекисного окисления приводит к уменьшению уровня окисленных ЛПНП, обладающих наиболее выраженным атерогенным эффектом.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что ТНГ корригируют и гемокоагуляционный статус. По всей видимости, влияние трансплантации гепатоцитов на липидный обмен, следовательно, и на систему гемостаза при ГХС заключается в их многофакторном воздействии на многие системы, ^ вовлеченные в данный патологический процесс. Известно, что

повышение уровня фракции ЛПВП позитивно влияет на систему гемостаза Установлено, что ЛПВП стимулирует образование простациклина и, как следствие, задерживают агрегацию тромбоцитов (D. Betteridge, 1989), a ano А-1 стабилизирует плазменный простациклин и активирует фибринолиз (Y. Yoi, 1988).

У животных с внутривенной ТНГ функциональная активность тромбоцитов оказалась меньше более чем на 38 % (группа № 4). у животных с внутрипеченочной ТНГ - на 46 % (группа № 5) в сравнении с моделью гиперхолестеринемии. В группах с ТНГ наблюдали повышенную активацию фибринолиза в сравнении с группами № 2 и 3. Так, на 180 сутки в группе с внутривенной ТНГ фибринолиз увеличился более чем на 263 % , а в группах с внутрипеченочной ТНГ - на 269 % . • Таким образом. ЛПВП в организме имеют многосторонние

точки приложения, способствуя сбалансированности гомеостаза организма при дислипопротеинемиях. Перенос ЛПВП осуществляет ряд субстратов с участием воды, что практически достаточно для переноса ХС (В. С. Репин, 1998).

Другой возможный механизм действия неонатальных клеток -неспецифический. Неонатальные гепатоциты продуцируют комплекс биологически активных веществ, которые активизируют собственные эндогенные механизмы регуляции восстановительных процессов в органах-мишенях, способствующих стабилизации гомеостаза организма (А. П. Голиков, 1992; С. Г. Козлов, 1999). Известно, что неонатальные гепатоциты содержат разнообразный спектр микроэлементов, цитокинов и гормонов (О. П. Рябчиков, 1998). Установлено, что включение жирорастворимых витаминов в

состав ЛПНП предохраняет последние от их окисления. Показано, что Fc-содержащие вещества участвуют в формировании активных центров окислительных ферментов (оксидазы,

супероксиддисмутзы) антиоксидантной системы организма Си и Zn участвуют в биосинтезе простангландинов и их функционировании (В. 3. Ланкин, 2000). Влияние ТНГ на уровень фибриногена, по-видимому, обусловлено прямым воздействием трансплантированных гепатоцитов на клетки печени, направленного на активацию фибринолитической системы, под действием которой расщепляется фибрин и иногда фибриноген (А. Н. Сидоркина, 2001).

Установлено, что ТНГ независимо от способов введения значительно повышала активность антитромбина III. Максимальное увеличение активности AT-III отмечено в группах с внутрипеченочной ТНГ. Регистрируемая в эксперименте активация антисвертьгвающей системы, вероятно, происходит в результате повышения процесса синтеза антитромбина III и повышения концентрации активаторов плазминогена, синтез и секреция которых осуществляется в основном эндотелием сосудов, в то время как печень является преимущественным местом синтеза плазминогена (М. Ферстрате, 1986: А. И. Грицюк, 1994).

При исследовании срезов головного мозга животных с моделью ГХС было выявлено малокровие и сужение просвета сосудов микроциркуляторного русла с расширением периваскуляторных пространств вокруг капилляров, что согласуется с исследованиями проведенными Т. С. Гулевской (2000) на модели гиперлипидемии у кроликов в эксперименте.

У животных с моделью гиперхолестеринемии наряду с нарушениями липидного обмена на 180 сутки сформировались морфологические изменения, характерные для этого патологического процесса. Так, в бассейне средней мозговой артерии отношение площади стенки сосуда к площади просвета составило 2,34±0Л9, в бассейне базилярной артерии - 2,04±0.22. Результаты морфологического анализа ткани мозга показали, что количество капилляров с суженным просветом составило 2,34-ь0,12 на 1 мм2.

Внутривенная ТНГ способствовала менее интенсивному сужению просвета сосуда в бассейне средней мозговой артерии. Отношение площади стенки сосуда к площади просвета превышало контроль на 49 %, в бассейне базилярной артерии - на 25 %, количество капилляров с суженным просветом было меньше на 29 %, чем в группе с моделью гиперхолестеринемией.

