Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на содержание белков теплового шока (БТШ 70) при экспериментальной гиперхолестеринемии

На правах рукописи

СЕРГЕЕВА Анна Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННЫХ НЕОНАТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА (БТШ 70) ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в ГУ «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Рунович Алексей Анатольевич Боровский Геннадий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Явербаум Павел Моисеевич Пушкарев Борис Георгиевич

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра Сибирского Отделения РАМН

Защита состоится « » Лхм^аа 2005 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д. 001.054.01. при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского Отделения РАМН» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан « » 2005

г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Список сокращений

АД - атерогенная диета

БТШ - белки теплового шока

Ка - коэффициент атерогенности

ЛП - липопротеины

ННК - нативные неонатальные клетки

ПААГ - полиакриламидный гель

ТГ - триглицериды

ТНГ - трансплантация неонатальных гепатоцитов

УЕ - условные единицы

ХС - холестерин

ЭГХ - экспериментальная гиперхолестеринемия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последнее время особое внимание уделяется изучению белков теплового шока (стрессовых белков), которые принимают участие в правильном сворачивании полипептидных цепей (фолдинге) в нормальных и экстремальных условиях. Кроме того, белки теплового шока способствуют ренатурации частично денатурированных и элиминации полностью денатурированных белков. Нарушение функционирования белков данного класса может явиться одной из причин дисфункции и повреждения органов и тканей. Обнаружено участие стрессовых белков и в патогенезе атеросклероза (ХиС}., 2001).

Известно, что Россия по смертности от заболеваний, в основе которых лежат атеросклеротические повреждения, занимает одно из первых мест в Европе (Оганов Р.Г., 2002). Существующие методы коррекции гиперхолестеринемии, способствуют лишь временной стабилизации патологического процесса (Чазов Е.И., 1998). В этой связи актуальной является проблема поиска более эффективных методов лечения атеросклероза. Сегодня новые технологии в решении этой проблемы связаны с использованием клеточной трансплантации.

Известно, что ключевыми патогенетическими звеньями атероген-ного процесса являются нарушение обмена липопротеинов, интенсификация перекисного окисления липидов (Климов А.Н., 1999). Выше-

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БКК1ЧОТЕКА С.1Ктсрбург

перечисленные факторы вызывают повреждение внутриклеточных структур, в частности белковых молекул. Участие стрессовых белков в этом процессе описано многими авторами (Кап\уаг ¿.К., 2001; Хи 2002).

Накоплены экспериментальные и клинические данные, указывающие на снижение активности атеросклеротических изменений при клеточной трансплантации (Курильская Т.Е., 1999; Никифоров С.Б., 2000; вгошре М., 2001; ОЬавЫ К., 2001). Однако механизмы саногенетического эффекта клеточной терапии весьма далеки от окончательного понимания.

На уровне сегодняшних представлений белки теплового шока многими авторами расцениваются как часть внутриклеточной стресс-лимитирующей системы, способствующей защите клетки от повреждения (Меерсон Ф.З., 1993; Малышев И.Ю., 1998; Хи С?., 2001). В связи с этим представляет научный и практический интерес выяснение степени участия белков теплового шока в процессе клеточного повреждения при гиперхолестеринемии, а также влияние на этот процесс клеточной трансплантации.

Цель исследования: изучить влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на динамику содержания белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа в печени, миокарде и головном мозге в процессе развития экспериментальной гиперхолестеринемии.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние различных условий культивирования клеток и способа консервации трансплантата на содержание в нем белков теплового шока (БТШ 70). Определить стационарный уровень БТШ 70 в печени, миокарде и головном мозге кроликов.

2. Изучить динамику морфологических изменений и концентрации БТШ 70 в печени, миокарде и головном мозге экспериментальных животных в различные сроки развития гиперхолестеринемии.

3. Выявить особенности изменения содержания БТШ 70 в исследуемых органах при превентивной и отсроченной трансплантации неонатальных гепатоцитов.

4. Определить взаимосвязь количества БТШ 70 с морфологическими нарушениями в органах-мишенях и степенью выраженности экспериментальной гиперхолестеринемии у животных при внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов.

Научная новизна

В результате проведенного исследования в неонатальных клетках печени впервые обнаружено наличие белков теплового шока, количество которых можно увеличивать с помощью культивирования при повышенных температурах. Установлено, что способ консервации трансплантата не влияет на содержание БТШ 70 в нем.

Показан разный уровень стрессовых белков в печени, миокарде и головном мозге здоровых животных. Получены оригинальные данные, свидетельствующие об изменении стационарного уровня БТШ 70 и морфологических нарушениях в исследуемых органах при экспериментальной гиперхолестеринемии. Показано, что в условиях атерогенного процесса в печени, миокарде и головном мозге экспериментальных животных трансплантация неонатальных гепатоцитов способствует приближению уровня БТШ 70 к стационарным значениям и уменьшению морфологических нарушений в данных органах.

Получены данные, свидетельствующие о том, что превентивная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов в большей степени способствует нормализации измененного в результате атерогене-за уровня БТШ 70, чем трансплантация на фоне развивающейся гиперхолестеринемии.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты эксперимента позволяют рассматривать белки теплового шока в качестве компонента системы адаптации различных органов к хроническому повреждающему воздействию.

Установлено, что внутривенное введение неонатальных гепатоцитов оказывает влияние на внутриклеточные защитные механизмы, приближая уровень БТШ 70 в исследуемых органах к стационарным показателям и обеспечивая этим органам большую сохранность в процессе развития гиперхолестеринемии. Полученные данные являются свидетельством того, что клеточная трансплантация оказывает протекторный эффект и на внутриклеточном уровне.

Положения, выносимые на защиту:

1. Культура гепатоцитов неонатального кролика содержит белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа, количество которых может быть увеличено путем культивирования при повышенных температурах. Способ консервации клеточного трансплантата (криопрезервация, лиофилизация) существенно не изменяет в нем уровень БТШ 70.

2. В условиях экспериментальной гиперхолестеринемии стационарное содержание БТШ 70 изменяется: в печени исходный уровень данных белков понижается, в миокарде и головном мозге — увеличивается. При этом регистрируется нарастание морфологических нарушений в исследуемых органах.

3. Трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии способствует нормализации уровня БТШ 70 и снижению степени морфологических изменений в исследуемых органах.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

■ восьмом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (г. Москва, 19-22 ноября 2002 г.);

■ Международном конгрессе «Реабилитация в медицине и имму-нореабилитация» (Анталия, 27 апреля — 3 мая 2003 г.);

■ Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Турция, 19—25 мая 2003 г.);

■ пятом конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Египет, 19—25 апреля 2003 г.);

■ седьмой ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН (г. Москва, 25-27 мая 2003 г.);

ш пятом съезде иммунологов и аллергологов СНГ (г. Санкт-Петербург, 5-11 июля 2003 г.);

■ Международном междисциплинарном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, 8—19 июня 2003 г.);

■ Северо-западной Международной конференции по проблемам внезапной смерти (г. Санкт-Петербург, 14-16 октября 2003 г.);

■ четвертой научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (г. Иркутск, ноябрь 2003 г.);

■ научной конференции молодых ученых, посвященной Дню основания РНЦХ РАМН «Новое в реконструктивной хирургии» (г. Москва, 19 марта 2004 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи — в отечественных журналах, 8 тезисов и статей — в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, включая введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, заключение, практические рекомендации и выводы. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 22 рисунками. Библиография содержит 156 источников, из них 59 — отечественных и 97 — зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперимент выполнен на базе Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии ВСНЦ СО РАМН (директор — д.м.н., профессор, член-корр. РАМН Е.Г. Григорьев), г. Иркутск. Биохими-

ческие исследования проводились в лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений РАН (директор — д.б.н., профессор В.К. Войников), г. Иркутск. Моделирование экспериментальной гиперхолестеринемии осуществлялось на базе НИИ Медицины труда и экологии человека (директор — д.м.н., профессор, член-корр РАМН B.C. Рукавишников), г. Ангарск. Морфологические исследования проводились совместно с зав. отделом пато-морфологии и цитологии с цитогенетикой Областного клинико-кон-сультативного диагностического центра к.м.н. С.С. Голубевым.

