Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние трансплантации фетальной ткани печени на течение экспериментального атеросклероза

На правах рукописи

СТРЕКАЛОВСКИЙ Дмитрий Викторович

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНОЙ ТКАНИ ПЕЧЕНИ НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АТЕРОСКЛЕРОЗА

(Экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск - 1999

Работа выполнена на базе научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии ВСНЦ СО РАМН.

Научные руководители :

академик РАМН, доктор.медицинских наук, профессор Г.С.Якобсон,

Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор Пивоваров Ю.И. доктор биологических наук, профессор Васильева Л.С.

Ведущая организация :

Новосибирский медицинский институт

в "_" час.

на заседании диссертационного совета Д 001.41.01 ГУ «Восточно-Сибирский научный центр СО РАМН» (664003, Иркутск, ул. Тимирязева, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Президиума Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН (664003, Иркутск, ул. Тимирязева, 16)

Автореферат разослан" ^

доктор медицинских наук А.А. Рунович

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь диссертационного совета, к

О V-

ВВЕДЕНИЕ

По данным ВОЗ смертность от заболеваний сердечнососудистой системы, в основе которых лежит атеросклеротиче-ское поражение сосудистой стенки (ишемическая болезнь сердца, нарушение мозгового кровообращения и др.), в развитых странах мира и России составляет 52 % - 65 % (от общей смертности) /Grundy, 1997, Komatsu.1996/. В США финансовые затраты на лечение только ишемической болезни сердца составляют 15 млрд. долларов в год, а от потери трудоспособности 9 млрд. долларов /Stone, 1996, Kornitzer, 1996/. Основой этих заболеваний является нарушение липид-ного обмена с развитием гиперхолестеринемии и необратимыми изменениями сосудистой стенки.

Существующие методы коррекции гиперхолестеринемии, включающие хирургические вмешательства, эфферентную терапию, фармакологические воздействия на различные звенья синтеза холестерина в организме/Scheli, 1997, Grundy, 1997/ способствуют лишь временной стабилизации уровня липидов крови с последующим его восстановлением до исходных /Ganz,1996/. Именно поэтому проблема поиска новых, более эффективных, методов коррекции гиперхолестеринемии представляется актуальной.

Известно, что центральным органом, отвечающим за синтез и регуляцию обмена холестерина в организме, является печень /Waters, 1996/. Установлено, что у больных с коронарным атеросклерозом снижена концентрация холестерина липопротеидов высокой плотности, представляющих антиатерогенную фракцию, и повышена концентрация атерогенных фракций холестерина: липопротеидов низкой и очень низкой плотности /La Rosa, 1997/. Многие ведущие специалисты полагают, что этот факт связан с нарушением функции печени в поддержании липидного "гомеостаза", так как более 50% указанных липопротеидов синтезируется и метаболи-зируется этим органом /Dyng, 1996/.

В этой связи представляет несомненный научный и практический интерес попытка использования для восстановления измененной функциональной активности печени и коррекции гиперхолестеринемии метода трансплантации фетальных тканей (ФТ), в частности, фетальной ткани печени, так как из-

вестно, что ФТ стимулирует деятельность аналогичного органа реципиента.

Позитивное влияние фетальной ткани печени ранее было продемонстрировано при лечении хронических гепатитов, циррозов печени, различных видов анемий /Грицюк А.И. 1994/. гемобластозов /Савельев 1994, Teillet 1993/, лучевом повреждении/Ross, 1994/.

Фетальные ткани обладают большим пластическим потенциалом, связанным с высоким содержанием властных клеток, а также высокой приспособляемостью, за счет роста и миграции способны образовывать новые межклеточные связи; они делятся быстрее и чаще, чем зрелые клетки. У них значительно снижено количество зрелых иммунокомпетентных клеток, отсутствует видовая специфичность, провоцирующая развитие болезни "трансплантат против хозяина", так как в 1 и 2 триместрах гестации еще не экспрессированы белки гистосовместимости I и II классов /Кулаков с соавт.-1993/. Установлено, что фетальная "ткань содержит большое количество различных биологически активных веществ-таких как ростовые факторы, способные обеспечивать их выживание и стимуляцию регенерации поврежденных тканей реципиента, а так же факторы стимулирующие регенерацию гепатоцитов /В.И. Шумаков с соавт. 1989/.

Все изложенное выше дает основание считать актуальным вопрос коррекции основного патогенетического звена развития экспериментального атеросклероза с помощью трансплантации фетальной ткани печени,что и послужило основанием для выполнения данной работы, которая является частью государственной программы N9 015, а также фрагментом комплексной темы научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии ВСНЦ СО РАМН.

