Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на развитие экспериментальной гиперхолестеринемии

На правах рукописи

Судаков" Николай Петрович

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННЫХ НЕОНАТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ НА РАЗВИТИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ

14.00.16. - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 2004

Работа выполнена в ГУ «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского Отделения РАМН», Ангарском филиале ГУ «Научный центр медицинской экологии человека Восточно-Сибирского научного центра Сибирского Отделения РАМН», ГОУ ВПО «Иркутский Государственный Университет».

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Никифоров Сергей Борисович

Научный консультант: Доктор медицинских наук,

профессор Бенеманский Виктор Викторович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

профессор Константинов Юрий Михайлович

Доктор медицинских наук,

профессор Явербаум Павел Моисеевич

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П. Павлова.

Защита состоится « (Ч у, 2004 г. в И часов на заседании диссер-

тационного совета Д. 001. 054.01 при ГУ «Восточно-сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003. г, Иркутск, ул. Тимирязева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан « £* 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Шолохов Л. Ф.

2005-4 13433

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, смертность от заболеваний, в основе которых лежат атеросклеротические поражения, в развитых странах мира и России неуклонно увеличивается и составляет 65 % от общей смертности (Р. Г. Ога-нов, 2002). Общепризнанно, что гиперхолестеринемия и ассоциированные с ней активация процессов перекисного окисления липидов, нарушения системы гемостаза являются доминирующими факторами развития коронарного атеросклероза (А. Н. Климов, 1999). Многогранность патогенетических механизмов развития ги-перхолестеринемии обуславливает недостаточную эффективность современных способов лечения атеросклероза (Н. А. Грацианский, 1994).

Одним из перспективных методов воздействия на многие патологические процессы является клеточная трансплантация. Оригинальные лечебные биотехнологии заключаются в трансплантации стволовых, низкодифференцированных эмбриональных или зрелых соматических клеток, способных восстанавливать функции пораженных патологическим процессом органов и тканей (Г. Т. Сухих, 2002).

Известно, что с нарушениями обмена липидов в печени связанны процессы инициации атерогенеза (В. А. Нагорнев, 1998). В этой связи, перспективной представляется активация компенсаторных антиатерогенных механизмов в печени методом клеточной трансплантации.

Цель исследования: изучить влияние трансплантации аллогенных неонаталь-ных гепатоцитов на развитие экспериментальной гиперхолестеринемии.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на липидный обмен и процессы перекисного окисления липидов в крови животных с экспериментальной гиперхолестеринемией;

2. Определить особенности изменений показателей системы гемостаза у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов;

3. Оценить морфологические изменения в аорте, коронарных сосудах и в печени при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии;

4. Определить эффективность внутривенного и внутрипеченочного способа трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии.

Научная новизна:

Впервые установлено позитивное влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии с оценкой липидного обмена, процессов перекисного окисления липидов и гемокоагуля-

ционной системы.

I ''ОС. НАЦИОНАЛЬНА.

I

Показано, что время агрегации атерогенных фракций липопротеинов (ЛПНП и ЛПОНП) находится в обратной корреляции с коэффициентом атерогенности и коэффициентом пероксидации, характеризующими интенсивность течения экспериментальной гиперхолестеринемии и с выраженностью атерогенных изменений аорты и коронарных сосудов.

Установлено увеличение активности антитромбина III в плазме крови экспериментальных животных под воздействием трансплантации аллогенных неона-тальных гепатоцитов, что способствует снижению тромбогенного потенциала крови.

Показано, что в сравнении с внутривенной трансплантацией, внутрипече-ночная трансплантация аллогенных неонатапьных гепатоцитов способствует более эффективному влиянию на прогрессирование экспериментальной гиперхолестеринемии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическое значение работы состоит в том, что выявлен ряд новых патогенетически обоснованных принципов воздействия трансплантации аллогенных неонатапьных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии. Установленные в эксперименте закономерности течения экспериментальной гиперхолестеринемии под воздействием различных способов трансплантации гепатоцитов будут способствовать дальнейшему формированию общей стратегии клеточной трансплантации в коррекции гиперхолестеринемии, как одного из детерминирующих факторов развития атеросклероза.

Положения выносимые на защиту

1. Трансплантация аллогенных неонатапьных гепатоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии способствует снижению интенсивности развития данного патологического процесса, что характеризуется уменьшением коэффициентов атерогенности и пероксидации, снижением тромбогенного потенциала и активизацией фибринолитических свойств крови, уменьшением степени выраженности морфологических изменений аорты, коронарных сосудов и печени.

2. Внутрипеченочная трансплантация аллогенных неонатапьных гепатоцитов является более эффективным методом коррекции экспериментальной гиперхолестеринемии в сравнении с внутривенной трансплантацией.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на: 7-ом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН, Москва, ноябрь-декабрь 2001 г.; II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине», г. Новосибирск, 18-19 июня 2002 г; Международном конгрессе «Практикующий врач» г. Сочи 1-4 октября 2002 г.; Всероссийской конференции «Новые направления в клинической медицине», г. Ленинск-Кузнецкий, 3-4 октября 2002 г.; Всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии, Сингапур, 1-7 декабря 2002 г; 8-ом Все-

российском съезде сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН, Москва, ноябрь 2002 г.; Научно-практической конференции «Здоровье и образование», 19-25 мая, Пермь, 2003 г.; 7-й Ежегодной сессии Всероссийского НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых, 25-27 мая 2003 г.; Международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека», 8-19 июня, Кара-Даг, Феодосия, Украина, 2003 г.; 4-й Северо-западной международной научно-практической конференции по проблемам внезапной смерти, 10-12 октября, С-Петербург, 2003 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии на современном этапе», 23-25 октября, Иркутск, 2003 г.; Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», ноябрь, Иркутск, 2003 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 6 статей в отечественных журналах, 9 тезисов и статей в материалах международных и российских конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, включая введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, заключение, выводы и практические рекомендации. Указатель литературы содержит 125 источников на русском и 128 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования

Работа выполнена в Научном Центре Реконструктивной и Восстановительной Хирургии ВСНЦ СО РАМН (директор, член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор, Е. Г. Григорьев), Иркутском Государственном Университете (ректор, профессор А. И. Смирнов), г. Иркутск и НИИ Гигиены труда и экологии человека (директор, член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор В. С. Рукавишников), г. Ангарск.

Для изучения влияния трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на развитие экспериментальной гиперхолестеринемии оценивали биохимические показатели липидов крови, продуктов перекисного окисления липидов, активность антиоксидантных ферментов плазмы, основные компоненты системы гемо-коагуляции. Осуществляли морфологический анализ миокарда и печени, оценивали площадь липидной инфильтрации аорты.