Структура эксперимента

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов породы «шиншилла» весом 2,0—2,5 кг. Гиперхолестеринемию моделировали по общепринятой методике H.H. Аничкова атерогенной диетой. Эксперимент проводился на 40 кроликах, которые были подразделены на следующие группы:

■ группа № 1 (10 кроликов, контроль) — стандартная диета вивария;

■ группа № 2 (10 кроликов, модель гиперхолестеринемии) — ате-рогенная диета с добавлением в пищевой рацион холестерина из расчета 250 мг/кг веса животного, кроме того, каждые 15 дней животным внутривенно инъецировали 0,9% NaCl;

■ группа № 3 (10 кроликов) — животные получали холестерин в аналогичной дозе, но кроме этого каждые 15 дней в ушную вену им были трансплантированы культивированные неонатальные гепатоци-ты кролика в концентрации 1 х 106 кл/кг одновременно с началом атерогенной диеты (до начала атерогенного процесса - превентивно);

■ группа № 4 (10 кроликов) — животные получали холестерин в аналогичной дозе, но кроме этого каждые 15 дней в ушную вену им были трансплантированы культивированные неонатальные гепатоци-ты кролика в концентрации 1 х 10б кл/кг на фоне развивающейся гиперхолестеринемии (через 6 дней от начала диеты).

Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 45, 90 и 180 сутки.

Метод получения неонатальных гепатоцитов

Неонатальные гепатоциты получали из печени 1—2 суточных кроликов, по методике P.O. Seglen (1976). Печень перед извлечением подвергалась перфузии in situ изотоническим 0,005М раствором ЭДТА («БиоЛот», Россия). Препарированный орган фрагментировали и ре-суспендировали в 0,1% растворе коллагеназы из Clostridium histoliticum тип ///(«Sigma», США), подвергали энзиматической дезагрегации при 37 "С. Полученную суспензию гепатоцитов анализировали на витальность по окраске трипановым синим в камере Горяева, которая соста-

вила 80 %. Суспензию клеток центрифугировали, ресуспендировали в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Германия) и до трансплантации инкубировали в чашках Петри в С02-инкубаторе («Forma Scientific», США) при температуре 37 °С. Перед трансплантацией животным гепатоциты ресуспендировали в 0,9% растворе NaCl. Витальность клеточного трансплантата составляла 60 %.

Биохимические исследования

Анализ липидов крови

Уровень липидов (ОХ, ЛПВП, ТГ) определяли на анализаторе «Corona Clinicon» (Швеция) с использованием реагентов фирмы «Biocon» (Германия). Кроме того, использовали следующие зависимости: ЛПОНП = ТГ/2,2; ЛПНП = ОХ - ЛПВП - ЛПОНП; Ка=ОХ -ЛПВП/ЛПВП (Орехович В.Н., 1972).

Определение уровня белков теплового шока (БТШ 70) проводили в суспензиях неонатальных клеток печени различной консервации (нативные, криоконсервированные, лиофилизированные) и инкубированных при разных температурных условиях, а также в тканях печени, миокарда и головного мозга экспериментальных животных. Выделение и очистку суммарного белка проводили в холодной комнате (+4 °С) с использованием рефрижераторной центрифуги. Замороженные в жидком азоте исследуемые ткани гомогенизировали с добавлением PMSF и 0,1 М Трис-НС1-буфера (pH 7,6) и центрифугировали 10 мин при 17000 g. Суммарный белок осаждали из су-пернатанта 10% трихлоруксусной кислотой. После центрифугирования (10 мин при 8000 g) супернатант сливали, осадок дважды отмывали охлажденным ацетоном и растворяли в буфере для анализируемого образца (pH 6,8). Полученные растворы прогревали на водяной бане в течение 3 мин и центрифугировали 1 мин при 1000 g. Образцы хранили в морозильной камере при —20 °С. Концентрацию белка измеряли по методу Лоури (Lowry О.Н., 1951). Для SDS-фореза использовалась аппаратура и реактивы фирмы «Bio-RAD» (США). Электрофорез проводили в полиакриламидном геле по U. Laemmli (1970). Разделение белковых молекул проходило при постоянном напряжении 100 В, в течение 3—4 часов. Перенос электрофоретически-фракционированных белков на нитроцеллюлозную мембрану («BioRAD», США) проводили электроэлюцией в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Выявление белков проводили с использованием специфических антител против полипептидов семейства БТШ 70 («Sigma», США) и вторичных антител, конъюги-рованных с щелочной фосфатазой («Sigma», США). Окраску зон локализации БТШ 70 проводили с использованием раствора ВС1Р/ NBT («Sigma», США). Содержание БТШ 70 определяли в пересчете

на 1 мг общего белка. Уровень БТШ 70 оценивали в условных единицах (УЕ) по программе «Sigma scan pro» (США).

Морфологическое исследование проводили по общепринятым методикам (ТашкэК., 1980; Автандилов Г.Г., 1990). Объектами гистологического исследования были срединные срезы печени, срезы левого желудочка миокарда и срезы теменной области (область центральной извилины) головного мозга, осуществленные на 45, 90 и 180 сутки с начала эксперимента. Фиксация материала проводилась в забуферен-ном нейтральном 10% растворе формалина. Проводка материала осуществлялась в автомате для вакуумной проводки VIP-E150F фирмы «Sacura» (Япония). Заливка — в системе для автоматической заливки материала «TEC-IV» фирмы «Sacura». Резка срезов — на роторных микротомах СМ-502 фирмы «Microm» (Германия). Покраска срезов гематоксилин-эозином осуществлялась в автомате DRS-601A фирмы «Sacura». Микроскопическое исследование препаратов проводилось с помощью компьютерной микроскопической видеосистемы «Quantimet 550IW» фирмы «Leica» (Англия) для цифрового анализа патоморфологичес-кого и цитологического материала и углубленной диагностики с камерой высокого разрешения, позволяющей проводить количественный анализ изображения по реальным цветам или оптическим плотностям с форматом изображения 6000 х 4000 пикселей.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft ® Excel 2000. Внугригрупповые и межгрупповые отличия анализировали, используя t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень БТШ 70 в клеточных трансплантатах

Проведено исследование содержания БТШ 70 в суспензионных культурах клеток печени новорожденных кроликов в сравнении с клетками печени половозрелых животных. Кроме того, был проведен анализ влияния способа консервации клеточных трансплантатов на уровень белков теплового шока. Для этого уровень БТШ 70 определяли в нативных, криоконсервированных и лиофилизированных культурах клеток печени новорожденных кроликов.

Клетки новорожденных кроликов имели незначительно более высокий уровень БТШ 70 по отношению к клеткам печени половозрелых животных (р < 0,05) (табл. 1). Способ консервации трансплантата существенно не влияет на содержание БТШ 70 в нем. Только в лиофилизированных клетках содержание данных белков незначительно снижается (табл. 1).

Таблица 1

Содержание БТШ 70 в культурах клеток печени новорожденных

и половозрелых кроликов породы «шиншилла» (п = 30)

Тип клеточной суспензии Уровень БТШ 70 (УЕ)

Нативные НК 3,6 ± 0,007

Криоконсервированные НК 3,5 ± 0,01*

Лиофилизированные НК 3,4 ± 0,04*

Клетки половозрелых животных 3,5 + 0,01*

Примечание: НК - неонатальные клетки, УЕ - условные единицы, п - количество исследуемых образцов для каждой группы, * - р < 0,05 в сравнении с нативными НК.