Цель исследования - Разработать новый способ снижения гиперхолестеринемии и изучить влияние трансплантации ксеногенной фетальной ткани печени на развитие экспериментального атеросклероза.

Задачи исследования:

1. Определить влияние трансплантации фетальной ткани печени на изменение липидного спектра крови у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.

2. Установить влияние фетальной ткани печени на систему гемостаза при экспериментальной гиперхолестеринемии.

3. Изучить структурно-функциональные изменения в сердце, аорте и печени при экспериментальной гиперхолестеринемии и трансплантации фетальной ткани печени.

4. На основании полученных данных разработать новый способ коррекции экспериментального атеросклероза.

Научная новизна

Впервые установлено, что у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией трансплантируемая ксеногенная фе-тальная ткань печени вызывает снижение концентрации общего холестерина, повышение фракции антиатерогенных липо-протеидов высокой плотности (ЛПВП), снижение фракции атерогенных липопротеидов, низкой и очень низкой плотности (ЛПНП, ЛПОНП), уменьшение концентрации триглицеридов (ТГ) и снижение коэффициента атерогенности (Ка).

Трансплантация фетальной ткани печени способствует повышению антикоагуляционных свойств крови, снижению ее тромбопластической активности, стабилизации агрегационных свойств тромбоцитов.

Установлено, что трансплантация фетальной ткани печени у животных с гиперхолестеринемией уменьшает площадь ли-пидной инфильтрации аорты в 1,5 раза по сравнению с группой контроля. Выявлено, что под воздействием трансплантации фетальной ткани печени увеличивается площадь капиллярного русла миокарда.

Практическая значимость работы

Предложено новое средство для коррекции гиперхолестеринемии и ее морфологических последствий, что может служить разумной альтернативой в лечении ишемической болезни сердца и ее осложнений у людей. Полученные новые данные о влиянии трансплантации фетальной ткани печени на гомеостаз расширяют область ее клинического применения. Получен патент на изобретение « новое средство коррекции гиперхолестеринемии».

Апробация работы

Материалы диссертациионной работы доложены и обсуждены на:

1 . Итоговых научных сессиях Института хирургии ВосточноСибирского научного Центра СО РАМН (Иркутск, 1993 ,1995)

2 . Научной конференции Иркутского ГИДУВа "Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины". Иркутск, 1995 г. ■

3 . Заседании Ученого Совета Института хирургии (Иркутск 1997)

4 . II Национальном конгрессе «Трансплантация феталь-ных тканей и клеток человека» (Москва 1998)

По результатам проведенных исследований опубликовано 9 научных работ, получено 2 патента на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Трансплантация ксеногенной фетальной ткани печени у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией изменяет липопротеидный спектр сыворотки крови, снижая концентрацию общего холестерина и уровень атерогенных липопотеидов, повышает концентрацию антиатерогенных липопротеидов.

2. Трансплантация фетальной ткани печени животным с экспериментальной гиперхолестеринемией способствует повышению антикоагуляционных свойств и снижению тромбопласти-ческой активности крови.

3. Трансплантация фетальной ткани печени способствует уменьшению липидной инфильтрации аорты и коронарных артерий у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.

Обьем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Изложена на 90 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 10 рисунков и одну схему. В приведенном списке литературы 109 отечественных и 94 иностранных источника.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве экспериментальных животных использовались кролики мужского пола породы "шиншилла" массой 1,5 - 3 кг, в возрасте 12-16 месяцев. Эксперимент проводили на 40 животных, которые были подразделены на следующие группы: группа N 1 (10 кроликов, контроль) находилась на стандартной диете вивария; группа N2 (12 кроликов) получали диету с добавлением в пищевой рацион холестерина из расчета 250 мг/кг веса животного; группа N3 (18 кроликов) также получала в диете холестерин в аналогичной дозе, кроме этого ей была трансплантирована фетальная ткань печени человека.

В течение 4 месяцев животные 2 и 3 групп получали холестериновую диету, далее в течении 3 месяцев после ее отмены наблюдали реакцию влияния имплантации фетальной ткани печени на динамику обратного развития последствий гиперхоле-стеринемии.

В начале эксперимента и каждые 24 дня в ходе его осуществляли забор крови во всех группах животных для проведения биохимических исследований и оценки показателей гемостаза. Сроки забора крови: 24, 48, 72, 96 и 120 день эксперимента. После отмены атерогенной диеты биохимические анализы и параметры гемостаза определяли 1 раз в 30 дней.