В1гутрипеченочная ТНГ минимизировала эти морфологические проявления. В бассейне средней мозговой артерии отношение площади стенки сосуда к площади просвета было более высоким, чем в контроле на 26 % и ниже, чем в группе с внутривенной ТНГ на 31 %. а в бассейне базилярной артерии данный показатель составил 1,23±0,08, чго было ниже на 38 %, чем в ipynne с моделью ГХС и выше на 13 %, чем в контроле. Количество капилляров с суженным просветом на 1 мм2 было ниже на 44 %, чем в группе с моделью ГХС и на 28 % в сравнении с группой с внутривенной ТПГ. У животных, находившихся на атерогенной диете (группа № 2 и 3). на 180 сутки эксперимента наблюдали сужение просвета венечных сосудов, вследствие развившейся липидной инфильтрации интимы.

Согласно данным морфометрического анализа при внутривенной трансплантации неонатальных гепатоцитов на 180 сутки наблюдали сужение просвета венечных сосудов на 5 %, при этом количество сосудов с уменьшенным просветом в ткани миокарда было ниже на 20 %, чем в группе с моделью ГХС, тогда как при внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов сужение просвета венечных сосудов составило 2,4 %, а количество сосудов с уменьшенным просветом в ткани миокарда было меньше на 50 %, чем в группе с моделью ГХС и на 37 % в сравнении с внутривенной трансплантацией.

Установлено, что при ТНГ, меньшая выраженность морфологических изменений в исследованных органах соответствовала низкому уровню биохимических нарушений, характеризующих процесс ГХС.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что ТНГ при экспериментальной гипер-холестеринемии влияет на ключевые звенья липидного метаболизма, восстанавливая метаболическую функцию печени. При этом ее воздействие является позитивным как для сосудов головного мозга, так и для коронарных сосудов, что свидетельствует об общности антиатерогенного механизма клеточной терапии. ТНГ в свое естественное микроокружение предопределила более позитивный эффект воздействия неонатальных гепатоцитов.

Вышеизложенное позволило разработать концептуальную схему саногенетических механизмов метаболического влияния трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на морфологические изменения в сосудах головного мозга и миокарда в условиях гиперхолестеринемии, представленную на рис. 3.

Факторы роста, ннтерлейкины, ри>ляторные пептиды и др.

|И V

( « Рецепция ЛПШ1 нЛПВП

♦ Синтез апоЛ'1

♦ Экспрессия аноВ/Е-рецепторов

♦ Активация 7а-гндрокентдзы

х^д.-г..«,,.,,.. ч\1г у

тЧипидный спектр кпоеи

t

А *

*

т Тршлицернды

# Коэффициент Ф дтерогенностн

• ОбщиП \С

• \С ЛГ1ВП

• ХС ЛПНП

• \с лпонп

V

►Синтез Антитрочбнна Ш

► Смите) тетива юров ггляэмино-геня

♦ CiiiiTei npoCTfluiiKjiiiHft

Коапляционное 1вено

-У

Л

* Ф>нкцноняльная активность^ тромбоцитов

* Концентрация фибриногена ^ Антнкоягуляктнля активность

Активность пнтнтромбння III Активность

фпбр.нмолитичсской системы. ^

* Кониентрпцня платчкнигена

i

Интенсивность фпбрнно 1113 а

' мррфр 10г11чсскнс ^

проявления в сосуда»

головного м01гя

* Степень сужения просвет ^ сосуд»

9 Отношение тощадн стенкн'? сосуда к площпдн просвета

* Количество сосудов с ^ суженным просветом на I мм2

* Диаметр пернваск>лярны\ ^ прострянс!» сосчдоа

* Количество нпб>\шнх ф

г зклотелноцнтои /

/ МорФо чогнческие проявления в сосудах миокарда

\

V

* Степень сужения просвета^ сосудт

* Количество соодов с суженным просветом на 5 мч2 <

Рис 3 Концептуа 1ьная схема саногенетических механизмов метаболического влияния трансплан таг^ии неонатальных гепатог\итов на гомеостаз организма животных при экспериментальной гиперхолестерине \ти

ВЫВОДЫ:

1. Трансплантация неонатальных аллогенных i епатоцитов способствует снижению агрессивности течения экспериментальной гиперхолестеринемии, что характеризуется уменьшением фракции холестерина липопротеинов низкой плотности на 22 % и повышением фракции холестерина липопротеинов высокой плотности на 99 %, снижением коэффициента атерогенносги на 56 %, активированием антиоксидантной системы (увеличение активности каталазы на 115 %) в сравнении с моделью гиперхолест еринемии;

2. В экспериментальных группах трансплан 1ация неонатальных аллогенных гепатоцитов, в сравнении с моделью гиперхолестеринемии, способствует стабилизации атромбогенного потенциала сосудистой стенки со снижением уровня фибриногена на 64 % в плазме крови, функциональной активности тромбоцитов на 46 % и повышению ашикоагулянтной активности на 47 %, интенсификации фибринолитической системы на 269 %;