Проведено исследование влияния температуры на неонатальные клетки печени кроликов. Для этого культура неонатальных гепатоцитов была разделена на 4 группы: № 1 — нативные клетки, № 2 — клетки нагревали при 37 °С в течение 1 часа, № 3 — клетки нагревали при 37 °С в течение 24 часов, № 4 — клетки нагревали при 42 °С в течение 1 часа.

Анализ уровня БТШ 70 в этих группах показал, что наибольшее количество данных белков (4,3 ± 0,02 УЕ) обнаруживается в клетках печени при нагревании до 42 °С в течение 1 часа. С другой стороны, наименьший показатель уровня БТШ 70 был получен в группе натив-ных клеток без обработки температурой (табл. 2).

Таблица 2

Содержание БТШ 70 в неонатальных клетках печени,

культивируемых в разных температурных режимах (п = 30)

Номер группы Температура нагревания Время инкубации (часы) Уровень БТШ 70 (УЕ)

1 Без нагревания - 3,6 ± 0,007

2 37 °С 1 3,7 ± 0,01*

3 37 "С 24 4,0 ± 0,02*

4 42 °С 1 4,3 ± 0,02*

Примечание: ННК - нативные неонатальные клетки, УЕ - условные единицы, п -количество исследуемых образцов для каждой группы, * - р < 0,05 в сравнении с группой № 1.

Таким образом, клетки печени новорожденных кроликов обладают уровнем БТШ 70, который несколько выше в сравнении с клетками печени половозрелых животных. Полученные данные позволяют предполагать возможность привнесения данных белков к поврежденному органу в результате клеточной трансплантации. Криоконсерва-

ция и лиофилизация клеточного материала существенно не изменяют концентрацию БТШ70 в нем, но, нагревая клеточную культуру при определенных температурах, можно увеличивать уровень содержания БТШ 70 в клетках.

Содержание БТШ 70 и морфологические изменения в печени, миокарде и головном мозге кроликов при экспериментальной гиперхолестеринемии

Печень. В группе № 2 (АД) на 45 сутки видимых нарушений в печени обнаружено не было. К 90 дню на некоторых участках ткани появлялась мелкокапельная центролобулярная жировая дистрофия гепатоци-тов. На 180 сутки в этой группе наблюдали выраженный липоидоз гепа-тоцитов. Так, при максимальной оценке в 5 баллов (Автандилов Г.Г., 1990), уровень липоидоза гепатоцитов в группе с АД составил 4,4 ± 0,6 балла. Отмечено сужение просвета крупных печеночных сосудов, образовавшееся за счет набухания гепатоцитов. На исследованных гистологических препаратах печени животных этой группы выявлялись гепато-циты с тотальной крупнокапельной жировой дистрофией.

Анализ исследования уровня БТШ 70 в печени животных, находившихся на стандартной диете вивария, обнаружил базовый уровень данных белков (3,50 ± 0,007 УЕ), который практически не изменялся на протяжении всего эксперимента.

В группе животных с моделью гиперхолестеринемии на 45 сутки эксперимента было обнаружено снижение уровня БТШ 70 до 0,70 ± 0,008 УЕ, что в 5 раз ниже относительно исходного значения. Далее в ходе эксперимента в этой группе животных наблюдалось увеличение концентрации БТШ 70 Однако и на 180 сутки эксперимента уровень БТШ 70 в этой группе оставался ниже стационарного (2,10 +0,02 УЕ).

Механизмы стрессорной активации синтеза белков теплового шока характеризуются высокой тканевой специфичностью (Blake M.J. et al., 1990). Возможно, уменьшение уровня БТШ 70 в печени кроликов, находившихся на АД, по отношению к исходу как-то связано с тканеспецифичностью экспрессии этих белков. Кроме того, белково-синтетическая функция и регенеративный потенциал печени существенно выше по отношению к другим органам. Об этом свидетельствует и высокий стационарный уровень БТШ 70 в этом органе. Нарушение вышеперечисленных функций при атерогенном процессе, вероятно, сказывается на синтезе БТШ 70, который заметно снижается в группе с ЭГХ. Незначительное увеличение уровня данных белков в динамике эксперимента (45, 90, 180 сутки), возможно, связано с постоянно нарастающей нагрузкой на печень.

Миокард. У животных с моделью ЭГХ (группа -№ 2) на 45 сутки эксперимента в интиме коронарных сосудов были обнаружены первые признаки дистрофических изменений клеток эндотелия. К 90 суткам наблюдали незначительное сужение некоторых коронарных сосудов. На 180 сутки развивалась липидная инфильтрация интимы. Согласно данным морфометрического анализа, степень сужения просвета венечных сосудов составила 16,6 ± 5,2 % от нормы, в атерогенный процесс вовлечено 95,6 ± 6,9 % от общего количества исследуемых сосудов.

На фоне развившихся под влиянием экспериментальной гипер-холестеринемии атерогенных изменений коронарных сосудов на 180 сутки эксперимента наблюдали также незначительные нарушения поперечной исчерченности кардиомиоцитов, что свидетельствовало о развитии начальных проявлений тканевой гипоксии миокарда на отдельных участках.

На протяжении 180 суток содержание БТШ70 в миокарде животных группы контроля находилось на стационарном уровне — 1,50 ± 0,01 УЕ. В группе с моделью ЭГХ на 45 сутки наблюдали увеличение содержания БТП170 в 2,7 раза относительно группы контроля, что, вероятно, индуцировалось метаболическими нарушениями при ЭГХ Полученные экспериментальные данные согласуются с результатами исследований XuQ. (2002) и Snoeckx L.H.E.H. (2001), которые показали увеличение экспрессии БТШ 60 и БТШ 70 во всех основных типах клеток, склонных к повреждению в течение атерогенеза.

К 90 суткам эксперимента уровень БТШ 70 в миокарде животных группы № 2 (ЭГХ) составлял 3,40 ± 0,01 УЕ, что в 2 раза выше по сравнению с контролем. При этом данная тенденция сохранялась до 180 суток наблюдения.

Головной мозг. Исследование мозговой ткани в области центральной извилины показало, что наибольшее атеросклеротическое поражение наблюдалось в бассейне средней и базилярной артерий, что соответствует данным литературы. При исследовании препаратов головного мозга животных группы № 2 (АД) на 45 сутки эксперимента было отмечено незначительное набухание клеток эндотелия сосудов микро-циркуляторного русла, которое становилось более выраженным к 90 суткам, за счет чего исследуемые клетки принимали округлую форму. На 180 день было выявлено малокровие и сужение просвета сосудов микроциркуляторного русла, сопровождающееся расширением пери-васкулярных пространств вокруг капилляров, артериол. Количество капилляров с уменьшенным просветом составило 2,3 ± 0,1 на 1 мм2.

У животных с ЭГХ вблизи капилляров коры головного мозга обнаружена гипертрофия и пролиферация астроцитов, в единичных капиллярах выявлены гиалиновые микротромбы. В сосудах микроциркуляторного русла коры полушарий большого мозга и мозжечка, а также

белого вещества обнаружено резкое увеличение объема цитоплазмы эндотелиоцитов, которые перекрывали просвет капилляров.

На фоне атерогенных изменений в головном мозге, как и в миокарде, было отмечено увеличение исходного уровня БТШ 70. Так базовый уровень БТШ 70 в головном мозге составлял 3,0 ± 0,01 УЕ, а в группе с ЭГХ на 45 сутки эксперимента — 3,7 + 0,04 УЕ. К 180 суткам в головном мозге, как и в миокарде животных группы № 2 (АД), было отмечено снижение уровня БТШ 70 в сравнении с 45 сутками, но по отношению к контролю (группа № 1) уровень данных белков оставался повышенным. Уменьшение уровня БТШ 70 в головном мозге к 180 суткам в группе животных с ЭГХ, вероятно, свидетельствовало об адаптации организма к постоянному повреждающему воздействию атерогенных факторов.