1.1. Структура эксперимента. В качестве экспериментальных животных использовали кроликов породы "шиншилла". Гиперхолестеринемию моделировали атерогенной диетой по методике Н. Н. Аничкова (1917 г.). Экспериментальные наблюдения проводили на 56 кроликах в течение 180 дней. Животные были подразделены на 7 групп (п=8). Группа № 1 (контроль) находилась на стандартной диете вивария. Животные групп № 2 и № 3 (модель гиперхолестеринемии) нахо-

дились на ежедневной холестериновой диете, из расчета 250 мг/кг веса животного. В группах № 2 и № 3 проводили ложные трансплантации: инъецировали физиологический раствор в ушную вену (группа № 2) и внутрипеченочно (группа № 3). Группы № 4, № 5 получали холестерин в аналогичной дозе, но кроме этого им были трансплантированы аллогенные неонатальные гепатоци-ты в ушную вену; группы № 6, № 7 также находились на атерогенной диете и получали трансплантации гепатоцитов внутрипеченочно. Трансплантации не-онатальных гепатоцитов начинались одновременно с началом диеты (превентивно) в группах № 4 и 6, и на фоне гиперхолестеринемии (с 6 дня диеты) в группах № 5 и № 7. Неонатальные гепатоциты трансплантировали через каждые 15 дней в количестве 1х106 на кг/веса в течение всего эксперимента (всего проведено 12 трансплантаций). Сроки наблюдения: 45, 90, 135 и 180 суток.

1.2. Метод получения неонатальных гепатоцитов. Неонатальные гепатоциты получали из печени 1-2 суточных кроликов по методике Р. О. Seglen (1976 г.). Печень перед извлечением подвергалась перфузии in situ изотоническим 0,005 М раствором ЭДТА (БиоЛот, Россия) с помощью перистальтической установки фирмы LKB (Швеция). Препарированный орган фрагментиро-вали и ресуспендировали в 0,1 % растворе коллагеназы из Clostridium histoliti-cum тип III (Sigma, США), подвергали энзиматической дезагрегации при 37° С. Полученную суспензию гепатоцитов анализировали на витальность по окраске трипановым синим в камере Горяева, которая составила 80 %. Суспензию клеток подвергали центрифугированию, ресуспендировали в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (БиоЛот, Россия) и до трансплантации инкубировали в 90-мм чашках Петри в СС^-инкубаторе (Forma Scientific, США). Перед трансплантацией животным гепатоциты отмывали от кондиционной среды в процессе ступенчатого центрифугирования и ресуспендировали в 0,9 % растворе NaCl, витальность клеточного трансплантата составляла 60 %.

1.3. Биохимические исследования. Анализ липидов крови осуществляли на анализаторе "Corona Clinicon" (Швеция), используя набор реагентов фирмы "Biocon" (Германия). Анализировали: общий холестерин (Хс), холестерин ли-попротеинов высокой плотности (ХсЛПВП), холестерин липопротеинов низкой плотности (ХсЛПНП), триглицериды (ТГ), коэффициент атерогенности (Ка) (А. Н. Климов, 2001). Агрегационную способность атерогенных липопро-теиновых фракций изучали по методике А. Л. Тарабрина (1994 г.). Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали, анализируя уровень продуктов ПОЛ (гидроперекиси, малоновый диальдегид) и определяя активность антиоксидантных ферментов (каталаза, пероксидаза) в плазме. Гидроперекиси липидов (ГПЛ) определяли по интенсивности поглощения световой волны в области 232-234 нм. (В. Б. Гаврилов, 1983). Малоновый диальдегид (МДА) определяли по концентрации окрашенного комплекса, образующегося в результате реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой. Активность каталазы определяли титрованием 0,1 Н раствором КМПО4. Пероксидаз-

ную активность анализировали фотометрически (С. Д. Балаховский, 1953). Интенсивность про- цессов ПОЛ оценивали, рассчитывая коэффициент пероксидации

МДА + ГПЛ

(Кп): Кп = т--г-.

[Перокс/100)+Кат

1.4. Оценка показателей системы гемостаза. Определение агрегационной активности тромбоцитов проводили на фотоэлектрокалориметре по В. П. Балуда (1980 г.). Индекс агрегации тромбоцитов рассчитывали по формуле:

Е -Е

—-, где Е - оптическая плотность. Количество фибриногена определя-

ЕмаксхШ%

ли по методике, основанной на его преципитации сульфатом аммония (3. С. Бар-каган, 1994). Активность антитромбина III оценивали, используя метод С. Abildgaard (1979 г.) в модификации К. М. Бышевского (1983 г.). Интенсивность процессов фибринолиза определяли по естественному лисизу фибринового сгустка по М.А. Котовщиковой и Б.И. Кузнику (1980 г.). Концентрацию плазминогена анализировали согласно методике В. Г. Лычева и А. Е. Дорохова (1981 г.).

1.5. Морфологические исследования. Проводили морфологический анализ миокарда, аорты и печени. После эвтаназии экспериментальных животных осуществляли взятие морфологического материала, который фиксировали в 10 % формалине и, после обезвоживания, заливали в парафин. Гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином. Степени липоидоза печени оценивали, анализируя гистологические микропрепараты, окрашенные Суданом IV. Макропрепараты аорты окрашивали на липиды Суданом III. Площадь липидной инфильтрации аорты оценивали по Г. Г. Автандилову (1990 г). Морфологические изменения тканей аорты, миокарда и печени на микропрепаратах анализировали с использованием видеосистемы JVC на световом микроскопе "Leica" (Великобритания). Количественную оценку исследуемых показателей осуществляли в специализированной версии программы "Photoshop".

Статистический анализ проводился в программах Excel, Stadia. Для сравнения количественных показателей использовали двухвыборочный t-критерий Стьюден-та с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. Межгрупповые отличия считались достоверными при р<0,05. Взаимосвязи исследуемых показателей оценивали с помощью корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2. Влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии

Изменения липидного спектра, процессов ПОЛ и показателей гемостаза в крови животных, получавших атерогенную диету (группы №№ 2-7) регистрировались уже на 45 сутки наблюдения. К 180 суткам эксперимента изменения

данных показателей приняли наиболее выраженную форму, что послужило основанием для более детального анализа течения ЭГХс в этом сроке наблюдения.

2.1. Липидный обмен. Показатели липидного обмена животных, находившихся на атерогенной диете и получавших внутривенные (группа № 2) и внут-рипеченочные (группа № 3) инъекции физиологического раствора статистически достоверно не различались на протяжении всего эксперимента. У животных с моделью ЭГХс концентрация Хс в крови на 180 сутки эксперимента достигла наивысшей точки и была на 1064 % выше по отношению к контролю (р<0,05). Уровень ХсЛПНП и триглицеридов возрос на 1983,5 и на 598 % соответственно, снижение концентрации ХсЛПВП составило 42 % (р<0,05). Время агрегации атерогенных липопротеинов на 180 сутки у животных с моделью гиперхолестеринемии уменьшилось на 66% в сравнении с контрольной группой (р<0,05). Коэффициент атерогенности в этот срок оказался выше на 2645 % в сравнении с контрольной группой (р<0,05), что свидетельствует о корректности воспроизведенной модели патологического процесса.