3. Внутрипеченочная трансплантация неонатальных гепатоцитов более эффективно замедляет развитие морфологических изменений в сосудах различного калибра и локализации, о чем свидетельствует уменьшение степени сужения просвета сонных артерий на 92 %, снижение количества сосудов с суженным просветом в ткани головного мозга и миокарда на 44 и 50 % соответственно;

4. Метаболическое влияние клеточной трансплантации подтверждает системность воздействия саногенетических механизмов трансплантируемых гепатоцитов на магистральные сосуды, сосуды головного мозга и миокарда у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Влияние трансплантации неонатальных геиатоцитов на перскисное окисление липидов при экспериментальной гиперхолестеринемии / Н.П. Судаков, А. А. Берина, В.В. Ильина и др. // Новые технологии в медицине: Тезисы докладов И объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН, г. Новосибирск, 18-19 июня 2002 г. - Новосибирск, 2002. - С. 44.

2. Внутриорганная трансплантация гепатоцитов в коррекции экспериментального атеросклероза / A.A. Рунович, Н.П. Судаков, A.A. Берина и др.// Практикующий врач: Тезисы докладов международного конгр., 1-4 окт. 2002 г. - М. - 2002 . -С. 103,225.

3. Перспективы трансплантации неонатальных гепатоцитов в коррекции гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, Н.П. Судаков, А А. Берина и др // Новые направления в клинической медицине: материалы Всероссийской конф., 3-4 окт. 2002 г. -Ленинск-Кузнецкий. - 2002 г. - С. 335-336.

4. Изучение эффективности влияния внутривенной и внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов на течение экспериментального атеросклероза / A.A. Рунович, Н.П. Судаков, А.А Берина и др // International Journal of Immunoreabilitation: Труды Всемирного конгр. по клинической и иммунной патологии, 1-7 дек. 2002 г. - М., 2002 .- Т. 4. - № 2,- С. 308.

5. Изучение эффективности внутривенной и внутрипеченочной трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, С.Б. Никифоров, A.A. Берина и др.// Бюлл. ВСНЦ СО РАМН.-2002.-Т. 1, №5. -Иркутск,- С. 114.

6. Возможности трансплантации гепатоцитов в коррекции гиперхолестеринемии/ A.A. Рунович, С.Б. Никифоров, Н.П. Судаков и др.// Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - Т. 1, № 5. -Иркутск. - С. 123.

7. Влияние внутрипеченочной трансплантации гепатоцитов на развитие и течение экспериментальной гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, A.A. Берина, Н.П. Судаков и др. // Паллиативная медицина и реабилитация: Материалы V конгр. с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении», 19-25 апр. 2003 г. - М., 2003,-№2.-С. 152.

8. Рунович А А. Влияние впутрипеченочной трансплантации неонатальных генатоцитов на показатели системы гемостаза при экспериментальной гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, Н П. Судаков, A.A. Берина и др.// International Journal of Imm unoreabililation: Мгпериалы IX Международного KOHip. «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация», 27 апр. - 3 мая 2003 г. - Т. 5, № 1. - М., 2003. - С. 95-96.

9. Влияние трансплантации неонатальных гепатоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии на стабильность атерогенных классов липопротеинов / Рунович A.A., A.A. Берина, Судаков Н.П. и др.// Журн. Аллергология и иммунология: Тезисы докладов Y съезда иммунологов и аллергологов СНГ, 5-11 июля 2003 i. - СПб., 2003. - Т. 4, № 2. -С. 199.

10 Некоторые механизмы воздействия трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии / А. А. Рунович, С. Б. Никифоров, Н. П. Судаков и др. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. -2003. 7.- С. 32-33.

11. Влияние внутривенной трансплантации гепатоцитов на показатели липидного обмена и системы гемостаза при экспериментальной гиперхолестеринемии / Н.П, Судаков, A.A. Берина, А С. Сергеева и др. // Акгуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Материалы межрет иональной научно-практич. конф. молодых ученых Сибири, 11 ноября 2003 г. - Иркутск, 2003. - С. 219-220.