Таким образом, в группе животных, получавших АД (группа № 2), было зафиксировано развитие процесса гиперхолестеринемии. Об этом свидетельствуют морфологические изменения в печени, миокарде и головном мозге животных этой экспериментальной группы в сравнении с группой контроля.

Во всех исследуемых органах на фоне этого процесса было отмечено изменение исходного уровня белков теплового шока. Однако в печени животных с моделью ЭГХ данный уровень резко снижался по отношению к контролю, тогда как в миокарде и головном мозге наблюдали его увеличение. Вероятно, такая закономерность связана с особенно высокой нагрузкой на печень при атеросклерозе, а также с тканевой специфичностью активации синтеза БТШ. Увеличение же уровня БТШ 70 в тканях миокарда и головного мозга при гиперхолестеринемии описано многими авторами (Kanwar R.K., 2001; Snoeckx L.H.E.H., 2001; Xu Q., 2002). К основным факторам, инициирующим повышенный синтез БТШ 70, в данном случае относят окислительный стресс, высокую концентрацию окисленных ЛПНП, провоспалительные цитокины. Данное положение, позволяет говорить о белках теплового шока как об индикаторе уровня внутриклеточных повреждений в миокарде и головном мозге, индуцируемых ЭГХ.

Влияние клеточной трансплантации на морфологические изменения и уровень БТШ 70 в органах-мишенях при экспериментальной гиперхолестеринемии

Печень. Как было показано выше, у животных, находившихся на АД, наблюдали выраженный липоидоз гепатоцитов и снижение исходного уровня БТШ 70 В группах животных с ТНГ (группа № 3 — до начала АД; группа № 4 - на фоне развивающейся ЭГХ) на 45 и 90 сутки эксперимента были обнаружены единичные набухшие гепато-циты, сужения крупных печеночных сосудов не наблюдали. На 180

день в этих группах липоидоз гепатоцитов был менее выражен в сравнении с животными группы № 2 (АД) и составил 2,9 ± 0,6 балла (в группе с ЭГХ - 4,4 ± 0,6 балла).

Кроме того, у животных с ТНГ на 180 сутки эксперимента атеро-генные изменения сосудов печени практически отсутствовали, тогда как в группе с моделью гиперхолестеринемии было отмечено сужение просвета данных сосудов.

В печени животных из групп с ТНГ уровень БТШ 70 повышался в сравнении с группой № 2 (АД), и его показатели приближались к стационарным. Причем, в группе с превентивной ТНГ уровень БТШ 70 был наиболее приближен к контрольным значениям, в сравнении с группой, где трансплантацию проводили на 6 сутки от начала АД. Так на 45 сутки уровень БТШ 70 в группе № 3 (превентивная ТНГ) составлял 4,0 +0,008 УЕ, на 90 день - 3,5 +0,005 УЕ, а к 180 суткам снизился до 3,1 + 0,006 УЕ. В группе № 4 (ТНГ на 6 сутки АД) значения БТШ 70 были выше в сравнении с группой № 2 (АД), но все же оставались пониженными по отношению к показателям здоровых животных (рис. 1).

БТШ 70 (УЕ)

45

■ Контроль ШАД

3 АД+превентивная внутривенная ТНГ Ш АД+внутривенная ТНГ на 6 сутки АД

180 Мсупси)

Рис. 1. Содержание БТШ 70 в печени кроликов при экспериментальной гиперхолестеринемии и трансплантации аплогенных неонатальных гепатоцитов (п = 36). Примечание: АД - атерогенная диета; ТНГ - трансплантация неонатальных гепатоцитов; УЕ - условные единицы в пересчете на 1 мг общего белка; * - время наблюдения; п - количество изученных образцов для каждой группы на каждый срок; * -р < 0,05 в сравнении с контролем; **-р< 0,05 в сравнении с АД.

Таким образом, на фоне уменьшения жировой дистрофии гепатоцитов в группе животных с внутривенной ТНГ было отмечено увеличение уровня БТШ 70 и приближение его к показателям здоровых животных. Возможно, что положительный эффект трансплантации для

печени обусловлен среди прочих механизмов и активацией системы БТШ, которые в данном случае выступают как звено адаптации исследуемого органа к повреждениям, вызванным АД.

Анализ морфологических изменений в печени не выявил достоверных различий между группами с превентивной и отсроченной ТНГ. Но изменения уровня БТШ 70 в этих группах различались, причем было отмечено наибольшее соответствие стационарным значениям в группе с превентивной ТНГ (группа № 3).

Миокард. В сердечной мышце животных, получавших холестерин (группа №2), к 180 суткам эксперимента было отмечено выраженное 4 сужение просвета венечных сосудов на 16,6 ± 5,2 % от нормы. При ТНГ

(группы № 3-4) в миокарде животных на 45 день атерогенных изменений не наблюдалось. К 90 суткам появились первые признаки дистро-/ фических изменений клеток эндотелия коронарных сосудов, но визу-

ально данные изменения были менее выраженными в сравнении с миокардом из группы с АД в этот же срок наблюдения. На 180 сутки эксперимента наблюдали сужение просвета венечных сосудов на 5,4 ± 0,7 % от нормы. Данный показатель был в 3 раза ниже в сравнении с моделью ЭГХ. Кроме того, в группах с ТНГ количество вовлеченных в атероген-ный процесс сосудов значительно уменьшилось (до 79,6 ± 5,9 % от общего количества исследуемых сосудов) по отношению к модели ЭГХ (95,6 + 7 %). Структура кардиомиоцитов в группах с ТНГ соответствовала группе животных, находившихся на стандартной диете вивария.

При сравнительном анализе степени сужения просвета венечных сосудов при превентивной ТНГ и трансплантации на фоне развивающейся гиперхолестеринемии не было установлено статистически достоверных различий.

Установлено, что ТНГ снижала содержание БТШ 70 в миокарде экспериментальных животных в сравнении с группой № 2 (АД) и значения уровня данных белков приближались к стационарным, что по-4 зволяет высказать предположение о протективном эффекте, оказывае-

мом клеточной трансплантацией на миокард.

На 45 сутки в группе № 3 (АД + превентивная ТНГ) установлено I снижение концентрации БТШ 70 на 49 %, а в группе № 4 (АД + отс-

роченная ТНГ) — на 22 % по отношению к группе № 2 (ЭГХ). На 90 сутки эксперимента соотношения значений уровня БТШ 70, выявленные в этих группах в первом сроке эксперимента, сохранялись. К 180 суткам у всех животных с трансплантациями гепатоцитов (группы № 3— 4) наблюдали уровень БТШ 70, максимально приближенный к стационарному (рис. 2).

Таким образом, внутривенная ТНГ способствовала замедлению развития морфологических изменений в миокарде экспериментальных животных, образовавшихся в результате атерогенного процесса. При

этом было отмечено существенное снижение уровня БТШ 70, что может свидетельствовать об уменьшении внутриклеточных повреждений в кардиомиоцитах, оказываемых такими факторами ЭГХ, как активация перикисного окисления липидов, продукция провоспалительных цитокинов и т. д. Также следует отметить, что показатели уровня БТШ 70 в группе с превентивной ТНГ были более приближены к стационарным значениям в сравнении с показателями группы с отсроченной ТНГ. Как и в случае с печенью, для сердечной мышцы превентивная трансплантация биоматериала оказывается более эффективной в сравнении с отсроченной.

