Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Рецепторы эпидермального фактора роста, ЭФР-подобные пептиды и рецепторы глюкокортикоидов в остеогенной саркоме

на правах рукописи

<т>

СП

ОС

о

СМ

РАДЧЕНКО Андрей Александрович

РЕЦЕПТОРЫ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА,

ЭФР-ПОДОБНЫЕ ПЕПТИДЫ И РЕЦЕПТОРЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ В ОСТЕОГЕННОЙ САРКОМЕ

(онкология -14.00.14)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканне ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в Онкологическом научном центре им. H.H. Бло-хина РАМН и Московской медицинской Академии им. И.М. Сеченова

Научные руководители:

Академик РАН, профессор H.H. Трапезников

доктор медицинских наук, профессор Н.Е. Кушлинский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.П. Летягин

доктор медицинских наук, профессор С.Т. Зацепин

Ведущее учреждение:

Московский НИИ диагностики и хирургии.

Защита состоится "_"_1997 года на заседании Специализированного совета (К.001.17.01) при Онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Остеогенная саркома (ОС) - наиболее распространённая злокачественная опухоль костей мезенхимального происхождения, продуцирующая остеоид, чаще встречающаяся во второй декаде жизни у лиц мужского пола (М:Ж=1.5:1).

Современные методы лечения ОС включают комбинацию неоадью-вантной химиотерапии, хирургического вмешательства, а также адыо-вантной химиотерапии, по схеме, адаптированной в соответствии со степенью лечебного патоморфоза (Trapeznikov N.N. et al., 1992). Данный подход к лечению больных ОС значительно улучшил результаты пятилетней выживаемости: до 77% общей и 73% безрецидивной выживаемости у больных со II стадией распространённости опухолевого процесса (Classer D.B. et al., 1992). С целью дальнейшего улучшения результатов лечения правомерен поиск новых терапевтических подходов, основанных на знании центральных и локальных механизмов регуляции опухолевого роста при ОС.

Костная ткань является мишенью многих гормонов, а также факторов роста. Пролиферация остеобластов находится под эндокринным, па-ракринным, а также аутокршшым контролем (Mohan S., Baylink D.J., 1991; Gonzalez H.A., Martin K.J., 1996).

О гормональной чувствительности костной ткани в норме и при патологии свидетельствует ряд экспериментальных и клинических данных. Так, рецепторы андрогенов (РА), а также экспрессия РА-мРНК были обнаружены в нормальных остеобластах человека (ColvardD.S. et al., 19S9). In vitro андрогены оказывали митогенное влияние и повышали уровень экспрессии рецепторов факторов роста (Gupta С., Sign M., 1996). В эксперименте была показана промоторная роль андрогенов в развитии ОС у кроликов (Корницкий М.А., 1974). Клинические исследования продемонстрировали повышение свободной фракции тестостерона в сыворотке крови больных ОС, а наличие РА в опухоли, как неблагоприятного про-

гностического признака у больных ОС (Кушлинский Н.Е. и соавт., 1987; 1993).

Рецепторы эстрогенов (РЭ) были обнаружены в культуре нормальных остеобластов человека (Eriksen E.F. et al., 1988), а также в культуре остеогенной саркомы человека HOS ТЕ 85. В эксперименте эстрогены стимулируют пролиферацию остеобластов, ускоряют процесс их диффе-ренцировки и созревания (Кауе A.M., 1990). В клинических исследованиях было продемонстрировано наличие РЭ в ОС и их благоприятное прогностическое значение (Кушлинский Н.Е., 1993).

Глюкокортикоиды (ГК) также играют важную роль в регуляции костного метаболизма. In vivo ГК стимулируют резорбцию костной ткани и тормозят костеобразование. Продолжительное воздействие высоких доз ГК приводит к остеопорозу: они вызывают деминерализацию костной ткани, стимулируют резорбцию костей и тормозят костеобразование (Gennari С., 1993; Delany A.M., 1994). Рецепторы глюкокортикоидов (РГК) были изучены в культурах остеобластоподобных клеток: оценка специфического связывания по Скэтчарду показала наличие в клетках HOS-8603 высокоаффинных РГК (Song L.N., 1994). До настоящего времени не проводилось исследований по оценке клинического значения РГК в опухолях костей, в частности, в ОС.

Немаловажной в регуляции роста и дифференцировки костной ткани в норме и при патологии является роль других гормонов.