12. Судаков НII. Морфологические изменения в сосудах миокарда и головного мозга при трансплантации неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии / Н.П. Судаков, A.A. Берина, A.C. Сергеева. // Новое в реконструктивной хирургии: Тезисы науч. конф. молодых ученых, посвященной дню основания РНЦХ РАМН, 19 марта 2004 г. - М., - 2004. - С. 304-305.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

гхс - Гиперхолестеринемия

xc - Холестерин

лп - Липопротеины

лпвп - Липопротеины высокой плотности

лпнп - Липопротеины низкой плотности

лпонп - Липопротеины очень низкой плотности

тг - Триглицериды

Ка - Коэффициент атерогенности

Кп - Коэффициент пероксидации

П Ш - Гидроперекиси липидов

МДА - Малоновый диальдегид

пол - Перекисное окисление липидов

AT-III - Антитромбин III

Отпечатано 10.11.2004 г. в типографии РГ «Пилот», 664061, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 12, тел/факс: (3952)240-612. Заказ № 258, тираж 100 экз.

««271 82

РНБ Русский фонд

2006-4 794

Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения смертность от заболеваний сердечно-сосудистой системы, в основе которых лежат атеросклеротические поражения, в развитых странах мира и России неуклонно увеличивается и составляет 52-65 % от общей смертности [109].

Признано, что гиперхолестеринемия и ассоциированные с ней процессы перекисного окисления липидов, иммунные процессы в сосудистой стенке, тромбогенные нарушения являются основными факторами развития атеросклероза [70, 71].

В последние годы статистические данные по осложненным формам атеросклероза не утешительны. Известно, что атеросклероз является в 84-90% случаев причиной окклюзий и стенозов магистральных артерий головного мозга с их ишемическим поражением [77, 174, 185, 213]. Ишемическая болезнь головного мозга (45-75 %) сопоставима с распространенностью ишемической болезни сердца, имеющей общие черты этиопатогенеза [6, 51]. Инсульт является причиной более 50 % смертей в развитых странах, таких как США, Германия и Великобритания [58]. Россия по смертности от инсультов мозга занимает одно из первых мест в Европе [67]. Инсульт сегодня является не только причиной смерти, но и основной причиной инвалидности [52, 113, 181, 184, 198].

В современной медицине, имеющиеся методы коррекции гиперхолесте-ринемии как одного из основных факторов развития атеросклероза, включая хирургические вмешательства, эфферентную терапию, фармакологическое воздействие на различные звенья синтеза холестерина, дают временный эффект [146].

Сегодня одним из перспективных методов воздействия на многие патологические процессы является клеточная трансплантация [12, 119]. Важная роль гепатоцитов в регуляции липидного метаболизма открывает перспективы для их использования с целью коррекции нарушений липидного обмена. Ранее было показано, что введение эмбриональных и неонатальных нативных клеток печени на метаболическом уровне препятствует развитию в печени липоидоза, который развивается у животных с атерогенной диетой [128].

В этой связи представляет научный и практический интерес использование метода трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов с системной оценкой воздействия на общий метаболизм, морфологические изменения в головном мозге при экспериментальной гиперхолестеринемии.

Цель работы: оценить метаболизм липидов, морфологические изменения сосудов головного мозга и миокарда у животных под влиянием трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов в условиях экспериментальной гипер-холестеринемии.

Задачи исследования:

1. Изучить метаболизм липидов, показатели окислительной и антиокислительной систем, компоненты системы гемостаза при трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов у животных с экспериментальной гиперхоле-стеринемией.

2. Оценить морфологические изменения в магистральных сосудах, сосудах головного мозга и миокарда под влиянием трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии.

3. Провести сравнительный анализ метаболического влияния внутривенной и внутрипеченочной трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов на морфологические изменения сосудов головного мозга и миокарда в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии.

Научная новизна. Впервые представлены данные о метаболическом влиянии трансплантируемых неонатальных аллогенных гепатоцитов на морфологические изменения сосудов головного мозга у животных в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии, заключающееся в снижении числа капилляров с суженным просветом, в снижении интенсивности периваскулярного отека вокруг них, в ограниченном развитии гипертрофии и пролиферации аст-роцитов, дистрофии нейронов. Установлено, что трансплантация неонатальных гепатоцитов также способствует снижению степени сужения просвета сонных артерий, уменьшению степени сужения венечных артерий и снижению количества сосудов с суженным просветом в миокарде. Показано преимущество технологии внутрипеченочной трансплантации в реализации метаболических антиатерогенных механизмов трансплантируемых неонатальных гепато-цитов на морфологические изменения магистральных сосудов, сосудов головного мозга и миокарда.