Анализируя показатели липидного обмена при трансплантации неонаталь-ных гепатоцитов на 180 сутки эксперимента, установили, что группа с внутри-печеночной ТНГ на фоне ЭГХс характеризовалась наименьшими значениями Хс (23,71±0,05 ммоль/л) и ХсЛПНП (21,58±0,08 ммоль/л) по отношению к ЭГХс. Остальные группы животных с ТНГ расположились в порядке возрастания данных показателей: № 6 (превентивная внутрипеченочная ТНГ), № 4 (превентивная внутривенная ТНГ), № 5 (внутривенная ТНГ на фоне ЭГХс). Максимальное значение концентрации ХсЛПВП наблюдали в группе № 6 (0,78±0,07 ммоль/л), что способствовало снижению Ка в вышеуказанной группе до минимального значения (29,54±0,23 ЕД). Следует отметить, что группы с ТНГ статистически достоверно отличались от модели гиперхолестеринемии по концентрации Хс, ХсЛПНП и ХсЛПВП (р<0,05) и недостоверно различались между собой. Наиболее приближенное к контролю время агрегации атерогенных липопротеинов наблюдали у животных с внутрипеченочной превентивной ТНГ (6,67±0,36 мин) и у животных с внутрипеченочной ТНГ на фоне ЭГХс (6,83±0,14 мин). Полученные значения для этих групп статистически достоверно не отличались от группы контроля и оказались достоверно меньше по отношению к модели гиперхолестеринемии (р<0,05). Меньшее время агрегации атерогенных липопротеинов, в сравнении с ЭГХс, было зарегистрировано у животных с внутривенной ТНГ на фоне ЭГХс (4,25±0,27 мин) и у животных с внутривенной превентивной ТНГ (5,25±0,65 мин). Полученные значения для групп с внутривенной ТНГ недостоверно отличались от ЭГХс. Сравнительный анализ времени агрегации атерогенных липопротеинов в группах с ТНГ показал достоверное замедление процесса агрегации атерогенных липопротеинов в группах с внутрипеченочной ТНГ в сравнении с внутривенной ТНГ (р<0,05), что свидетельствует о снижении атерогенных свойств данных липопротеинов.

При анализе коэффициента атерогенности в крови животных с ТНГ получены статистически достоверные отличия от группы с моделью гиперхолестеринемии (р<0,05), при этом также выявлено достоверно меньшее значение Ка у животных с внутрипеченочной ТНГ по отношению к группам с внутривенной ТНГ (р<0,05). Минимальное значение уровня триглицеридов определяли в группе с внутрипеченочной ТНГ (2,16±0,07 ммоль/л), что оказалось достоверно ниже в сравнении с моделью гиперхолестеринемии (р<0,05) и по отношению к группам с внутривенной ТНГ (р<0,05). Различия между группами с превентивной трансплантацией аллогенных неонатальных гепатоцитов и ТНГ на фоне ЭГХс были статистически недостоверными.

Установлено, что трансплантации неонатальных гепатоцитов в группах №№ 4-7 в сравнении с ЭГХс способствовуют меньшему увеличению уровня Хс в крови экспериментальных животных, которое сопровождается перераспределением его между фракциями липопротеинов: наблюдали меньшее процентное содержание ХсЛПНП и больший уровень ХсЛПВП. Индуцированный трансплантированными гепатоцитами адаптационный антиатерогенный сдвиг в липопротеино-вых фракциях способствует меньшему возрастанию значения Ка. Наиболее эффективное воздействие на течение экспериментальной гиперхолестеринемии оказывает внутрипеченочная трансплантация неонатальных гепатоцитов.

2.2. Изменения в системе ПОЛ. Анализ процессов ПОЛ проводили, используя коэффициент пероксидации. Установлено, что значения коэффициента перок-сидации у животных с моделью гиперхолестеринемии с внутривенным и внутри-печеночным введением физиологического раствора статистически достоверно не различались. У животных с экспериментальной гиперхолестеринемией на 180 сутки наблюдения значение коэффициента пероксидации было на 145,3 % выше по отношению к контролю (р<0,05). Наблюдаемая активизация процессов перекис-ного окисления липидов в группе с ЭГХс совпадала с темпами прогрессирования экспериментальной гиперхолестеринемии.

В группах с ТНГ также зарегистрирована интенсификация процессов ПОЛ, но менее значительная в сравнении с моделью гиперхолестеринемии. К 180 суткам эксперимента в группах с внутривенной ТНГ (группы № 4 и 5) установлены значения Кп, меньшие по отношению к ЭГХс на 26,8 % и на 19,8 % соответственно (р<0,05). Внутрипеченочная ТНГ (группы № 6 и 7) способствовала меньшему увеличению уровня Кп (на 33%) в сравнении с моделью гиперхолестеринемии (р<0,05). Сравнительный анализ данных показал статистически достоверно меньшую интенсивность процессов пероксидации в крови животных с внутрипеченочной ТНГ в сравнении с внутривенной ТНГ (р<0,05). Анализ параметров ПОЛ свидетельствует, что преимущественное влияние на снижение Кп оказывает увеличение активности каталазы и пероксидазы под действием ТНГ.

2.4. Состояние гемокоагуляционной и фибринолитической систем крови. Сравнение показателей системы гемостаза животных, находившихся на атероген-ной диете и получавших внутривенную (группа № 2) и внутрипече-

ночную (группа № 3) инъекции физиологического раствора не выявило статистически достоверных различий между группами на протяжении всего эксперимента. На 180 сутки наблюдения в группе с моделью гиперхолестеринемии отмечалось возрастание индекса агрегации тромбоцитов на 163,4 % в сравнении с контролем. При этом активность антитромбина III уменьшилась на 9%. Изменения показателей гемостаза свидетельствуют о степени тромбогенного риска у животных с моделью гиперхолестеринемии. Наблюдали снижение тромболитического потенциала крови с уменьшением активности фибринолиза на 40,3 % и снижением концентрации плазминогена на 25,3%.

В группах с ТНГ на 180 сутки значения индекса агрегации тромбоцитов, концентрация фибриногена приближались к таковым для группы контроля. Активность антитромбина III у животных с превентивной внутрипеченочной трансплантацией в сравнении с моделью гиперхолестеринеми (группа № 6) возросла на 53 % (р<0,05). Остальные группы с ТНГ по снижению активности антитромбина III расположились в следующем порядке: № 7 (внутрипеченоч-ная ТНГ на фоне ЭГХс), № 4 (превентивная внутривенная ТНГ). № 5 (внутривенная ТНГ на фоне ЭГХс). Показано увеличение активности антитромбина III в группах с ТНГ в сравнении с группой контроля (р<0,05). Наблюдали увеличение в крови концентрации плазминогена и усиление процесса фибринолиза. У животных с превентивной внутрипеченочной ТНГ значения этих показателей были максимальными и возрастали в сравнении с ЭГХс на 72,8 % и на 367,3 % соответственно (р<0,05). Другие группы с ТНГ расположились по снижению концентрации плазминогена и активности фибринолитических процессов в том же порядке, что и для активности антитромбина III.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что под влиянием ТНГ происходит снижение тромбогенного потенциала и активация фибрино-литической системы крови. Наиболее выраженный эффект наблюдали у животных с внутрипеченочной ТНГ.