БТШ 70 <УЕ)

4,1*

1.6

I

3,2**

3,4*

3,6*

2,1'

II

2-7"

-177

£ I

1,3*

1,5*'

45

180 1 (сутки)

90

■ Контроль ШОД

ВДД+превенгивиая внутривенная ИНГ ЕЭАД+внутриввнная ТНГ на 6 сутки ОД

Рис. 2. Содержание БТШ 70 в миокарде кроликов при экспериментальной гиперхолес-теринемии и трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов (п = 36). Примечание: АД - атерогенная диета, ТНГ - трансплантация неонатальных гепатоцитов; УЕ - условные единицы в пересчете на 1 мг общего белка; t- время наблюдения; п - количество изученных образцов для каждой группы на каждый срок; * - р < 0,05 в сравнении с контролем; ** — р < 0,05 в сравнении с АД.

Головной мозг. У животных с моделью ЭГХ на 180 сутки эксперимента было обнаружено ярко выраженное сужение просвета сосудов микроциркуляторного русла, которое сопровождалось расширением периваскулярных пространств вокруг капилляров и ар-териол В группах с ТНГ на 45 и 90 сутки сужение просвета данных сосудов практически не наблюдалось. А к 180 дню было отмечено менее выраженное в сравнении с группой № 2 (АД) сужение просвета сосудов микроциркуляторного русла. Количество капилляров с уменьшенным просветом в группах с ТНГ (№ 3—4) составило 1,8 + 0,09 на 1 мм2, что было на 22,6 % меньше в сравнении с группой животных, находившихся на АД. Кроме того, у животных,

находившихся на АД, вблизи капилляров коры головного мозга была обнаружена выраженная гипертрофия и пролиферация астроцитов, в единичных капиллярах выявлены гиалиновые микротромбы. В группах с ТНГ (группы № 3-4) данные изменения были менее выраженными.

При светооптическом исследовании препаратов головного мозга из групп с ТНГ (№ 3—4) отмечено заметное уменьшение количества плазматизированных эндотелиоцитов в сравнении с образцами головного мозга из группы с ЭГХ. За счет этого сужение просвета капилляров в группах с трансплантациями было менее выраженным.

Полученные данные свидетельствуют о том, что внутривенная ТНГ замедляет развитие атерогенного процесса в головном мозге, вызванного ЭГХ. Анализ описанных выше морфологических изменений в головном мозге при превентивной ТНГ и ТНГ на фоне развивающейся ги-перхолестеринемии не обнаружил статистически достоверных различий.

Так же, как и в миокарде кроликов из групп с ТНГ (№ 3—4), в головном мозге снижался повышенный в результате процесса ги-перхолестеринемии уровень БТШ 70, и его значения приближались к стационарным. Так уровень БТШ 70 в головном мозге животных группы № 3 (АД + превентивная ТНГ) на 45 сутки соответствовал 2,9 ± 0,01 УЕ и практически не изменялся в течение всего эксперимента. Данный показатель из четырех экспериментальных групп был ближе всего к группе контроля (рис. 3). Группа № 4 (АД + ТНГ на фоне развивающейся гиперхолестеринемии) по значениям уровня БТШ 70 была близка к группе № 2 (АД) в течение всего эксперимента (рис. 3).

Таким образом, продемонстрировано влияние внутривенной ТНГ на морфологические изменения в головном мозге экспериментальных животных, вызванные атерогенным процессом, и систему белков теплового шока. Полученные данные позволили установить, что превентивная ТНГ в головном мозге способствовала более выраженному соответствию концентрации БТШ 70 стационарному уровню и, следовательно, являлась более эффективной, в сравнении с ТНГ на фоне развивающейся гиперхолестеринемии.

Трансплантация гепатоцитов способствовала снижению уровня БТШ 70 в головном мозге в сравнении с уровнем данных белков при ЭГХ. Основываясь на полученных морфологических данных для групп с ТНГ, можно сделать предположение о том, что и в головном мозге такое уменьшение уровня БТШ 70 и приближение его значений к стационарным может свидетельствовать об уменьшении внутриклеточных повреждений в нервных клетках, оказываемых различными факторами атерогенеза.

45 90 180 Нсутеи)

■ Контроль ШАД

□ АД+превентивная "ГНГ

ЕЗ АД + внутривенная ТНГ на 6 сутки АД

Рис. 3. Содержание БТШ 70 в головном мозге кроликов при экспериментальной тперхо-лестеринемии и трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов (п = 36). Примечание: АД - атерогенная диета; ТНГ - трансплантация неонатальных ге-патоцитов; УЕ - условные единицы в пересчете на 1 мг общего белка; 1 - время наблюдения; п - количество изученных образцов для каждой группы на каждый срок; * - р < 0,05 в сравнении с контролем, ** - р < 0,05 в сравнении с АД.

По-видимому, ТНГ снижает негативное воздействие ЭГХ на миокард и головной мозг, вследствие чего мы наблюдаем снижение уровня БТШ 70 в исследуемых органах. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что БТШ 70 можно рассматривать как индикатор уровня внутриклеточных повреждений в миокарде и головном мозге животных при ЭГХ.

Для печени же характерна другая ситуация. Здесь положительный эффект трансплантации обусловлен, по-видимому, среди прочих ме- >

ханизмов, активацией системы БТШ, которые, вероятно, в данном случае выступают как звено адаптации исследуемого органа к повреждениям, вызванным АД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема профилактики и лечения атеросклероза и его осложнений усиленно разрабатывается во многих странах мира, и здесь уже достигнуты определенные успехи. Однако многогранность и сложность механизмов развития и течения атерогенеза определяет недостаточную эффективность современных способов коррекции этого процесса. Одним из альтернативных подходов для лечения атеросклероза является

трансплантация биоматериала. Механизмы лечебного действия трансплантируемых клеток интенсивно исследуются, но, по-прежнему, остается много нерешенных вопросов. В настоящее время одним из возможных механизмов коррекции патологических процессов считается активация системы стрессовых белков.

В данной работе показано воздействие внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на систему белков теплового шока при ЭГХ. Установлено, что трансплантируемые клетки обладают собственным уровнем БТШ 70, который несколько больше исходного уровня данных белков в органах здоровых половозрелых животных. Существует вероятность того, что позитивный эффект клеточной трансплантации при патологических процессах определяется привнесением к пораженному органу БТШ. Полученные результаты не противоречат данному утверждению, хотя и не доказывают его. Однако наличие белков теплового шока в составе клеточного трансплантата еще раз подчеркивает высокую насыщенность вводимого материала биологически-активными веществами. Показано, что кри-оконсервация и лиофилизация биоматериала не влияет на исходный уровень БТШ 70 в нем.

Многочисленными экспериментальными исследованиями показано, что увеличение количества БТШ может защищать различные органы от повреждений (Меерсон Ф.З., 1993; Малышев И.Ю., 1998; Сигпе ЛЖ, 1988). Нами была предпринята попытка увеличения уровня БТШ 70 в культурах неонатальных клеток печени. Было установлено, что наибольшее увеличение содержания БТШ 70 в культурах клеток получено при их нагревании в течение 1 часа при 42 °С, а также при нагревании до 37 °С в течение 24 часов. Полученные данные были использованы для проводимого эксперимента. Для трансплантации использовались клетки, инкубируемые до введения животным в течение 24 часов при 37 "С.

В ходе проведенного исследования было обнаружено наличие определенного уровня БТШ 70 в органах здоровых животных. Причем получены результаты, свидетельствующие о различном содержании БТШ 70 в разных органах. Так в печени уровень БТШ 70 оказался самым высоким в сравнении с головным мозгом и миокардом. Такую закономерность можно объяснить несколькими положениями. Во-первых, как известно, печень по отношению к другим органам обладает высокой белково-синтетической функцией, а для БТШ одной из наиболее важных функций принято считать шаперонную активность при образовании третичной и четвертичной структуры вновь синтезированных полипептидов (МоппкЛо Т.Ы., 1994). Во-вторых, печень в нормальных условиях является активно пролиферирующим органом. Следовательно, уровень БТШ также должен быть повышенным, так как

известны данные об участии данных белков в процессе пролиферации (Меерсон Ф.З., 1993). В -третьих, причина повышенного уровня БТШ 70 в печени здоровых животных, возможно, связана с тканеспецифично-стью экспрессии данных белков (Blake M.J., 1990).