Теоретическая и практическая значимость. Трансплантация неонатальных аллогенных гепатоцитов способствует восстановлению баланса различных классов липопротеинов, стабилизирует коагуляционное звено системы гемостаза, активирует фибринолитическую и антикоагуляционную активность крови. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о метаболическом влиянии клеточной трансплантации, проявляющегося в замедлении развития морфологических изменений в магистральных сосудах, сосудах головного мозга и миокарда в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии. Эти данные позволят расширить представление о саногенетических механизмах воздействия клеточной трансплантации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Трансплантация неонатальных аллогенных гепатоцитов животным с экспериментальной гиперхолестеринемией замедляет развитие морфологических изменений в магистральных сосудах, сосудах головного мозга и миокарда за счет устранения дисбаланса фракций липопротеинов, активации ферментов антиоксидантной системы и противосвертывающей системы гемостаза

2. Внутрипеченочная трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов способствуют более эффективному сдерживанию агрессивности течения экспериментальной гиперхолестеринемии.

Апробация. Материалы диссертации представлены на: второй объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине», г. Новосибирск, 18-19 июня 2002 г.; международном конгрессе «Практикующий врач», г. Сочи, 1-4 октября 2002 г.; всероссийской конференции «Новые направления в клинической медицине», г. Ленинск-Кузнецкий, 3-4 октября 2002 г.; всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии, Сингапур, 1-7 декабря 2002 г.; девятом международном конгрессе «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация», 27 апреля-3 мая 2003 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии на современном этапе», Иркутск, 23-25 октября 2003 г.; Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», ноябрь 2003 г., Иркутск; научной конференции молодых ученых «Новое в реконструктивной хирургии», Москва, март, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 статьи в отечественных журналах, 9 тезисов и статей в материалах международных и российских конференций.

ВЫВОДЫ:

1. Трансплантация неонатальных аллогенных гепатоцитов способствует снижению агрессивности течения экспериментальной гиперхолестеринемии, что характеризуется уменьшением фракции холестерина липопротеинов низкой плотности на 22 % и повышением фракции холестерина липопротеинов высокой плотности на 99 %, снижением коэффициента атерогенности на 56 %, активированием антиоксидантной системы (увеличение активности каталазы на 115 %) в сравнении с моделью гиперхолестеринемии;

2. В экспериментальных группах трансплантация неонатальных аллогенных гепатоцитов, в сравнении с моделью гиперхолестеринемии, способствует стабилизации атромбогенного потенциала сосудистой стенки со снижением уровня фибриногена на 64 % в плазме крови, функциональной активности тромбоцитов на 46 % и повышению антикоагулянтной активности на 47 %, интенсификации фибринолитической системы на 269 %;

3. Внутрипеченочная трансплантация неонатальных гепатоцитов более эффективно замедляет развитие морфологических изменений в сосудах различного калибра и локализации, о чем свидетельствует уменьшение степени сужения просвета сонных артерий на 92 %, снижение количества сосудов с суженным просветом в ткани головного мозга и миокарда на 44 и 50 % соответственно;

4. Метаболическое влияние клеточной трансплантации подтверждает системность воздействия саногенетических механизмов трансплантируемых гепатоцитов на магистральные сосуды, сосуды головного мозга и миокарда у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что ишемическая болезнь головного мозга и ишемическая болезнь сердца, в основе которых лежит атеросклероз, занимают одно из первых мест в мире по распространенности. Современные методы коррекции гиперхолестеринемии, как фактора атеросклеротического процесса, носят временный характер [147.

В настоящее время технология клеточной трансплантации используется для разработок новых методов терапии патологических процессов в эксперименте и ограниченно в клинике [12]. Ранее было показано, что имплантация фе-тальных нативных клеток печени препятствует развитию в печени липидоза у животных, находящихся на атерогенной диетой [128].

Так как печень является центральным органом, где происходят процессы синтеза и метаболизма холестерина, обмена и рецепции различных классов ли-попротеинов, синтез липолитических ферментов и некоторых компонентров системы гемостаза [71, 126], воздействие трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на характер морфологических изменений сосудов головного мозга и миокарда у животных при экспериментальной гиперхолестеринемии представляет неоспоримый интерес.

Атерогенная диета у животных способствовала повышению концентрации общего холестерина, который к 180 суткам эксперимента достиг максимального уровня и был выше на 91 %, чем в контрольной группе. Концентрация ЛПНП увеличилось по сравнению с контролем на 95 %, концентрация ЛПВП составила 0,37 ± 0,01ммоль/мл, что свидетельствовало об угнетенности клирен-ся ЛПНП.

Одним из основных механизмов лечебного воздействия трансплантированных клеток, возможно, является восстановление ЛПНП-рецепции гепатоцитов и усиление клиренса ХС через апоВ/Е - механизм [79, 158, 180, 222]. Известно, что выведение холестерина из организма осуществляется преимущественно за счет его окисления в желчные кислоты, где ключевая роль принадлежит ферменту - 7-а-гидроксилазе [71]. Следовательно, снижение концентрации общего холестерина в крови животных с ТНГ может происходить при активации данного фермента.