3. Морфологические изменения в миокарде, аорте и печени животных при экспериментальной гиперхолестеринемии

3.1. Морфологические исследования аорты и миокарда. Анализ морфологических изменений аорты и миокарда кроликов осуществляли на 180 сутки эксперимента. Оценивали площадь липидной инфильтрации аорты (дуга, грудной и брюшной отделы), окрашенной Суданом III. Изучали срезы основания сердца (в месте локализации соустья коронарной артерии и аорты), средней части и верхушки миокарда. Для описания экспериментальных данных, вследствие недостоверности различий биохимических и морфологических данных для животных с моделью гиперхолестеринемии и разными способами ложной трансплантации (0,9 % NaCl), животные были объединены в единую группу.

Морфологические изменения в аорте. У экспериментальных животных с моделью гиперхолестернемии площадь липидной инфильтрации дуги аорты

занимала 93,2±4,2%, грудного и брюшного отдела - 60,3±3,4% и 75,5±5,3% соответственно. Общая площадь инфильтрации липидами аорты (от дуги до места отхождения почечных артерий) составила 80,5±6,8%. Полученные экспериментальные данные согласовываются с классическими представлениями атерогенеза, индуцированного атерогенной диетой у кроликов и свидетельствуют об адекватности воспроизведенной модели гиперхолестеринемии.

На 180 сутки у животных с внутривенной ТНГ (группы №№ 4-5), площадь ли-пидной инфильтрации дуги аорты животных группы с превентивной внутривенной ТНГ составила 80,3±4,7 %, у животных с внутривенной ТНГ на фоне гиперхолестеринемии - 75,2±6,2 %.

Грудной и брюшной отделы аорты у животных с внутривенной превентивной ТНГ были инфильтрированны липидами соответственно на 15,8±4,6 и 14,5±3,7 %. а у животных с внутривенной ТНГ на фоне ЭГХс - на 17,3±2,5 и 13,2±3,8 %. Общая площадь инфильтрации аорты липидами у животных 4-й и 5-й группы составила 36,4±8,7 и 35,8±7,3 % соответственно.

При эвтаназии (180 сутки эксперимента) площадь липидной инфильтрации дуги аорты животных с превентивной внутрипеченочной ТНГ (группа № 6) и у животных с внутрипеченочной ТНГ на фоне сформировавшейся ЭГХс (группа № 7) - занимала 27,3±5,8 и 31,3±6,6% соответственно. Инфильтрация липидами грудного отдела аорты животных вышеуказанных групп составляла 13,2±2,6 и 12,6±1,8% соответственно. Брюшной отдел аорты у животных с превентивной внутрипеченочной ТНГ был инфильтрирован липидами на 9,2±2,4%, а у животных с внутрипеченочной ТНГ на фоне ЭГХс - 11,5±2,1% соответственно. Общая площадь инфильтрации аорты липидами у животных группы № 6 была равной 18,6±5,7%, а у животных 7-й группы - 21,5±6,7 %.

Морфологические изменения в миокарде. У животных, находившихся на атерогенной диете (группа № 2), на 180 сутки эксперимента наблюдали уменьшение внутреннего диаметра венечных сосудов вследствие развившейся липидной инфильтрации интимы. По данным морфометрического анализа, степень сужения просвета венечных сосудов составила 16,7±5,2 %. Установлено, что в атерогенный процесс вовлечено 100 % от общего количества исследуемых сосудов. На фоне развившихся под влиянием ЭГХс атерогенных изменений коронарных сосудоЕ наблюдали также незначительные нарушения поперечной исчерченности кардио-миоцитов.

При внутривенной превентивной ТНГ и внутривенной ТНГ на фоне ЭГХс hp 180 сутки наблюдали уменьшение внутреннего диаметра венечных сосудов нг 5,3±1,1 и 5,4±0,7 % соответственно, при этом количество вовлеченных в атеро генный процесс сосудов составило 78,3±5,1 и 79,6±5,9%. Выявленные нарушена сосудистой системы миокарда не отразились на морфологии кардиомиоцитов структура которых соответствовала контрольной группе животных.

У экспериментальных животных с внутрипеченочной трансплантацией алло генных неонатальных гепатоцитов (6-я и 7-я группы) уменьшение диаметра ве нечных сосудов в сравнении со всеми остальными группами животных, на

ходящихся на атерогенной диете было наименьшим и составило 2,3±0,7 % и 2,4±0,8 %. Согласно результатам морфометрического анализа, у животных с внутрипеченочной превентивной ТНГ атерогенным процессом было захвачено 32,13±4,34 %, а у животных с ТНГ на фоне ЭГХс - 34,3±3,6 % сосудов от их общего количества. При этом нарушений морфологической структуры кар-диомиоцитов выявлено не было.

Таким образом, трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов способствует замедлению развития атерогенных изменений аорты и миокарда, индуцируемых при экспериментальной гиперхолестеринемии. Установлено, что наиболее выраженный защитный эффект оказывает внутрипеченочная ТНГ. При сравнительном анализе морфологических изменений при превентивной трансплантации гепатоцитов и трансплантации гепатоцитов на фоне развитой гиперхолестеринемии не было установлено статистически достоверных различий.

3,2. Морфологические изменения в печени. У животных с моделью гиперхолестеринемии (группы № 2 и № 3) при окраске на липиды Суданом III наблюдали выраженную липидную дистрофию ткани печени: 4,2±0,6 баллов (по Г. Г. Автандилову, 1990 г.), а также незначительное сужение просвета крупных печеночных сосудов. На гистологических препаратах печени экспериментальных животных также выявляются макрофаги с признаками жировой дистрофии.

Установлено, что при внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов в печени экспериментальных животных (группы №№ 45) жировая дистрофия была менее выражена в сравнении с животными с моделью гиперхолестеринемии и составила 3,0±0,6 и 3,0±0,3 балла соответственно. При внутрипеченочной ТНГ наблюдали меньшую степень жировой дистрофии паренхимы печени - 1,4±0,3 (превентивная ТНГ) и 1,5±0,1 балла (ТНГ на фоне ЭГХс), что в сравнении с остальными экспериментальными группами максимально приближается к морфологической структуре печени животных контрольной группы. Интересным явилось отсутствие морфологических изменений в месте имплантации гепатоцитов в печени животных с внутриорганной трансплантацией, что свидетельствует об отсутствии развития асептического воспаления в ответ на трансплантированные аллогенные неонатальные гепато-циты. Полученные результаты согласовываются с данными В. Г. Бруслик (1994 г.) и Г. Т. Сухих (2002 г.).