С целью постадийного изучения процесса формирования атеросклеротического поражения сосудистой стенки в сроки 2, 3 и 4 месяца проводили плановое выведение животных из эксперимента. Перед эвтаназией животные усыплялись с помощью внутримышечного введения калипсола.

Фетальную ткань печени (ФТП) человека получали при выполнении медицинских абортов (срок гестации 8 - 12 недель) в специализированном лечебном учереждении.

Абортная масса собиралась в стерильный лоток, затем фильтровалась через сито из медицинской нержавеющей стали с диаметром отверстий 0,5 см для отделения жидкой фракции абортной массы, содержащей кровь и околоплодные воды. Далее стерильным пинцетом абортная масса раскладывалась тонким слоем на сите для визуальной идентификации органной принадлежности. Выделенные части эмбриона помещались в раствор Хенкса с антибиотиками (пенициллина натриевая соль 500 тыс ЕД и 1 гр. стрептомицина на 500 мл. раствора Хенкса, рН раствора 7,3 - 7,4) и транспортировались в контейнере с сухим льдом в ла-

бораторию. В условиях стерильного бокса фрагменты эмбриональной ткани отмывались в растворе Хенкса от сгустков и клеточных элементов крови 3-4 раза до получения прозрачного раствора. Затем отмытые фрагменты эмбриональной ткани в стерильной чашке Петри помещались под бинокулярную лупу с увеличением 15-20 раз. Ткань препарировалась и извлекалась фетальная печень. Полученную фетальную печень рассекали на мелкие фрагменты (1 х 1 мм) и повторно отмывали в растворе Хенкса 4 - 5 раз. Далее фрагменты ткани печени помещали в ручной стеклянный гомогенизатор Поттера для получения гомогената. Последний также отмывали от клеточных элементов крови в растворе Хенкса. Полученная нативная суспензия фетальной ткани печени в растворе Хенкса, вводилась кролику в паравертебральную область из расчета 50 мг/кг массы животного. Непосредственно перед трансплантацией ФТП проводили цитологическую верификацию вводимого гомогенизата путем приготовления на-тивного мазка и исследования под микроскопом, параллельно путем окраски трипановым синим оценивалась жизнеспособность получаемых клеточных образцов. При микроскопическом исследовании вводимой ткани гепатоциты, как правило, располагались группами и конгломератами с элементами кроветворной ткани, имелось незначительное число разрушенных клеток с вакуолизацией цитоплазмы.

Для оценки изменений, происходящих в организме лабораторных животных, производились биохимические исследования. Использовали анализатор "Corona Clinicon" и реактивы фирмы "Boehringer Mannheim". Применялись энзиматические методики, измерение проводили при температуре 37 °С. Общий холестерин крови определяли спектрофотометрически с использованием фермента холестерин-эстеразы по образованию эквивалентного количества перекиси водорода. Содержание холестерина липопротеидов высокой плотности определяли в надо-садочной части сыворотки крови после осаждения суммарных атерогенных липопротеидов (липопротеиды низкой и очень низкой плотности). В качестве осадителя использовали смесь фосфорновольфрамовой кислоты (0,55 ммоль/л) и хлорид магния (0,25 ммоль/л). Уровень триглицеридов определяли по методу энзиматического гидролиза путем освобождения из триглицеридов глицерина, который далее колориметрировали. Фосфолипиды определяли с использованием холин-оксидазы по

образованию эквивалентного количества перекиси водорода, которую колориметрировали. Анализировались следующие показатели: общий холестерин (ОХ), холестерин липопротеидов высокой плотности (ХсЛПВП), холестерин липопротеидов низкой плотности (ХсЛПНП), холестерин липопротеидов очень низкой плотности (ХсЛПОНП), триглицериды (ТГ), фосфолипи-ды (ФЛ), общие липиды (ОЛ), коэффициент атерогенности (Ка). ОХ, ХсЛПВП, ТГ, ФЛ - определяли колориметрическим методом, другие показатели расчитывались математически: ХсЛПОНП = ТГ/5 (отношение); ХсЛПНП = ОХ - ХсЛПВП -ХсЛПОНП; коэффициент атерогенности (Ка) = ОХ - ХсЛПВП 15.