В ходе эксперимента было отмечено, что атерогенные изменения оказывали влияние на содержание БТШ 70. В печени животных группы с ЭГХ на 45 сутки наблюдали уменьшение стационарного уровня БТШ 70 на 80 %. Известно, что печень является органом, в котором происходит регуляция метаболических показателей, вовлеченных в патогенез атеросклероза (процессы синтеза и метаболизма ХС, обмен и рецепция различных классов липопротеинов, синтез липолитических ферментов и некоторых компонентов системы гемостаза) (Климов А.Н., 1999). Очевидно, при ЭГХ печень животных страдает в первую очередь и в большей степени по отношению к другим органам. Анализ морфологических данных печени при ЭГХ показал наличие липоидоза гепа-тоцитов и сужение крупных сосудов в исследуемом органе. Вероятно, процесс атерогенеза кроме прочих изменений в печени каким-то образом воздействует на систему БТШ, угнетая синтез данных белков. Увеличение же уровня БТШ 70 в печени этой экспериментальной группы к 180 дню, возможно, как-то связано с тканеспецифичностью стресс-активации синтеза БТШ, которая может проявляться как в количественном различии между разными тканями, так и во времени активации системы данных белков.

В миокарде и головном мозге животных группы № 2 (АД) наблюдали увеличение уровня БТШ 70 в сравнении с показателями группы № 1 (стандартная диета вивария). К 180 дню эксперимента и в том, и в другом органе внутри исследуемой группы (группа № 2) было отмечено незначительное снижение содержания БТШ 70 по отношению к 45 суткам, но данный уровень оставался повышенным по отношению к исходу. Кроме того, для миокарда и головного мозга были получены морфологические данные, свидетельствующие о патологических изменениях, вызванных АД (сужение просвета крупных сосудов; плазма-тизация эндотелиоцитов, пролиферация и гипертрофия астроцитов для головного мозга и нарушение поперечной исчерченности кардиомио-цитов для миокарда).

По литературным данным, различные факторы риска, такие как, например, инфекции, провоспалительные цитокины, окисленные липопротеиды и свободные радикалы, непосредственно стимулируют клетки артериальной стенки и других тканей для экспрессии высоких уровней белков теплового шока (Qingbo Xu, 2002). В ответ на повреждение субклеточных структур клетки реагируют повышением уровня стрессовых белков, которые являются одним из основных компонентов внутриклеточной защиты (Меерсон Ф.З., 1993). Данное положение, позво-

ляет предполагать возможность использования увеличения уровня БТШ 70 в тканях головного мозга и миокарда в качестве прогностического критерия, определяющего степень повреждения данных органов при атерогенезе.

Внутривенная ТНГ, по-видимому, снижает негативное воздействие ЭГХ на организм. Об этом свидетельствуют морфологические данные для исследуемых органов-мишеней атерогенного процесса, полученные для групп с трансплантациями гепатоцитов. Так, в печени наблюдали меньшую выраженность жировой дистрофии гепатоцитов и практическое отсутствие суженных вследствие этого сосудов в сравнении с моделью ЭГХ. Для миокарда было показано меньшее сужения просвета венечных сосудов и отсутствие нарушений исчерченности кардиомиоцитов. В головном мозге животных с ТНГ отмечали меньшее сужение просвета сосудов микроциркуляторного русла за счет уменьшения плазматизации эндотелиоцитов, а также уменьшение выраженности гипертрофии и пролиферации астроцитов (в сравнении с ЭГХ). Кроме того, в группах с ТНГ наблюдали изменения уровней белков теплового шока. Во всех исследуемых органах в группах с трансплантациями было отмечено приближение измененных в ходе атерогенного процесса показателей содержания БТШ 70 к стационарным.

В печени животных группы с превентивной ТНГ уровень БТШ 70 повышался по отношению к группе с ЭГХ, но, в то же время, его значения были максимально приближены к контрольным. При ТНГ на 6 сутки после начала АД в печени также наблюдали увеличение содержания БТШ 70 относительно группы с ЭГХ, однако полученные данные были менее приближенными к группе контроля. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что предпочтительнее по биоэффективности оказывается превентивная трансплантация в сравнении с отсроченной. Вероятно, это связано с тем, что орган с дополнительными биологически-активными компонентами (в том числе и белками теплового шока), которые были привнесены в него трансплантируемыми клетками до воздействия стрессирующе-го фактора, способен легче переносить нагрузки, вызванные атеро-генным процессом. Положительный эффект трансплантации для печени, как органа с основной нагрузкой при гиперхолестеринемии, возможно, обусловлен среди прочих механизмов и активацией системы белков теплового шока, которые в данном случае выступают в качестве одного из компонентов системы адаптации исследуемого органа к повреждениям, вызванным атерогенной диетой. В головном мозге и миокарде животных с ТНГ наблюдали уменьшение уровня БТШ 70 по отношению к группе с моделью гиперхолестеринемии, что, вероятно, свидетельствовало о снижении внутриклеточных повреждений в данных органах. Как и в случае с печенью, было отмече-

но приближение показателей содержания уровня БТШ 70 у групп с трансплантациями к таковым в группе контроля (группа № 1). Эффект клеточной трансплантации на фоне ЭГХ для миокарда и головного мозга, вероятно, связан с задействованием несколько иных защитных механизмов, чем в печени. По-видимому, ТНГ снижает повреждающее воздействие гиперхолестеринемии на миокард и головной мозг (возможно даже через нормализацию метаболических процессов в печени), вследствие чего мы наблюдаем снижение уровня БТШ 70 в исследуемых органах. Полученные данные подтверждают вероятность использования значений БТШ 70 для миокарда и головного мозга в качестве маркера внутриклеточных повреждений. Но, следует отметить, что данное положение требует дальнейших исследований и уточнений.

Ранее сотрудниками отделения метаболической хирургии и терапии коронарного атеросклероза была продемонстрирована многофакторность воздействия клеточной трансплантации на патологические изменения при атерогенном процессе и, как следствие его, ишеми-ческой болезни сердца (Курильская Т.Е., 1999; Стрекаловский Д.В., 1999; Никифоров С.Б., 2000). В проведенном исследовании была предпринята попытка раскрыть еще один из возможных механизмов воздействия клеточной трансплантации. Из полученных в ходе эксперимента морфологических данных следует, что ТНГ снижает агрессивность атерогенного процесса, при этом обнаружено уменьшение образованных повреждений. На этом фоне во всех исследуемых органах-мишенях атерогенного процесса (печень, миокард и головной мозг) наблюдали приближение показателей содержания БТШ 70 к стационарным значениям. Следует учитывать, что ТНГ, по-видимому, активирует различные защитные механизмы в разных органах, но положительный эффект данного способа коррекции гиперхолестеринемии остается неоспоримым.

По-видимому, клеточная трансплантация способствует нормализации процессов, нарушенных ЭГХ, о чем свидетельствуют полученные морфологические данные. Кроме того, ТНГ, вероятно, нормализует и внутриклеточные нарушения. Об этом свидетельствует тенденция приближения уровня БТШ 70 к показателям, свойственным здоровым животным, несмотря на то, что исходный уровень БТШ 70 в разных органах может существенно отличаться и при гиперхолестеринемии колебания уровня данных белков происходят в разных органах по-разному. Полученные в ходе проведенного эксперимента результаты позволили разработать концептуальную схему воздействия внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоци-тов на организм и внутриклеточные процессы в условиях гиперхолестеринемии (рис. 4).

ВНУТРИВЕННАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ НЕОНАТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ

О р

г

А

Н < И 3 М

К Л Е Т К А

АТЕРОГЕННАЯ ДИЕТА

Ка 1 Восстановление баланса липопротеинов

I Степень сужения просвета V крупных сосудов

Нарушение баланса липопротеинов

Ка Т

Степень сужения просвета крупных сосудов

1-

г

СТАБИЛИЗАЦИЯ УРОВНЯ БТШ70

СНИЖЕНИЕ СТЕПЕНИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ

V

Плазматизация эндотелиоцитов; гипертрофия и пролиферация астроцитов; дистрофические изменения нейронов

44 уровень БТШ 70

Нарушение поперечной исчерченное™ кардиомиоцитов

44 уровень БТШ 70

Жировая дистрофия гепатоцитов

\|/ уровень БТШ 70

Рис. 4. Воздействие трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на систему белков теплового шока (БТШ 70) и морфологические изменения в органах-мишенях при гиперхолестеринемии.

а

выводы

1. Культура неонатальных гепатоцитов кролика содержит стационарный уровень БТШ 70 (3,60 ± 0,007 УЕ). Способ консервации клеточного трансплантата печени (криопрезервация, лиофилизация) не приводит к изменению в нем содержания БТШ 70. Увеличение концентрации белков теплового шока в трансплантате достигается при его нагревании до 42 °С в течение 1 часа, или инкубацией клеток при 37 °С в течение 24 часов.

2. Клетки здоровых половозрелых кроликов содержат исходно различные уровни БТШ 70: печень — 3,50 ± 0,007 УЕ; миокард — 1,50 ± 0,01 УЕ; головной мозг - 2,8 + 0,01 УЕ.

3. В процессе развития гиперхолестеринемии содержание БТШ 70 в исследуемых органах изменяется: в печени исходный уровень снижается на 80 %; в миокарде и головном мозге — увеличивается на 173 % и 23 % соответственно, что происходит на фоне морфологических нарушений в этих органах.

4. Внутривенная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов в условиях гиперхолестеринемии способствовала защите органов, что подтверждается нормализацией уровня БТШ 70 и уменьшением атерогенных изменений в печени, миокарде и головном мозге.

5. Наибольшая эффективность в отношении нормализации концентрации БТШ 70 в печени, миокарде и головном мозге экспериментальных животных достигается в результате введения клеток с началом атерогенной диеты, чем при трансплантации на фоне развивающейся гиперхолестеринемии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования внутривенной трансплантации неонатальных гепатоцитов в лечении гиперхолестеринемии. Показано, что клеточная терапия способна оказывать протекторный эффект на внутриклеточном уровне, воздействуя на систему белков теплового шока. Результаты работы были внедрены в научную и практическую деятельность отделения метаболической хирургии и терапии коронарного атеросклероза НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН и лаборатории физиологической генетики СИФИБ-Ра РАН. Целесообразно рекомендовать внедрение полученных результатов в учебный процесс кафедр патологической физиологии и биохимии медицинских и биологических университетов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Уровень БТШ70 в миокарде кроликов при экспериментальной гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, A.C. Сергеева, Г.Б. Боровский и др. // Бюл. НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН: Матер. 8 Всерос. съезда сердечно-сосудистых хирургов, 19—22 ноября. — М., 2002. — Т. 3, № 11.-С. 312.

2. Стресс-белки при экспериментальной гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, С.Б. Никифоров, A.C. Сергеева и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - № 5, Т. 1. - С. 119-123.

3. Возможности трансплантации гепатоцитов в коррекции гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, A.C. Сергеева, Н.П. Судаков и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - № 5, Т. 1. - С. 123-126.

4. Влияние трансплантации гепатоцитов на уровень БТШ 70 при экспериментальной гиперхолестеринемии / A.A. Рунович, A.C. Сергеева, Г.Б. Боровский и др. // International Journal on Immunorehabilitation: Тез. IX междунар. Конгр. «Проблемы иммунореабилитации: физиология и патология иммунной системы» — М., 2003. — Т. 5, № 1. — С. 95.

5. Влияние внутрипеченочной трансплантации неонатальных гепатоцитов кролика на показатели липидного обмена и уровень белков теплового шока (70 кДа) в ткани миокарда и головного мозга при экспериментальной гиперхолестеринемии / Н.П. Судаков, A.A. Берина, A.C. Сергеева и др. // Матер, междунар. научн.-практич. конф. «Здоровье и образование», 19—25 мая. - Пермь, 2003. — С. 240—243.

6. Клеточные стрессовые белки миокарда при экспериментальной гиперхолестеринемии и клеточной терапии / A.A. Рунович, A.C. Сергеева, Б.К. Бадуев и др. // Матер. VII ежегодной сессии НЦ ССХ им. А Н. Бакулева РАМН, 25-27 мая. - М., 2003. - С. 209.

7. Влияние трансплантации неонатальных гепатоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии на стабильность атерогенных классов липопротеинов in vitro / A.A. Рунович, С.Б. Никифоров, A.C. Сергеева и др. // Аллергология и иммунология. — М., 2003. — Т. 4, № 2. - С. 199.

8. Воздействие трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на систему стрессовых белков при экспериментальной гиперхолестеринемии / A.C. Сергеева, Б.К. Бадуев, A.A. Рунович и др. // Сб. по матер, междунар. междисциплинарного конгр. «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека», 18—19 июня. — Кара-Даг, Феодосия, Украина, 2003. - С. 125-126.

9. Влияние трансплантации гепатоцитов на содержание стресс-белков миокарда и головного мозга в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии / A.C. Сергеева, Б.К. Бадуев, Н.П. Судаков и др. / / Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медици-

ны: Матер, межрегион, научн.-практ. конф. молодых ученых Сибири, 26 ноября - Иркутск: ГИДУВ, 2003. - С. 218-219.

10. Некоторые механизмы воздействия трансплантации аллоген-ных неонатальных гепатоцитов на течение экспериментальной гипер-холестеринемии / A.A. Рунович, С.Б. Никифоров, A.C. Сергеева и др. / / Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - № 7. - С. 32-33.

11. Стресс-белки при клеточной трансплантации и экспериментальной гиперхолестеринемии / A.C. Сергеева, Б.К. Бадуев, Г.Б. Боровский и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - № 7. - С. 35-36.

12. Сергеева A.C. Морфологические изменения в сосудах миокарда и головного мозга при трансплантации неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии /A.C. Сергеева, Н.П. Судаков, A.A. Берина // Новое в реконструктивной хирургии: Тез. докл. научн. конф. молодых ученых, поев. Дню основания РНЦХ РАМН, 19 марта. - М., 2004. - С. 304-305.

Подписано в печать 02.02.2005. Бумага офсетная. Формат 60x84'/

Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 _Тираж 100 экз. Заказ Na 037-05._

РИО НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37)

РНБ Русский фонд

2005-4 41437

2 7 МДР т{ -

V: 1242

Актуальность проблемы. Последние несколько лет ученые различных специальностей особое внимание уделяют изучению стрессовых белков, или белков теплового шока. Белки этого класса обладают шаперонной активностью, т. е. принимают участие в правильном сворачивании полипептидных цепей (фолдинге) в нормальных и, особенно, в экстремальных условиях (таких, как тепловой шок, воздействие сильных оксидантов, интоксикации, ишемии, воспалении и т.д.). Кроме того, белки теплового шока способствуют ренатурации частично денатурированных или элиминации полностью денатурированных белков.