Таким образом, при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов происходит замедление развития дегенеративных изменений в печени, индуцируемых экспериментальной гиперхолестеринемией. Это свидетельствует об активации компенсаторных антиатерогенных механизмов в данном органе под влиянием ТНГ, что подтверждается результатами исследования показателей липидов и системы гемостаза.

3.3. Взаимосвязь интегральных показателей липидного обмена и морфологических изменений в аорте и миокарде. Для получения объективной

картины влияния ТНГ на развитие экспериментальной гиперхолестеринемии, изучены корреляционные взаимосвязи между исследуемыми показателями ли-пидного обмена, системы гемостаза, морфологическими изменениями в аорте и коронарных сосудах (рис. 1). Показана прямая корреляционная взаимосвязь интенсивности процессов пероксидации (Кп) со степенью дисбаланса атерогенных и антиатерогенных липопротеиновых фракций, характеризуемой величиной Ка (Я= +0,92, р<0,05). Установлена обратная взаимосвязь между интенсивностью ПОЛ и временем агрегации атерогенных липопротеинов (И= +0,92, р<0,05). Процессы перекисного окисления липидов при ЭГХс, по всей видимости, оказывают влияние на агрегационную способность атерогенных фракций липопротеинов за счет их окислительной модификации.

Корреляционные взаимосвязи изучаемых компонентов системы гемостаза и показателей липидного обмена у экспериментальных животных с ТНГ показали достаточно низкую степень корреляции, что объясняется, по-видимому, отсутствием интегрального показателя, отражающего общее состояние данной системы.

Установлено, что площадь липидной инфильрации аорты находится в прямой зависимости с коэффициентом атерогенности (11= +0,90) и коэффициентом пероксидации (Я= +0,97). Время агрегации атерогенных фракций липоротеинов обратно коррелирует с площадью липидной инфильтрации аорты (Я= -0,88). Корреляционный анализ позволил установить прямую взаимосвязь между числом коронарных сосудов, вовлеченных в атерогенный процесс, величиной Ка (Я= +0,87) и значением Кп (11= +0,97). Степень сужения просвета коронарных сосудов также находится в прямой взаимосвязи с коэффициентом атерогенности (Я= +0,91) и интенсивностью процессов пероксидации (Я= +0,93). Время агрегации атерогенных липопротеинов обратно коррелирует с количеством коронарных сосудов, вовлеченных в атерогенный процесс (Я= -0,97) и степенью сужения просвета сосудов миокарда (Я= -0,81). Полученные значения коэффициента корреляции биохимических и морфологических показателей были достоверными (р<0,05).

Таким образом, у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов степень выраженности нарушений липидного обмена находится в прямой корреляционной взаимосвязи со степенью морфологических изменений аорты и коронарных сосудов, что объективно свидетельствует о комплексном воздействии ТНГ на атерогенный процесс.

3.4. Сравнительный анализ эффективности различных способов трансплантации неонатальных гепатоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии. Для большинства показателей, характеризующих течение экспериментальной гиперхолестеринемии отмечали статистически недостоверные различия в группах с ТНГ. Тем не менее, в крови животных с внутрипеченочной ТНГ регистрировали достоверно меньший уровень триглицеридов (на 22,6 %, р<0,05), более низкое значение коэффициента атерогенности (на 6,0 %, р<0,05) в сравнении с внутривенной ТНГ. Время агрегации атерогенных фракций липопротеинов

Рис. 1. Корреляционные взаимосвязи интегральных показателей липидного обмена с морфологическими изменениями аорты и коронарных сосудов у животных с ТНГ при экспериментальной гиперхолестеринемии

к 180 суткам у животных с внутрипечночной ТНГ было статистически достоверно больше в сравнении с внутривенной ТНГ (на 54,0 %, р<0,05). Показано, что у животных с внутрипеченочной ТНГ процессы пероксидации протекали менее интенсивно в сравнении с внутривенной ТНГ (на 29,6 %, р<0,05).

Показано, что при внутрипеченочной ТНГ площадь липидной инфильтрации дуги аорты экспериментальных животных была на 66,0 % (р<0,05) ниже в сравнении с внутривенной ТНГ. Общая площадь липидной инфильтрации аорты животных с внутрипеченочной ТНГ составила 50,9 % (р<0,05) от общей площади липидной инфильтрации аорты животных с внутривенной ТНГ. В отличие от экспериментальных животных с внутривенной ТНГ, степень сужения просвета коронарных сосудов животных с внутрипеченочной ТНГ была меньше на 56,4 % (р<0,05), а количество коронарных сосудов, вовлеченных в атерогенный процесс -на 59,0 % (р<0,05). Установлено, что при внутрипеченочной ТНГ степень липои-доза в печени экспериментальных животных составила 46,8 % (р<0,05) от таковой для животных с внутривенной ТНГ.

Анализ полученных экспериментальных данных свидетельствует об отсутствии статистически достоверных различий между превентивной ТНГ и ТНГ на фоне ЭГХс. Тем не менее, как при внутривенной, так и при внутрипеченочной ТНГ, превентивный способ трансплантации проявляет тенденцию к большей эффективности в воздействии на процесс гиперхолестеринемии в сравнении с ТНГ на фоне ЭГХс.

Таким образом, полученные результаты исследования воздействия различных способов ТНГ на течение экспериментальной гиперхолестеринемии свидетельст-вовуют о большей эффективности внутрипеченочного способа ТНГ в сравнении с внутривенным.

4. Возможные механизмы влияния трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии.

Многогранность и сложность патогенетических механизмов развития гиперхолестеринемии, по мнению Г. Н. Крыжановского (2002 г.), требуют «применения комплексной терапии, действующей на разные патогенетические механизмы и звенья взаимопотенциирующих патологических систем». Сегодня, метод клеточной трансплантации наиболее оптимально соответствует этим принципам.

Установлено, что эмбриональные и неонатальные гепатоциты несут на своей поверхности рецепторы к ЛПНП и ЛПВП, синтезируют апопротеины: A-I, A-IV, Е, компоненты системы гемостаза, а так же комплекс биологически-активных веществ: альфа-фетопротеин, интерлейкин-6, -8, факторы роста и др. (А. В. Бочаров, 1998.; R. L. Hamilton, 1990.; G. Friedman, 1991). Показана способность изолированных гепатоцитов в культуре на протяжении 12 дней сохранять исходный уровень м-РНК апопротеинов и ферментов липиднОго обмена (M. Douaire, 1993). Эти уникальные свойства гепатоцитов, на наш взгляд, определяют их потенциальные возможности в коррекции ключевых патогенетических звеньев атерогенного процесса.

Установлено, что на протяжении всего эксперимента нарушения обмена липидов в группах с моделью гиперхолестеринемии прогрессировали и на 180 сутки приняли наиболее выраженную форму. Увеличение концентрации Хс в крови животных с моделью гиперхолестеринемии и его преимущественная локализация в атерогенной фракции ЛПНП свидетельствуют об угнетении клиренса ХсЛПНП. По данным С. А. Волгушева (1991 г.), основным механизмом, лежащим в основе этого процесса, является снижение количества апоВ/Е-рецепторов на поверхности клеток печени и подавление активности 7а-гидроксилазы гепатоцитов. Уменьшение концентрации ХсЛПВП на фоне возрастания фракции ХсЛПНП характеризует процесс снижения синтеза белка ano A-I, выполняющего основную роль в формировании насцентных ЛПВП.