Кроме показателей липидного спектра крови производилось исследование свертывающей системы. Непосредственно в момент забора крови у животных выполняли запись элек-трокоагулограммы с помощью прибора «коагулограф Н-334». По полученной кривой анализировались следующие показатели: гематокрит, время начала (Т1), конца (Т2) и продолжительности свертывания крови (ТЗ). Реакцию агрегации тромбоцитов исследовали на фотоэлектрокалориметре КФК-2. УХЛ - 4,2 по методике В.П. Балуда (1982). Метод основан на изменении оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы до и после добавления в нее определеного количества реагента, вызывающего агрегацию тромбоцитов при постоянном помешивании. Индекс агрегации тромбоцитов расчитывался по формуле.

дгу = iE max - Е min) Е max.

где Е min - оптическая плотность плазмы без реагента, активирующего агрегацию тромбоцитов, Е max - оптическая плотность плазмы после добавления реагента (АДФ). Концентрацию фибриногена определяли на концентрационном фотоэлектрокалориметре КФК-2 МП по методике Парфентьев (1983). Концентрацию антитромбина - III исследовали в плазме крови по методике Hense (1976). Концентрацию простацикпина в биологических образцах определяли по методике Н.Г. Гелина (1986). Метод основан на подавлении реакции агрегации тромбоцитов под действием экстракта эндотелия сосудистой стенки. Для выполнения данной методики брали участок аорты от почечных артерий до бифуркации на наружную и внутреннюю подвздошные артерии.

Морфологические исследования - верификацию вводимой фетальной ткани печени человека производили на световом микроскопе «Карл Цейс Иена» при увеличении 1000 раз. В срок 8 -12 недель гестации печень эмбриона содержит до 75 - 80% кроветворных элементов. Применяемая нами методика гомогенизации печени позволяла получить в исследуемых образцах (мазках) преимущественно гепатоциты группами и одиночные. Жизнеспособность клеток определялась методом витальной окраски трипановым синим. Для общегистологических исследований и количественной оценки морфологических изменений сердце, аорта и печень животных фиксировались в 10% нейтральном формалине. Парафиновые срезы окрашивались гематоксилином (Вегерта) и пикрофуксином, орсеином на эластические волокна по Унна-Тенцеру. Липиды выявлялись с помощью окраски суданом-lll на замороженных срезах. Аорта для подсчета площади липидной инфильтрации (исследование проводилось на участке аорты от аортального клапана до отхождения почечных артерий) готовилась по следующей схеме: фиксация в 10% нейтральном формалине, окраска Суданом - III. Подсчет площади инфильтрации аорты липидами осуществлялся планиметрическим методом (Автандилов,1972) в процентах к общей площади исследуемой аорты. Диаметр артерий и толщина их стенок измерялись окулярмикрометром.

Биологический материал для электронной микроскопии забирался в 4% раствор параформальдегида на фосфатном буфере (0.1 М); (рН - 7,4), после этого фиксировался 2 часа в 1% растворе Os 04. Далее осуществляли обезжиривание в спиртах возрастающей концентрации, пропиленоксиде и заключали в смесь оралдита и эпона. Предварительно из каждого блока готовили полутонкие срезы, которые окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие срезы, (сердце и печень) получали на ультратоме фирмы "LKB", монтировали на сетки, покрытые формаром; материал контрастировали насыщенным водным раствором уранил-ацетата и цитрата свинца. Ультротонкие срезы сердца морфометрировали на экране электронного микроскопа при увеличении 12000 раз. Структурную организацию гепатоцитов (площадь ядра, цитоплазмы и обьемную площадь липидов) оценивали используя окулярную тестовую решетку при конечном увеличении в 1200 раз.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Длительность наблюдения за экспериментальными животными составила семь месяцев. В течение 120 дней кролики обеих экспериментальных групп находились на холестериновой диете, далее в течение 3-х месяцев после отмены атерогенной диеты (АТД) наблюдали влияние трансплантации ФТП на восстановление липидного обмена и показателей гемостаза. В течении 120 дней в плановом порядке (1 раз в месяц) группе экспериментальных животных выполнено пять трансплантаций ФТП.

Влияние трансплантации ФТП на липидный спектр крови.

Установлено, что через 24 дня у кроликов, получавших АТД, наблюдалась выраженная гиперхолестеринемия. Увеличение концентрации ОХ составило 920 % по отношению к исходному уровню, в то же время в группе с трансплантацией, первая из которых была выполнена одновременно с началом АТД, 730 % (р<0.001). Анализ липидного спектра крови животных, находящихся на АТД и с ТФТП показал достоверные отличия в концентрациях общего холестерина (рис.1)

Концентрация общего холестерина в сыворотке крови

24 48 72 96 120 }

время наблюдения (сутки) I

_О группа с АТД □ группа с ТФТП |

рисунок 1

Через 48 дней обнаружена самая высокая за весь период эксперимента концентрация ОХ в сыворотке крови животных.