Помимо непосредственного действия на клетки-мишени гормоны, а также некоторые витамины, приводят к изменению концентрации и активности локальных регуляторов, факторов роста и цитокинов. Опухолевая трансформация нарушает чёткую координацию между эндокринной регуляцией и локальным ответом, между процессами дифференцировки и пролиферации (Goustin A.S. et al., 1986). При этом клетки могут значительно увеличивать экспрессию характерных для них факторов роста (ФР) и их рецепторов (РФР), возобновлять синтез ФР и РФР, инактивиро-ванных с момента эмбрионального развития или начинать синтез новых, нехарактерных для данного типа клеток, ФР (Cross М., 1991). Эхо приводит к значительному увеличению роли ауто- и паракринной регуляции и

автономизации роста опухоли. Опухолевая трансформация может приводить также к исчезновению продукции характерных для дифференцированных клеток ФР.

В регуляции пролиферативных процессов и дифференцировки нормальных и трансформированных остеобластов участвуют многие ФР и цитокины. В спектр настоящего исследования вошли: эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецепторы (РЭФР), а также РГК, поскольку роль глкжокортикоидов в нетрансформированной костной ткани достаточно хорошо известна, а их значение при опухолях костей ис изучено; ЭФР и его рецепторы - как наименее известный фактор роста в костной ткани, который в то же время достаточно хорошо изучен, как с биохимической, так и с клинической точек зрения, при опухолях самой различной локализации (Ambs К.Б. 1989; Bast R.C. ct al., 1993).

Па основании вышеизложенного цель настоящего исследования - изучение экспрессии РЭФР, ЭФР-подобных пептидов, а также РГК в ос-теогенной саркоме для оценки их взаимосвязи с основными клинико-морфологическими показателями и в прогностического заболевания. Были поставлены следущие основные задачи:

1 .Стандартизированным радиолигандным методом определить содержание РЭФР в мембранной фракции остеогенной саркомы.

2.Радиорецепторным методом определить содержание ЭФР-подобных пептидов в цитозолях опухолей.

3.Радиолигандным методом определить содержание РГК в цитозолях опухолей у больных остеогенной саркомой.

4.Провести сравнительное исследование уровней и частоты выявления РЭФР, ЭФР-подобных пептидов и РГК в опухолях с учетом клинических и морфологических характеристик заболевания.

5.0ценить значение РЭФР, их лигандов, РГК для прогноза общей и безрецидивной выживаемости больных остеогенной саркомой.

Научная новизна работы. Впервые детально проанализировано распределение и прогностическое значение экспрессии РЭФР, их лиган-

дов и РГК в основных клинико-морфологических группах больных ОС и показаны:

- благоприятное прогностическое значение РГК в опухолях больных ОС, а также лучшая безрецидивная выживаемость больных с концентрацией РГК от 10 до 50 фмоль/мг белка;

- благоприятное прогностическое значение ЭФР-подобных пептидов в опухолях больных ОС, как фактора, влияющего на общую выживаемость;

- лучшая безрецидивная выживаемость больных ОС, в опухолях которых отсутствуют РЭФР или их уровень выше 150 фмоль/мг белка, по сравнению с больными, в опухолях которых концентрация РЭФР колеблется от 10 до 150 фмоль/мг белка.

Практическая значимость. Обнаружение РЭФР, его лигандов и РГК в опухолях у больных ОС, результаты оценки их клинического значения позволяют рассматривать РЭФР, ЭФР и РГК как дополнительные прогностические факторы, а, возможно, также подходить к лечению больных ОС с учётом биохимического фенотипа опухоли.

Обнаружение РЭФР и его лигандов в большом числе опухолей у больных ОС, а также результаты экспериментальных и клинических испытаний препаратов, влияющих на различные этапы генерации и передачи митогенного сигнала при активации РЭФР в других РЭФР опухолях, позволяют обсуждать вопрос об использовании новых терапевтических подходов в лечении ОС.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания клинического материала и методов исследования, результатов, их обсуждения и выводов, а также списка литературы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами, 1 диаграммой и 22 графиками. Список литературы включает 20 отечественных и 239 зарубежных источников.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных, включённых в исследование. В исследование были включены 47 больных ОС, находившихся на лечении в хирургическом отделении общей онкологии НИИ клинической онкологии Онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН в период с апреля 1993 г. по апрель 1996 г. Группу составили первичные, предварительно нелеченые, больные ОС: 31 пациент мужского пола и 16 пациентов женского пола в возрасте от 13 до 57 лет. Средний возраст пациентов мужского пола составил 21,ОН,6 лет, женского пола - 21,0+2,5 лет.

Наиболее часто локализация опухолевого процесса наблюдалась в трубчатых костях, в частности: у 22 больных опухоль локализовалась в бедренной кости (47,8%), у 11 больных - в болыисберцовой (23,9%), у 6 -в плечевой кости (13,0%), у 4 больных локализация опухоли была в малоберцовой кости (8,7%). Наблюдались также и редкие локализации, в частности по одному наблюдению в челюсти (2,2%), в лопатке (2,2%) и в' подвздошной кости (2,2%).

