Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Метаболизм андрогенов в опухолях костей

О О / /' '

у / ' - -РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им.

Н.Н.БЛОХИНА

на правах рукописи УДК: 616-006.34:04.577.171.

БАБКИНА Татьяна Викторовна

МЕТАБОЛИЗМ АНДРОГЕНОВ В ОПУХОЛЯХ КОСТЕЙ

(ОНКОЛОГИЯ-14.00.14)

Научные руководители: д.х.н. Дегтярь В.Г. д.м.н., профессор Алиев М.Д.

диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений 4

Введение 5 Глава 1. Метаболизм андрогенов в опухолях костей

(обзор литературы) 8

1.1. Общая схема метаболизма андрогенов 8

1.2. Биологическая активность андрогенов - 16

1.3. Механизм действия андрогенов 19

1.4.Кости и андрогены 21 1.5.0пухоли костей и андрогены 28 Глава 2. Материалы и методы 30 2.1.Краткая характеристика больных и материала 30 2.2,Очистка [3Н]стероидов-субстратов 33

2.3. Количественное определение стероидов при изучении метаболизма андрогенов в гомогенате

костной ткани 34

2.4. Определение содержания белка в гомогенате опухолей 37

2.5. Статистическая обработка 37 Глава 3. Собственные исследования 39

3.1. Выбор некоторых условий при изучении метаболизма андрогенов в опухолях костей 39

3.1.1. Разделение андрогенов ХТС 39

3.1.2. Проявление пластинок 41

3.1.3. Выбор условий инкубации гомогената с субстратами 41

3.2. Активность ферментов метаболизма андрогенов в

опухолях костей 45

3.2.1. Общая группа больных 45

3.2.1.1. Общая группа больных по возрастным группам 46

3.2.2. Группы мужчин и женщин 50

3.2.3. Опухоли различного гистологического строения 59 3.3. Взаимосвязь активности ферментов метаболизма андрогенов в опухолях костей 73 Глава 4. Обсуждение результатов 84 Выводы 96 Список литературы 98

Список используемых в диссертации сокращений

А - андростерон

4А - андрост-4-ен-3,17-дион

5а-А - 5а-андростан-3,17-дион

изо-А - изо-андростерон

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГСПС - глобулин, связывающий половые стероиды

17Р-ГСОР -17р-гидроксистероидоксидоредуктаза

30-ГСОР - 3|3-гидроксистероидоксидоредуктаза

Зсх-ГСОР - За-гидроксистероидоксидоредуктаза

6,7-ГСОР - 6,7-гидроксистероидоксидоредуктазы

За-диол - 5а-андростан-За,17р-диол

Зр-диол - 5а-андростан-Зр,17р-диол

ДГЭА - дегидроэпиандростерон

ДГТ - 5а-дигидротестостерон

Е1 -эстрон-17р

Е2 - эстрадиол-17р

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ПЖ - предстательная железа

5а-редуктаза - Д4стероид:НАД(Ф)-оксидоредуктаза

РА - рецепторы андрогенов

бе-триол - 5а-андростан-Зр,6е,17р-триолы

7е-триол - 5а-андростан-Зр,7е,17р-триолы

Т - тестостерон

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Саркомы костей составляют относительно небольшую долю (около 2%) в общей заболеваемости злокачественными новообразованиями, но из-за тяжести течения и сложности выбора адекватных видов терапии эти опухоли всегда находились под пристальным вниманием клиницистов. Опухоли костей чаще поражают детей и лиц молодого возраста, отличаются агрессивностью клинического течения, высокой способностью к метастазированию в легкие, другие кости скелета, внутренние органы. Лечение больных с указанной патологией является сложной проблемой, тем не менее в последние годы достигнуты значительные успехи и в этой области онкологии.

В настоящее время применяются различные виды комбинированного лечения сарком костей с использованием оперативного, лучевого и химиотерапевтического методов. Исключение составляет гормональная терапия, которая не нашла еще применения при данной патологии. Вместе с тем имеются литературные данные об изменении гормонального статуса у больных саркомами костей. Это показано, например, для половых стероидных гормонов. Последнее дает основание предполагать, что саркомы костей могут быть гормонозависимыми опухолями, при которых коррекция гормональных нарушений сможет привести к улучшению результатов лечения. Для разработки рациональных методов гормонотерапии необходимо представлять механизмы гормональной регуляции роста соответствующей опухоли. Важным этапом исследования является изучение особенностей воздействия стероидных гормонов на клетки опухолей костей, так как до сих пор отсутствует единая точка зрения на эту проблему.