Отмечена также тенденция к дальнейшему росту концентрации ХсЛПНП, тогда как другие показатели липидного спектра в сравнении с предыдущим сроком не изменились. Отмечено снижение Ка за счет повышения концентрации ХсЛПВП.

В группе с ТФТП в этом сроке эксперимента (48 дней) хотя и сохранялась тенденция к росту концентрации липидов, но она была выражена в меньшей степени. Замедленный темп роста концентрации ОХ и атерогенной фракции ЛПНП в группе с ТФТП, очевидно, определялся влиянием трансплантированной фетальной ткани печени. Отмечено существенное возрастание концентрации антиатерогенной фракции ХсЛПВП; Ка, по сравнению с 24 днями наблюдения, остался неизменным.

Через 72 дня концентрация ОХ в группе с АТД, по сравнению с предыдущим сроком, достоверно не изменилась. Снизился уровень ХсЛПВП и, как следствие этого, увеличился коэффициент атерогенности. В группе с ТФТП показатели липидного спектра на 72 сутки также находились на уровне предыдущего срока (48 дней) наблюдения.

При анализе показателей липдограммы на 96 день эксперимента в группе животных с АТД концентрация ОХ и ТГ в сыворотке крови несколько снизились. Этот факт, по мнению ряда исследователей, занимавшихся данной проблемой, обусловлен не замедлением прогрессирования атеросклеротиче-ского процесса, а связан с интенсивным отложением холестерина в крупных сосудах и органах на фоне высокой его концентрации в крови. На основании наших исследований мы полностью разделяем эту точку зрения. В то же время в группе кроликов с ТФТП концентрация основных липидов сыворотки крови достоверно не изменялась в сравнении с показателями на 72 день эксперимента. Отмечено только некоторое увеличение концентрации ТГ. Можно предположить, что в группе с ТФТП уровень холестерина не достиг той "критической точки" после которой дальнейшее повышение концентрации липидов в крови уже невозможно и начинается активный их переход в ткани.

В сроке 120 дней наблюдения АТД была отменена. На этот момент времени в группе животных с АТД достоверно увеличилась только концентрация ТГ (на 45%). Отмечено незначительное увеличение фракции ХсЛПНП в сравнении с предыдущим сроком. В группе с ТФТП сохранялась тенденция к постепенному снижению ОХ и ХсЛПНП.

Таким образом, можно утверждать, что ТФТП позитивно влияет на липидный обмен в условиях алиментарной ги-перхолестеринемии. Это проявляется более медленным нарастании концентрации ОХ и фракций атерогенных липопротеидов (ХсЛПНП и ХсЛПОНП). Наглядной является динамика интегрального показателя Ка на 120 день эксперимента, значение которого в группе с ТФТП было в 2 раза меньшим по сравнению с животными, которым трансплантация ФТП не производилась.

Тот факт, что отмена АТД влечет за собой снижение концентрации основных липидов сыворотки крови является известным. Анализ показателей липидного спектра сыворотки крови после отмены АТД выявил следующие изменения в период наблюдения от 120 до - 210 дня эксперимента. В группе животных, находившихся на АТД, к 210 дню эксперимента отмечено снижение концентрации ОХ на 278%, ХсЛПНП на 336%, Ка уменьшился в 2,4 раза. Концентрация липидов в сыворотке крови у животных с ТФТП в этом сроке также снизилась: ОХ на 236%, Хлпнп на 278%, ХсЛПОНП на 173%. Ка также уменьшился в 1,7 раза. В итоге к 210 дню наблюдения у кроликов с ТФТП показатели липидного спектра в меньшей степени отличались от аналогичных показателей группы, находящейся только на стандартном рационе вивария, и были существенно ниже, чем в группе с АТД. Одним из возможных вариантов, обьясняющих полученные результаты, может быть следующее предположение. Введение ФТП, которая содержит и ростовые факторы, приводит к усилению метаболизма холестерина за счет активизации соответствующих структур, воздействующих на геном клетки реципиента через донорские РНК и ДНК. Возможно, происходит и активизация процессов митоза вышеуказанных клеток. Это предположение косвенно подтверждается полученными нами морфологическими данными - меньшее количество липидных включений в гепатоцитах группы экспериментальных животных с трансплантированной ФТП.