Выявлена активная роль этих белков в физиологии клетки, цитопротекции, формировании стресс-индуцируемых регуляторных цепей. Активное участие в важнейших процессах клетки является свидетельством того, что белки теплового шока играют ведущую роль в обеспечении репарации и деградации, а нарушение функционирования этих белков может явиться одной из причин дисфункции и повреждения органов и тканей. Обнаружено участие стрессовых белков в различных патологических процессах, в том числе атеросклерозе (Xu Q.,2001).

Известно, что Россия по смертности от заболеваний, в основе которых лежат атеросклеротические повреждения сосудистой стенки, занимает одно из первых мест в Европе (Оганов Р. Г., 2002).

Существующие методы коррекции гиперхолестеринемии, как одного из детерминирующих факторов атерогенного процесса, включающие хирургические вмешательства, эфферентную терапию, фармакологическое воздействие на различные звенья синтеза холестерина в организме, способствуют лишь временной стабилизации патологического процесса (Чазов Е.И., 1998). В этой связи представляется актуальной проблема поиска более эффективных методов лечения атеросклероза. Сегодня новые биомедицинские технологии в решении этой проблемы связаны с использованием клеточной трансплантации. Оригинальные лечебные биотехнологии заключаются в трансплантации стволовых, низкодифференцированных эмбриональных или зрелых соматических клеток, способных восстанавливать функции пораженных патологическим процессом органов и тканей (Сухих Г.Т., 2002).

Известно, что ключевыми патогенетическими звеньями атерогенного процесса являются нарушения обмена липопротеинов, интенсификация перекисного окисления липидов (Климов А.Н., 1999). Вышеперечисленные факторы оказывают кроме прочего и стрессовое воздействие на органы-мишени атерогенеза, вызывая повреждения внутриклеточных структур, в частности белковых молекул. Участие белков теплового шока в этом процессе описано многими авторами (Kanwar R.K., 2001; Snoeckx L.H.E.H., 2001; Xu Q., 2002).

Накоплены весьма убедительные экспериментальные и клинические данные, указывающие на снижение активности атеросклеротических изменений при клеточной трансплантации (Голдобина А.В., 1998; Курильская Т.Е., 1999; Никифоров С.Б., 2000; Grompe М.С., 2001; Ohashi К.Е., 2001). Вместе с тем, механизмы саногенетического эффекта клеточной трансплантации весьма далеки от окончательного понимания.

На уровне сегодняшних представлений белки теплового шока многими авторами расцениваются как часть или целое внутриклеточной стресс-лимитирующей системы, способствующей защите клетки от повреждения (Меерсон Ф.З., 1993; Малышев И.Ю., 1998; Шевченко Ю.Л., 1999; Xu Q., 2001). В связи с этим представляет научный и практический интерес выяснение степени участия белков теплового шока в процессе клеточного повреждения при хроническом стрессовом воздействии в виде гиперхолестеринемии, а также влияние на этот процесс клеточной трансплантации.

Цель исследования: изучить влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на динамику содержания белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа в печени, миокарде и головном мозге в процессе развития экспериментальной гиперхолестеринемии.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние различных условий культивирования клеток и способа консервации трансплантата на содержание в нем белков теплового шока (БТШ 70). Определить стационарный уровень БТШ 70 в печени, миокарде и головном мозге кроликов.

2. Изучить динамику морфологических изменений и концентрации БТШ 70 в печени, миокарде и головном мозге экспериментальных животных в различные сроки развития гиперхолестеринемии.

3. Выявить особенности изменения содержания БТШ 70 в исследуемых органах при превентивной и отсроченной трансплантации неонатальных гепатоцитов.

4. Определить взаимосвязь количества БТШ 70 с уровнем морфологических нарушений в органах-мишенях и степенью выраженности экспериментальной гиперхолестеринемии у животных при внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов.

Научная новизна: В результате проведенного исследования в неонатальных клетках печени впервые обнаружено наличие белков теплового шока, количество которых можно увеличивать с помощью культивирования при повышенных температурах. Установлено, что способ консервации трансплантата не влияет на содержание БТШ 70 в нем.

Продемонстрировано наличие разных уровней стрессовых белков в печени, миокарде и головном мозге здоровых животных. Получены оригинальные данные, свидетельствующие об изменении стационарного уровня БТШ 70 и морфологических нарушениях в исследуемых органах при экспериментальной гиперхолестеринемии. Показано, что в условиях атерогенного процесса в печени, миокарде и головном мозге экспериментальных животных трансплантация неонатальных гепатоцитов способствует приближению уровня БТШ 70 к стационарным значениям и уменьшению морфологических нарушений в данных органах.

Получены данные, свидетельствующие о том, что превентивная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов в большей степени способствует нормализации измененного в результате атерогенеза уровня БТШ 70, чем трансплантация на фоне развивающейся гиперхолестеринемии.

Теоретическая и практическая значимость работы: Результаты эксперимента позволяют рассматривать белки теплового шока в качестве компанента системы адаптации различных органов к хроническому повреждающему воздействию.

Установлено, что внутривенное введение неонатальных гепатоцитов оказывает влияние на внутриклеточные защитные механизмы, приближая уровень БТШ 70 в исследуемых органах к стационарным показателям и обеспечивая этим органам большую сохранность в процессе развития гиперхолестеринемии. Полученные данные являются свидетельством того, что клеточная трансплантация оказывает протекторный эффект и на внутриклеточном уровне.

Положения, выносимые на защиту:

1. Культура гепатоцитов неонатального кролика содержит белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа, количество которых может быть увеличено путем культивирования при повышенных температурах. Способ консервации клеточного трансплантата (криопрезервация, лиофилизация) существенно не изменяет в нем уровень БТШ 70.

2. В условиях экспериментальной гиперхолестеринемии стационарное содержание БТШ 70 изменяется: в печени исходный уровень данных белков понижается, в миокарде и головном мозге - увеличивается. При этом регистрируется нарастание морфологических нарушений в исследуемых органах.

3. Трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии способствует нормализации уровня БТШ 70 и снижению степени морфологических изменений в исследуемых органах.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: восьмом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов, (г. Москва, 19-22 ноября 2002 г.); Международном конгрессе «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация», (Анталия, 27 апреля - 3 мая 2003 г.); Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование», (Турция, 19-25 мая 2003 г.); пятом конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении», (Египет 19-25 апреля 2003 г.); седьмой ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, (Москва, 25-27 мая 2003 г.); пятом съезде иммунологов и аллергологов СНГ, (Санкт-Петербург, 5-11 июля 2003г.); Международном междисциплинарном конгрессе "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека", (Кара-Даг, Украина, 8-19 июня 2003г.); Северо-западной Международной конференции по проблемам внезапной смерти, (Санкт-Петербург, 14-16 октября 2003 г.); четвертой научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», (Иркутск, ноябрь 2003г.); научной конференции молодых ученых, посвященной Дню основания PHI ТХ РАМН «Новое в реконструктивной хирургии», (Москва, 19 марта 2004г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи - в отечественных журналах, 8 тезисов и статей - в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, включая введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных наблюдений, заключение, практические рекомендации и выводы. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 22 рисунками. Библиография содержит 156 источников, из них 59 - отечественных и 97 — зарубежных авторов.

Результаты работы были внедрены в научную и практическую деятельность отделения метаболической хирургии и терапии коронарного атеросклероза НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН и лаборитории физиологической генетики СИФИБРа РАН. Целесообразно рекомендовать внедрение полученных результатов в учебный процесс кафедр патологической физиологии и биохимии медицинских и биологических университетов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования внутривенной трансплантации неонатальных гепатоцитов в лечении гиперхолестеринемии. Показано, что клеточная терапия способна оказывать протекторный эффект на внутриклеточном уровне, воздействуя на систему белков теплового шока.