Показано, что трансплантация неонатальных гепатоцитов при дисбалансе липопротеинов с преобладанием атерогенной фракции ЛП способствует повышению концентрации ЛПВП. На 180 сутки эксперимента в группе № 4 с внутривенной ТНГ Ка составил 38,53 ±1,14 ЕД, что на 42 % ниже, чем в группе № 2. Меньшее увеличение Ка наблюдалось в группе № 5 (внутрипеченочная ТНГ), с моделью ГХС разница составила 56 %. Известно, что ЛПВП способны осуществлять обратный транспорт ХС из периферических органов и тканей в печень для окисления в желчные кислоты и выведения с желчью, что характеризует их антиатерогенную активность [201]. Показано, что добавление ЛПВП к инкубированным эндотелиальным клеткам во фракции ЛПНП задерживает развитие модификации последних за счет уменьшения их захвата при участии скевенд-жер-рецепторов макрофагов [70]. Предполагается, что этим свойством обладают ЛПВП, которые содержат только апоА-1. ЛПВП и апоА-1 ингибируют способность ЛПНП к агрегации [70, 84, 134, 170, 175].

Образование ЛПВП происходит в гепатоцитах и энтероцитах - из предшественников, синтезируемых в этих клетках; в токе крови - независимым путем в процессе катаболизма богатых ТГ липопротеинов (ХМ и ЛПОНП) [59, 84, 145]. В превращении ЛПВП в нативные детерминирующую роль выполняет фермент лецитинхолестеринацилтрансфераза, синтезируемый в печени, но осуществляющий свое непосредственное действие в плазме крови. Лецитин-холестеринацилтрансфераза осуществляет процесс трансэстерификации ХС, и его активность непосредственно связана с фракцией ЛПВП. Признано, что около 90 % эстерифицированного ХС плазмы крови человека в сосудистом русле образуется при участии лецитинхолестеринацилтрансферазы [131, 132, 165]. Показано, что ЛПВП активно преносят ХС из гладкомышечных клеток, фибробластов, макрофагов, эндотелиальных клеток и направляют его в печень [137, 139]. В то же время отмечено, что ЛПВП является предпочительным субстратом для образования желчных кислот [139].

На 180 сутки значения Кп у животных с внутривенной ТНГ уменьшился на 23 % . Максимальное снижение Кп наблюдалось в группе с внутрипече-ночной ТНГ — на 34 %. В сравнении с моделью ГХС активность каталазы в группе с внутривенной ТНГ увеличилась на 34 %. В группе с внутрипеченоч-ной ТНГ также наблюдалось увеличение активности каталазы на 115 %. Активность пероксидазы была максимальной в группе с внутривенной ТНГ (16%).

Известно, что ЛПВП способны снижать темпы процессов ПОЛ, что отражается уменьшением количества продуктов ПОЛ [87, 108, 125, 186]. Важная роль в снижении темпов ПОЛ помимо ЛПВП, по всей видимости, принадлежит активации антиокислительнаых ферментов клеток. В проведенном исследовании продемонстрировано повышение активности каталазы и пероксидазы в плазме крови на фоне трансплантации неонатальных гепатоцитов. Активация антиоксидантной защиты клеток за счет увеличения активности ферментов клеточных структур - каталазы и пероксидазы - способствует разрыву цепей молекул при реакциях свободнорадикального окисления, разрушает перекиси [116]. Снижение темпов перекисного окисления приводит к уменьшению уровня окисленных ЛПНП, обладающих наиболее выраженным атерогенным эффектом, что приводит к снижению клеточного повреждения.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что ТНГ корригируют и нарушенный гемокоагуляционный статус. По всей видимости, влияние трансплантации гепатоцитов на липидный обмен, следовательно, и на систему гемостаза при гиперхолестеринемии заключается в их многофакторном воздействии на многие системы, вовлеченные в данный патологический процесс. Известно, что повышение уровня фракции ЛПВП позитивно влияет на систему гемостаза. Установлено, что ЛПВП стимулирует образование простациклина и, как следствие, замедляют агрегацию тромбоцитов [165], а апо А-1 стабилизирует плазменный простациклин и активирует фибринолиз [221].

У животных с внутривенной трансплантацией гепатоцитов функциональная активность тромбоцитов оказалась меньше более чем на 38 % (группа № 4), у животных с внутрипеченочной ТНГ - на 46 % (группа № 5) в сравнении с моделью гиперхолестеринемии. В группах с ТНГ наблюдали повышенную активацию фибринолиза в сравнении с группой № 2. Так, на 180 сутки в группе с внутривенной ТНГ фибринолиз увеличился более чем на 263 % (группа № 4), а в группах с внутрипеченочной ТНГ - на 269 % (группа № 5).