Влияние ТФТ на систему коагуляции.

В группе животных, находящихся только на АТД, показатель Ht к концу эксперимента (120 дней) снизился в сравнении с исходом на 15,5%, концентрация фибриногена увеличилась на 35,4%. В этом же сроке уровень At - III уменьшился на 39%, что свидетельствует о снижении антикоагуляционной активности крови. В группе с ТФТП к 120 дню эксперимента снижение Ht было более существенным, на 25,9% в сравнении с исходом.

Концентрация фибриногена практически не изменилась, a At - III увеличилась на 12,5%. Эти данные указывают на тот факт, что трансплантация ФТП оказывает влияние не только на липидный спектр сыворотки крови, но и способствует стабилизации системы гемокоагуляции, уменьшая тромбопластическую активность крови. Концентрация фибриногена в сроке 120 дней эксперимента в группе с холестериновой диетой была повышена до 4,2 ± 1,6 г/л, тогда как в группе животных с ТФТП это показатель составил только 3,6 ± 0,4 г/л, что возможно связано с улучшением белковосинтетической функции печени. Агрегация тромбоцитов в группе с холестериновой диетой к 120 дню наблюдения увеличилась на 17,5%, в группе с ТФТП колебалась в течении всего срока эксперимента со 134,2 ± 19,9 % в начале наблюдения, до 133,3 ± 9,7 % на 120 день эксперимента, то есть практически не изменилась.

Изучение коагуляционных свойств крови посредством динамической записи электрокоагулограммы (ЭКГ) показало, что время окончания свертывания крови (Т2) менялось с определенной закономерностью, характерной для каждой группы. У находившихся только на холестериновой диете оно достоверно увеличилось на 31,1%, тогда как в группе с ТФТП регистрировалось значительно большее увеличение этого показателя, составившее к концу эксперимента 61,4%, что свидетельствует о благоприятном влиянии ТФТП на коагуляционные свойства крови в плане увеличения времени свертывания. Учитывая тот факт, что в процессе тромбообразования существенную роль играет и состояние сосудистой стенки, нами было изучено влияние гиперхолестеринемии на содержание простацик-лина в аорте.

Выявлено, что концентрация простациклина сосудистой стенки в группе с ТФТП увеличилась на 44,1%, а в группе животных, находящихся только на АТД снизилась на 69,1% (120 дней наблюдения: р<0,01). Таким образом, ТФТП способствовала увеличению концентрации простациклина, снижая вероятность процесса пристеночного тромбообразования (рис 2).

концентрация простациклина в интиме аорты

□ группа с АТД В группа ТФТП j

рисунок 2

Можно предположить, что увеличение простациклина в интиме аорты осуществляется за счет стимуляции эндотелия фе-тальными тканями и «омоложения» существующего пула эндо-телиоцитов.

Клетки эндотелия сосудов увеличивают выделение простациклина в кровоток, препятствуя образованию тромбоцитарных агрегатов, что в свою очередь замедляет рост атеросклеротической бляшки.

После отмены АТД уровень Ht, фибриногена и At - III в группе с ТФТП приблизился к исходным показателям уже к 150 дню наблюдения (через месяц после отмены АТД). Эти же показатели в группе животных, находящихся только на АТД, приблизились к исходным значениям значительно позднее: Ht через 2 месяца после отмены АТД, уровень фибриногена и At -III через 3 месяца. Интегральный показатель (Т2) элек-трокоагулограммы, выполненной после отмены АТД существенно не изменялся и до 210 дня наблюдения, сохраняя ранее выявленную тенденцию (в группе с ТФТП был больше, чем в сравниваемой группе). Показатель агрегации тромбоцитов в группе животных, находившихся на стандартном рационе вивария и группе, которой выполнялась трансплантация фетальной ткани печени существенных изменений в сроки со 120 до 210 дней эксперимента не претерпел, оставаясь в пределах значений, полученных до начала эксперимента. В то же время в группе, находившейся только на АТД, агрегация тромбоцитов снизилась к

210 дню на 32,3%, приближаясь к значениям полученным у ин-тактных животных в начале эксперимента. Таким образом, ФТП сохраняет свой эффект через 1, 2 и 3 месяца после трансплантации, что подтверждается результатами, полученными при исследовании системы гемостаза.