Экспериментальные исследования и клинические наблюдения

показывают, что определенные нарушения функционального состояния некоторых органов эндокринной системы, прямо или косвенно связанных с обменом половых стероидов (биосинтез, метаболизм, катаболизм), вызывают метаболические изменения в костной ткани. Большинство литературных данных свидетельствует об участии половых стероидных гормонов в регуляции нормального развития и функционирования костной системы, а также в механизмах бластомогенеза костей человека и животных (Соловьев Ю.Н., 1970; Корницкий И.А., 1974; Кушлинский Н.Е. и соавт., 1991, 1993; Рикауата Б., ТавЫ^ап А., 1989). Однако среди исследователей нет единого мнения относительно характера влияния половых стероидных гормонов на костную систему как в норме, так и при развитии в ней опухолей. Противоречивость клинических и экспериментальных данных по этой проблеме, возможно, связана с рядом факторов, к числу которых можно отнести морфологические варианты строения опухоли, степень ее дифференцировки, а при экспериментальных исследованиях - разные условия проведения экспериментов. Кроме того, несмотря на важность проблемы, в литературе описано сравнительно небольшое количество клинических исследований, посвященных изучению обмена половых стероидных гормонов у больных с косте- и хрящеобразующими опухолями. Последнее в значительной степени относится к андрогенам, метаболизм которых в большинстве перефирических тканей человека изучается давно, но данные для костных тканей достаточно противоречивы. Все выше изложенное позволяет' заключить, что изучение метаболизма андрогенов в костных опухолях является актуальной проблемой.

Цель настоящего исследования - изучение метаболизма андрогенов в опухолях костей различного гистологического строения.

В исследовании решались следующие основные задачи:

1. Определить активность основных ферментов метаболизма андрогенов: НАДФН-зависимой 3-кетостероид-А4-5а-редуктазы (5а-редуктазы), 17р-гидроксистероидоксидоредуктазы (17р-ГСОР), За- и Зр-гидроксистероидоксидоредуктаз (За-ГСОР, Зр-ГСОР) в гомогенате первичных сарком костей различного генеза.

2. Изучить изменение активности указанных ферментов метаболизма андрогенов в первичных саркомах костей в зависимости от гистологического строения, возраста больных, пола.

3. Проанализировать возможности использования полученных данных в клиническом лечении сарком костей различного генеза.

Научная новизна

Впервые на клиническом материале изучены особенности метаболизма андрогенов в первичных саркомах костей.

Практическая значимость работы

1. Разработанный метод определения активности ферментов метаболизма андрогенов в гомогенате опухолей костей можно использовать в клинических и экспериментальных исследованиях, связанных с изучением механизма действия стероидных гормонов в саркомах костей.

2. Выявлена связь активности ферментов метаболизма андрогенов в опухолях костей различного генеза.

Объем работы

Текст диссертации изложен на 106 странице машинописного текста. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 28 рисунками. Библиографический указатель содержит 23 отечественных и 74 зарубежных источника. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

ГЛАВА 1

1. МЕТАБОЛИЗМ АНДРОГЕНОВ В ОПУХОЛЯХ КОСТЕЙ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Андрогены - мужские половые гормоны (С 19 стероиды) стимулируют развитие мужских половых органов и вторичных половых признаков. Ключевым промежуточным соединением в биосинтезе андрогенов является андростен-3,17-дион (А4), который образуется в надпочечниках из ДГЭА, тогда как в тканях половых желез он синтезируется из 17-гидроксипрогестерона. При восстановление С-17 кетогруппы А4 с участием 17р-ГСОР (в основном в половых железах) образуется тестостерон (Т) (Э.Хефтман, 1972). В зависимости от периода развития половые железы и надпочечники человека секретируют в кровь различные андрогены, в основном это Т и в меньшей степени А4. Считается, что примерно 70% Т и 30% А4 поступает в кровоток из половых желез и наоборот, около 30% Т и 70% А4 являются надпочечникового происхождения (Wheeler M.J., 1995).