Таким образом, ЛПВП в организме имеют многосторонние точки приложения, способствуя сбалансированности липидного гомеостаза организма при дислипопротеинемиях. Перенос ЛПВП осуществляет ряд субстратов с участием воды, что практически достаточно для переноса ХС [204].

Другой возможный механизм действия неонатальных гепатоцитов — неспецифический. Неонатальные гепатоциты продуцируют комплекс биологически активных веществ, которые активизируют собственные эндогенные механизмы регуляции восстановительных процессов в органах-мишенях, способствующих стабилизации гомеостаза организма [41, 76, 107]. Известно, что неонатальные гепатоциты содержат разнообразный спектр микроэлементов (особенно Fe, Си, Zn, Mg, Со), максимальный уровень витаминов Bj, Bi2, А и Е , цито-кинов и гормонов [121]. Установлено, что включение жирорастворимых витаминов в состав ЛПНП предохраняет последних от их окисления [88]. Показано, что железосодержащие вещества участвуют в формировании активных центров окислительных ферментов (оксидазы, супероксиддисмутазы и др.) антиок-сдантной системы организма. Медь и цинк участвуют в биосинтезе простанг-ландинов и их функционировании [107]. Следовательно, комплекс биологически активных веществ гепатоцитов индуцирует каскады биохимических реакций, спосбствующих восстановлению гомеостаза организма.

Трансплантация неонатальных гепатоцитов интесифицирует фибриноли-тическую систему крови, в результате которой расщепляется не только фибрин, но, по-видимому, и фибриноген (предиктора мозгового инсульта). Данный факт отмечен в литературе [126].

Установлено, что трансплантация неонатальных гепатоцитов независимо от способов введения значительно повышала активность антитромбина III. Максимальное увеличение активности AT-III отмечено в группах с внутрипе-ченочной ТНГ. Регистрируемая в эксперименте активация антисвертывающей системы, вероятно, происходит в результате повышения процесса синтеза антитромбина III и повышения концентрации активаторов плазминогена, синтез и секреция которых осуществляется в основном эндотелием сосудов, в то время как печень является преимущественным местом синтеза плазминогена [43, 144].

Установлено, что в течение 180 дней эксперимента в группе контроля значительных изменений в сосудистых стенках сосудов головного мозга, сонных и коронарных артерий не наблюдалось.

Гиперхолестеринемия отмечалась во всех группах, находившихся на ате-рогенной диете. Были отмечены нарушения липидного гомеостаза и системы гемостаза. К 180 суткам сформировалась жировая дистрофия гепатоцитов, что согласуется с общепринятыми представлениями течения алиментарной гиперхолестеринемии у кроликов [8, 103].

Анализ препаратов головного мозга экспериментальных животных в бассейне передней, средней мозговых артерий и базилярной артерии показал, что наибольшее атеросклеротическое поражение, характеризуемое отношением площади стенки сосуда к площади его просвета, наблюдалось бассейне средней и базилярной артерий, что соответствует данным литературы [9, 77, 149]. Так, в группе с моделью ГХС в бассейне средней мозговой артерии отношение площади стенки сосуда к площади просвета составило 2,34+0,19 ЕД. В группах с ТНГ этот показатель был ниже в сравнении с группой № 2 на 55 %. В бассейне базилярной артерии этот показатель у животных группы с моделью ГХС был выше по сравнению с контролем и составил 1,97±0,25 ЕД. В группе с внутрипеченочной ТНГ отношение площади стенки сосуда к площади просвета было ниже на 38 %, чем в группе № 3.

При исследовании срезов головного мозга животных с моделью ГХС было выявлено малокровие и сужение просвета сосудов микроциркуляторного русла с расширением периваскуляторных пространств вокруг капилляров, ар-териол, что согласуется с исследованиями проведенными Т. С. Гулевской на модели гиперлипидемии у кроликов в эксперименте [45].

Количество капилляров с суженным просветом в ткани головного мозга в

•у группе с моделью ГХС составило 2,34 ± 0,12 на 1 мм . В группе с внутривенной ТНГ (№ 4) количество данных сосудов было меньше на 19 %, чем в группе № 2. В группе с внутрипеченочной ТНГ (№ 5) количество капилляров с суженным просветом составило 1,37±0,14, что ниже на 41,5 % в сравнении с моделью ГХС. Диаметр периваскулярных пространств в этих группах был достоверно ниже, чем в группе с внутривенной ТНГ и группой с моделью ГХС.