Наблюдаемое в эксперименте снижение Хс в крови животных с трансплантацией неонатальных гепатоцитов (группы №№ 4-7) происходило преимущественно за счет уменьшения концентрации ХсЛПНП, что может быть следствием увеличения экспрессии в печени ano В/Е-рецепторов (Masucci-Magoulas L., 1997; Fass D., 1997.). Установленное снижение концентрации общего холестерина в крови животных с ТНГ, возможно, реализуется также при активации 7-а-гидроксилазы, окисляющей Хс в желчные кислоты (А. Н. Климов, 1999).

Повышение уровня ХсЛПВП, наблюдаемое при трансплантации неонатальных гепатоцитов свидетельствует об активизации синтеза апопротеинов A-I и А-П в печени. Не исключена также роль в этом процессе увеличения активности лецитин-холестерин-ацил-трансферазы (ЛХАТ), катализирующей процесс трансэтерификации холестерина в плазме крови (А. Н. Климов, 1999; Е. Quntao, 1995).

Зарегистрированное снижение уровня триглицеридов (косвенно характеризующего концентрацию ЛПОНП) может свидетельствовать о повышении в печени синтеза ano Е и экспрессии ano E-рецепторов, осуществляющих захват апоЕ-содержащих липопротеинов ЛПВП и ЛПОНП (F. Е. Thorngate, 2000).

Анализ экспериментальных данных показал, что у животных с ЭГХс интенсификация процессов ПОЛ наблюдалась на фоне увеличения концентрации ХсЛПНП и Хс в крови, что свидетельствует об увеличении окисленных форм ЛПНП в крови исследуемых животных (С. А. Волгушев, 1991). У животных с трансплантацией неонатальных гепатоцитов наблюдали снижение темпов пе-рекисного окисления липидов. Установлено, что преимущественное влияние на снижение коэффициента пероксидации оказывало увеличение активности каталазы и пероксидазы под действием ТНГ.

Показано, что снижение темпов пероксидации в крови животных с ТНГ происходило на фоне уменьшения выраженности течения ЭГХс. Возможно, это связано с отмеченным снижением фракции ЛПНП, как основного субстрата для окисления. Важным подтверждением снижения уровня модифицированных атерогенных липопротеинов при ТНГ является уменьшение агрегаци-онной способности ЛПНП и ЛПОНП у животных с ТНГ по отношению к ЭГХс

щих антиоксидантным эффектом, также может снижать интенсивность процессов ПОЛ (А. Н. Климов, 2001).

Полученные результаты свидетельствуют об активации трансплантированными гепатоцитами системы антиоксидантной защиты в крови экспериментальных животных, что по данным С. JT. Плавинского (2002 г.), существенно снижает агрессивность ЭГХс. Согласно полученным результатам, у животных с ЭГХс одновременно с прогрессированием гиперхолестеринемии и усилением процессов ПОЛ развивался эффект гиперкоагуляции, что согласуется с данными Д. М. Аронова (1999 г.). Показано, что трансплантация неонатальных гепатоцитов предотвращала развитие гиперкоагуляционных сдвигов в системе гемостаза и активировала фибринолитические свойства крови экспериментальных животных.

Торможение развития эффекта гиперкоагуляции у животных с трансплантацией неонатальных гепатоцитов может быть обусловлено зарегистрированным в эксперименте снижением интенсивности процессов ПОЛ и восстановлением баланса липопротеинов. Известно, что на фоне стабилизации липидного обмена происходит восстановление гемокоагуляционного статуса (Е. П. Панченко, 1997). В частности, установленное в нашем эксперименте снижение агрессивности гиперхолестеринемии и интенсивности ПОЛ предполагает снижение продукции эн-дотелиоцитами тканевых факторов, повышение в них активности NO-синтазы и, таким образом, увеличение атромбогенного потенциала сосудистой стенки (И. С. Северина; 1994; В. И. Куликов, 2002; Е. Б. Манухина, 2002).

Установленное у животных с ТНГ снижение агрегационной активности тромбоцитов может быть связано с уменьшением концентрации фибриногена в крови. Взаимодействуя с IIb/Ша-рецепторами тромбоцитов, фибриноген способствует агрегации тромбоцитов и их последующей адгезии к эндотелию (В. А. Марков, 1998). Возможно, снижение темпов ПОЛ при трансплантации гепатоцитов способствует уменьшению уровня ФАТ-подобных липидов, активирующих экспрессию с IIb/Ша-рецепторов на поверхности тромбоцитов (В. И. Куликов, 1996).

Наблюдаемое в осуществленном эксперименте увеличение активности антитромбина III и фибринолитической активности крови можно расценивать как индуцируемую ТНГ адаптивную реакцию на увеличение тромбогенного потенциала. Зарегистрированное у животных с ТНГ повышение уровня плазминогена в крови свидетельствует об активизации его синтеза в печени этих животных и, следовательно, о позитивном влиянии ТНГ на функции печени. Снижение уровня ЛПНП при трансплантации неонатальных гепатоцитов может непосредственно влиять на секрецию эндотелиоцитами ингибитора активатора плазмино гена-1 (ИАП-1), подавляющего активность фибринолиза. (А. Stiko-Rahm, 1990 г.).

В отличие от животных с моделью гиперхолестеринемии, у животных с трансплантацией неонатальных гепатоцитов наблюдали замедление развития липидной инфильтрации аорты, в особенности ее грудного и брюшного отделов. Коронарные сосуды и ткань печени при ТНГ поражались атерогенным процессом в меньшей степени, чем у животных с моделью гиперхолестеринемии. Интересно

отметить, что менее выраженным структурным нарушениям печени у животных с ТНГ соответствовало уменьшение агрессивности течения гиперхолесте-ринемии, что свидетельствует об активации собственных компенсаторных антиатерогенных механизмов в печени этих животных. Это также подтверждает существующее положение о ключевой роли функций печени в процессе ги-перхолестеринемии (А. Л. Мясников, 1960).

Таким образом, результаты исследования морфологических изменений аорты, миокарда и печени у животных с ЭГХс и трансплантацией неонатальных гепатоцитов свидетельствуют, что, снижая агрессивность процесса ЭГХс, трансплантированные аллогенные неонатальные гепатоциты способствуют замедлению развития морфологических изменений в данных органах (рис. 2).

Более выраженное позитивное влияние внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов на процесс ЭГХс свидетельствует о том, что в условиях собственного микроокружения трансплантированные гепатоциты наиболее эффективно активизируют антиатерогенные механизмы в печени экспериментальных животных (Б. П. Токин, 1959; Л. В. Полежаев, 1977).