1.1 Общая схема метаболизма андрогенов

Как известно, андрогены в основном транспортируются в организме в виде комплекса с белком, который специфически связывает половые стероиды - глобулин, связывающий половые стероиды (ГСПС) (Wheeler M.J., 1995). Концентрация этого белка регулирует поступление андрогенов в клетки мишени. Небольшая часть андрогенов крови связана неспецифически с альбумином. Часть андрогенов, как и других стероидов, которые не связаны с белками (свободные стероиды) считаются биологически активными (Wheeler M.J., 1995). Свободный Т

(и другие андрогены), как полагает большинство исследователей, проникают в клетки путем простой диффузии, из-за наличия положительного градиента концентрации и их липофильности. Однако механизмы, с помощью которых осуществляется проникновение стероидных гормонов (в том числе и Т) через мембрану в клетку до сих пор остаются дисскусионной проблемой. Пассивная диффузия стероидов в клетку ставится некоторыми исследователями под сомнение, или она может быть одним (отнюдь не основным) из механизмов попадания стероидных гормонов в клетки. Альтернативный механизм (вероятно только in vivo) - участие в этих процессах ГСПС, который имеет связывающие участки на наружной мембране клетки-мишени (Meyer S. и соавт., 1994). Еще один вариант: только некоторые андрогены проникают в клетку путем простой диффузии, например, Т и А4, а для других природных андрогенов необходимо участие ГСПС (Meyer S. и соавт., 1994).

Наиболее удивительной особенностью андрогенов среди других стероидов является выраженная связь их метаболизма с типом клетки-мишени, что делает такие различия между тканями скорее правилом, чем исключением, и можем свидетельствовать о более сложном механизме действия этих гормонов, чем предпологалось до сих пор. В то же время филогенетические исследования пока не дали возможности установить с достаточной точностью, на каком этапе эволюционного развития клетки-мишени приобретают различия в метаболизме одного и того же андрогена.

Попадая в клетки из крови андрогены подвергаются метаболитическим превращениям (Дегтярь В.Г., 1992). Схема метаболизма (биотрансформации) андрогенов на примере ПЖ человека показана на рис. 1. В данной работе термин "биотрансформация" означает, что происходит превращение стероидов с участием соответствующих ферментов in vivo или in vitro. Термины "метаболизм" и

Рис. 1 Биотрансформация андрогенов в тканях животных и человека.

1 - 17р-ГСОР; 2 - ароматаза; 3 - 5а-редуктаза; 4 - За-ГСОР; 5 - Зр-ГСОР; 6 - комплекс ферментов, гидроксилирующих Зр-диол в Сб-положение; 7 -комплекс ферментов, гидроксилирующих Зр-диол в С7-положении.

"катаболизм" подразумевают превращение андрогенов под действием ферментов, соответственно, в метаболиты, которые обладают или могут обладать в принципе биологической активностью, и катаболиты, которые не обладают биологической активностью (по крайней мере по известным до настоящего времени литературным данным) и являются конечными продуктами метаболизма андрогенов в тканях-мишенях (периферических тканях). Для всех тканей, кроме половых желез и печени, термин "биотрансформация" (как более общий, включающий понятия метаболизм и катаболизм), следует считать наиболее приемлемым, т.к. в большинстве тканей из Т образуются различные андрогены, в том числе и более активный андроген, чем сам Т. Необходимо отметить, что в большинстве тканей биотрансформация андрогенов осуществляется с преимущественным образованием только некоторых из них, а специфические различия в метаболизме андрогенов чаще всего сводятся к соотношению образующихся метаболитов.

В механизме действия половых стероидных гормонов, в частности, андрогенов и эстрогенов, важное значение имеют два основных пути метаболизма (рис. 1): превращение A4 в Т и наоборот (Horton R. и соавт., 1966) и превращение A4 и Т в эстрогены - соответственно в El и Е2 (Longcopt С. и соавт., 1969).

Превращение Т в 4А происходит при участии 17ß-rCOP, однако активность этого фермента в большинстве тканей очень низка, за исключением печени, надпочечников и, возможно, мышц (Rawling N.C., Cook S.J., 1986), и направлена преимущественно в сторону образования Т, т.е. преобладает редуктазная активность 17ß-rCOP. При патологических нарушениях соотношение редуктазной и оксидазной активностей 17ß-TCOP может значительно изменятся, как это показано для рака предстательной железы человека (Negri-Cesi Р., Motta М., 1994).