У животных, находившихся на атерогенной диете (группа № 2 и 3), на 180 сутки эксперимента наблюдали сужение просвета венечных сосудов. Согласно данным морфометрического анализа, степень сужения просвета венечных сосудов составила 16,59 ± 5,22 %. Результаты морфометрического анализа коронарных сосудов, показали, что их количество с суженным просветом составило 2,05 ± 0,2 на 1 мм2.

При внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на 180 сутки наблюдали сужение просвета венечных сосудов на 5,33±1,03 %, при этом количество вовлеченных в атерогенный процесс сосудов составило 78,97 ± 4,59 %. У экспериментальных животных с внутрипеченочной трансплантацией неонатальных гепатоцитов сужение просвета венечных сосудов в сравнении со всеми остальными группами животных, находящихся на атерогенной диете было наименьшим и составило 2,36±0,82 %. Согласно результатам морфометрического анализа, у животных с внутрипеченочной ТНГ количество сосудов с уменьшенным просветом было меньше на 50 % и на 37 %, чем в группе с моделью ГХС и внутривенной трансплантацией.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что трансплантация неонатальных гепатоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии влияет на ключевые звенья липидного метаболизма, восстанавливая метаболическую функцию печени. При этом ее воздействие является позитивным как для сосудов головного мозга, так и для коронарных сосудов, что свидетельствует об общности антиатерогенного механизма клеточной терапии. Транспалнтация неонатальных гепатоцитов в свое естественное микроокружение предопределила более позитивный эффект воздействия неонатальных гепатоцитов.

Более выраженный эффект наблюдался при внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов, что свидетельствует о доминирующей роли печени в развитии гиперхолестеринемии и роли целевой трансплантации используемого биоматериала.

Нельзя исключить взаимодействие трансплантируемых гепатоцитов с компонентами иммунной системы. Известно, что печень посредством секреции ряда факторов (С-реактивный белок и др.) принимает участие в иммунных реакциях воспаления [25, 103]. В последнее время большое внимание уделяется способности многократно усиливать и передавать воспринимаемые ее компонентами локальные сигналы, что обеспечивает интегральную регуляцию многих биологических процессов. Получая информацию от трансплантированных гепатоцитов в виде цитокинов и адгезионных взаимодействий, иммунокомпе-тентные клетки могут моногократно усиливать ее и осуществлять стимуляцию органов-мишеней на уровне иммунной системы [103, 104].

Показано, что трансплантация неонатальных гепатоцитов, индуцируя разносторонние биологические эффекты, оказывает непосредственное влияние на основные патогенетические механизмы гиперхолестеринемии, проявляя тем самым системные эффекты клеточной трансплантации на атеросклеротические поражения сосудов головного мозга и миокарда.

Все вышеизложенное позволило разработать концептуальную схему механизмов воздействия трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на сосуды голвного мозга и миокарда в условиях гиперхолестеринемии, представленную на рис. 12.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ НЕОНАТАЛЬНЫХ АЛЛОГЕННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ

Факторы роста, интерлейкины, регуляторные пептиды и др.

Рецепция ЛПНП м ЛПВП

Синтез апоА-1

Экспрессия апоВ/Е-рецепторов

Активация 7а-гидроксилазы

Липидный спектр крови

• Общий ХС •ХС ЛПВП « ХС ЛПНП •ХСЛПОНП

• Трнглниернды

• Коэффициент атеро ген нести t V Активация антиокси-дантиых ферментов

АТЕРОГЕННАЯ ДИЕТА

Продукты пепекисного окисления липидов крови

• Малиновый диальдегид

• Гидроперекиси липидов

Антиоксидантная система крови

• Каталаза ^

• Перо кс и да за ^

• Коэффициент . пероксндации Т t t z л

Синтез антитромбина III

Синтез активаторов плазминогена

Синтез проста инкл и на

Коагуляционное звено

• Функциональная ^ активность тромбоцитов

• Концентрация \ фибриногена *

Антикоагулянтная активность

• Активности At-III ^

А кт и в но стьфиб р и и о л ит. системы

• Концентрация ^ плазминогена

• Интенсивность ^ фибрниолк за i i

Морфологические проявления в сосудах головного мозга

• Степень сужения просвета сосуда

Отношение плошади стенки сосуда к плошади просвета

Количество сосудов с суженным просветом на I мм2

•Диаметр пернваскулярных^ пространств сосудов

• Количество набухших эй- Т дотелноцитов

Морфологические проявления в сосудах миокарда

Степень сужения просвета сосуда х

• Количество сосудов с суженным просветом на 1 мм2 , оо

Рис. 12 Концептуальная схема саногенетических механизмов метаболического влияния трансплантации неонатальных гепатоцитов на гомеостаз организма животных при экспериментальной гиперхолестеринемии.