Одним из возможных механизмов стимуляции антиатерогенных процессов у животных при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов является активация у них собственного пула стволовых клеток и более зрелых клеток-предшественников, обладающих пролиферативным потенциалом и способных замещать поврежденные атерогенным процессом клетки. Установлено, что стволовые клетки обладают высокой пластичностью благодаря их способности к трансдетерминации (Л. И. Корочкин, 2002; И. Л.Чертков, 1998; С. Я. Я. Врпэоп, 1998), что, несомненно, открывает перспективы дальнейших экспериментальных исследований и новых оригинальных биотехнологических методов воздействия на ключевые патогенетические звенья атероге-неза.

ВЫВОДЫ

1. Трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов способствует уменьшению дисбаланса атерогенной (ЛПНП) и антиатерогенной (ЛПВП) фракций холестерина, снижению уровня триглицеридов, уменьшению аг-регационной способности атерогенных липопротеинов (ЛПОНП и ЛПНП) и снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов в крови животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.

2. У животных с экспериментальной гиперхолестеринемией при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов уменьшается агрегационная способность тромбоцитов, увеличивается активность антитромбина III, активизируются фибринолитические свойства крови.

3. В условиях экспериментальной гиперхолестеринемии у животных с трансплантацией аллогенных неонатальных гепатоцитов уменьшается площадь липидной инфильтрации аорты, снижается количество захваченных атеро-

Трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов

о

Рис. 2. Возможные механизмы воздействия трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на атеро-генный процесс в эксперименте.

генным процессом коронарных сосудов и степень сужения их внутренне-годиаметра; уменьшается степень липоидоза печени.

4. Внутрипеченочная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией, в сравнении с внутривенной трансплантацией, способствует более эффективному снижению коэффициентов атерогенности (на 6,0 %) пероксидации (на 29,6 %), уменьшению площади липидной инфильтрации аорты (на 56,4 %), количества коронарных сосудов, вовлеченных в атерогенный процесс (на 59,0 %), снижению степени липоидоза печени (на 46,8 %).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Аллогенная трансплантация гепатоцитов является эффективным биотехнологическим методом в коррекции ключевых звеньев атерогенного процесса: гиперхолестеринемии, процессов перекисного окисления липидов, гемокоагу-ляционных нарушений. В перспективе, клеточная трансплантация представляет реальную альтернативу современным медикаментозным и хирургическим способам воздействия на течение гиперхолестеринемии, как одного из доминирующих факторов развития атеросклероза.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

Ка Коэффициент атерогенности

Кп Коэффициент пероксидации

ЛПВП Липопротеины высокой плотности

ЛПНП Липопротеины низкой плотности

ЛПОНП Липопротеины очень низкой плотности

ОкЛПНП Окисленные липопротеины низкой плотности

ПОЛ Перекисное окисление липидов

ТНГ Трансплантация неонатальных гепатоцитов

ФАТ Фактор активации тромбоцитов

Хс Холестерин

ЭГХс Экспериментальная гиперхолестеринемия

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Неоангиогенез миокарда в эксперименте / А. А. Рунович, Т. Е. Курильская, С. Б. Никифоров и др. // Бюллетень НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева. - 2001. - т. 2. -№ 6. - С. 249.

2. Влияние трансплантации неонатальных гепатоцитов на перекисное окисление липидов при экспериментальной гиперхолестеринемии. / Н. П. Судаков, A.A. Берина, В. В. Ильина и др. // Новые технологии в медицине: Тезисы докладов II объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН, 18-19 июня 2002 г. - Новосибирск, 2002. - С. 44.

3. Внутриорганная трансплантация гепатоцитов в коррекции экспериментального атеросклероза. / А. А. Рунович, Н. П. Судаков А. А. Берина и др. // Практикующий врач: Тезисы докладов международного конгресса 1-4 октября 2002 г. -Москва, 2002.-С. 103.

4. Перспективы трансплантации неонатальных гепатоцитов в коррекции гиперхолестеринемии / А. А. Рунович, Н. П.Судаков, А. А. Берина и др. // Настоящее и будущее технологичной медицины: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 3-4 октября 2002 г. - Ленинск-Кузнецкий, 2002. -С.335-336.

5. Судаков Н. П. Биология стволовых кроветворных клеток / Н. П.Судаков, А. А. Рунович, С. Б. Никифоров // Бюллетень СО РАМН. - 2002. - № 4. -С. 97-99.

6. Изучение эффективности влияния внутривенной и внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов на течение экспериментального атеросклероза / А. А. Рунович, Н. П. Судаков, А. А. Берина и др. // International Journal of Immunorehabilitation. - 2002. - т. 4. - № 2. - С. 308.

7. Изучение эффективности внутривенной и внутрипеченочной трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии / А. А. Рунович, С. Б. Никифоров, Н. П. Судаков и др. // Бюллетень ВСНЦ. - 2002. - т. 1. - № 5. - С. 114.

8. Возможности трансплантации гепатоцитов в коррекции гиперхолестеринемии / А. А. Рунович, С. Б. Никифоров, Н. П. Судаков и др. // Бюллетень ВСНЦ. -2002.-т. 1. - № 5. - С. 123.

9. Влияние внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов на показатели системы гемостаза при эспериментальной гиперхолестеринемии / А. А. Рунович, А. А. Берина, Н. П. Судаков и др. // International Journal of Immunorehabilitation. - 2003. - т. 5. - № 1. - С. 95.

10. Влияние внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов кролика на показатели липидного обмена и уровень белков теплового шока (70 кДа) в ткани миокарда и головного мозга при экспе- риментальной гиперхолестеринемии / А. А. Рунович, Ю. И. Пивоваров, С. Б. Никифоров, и др. // Аллергология и иммунология. - 2003. - т.4, - № 2, - С. 240-243.

11. Влияние внутрипеченочной трансплантации гепатоцитов на развитие и течение экспериментальной гиперхолестеринемии / А. А. Руно-вич, А. А. Берина, Н. П.Судаков и др. // Паллиативная медицина и реабилитация.-2003. - №2.-С. 152.

12. Коррекция некоторых биохимических показателей в стенке аорты кроликов путем трансплантации неонатальных гепатоцитов при экспериментальном атеросклерозе / В. Г. Горохова, А. Г. Горохов, Э. Э. Кузнецова и др. // Тезисы докладов 4-й северо-западной международной конференции по проблемам внезапной смерти, 10-12 октября 2003 г-Санкт-Петербург, 2003. - С. 50

13. Некоторые механизмы воздействия трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии. / А. А. Рунович, С. Б. Никифоров, Н. П. Судаков и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2003. - № 7. - С. 32-33.

14. Влияние внутривенной трансплантации гепатоцитов на показатели ли-пидного обмена и системы гемостаза при экспериментальной гиперхолестеринемии / Н. П. Судаков, А. А. Берина, А. С. Сергеева и др. // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири, 11 ноября 2003 г. - Иркутск, 2003. - С. 219-220.