При общегистологическом изучении органов (аорта, миокард и печень) 35 экспериментальных животных в сроках 48, 96, 120 и 210 дней проводили количественную оценку морфологических изменений. Гистологическому исследованию подвергались также и места трансплантации ФТП. Установлено, что уже через 2 недели после трансплантации в месте введения ФТП у большинства животных невозможно было найти каких-либо следов манипуляции. Только в двух случаях были найдены очаги воспаления с инкапсуляцией и фиброзом. В более отдаленные сроки (2 и 3 месяца) место трансплантации ФТП практически не определялось. Отмечено, что в местах трансплантации у животных наблюдался интенсивный рост волосяного покрова, который перед трансплантацией ФТ полностью удалялся.

К 120 дню наблюдения при общей тенденции к увеличению площади поражения аорты в группах обнаружены достоверные различия .В группе с АТД площадь поражения аорты составила 69,7 ± 7,0%, тогда как в группе с ТФТП только 48,3 ± 8,9% (р<0,05).

Площадь липидной инфильтрации аорты после отмены АТД 210 день эксперимента в группе с ТФТП оказала также значительно меньшей, чем в группе находящейся только на АТД (рис 3).

Площадь липидной инфильтрации аорты

■ группа с АТД

□ группа с ТФТП

80

60

40

20

С

24 ---*

96 120 время наблюдения (сутки)

рисунок 3

Это связано вероятно с несколькими факторами: более низким уровнем холестерина сыворотки крови животных, получавших ТФТП, а также более быстрой сменой популяции эндоте-лиоцитов и усилением их метаболической и митотической активности за счет эмбриональной ткани.

Сравнение результатов липидо - и коагулограммы с'выраженностью морфологических проявлений гиперхолестеринемии и гиперкоагуляции показало, что последние отстают по времени от более подвижных лабораторных показателей в среднем на 3 -4 недели. Учитывая это мы считаем, что более достоверным признаком, характеризующим выраженность патологического процесса, является площадь липидной инфильтрации аорты, которая является своеобразным «критерием истины » имеющихся изменений.

Достоверные различия определялись в количестве вовлекаемых в атеросклеротический процесс сосудов. Так, на 120 день эксперимента в группе с АТД количество пораженных сосудов на условную единицу площади было 30, а в группе с ТФТП -12 сосудов. Возможно это обьясняется высоким содержанием в ФТП фактора роста эндотелия. Значение коэффициента экстенсивности патологического процесса (отношение между количеством пораженных липидной инфильтрацией артерий в группе, получающей только АТД и количеством инфильтрированных артерий в группе с ТФТП) составило - 2,5. К 210 дню наблюдения среднее число артерий, вовлеченных в атеросклеротический процесс, в группе с АТД составило -14.5, а в группе с ТФТП - 9.1. Следовательно, процесс поражения атеросклерозом венечных артерий и аорты в группе с ТФТП протекал менее агрессивно, чем в группе экспериментальных животных, находящихся только на АТД.

При изучении ультраструктурной организации печени и сердца методом электронной микроскопии установлено, что в группе с ТФТП отмечалось замедление процесса липоидоза ге-патоцитов, в сравнении с группой с АТД. Учитывая, что в обеих группах холестериновая нагрузка была одинаковой, а содержание холестерина и его фракций было различным можно предположить,что у животных с ТФТП происходил повышенный синтез и экскреция желчных кислот. Интересным является факт, что ТФТП вызывала пролиферацию капиллярного русла миокарда, улучшая тем самым его микроциркуляцию и оксигенацию. Увеличение капиллярного русла у животных, получавших ТФТП,

можно объяснить за счет тех же ростовых факторов. Таким образом, резюмируя полученные результаты можно утверждать, что ТФТП способствует регуляции липидного обмена и стабилизации системы гемостаза у животных с экспериментальным атеросклерозом. Эти данные подтверждаются и морфологическими исследованиями. Дальнейшее изучение данного метода вероятно позволит расширить сферу его применения и рекомендовать использование в качестве профилактического метода, способного коррегировать нарушение липидного обмена у лиц с предрасположенностью к атеросклерозу.

ВЫВОДЫ

1. Трансплантация ксеногенной фетальной ткани печени оказывает коррегирующее влияние на липопротеидный спектр крови животных с экспериментальным атеросклерозом, что проявляется в более медленном нарастании концентрации общего холестерина и атерогенных фракций (ХсЛПНП и ХсЛПоНП) по сравнению с группой контроля.

2. У кроликов с трансплантированной фетальной тканью печени уровень антиатерогенной фракции ХсЛПВП оказывается достоверно более высоким, чем в аналогичной группе, находящейся на атерогенной диете.