Превращение андрогенов в эстрогены (ароматизация) имеет большой биологический смысл, поэтому ферментная.система, которая

превращает андрогены в эстрогены - ароматаза, довольно широко распространена. Так, у человека ароматаза обнаружена в жировой ткани (Schindler А.Е. и соавт., 1971), лимбических структурах и гипоталамусе (Naftolin F. и соавт., 1971), в карциномах (Kirschner М.А. и соавт., 1974), плаценте и в волосяных фолликулах (Schweikert H.U. и соавт., 1975). Различные органы крыс, включая гипоталамус (Reddy V.V.R. и соавт., 1974), костную ткань (Vittek F. и соавт., 1974) могут превращать андрогены в эстрогены Ароматаза не является стереоспецифическим ферментом, так как этот комплекс может превращать эпитестостерон (17а-ОН-тестостерон) в неактивный стереоизомер 17а-эстрадиол (Higuchi Т., Villee С.А., 1970). Превращение андрогенов в эстрогены значительно усложняет изучение механизма действия этих двух типов половых стероидов, поскольку биологические ответы могут быть, фактически, опосредованы эстрогенами, образующимися в этих же клетках из андрогенов, если используются андрогены, которые могут подвергатся ароматизации - A4, Т и др. Активность 17ß-TCOP в ПЖ не высока и возраст не влияет на активность этого фермента. В то же время имеются данные, что при раке ПЖ у человека активность 17р-ГСОР может значительно увеличиватся

(Martini L., 1996).

Образование важного метаболита тестостерона - 5а-дигидро-тестостерона (ДГТ) происходит под действием 5а-редуктазы. 5сс-Редуктаза обнаружена в значительных количествах почти во всех мужских добавочных половых железах и во многих периферических тканях обоих полов, а активность этого фермента коррелирует с общим ростом основного органа-мишени для андрогенов - ПЖ, характерным для данного вида животных (Wilson J.D., Gloyna R.E., 1970). Скорость 5а-восстановления молекулы стероида лимитируется только внутриклеточной концентрацией свободного Т (Frederiksen D.W., Wilson J.D., 1971). Несмотря на исключительно важную роль 5а-редуктазы в

метаболизме андрогенов, этот фермент встречается не во всех тканях-мишенях для андрогенов. По мнению многих исследователей (Kelch R.P. и соавт., 1971) 5а-редуктаза в большинстве случаев отсутствует в скелетных мышцах животных, включая жевательные и бульбокавернозные мышцы. У некоторых видов животных активность 5а-редуктазы зависит от концентрации андрогенов в крови. Так, несмотря на противоречивость данных, показано, что активность 5а-редуктазы в простате крыс значительно уменьшается с возрастом и после кастрации, но может быть восстановлена введением Т при условии, что не ингибируется биосинтез РНК и белков (Shimazaki J. и соавт., 1970). Основное количество ДГТ в клетках образуется при участии 5а-редуктазы. В то же время некоторое количество этого активного метаболита может поступать в клетки из крови, поскольку, в крови собак и мужчин содержится значительное количество ДГТ (Ito Т., Horton R., 1971). При анализе оттекающей от ПЖ собак крови в динамике был сделан вывод о том, что только одна треть ДГТ образуется в самой железе из предшественников, поступающих с кровью, остальное количество этого андрогена синтезируется в самой железе (Tremblay R.R. и соавт., 1972).

Весь ДГТ в нормальной клетке-мишени состоит по крайней мере из трех основных (вероятно, неодинаковых) частей: а) ДГТ, который образуется их Т; б) ДГТ, который образуется из За-диола и Зр-диола (небольшая часть, и не во всех клетках); в) ДГТ, который, возможно, остается в клетке после распада комплекса рецептор андрогена (РА)-ДГТ в цитозоле или ядре. Можно полагать, что для образования комплекса РА-ДГТ используется лишь небольшая часть пула ДГТ в клетке.

Почти во всех клетках-мишенях половых стероидов 3-кетогруппа ДГТ может восстанавливатся как в За-положение с образованим За-диола, так и в Зр-положении с образованием Зр-диола, с участием, соответственно, ферментов За-ГСОР и Зр-ГСОР (рис. 1). Следовательно,

концентрация ДГТ в клетке может зависить от активности не только 5а-редуктазы, но еще по крайней мере трех ферментов (Резников А., 1979): 17Р-ГСОР, За- и Зр-ГСОР. Соотношение активностей указанных гидроксилаз зависит от ткани, однако почти всегда их активности можно расположить в ряд За-ГСОР>Зр-ГСОР» 17р-ГСОР. Акти