15. Судаков Н. П. Морфологические изменения в сосудах миокарда и головного мозга при трансплантации неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии. / Н. П. Судаков, А. А. Берина, А. С. Сергеева // Новое в реконструктивной хирургии: Тезисы научной конференции молодых ученых, посвященной Дню основания РНЦХ РАМН, 19 марта 2004 г. - Москва, 2004. - С. 304-305.

Отпечатано 26.08.2004 г. в типографии РГ «ПИЛОТ», 664061, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 12, тел/факс: (3952)240-612. Заказ № 232, тираж 100 экз.

«f M я f- Ç 1

ft г \ -J j

РНБ Русский фонд

2005-4 13433

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, смертность от заболеваний, в основе которых лежат атеросклеротические поражения, в развитых странах мира и России неуклонно увеличивается и составляет 65 % от общей смертности [74]. Общепризнанно, что гиперхолестеринемия и ассоциированные с ней активация процессов перекисного окисления липидов, нарушения системы гемостаза являются доминирующими факторами инициации и развития коронарного атеросклероза [44]. Многогранность патогенетических механизмов развития и течения гиперхолестеринемии обуславливает недостаточную эффективность современных способов лечения атеросклероза [24].

Одним из перспективных методов воздействия на многие патологические процессы является клеточная трансплантация. Оригинальные лечебные биотехнологии заключаются в трансплантации стволовых, низко-дифференцированных эмбриональных или зрелых соматических клеток, способных восстанавливать функции пораженных патологическим процессом органов и тканей [59, 72, 86].

Известно, что с дизрегуляционными нарушениями обмена липидов в печени связаны процессы инициации атерогенеза [41, 64]. В этой связи, перспективной представляется активация компенсаторных антиатероген-ных механизмов в печени методом клеточной трансплантации.

Цель исследования: изучить влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на развитие экспериментальной гиперхолестеринемии.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на липидный обмен и процессы перекисного окисления липидов в крови животных с экспериментальной гиперхолестеринемией;

2. Определить особенности изменения показателей системы гемостаза у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов;

3. Оценить морфологические изменения в аорте, коронарных сосудах и в печени при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии;

4. Определить эффективность внутривенного и внутрипеченочного способа трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии.

Научная новизна:

Впервые установлено позитивное влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии с оценкой липидного обмена, процессов перекисного окисления липидов и гемокоагуляционной системы.

Показано, что время агрегации атерогенных фракций липопротеинов (ЛПНП и ЛПОНП) находится в обратной корреляции с коэффициентом атерогенности и коэффициентом пероксидации, характеризующими интенсивность течения экспериментальной гиперхолестеринемии и с выраженностью атерогенных изменений аорты и коронарных сосудов.

Установлено увеличение активности антитромбина III в плазме крови экспериментальных животных под воздействием трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов, что способствует снижению тромбо-генного потенциала крови.

Показано, что внутрипеченочная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов способствует более эффективному влиянию на про-грессирование экспериментальной гиперхолестеринемии в сравнении с внутривенной трансплантацией.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическое значение работы состоит в том, что выявлен ряд новых патогенетически обоснованных принципов воздействия трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гиперхолестеринемии. Установленные в эксперименте закономерности течения экспериментальной гиперхолестеринемии под воздействием различных способов трансплантации гепатоцитов будут способствовать дальнейшему формированию общей стратегии клеточной трансплантации в коррекции гиперхолестеринемии, как одного из детерминирующих факторов развития атеросклероза.

Положения выносимые на защиту

1. Трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии способствует снижению интенсивности развития данного патологического процесса, что характеризуется уменьшением коэффициентов атерогенности и пероксидации, снижением тромбогенного потенциала и активизацией фибринолитических свойств крови, уменьшением степени выраженности морфологических изменений аорты, коронарных сосудов и печени.

2. Внутрипеченочная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов является более эффективным методом коррекции экспериментальной гиперхолестеринемии в сравнении с внутривенной трансплантацией.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на: 7-ом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН, Москва, ноябрь-декабрь 2001 г.; II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине», г. Новосибирск, 18-19 июня 2002 г; Международном конгрессе «Практикующий врач» г. Сочи 1-4 октября 2002 г.; Всероссийской конференции

Новые направления в клинической медицине», г. Ленинск-Кузнецкий, 3-4 октября 2002 г.; Всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии, Сингапур, 1-7 декабря 2002 г; 8-ом Всероссийском съезде сердечнососудистых хирургов НЦ CCX им. А. Н. Бакулева РАМН, Москва, ноябрь

2002 г.; Научно-практической конференции «Здоровье и образование», 1925 мая, Пермь, 2003 г.; 7-й Ежегодной сессии Всероссийского НЦ CCX им. А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых, 2527 мая 2003 г.; Международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека», 8-19 июня, Кара-Даг, Феодосия, Украина,

2003 г.; 4-й Северо-западной международной научно-практической конференции по проблемам внезапной смерти, 10-12 октября, С-Петербург, 2003 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии на современном этапе», 23-25 октября, Иркутск, 2003 г.; Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», ноябрь, Иркутск, 2003 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 6 статей в отечественных журналах, 9 тезисов и статей в материалах международных и российских конференций.

выводы

1. Трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов способствует уменьшению дисбаланса атерогенной (ЛПНП) и антиатерогенной (ЛПВП) фракций холестерина, снижению уровня триглицеридов, уменьшению агрегационной способности атерогенных липопротеинов (ЛПОНП и ЛПНП) и снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов в крови животных с экспериментальной гиперхоле-стеринемией.

2. У животных с экспериментальной гиперхолестеринемией при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов уменьшается агрега-ционная способность тромбоцитов, увеличивается активность антитромбина III, активизируются фибринолитические свойства крови.

3. В условиях экспериментальной гиперхолестеринемии у животных с трансплантацией аллогенных неонатальных гепатоцитов уменьшается площадь липидной инфильтрации аорты, снижается количество захваченных атерогенным процессом коронарных сосудов и степень сужения их внутреннего диаметра; уменьшается степень липоидоза печени.

4. Внутрипеченочная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией в сравнении с внутривенной трансплантацией способствует более эффективному снижению коэффициентов атерогенности (на 6,0 %) пероксидации (на 29,6 %), уменьшению площади липидной инфильтрации аорты (на 56,4 %), количества коронарных сосудов, вовлеченных в атерогенный процесс (на 59,0 %), снижению степени липоидоза печени (на 46,8 %).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Аллогенная трансплантация гепатоцитов является эффективным биотехнологическим методом, в коррекции ключевых звеньев атерогенного процесса: гиперхолестеринемии, процессов перекисного окисления липи-дов, гемокоагуляционных нарушений. В перспективе, клеточная трансплантация, представляет реальную альтернативу, современным медикаментозным и хирургическим способам воздействия на течение гиперхолестеринемии, как одного из доминирующих факторов развития атеросклероза.