3. Фетальная ткань печени у кроликов с алиментарной ги-перхолестеринемией повышает концентрацию Ат-Ш и содержание простациклина в сосудистой стенке.

4. У экспериментальных животных на фоне атерогенной диеты и трансплантации фетальной ткани печени достоверно снижается тромбопластическая активность крови и агрегационные свойства тромбоцитов.

5. Трансплантация фетальной ткани печени при экспериментальном атеросклерозе, способствует увеличению числа капилляров в миокарде, снижению интенсивности процесса липоидоза гепатоцитов и липидной инфильтрации аорты.

6. Трансплантированная фетальная ткань печени сохраняет свое воздействие как минимум в течении трех месяцев от момента введения, что проявляется в более раннем восстановлении показателей липидного обмена и системы гемостаза после отмены атерогенной диеты.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложено новое средство для коррекции ги-перхолестеринемии, которое дает возможность расширить диапазон гипохолестеринемических воздействий в лечении атеросклероза и осложненных его форм у людей.

Метод трансплантации фетальной ткани печени может использоваться отдельно или в сочетании с существующими методами коррекции гиперхолестеринемии, включая хирургическое лечение этого состояния.

Представляется возможным использование трансплантации фетальной ткани печени в качестве профилактического мероприятия при коррекции липидного обмена у лиц, предрасположенных к атеросклерозу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Влияние трансплантации фетальной ткани печени на белковые фракции крови у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией // Актуальные вопросы реконструктивной и востановительной хирургии. Иркутск, 1995. 178 (Соавт.: Богородская С.Л., Тарабрин А.Л., Никифоров С.Б.)

2 Морфология аорты, венечных артерий и печени при экспериментальной гиперхолестеринемии, коррегированной подсадкой эмбриональной ткани печени человека II Актуальные вопросы реконструктивной и востановительной хирургии. Иркутск, 1995. 176 (Соавт.: Гольдберг O.A.. Рунович A.A., Никифоров С.Б.)

3 Динамика агрегации тромбоцитов и фибриногена у животных в условиях экспериментального атеросклероза и трансплантации фетальной ткани печени //Актуальные вопросы реконструктивной и востановительной хирургии. Иркутск, 1995. 177 (Соавт.: Зубарева Л.Д., Марченко В.И , РуновичА.А.)

4 Получение фетальной ткание печени для экспериментальных исследований II Актуальные вопросы реконструктивной и востановительной хирургии. Иркутск, 1995. 175. (Соавт .Рунович A.A., Гольдберг O.A., Никифоров С.Б.)

5 Экспериментальная гиперхолестеринамия и трансплантация эмбриональной печеночной ткани // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии. Иркутск, 1995. 215 (Соавт: Зубарева Л.Д., Марченко В.И., Рунович A.A.)

6 Ксенотрансплантация кардиомиоцитов эмбриона и новорожденного в эксперименте // Актуальные вопросы реконструктивной и востановительной хирургии. Иркутск, 1993. 186 (Соавт: Рунович A.A., Гольдберг O.A.)

7 Влияние трансплантации фетальной ткани печени на течение экспериментального атеросклероза..// Актуальные вопросы реконструктивной и востановительной хирургии. Иркутск, 1995. 217 (Соавт: Никифоров С.Б., Тарабрин А.Л., Гольдберг O.A., O.A., Рунович A.A.)

8 Влияние трансплантации фетальной ткани печени на морфологические изменения при экспериментальном атеросклерозе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины приложние № 1 от 1998.г.ст. 134-137 (Соавт: Никифоров С.Б., Гольдберг O.A., Рунович A.A.,Гладышев Ю.В.)

9 Лечение ишемической болезни сердца методом трансплантации фетальных тканей. Методические рекомендации II Иркутск. 1999 ( Соавт: Рунович A.A., Сухих Г.Т., Тарабрин А.Л., Никифоров С.Б., Кузнецова Э.Э., Явербаум П.П., Голдобина В.И., Зуев A.B., Зубарева Л.Д., Богородская С.Л.)

10 Средство для коррекции гиперлипидемии - Патент РФ № 2112525 Соавторы: Рунович A.A., Гольдберг O.A., Тарабрин А.Л., Курильская Т.Е., Никифоров С.Б.

11 Средство коррекции дислипопротеинемии. Заявка от 5 мая 1997г. № 97107442 (Соавт: Рунович A.A., Курильская Т.Е., Тарабрин А.Л., Никифоров С.Б., Лепехова С.А.)