Оценка гистологического строения опухолей костей проводилась па основе классификации Dahlin D.C. и Unni K.K. (1986). Большая часть ОС относилась с остеобластическому варианту - 22 опухоли (46,8%), у 8 пациентов (17,0%) был мелкоклеточный вариант, у 7 пациентов (14,9%) -анаплазированный, у 5 (10,6%) - хондробластический, у 3 пациентов (6, 4 %) - телеанпюэктатический, у 2 (4,3%) - ЗФГ-подобиьш вариант ОС.

Из 47 первичных больных ОС 34 получили неоадыоваптиую химиотерапию различного типа, в частности, 18 пациентов (40,9%) - производные препаратов платины, 8 (18,2%) - комбинации препаратов платины и адриамицина, у семи больных (15,9%) базовым препаратом неоадьювант-ной химиотерапии был адриамицин, одному больному была выполнена предоперационная инфузия аллогенного костного мозга.

В дальнейшем 34 пациентам было выполнено хирургическое вмешательство в различном объеме, в частности: сохранные операции типа резекция с эндопротезированием, либо резекция с установкой аппарата

Илизарова были выполнены 7 больным (14,9%). Калечащие операции типа ампутация и экзартикуляция были выполнены 21 больному (44,7%), межлопаточно-грудное вычленение было произведено трём больным (6,4%), резекция в переделах здоровых тканей выполнена у 2 больных (4,4%), резекция с замещением костного дефекта алло трансплантантом -у 1 больного (2,1%).

Курс адыовантной химиотерапии получили 33 больных. Основную группу больных составили пациенты, получившие адыовантную химиотерапию препаратами адриамицина и платины - 23 пациента (56,1% ); 4 пациента (9,6%) получили курс адыовантной химиотерапии адриамицином в качестве основного препарата; 6 пациентов (14,6%) получили различные комбинации схем химиотерапии.

В качестве дополнительного метода лечения у 47,6% пациентов была использована лучевая терапия.

При наблюдении за больными местный рецидив возник у 5 пациентов (что составило 10,6% из общей группы), у 25 пациентов (53,2%) - в различные сроки после начала лечения были выявлены метастазы в лёгких и/или в костях. Летальный исход наступил у 12 пациентов (25,5%) в различные сроки от начала лечения и был связан с нрогрессированием основного заболевания.

Основные методы Получение и обработка образцов опухолей. Образцы опухолей (500-2500 мг), полученные в результате операции или биопсии, немедленно доставляли в лабораторию во льду. Для получения цитозоля опухолевые образцы измельчали в жидком азоте, а затем гомогенизировали в TED-буфере, (рН 7,4) при 4°С, по объему из расчета 1 мл буфера на 100 мг ткани. Цитозольную фракцию получали в результате центрифугирования гомогената при 105.000xg, 4°С в течение 30 мин. (центрифуга Optima ТМ TLC, "Beckman", США). Полученный супернатант, представляющий собой цитозоль, использовали для определения РГК и ЭФР-нодобных пептидов. Осадок использовали для получения грубой мембранной фракции клеток опухолей, где определяли содержание РЭФР.

Исследование РГК в цитозолыюй фракции остеогенной саркомы. Определение проводили радиолигандным методом с разделением гормон-репепторных комплексов и несвязанного лиганда на активированном угле Norit A ("Serva", Германия), покрытом декстраном 70-100 ("Serva", Германия) в TED-буфере с 10% глицерином (Бассалык Л.С. и соавт., 1986). В качестве лиганда использовали синтетический глюкокор-тикоид [3Н]-дексаметазон ("Amersham", Великобритания) с удельной радиоактивностью 75-95 Ки/ммоль. Радиометрию проб проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике LS 6500 ("Beckman", США). Специфическое связывание меченого гормона с рецепторами рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Содержание РГК выражали в фмоль/мг цитозольного белка. Границей рецепторполо-жителъности для 1Т1С была принята концентрация 10 фмоль/мг белка.

Определение РЭФР в мембранной фракции остеогенной саркомы. Исследование содержания РЭФР проводилось модифицированным радиолигандным методом Benraad T.J. и Foekens J.Л. (1990). Для получения [1251]-меченого лиганда ЭФР иодировали Na-['25IJ (Санкт-Петербург, Россия) в присутствии хлорамина Т. Удельная радиоактивность полученного меченого лиганда составляла 45-120 Ки/ммоль. Мембранные препараты (100 мкл) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 3,5 нмоль [Ш1]-ЭФР в присутствии или отсутствии 200-кратного избытка немеченого мышиного ЭФР (receptor grade; "Sigma", США). Реакция прекращалась при добавлении в пробы 100 мкл 75% суспензии гид-роксилапатита (DNA-grade; "Sigma", США) в K.Na-PBS-буфере (pH 7,4) (PBS) на льду. Инкубация проб с гидроксилапатигом продолжалась 30 мин при 0°С. После этого в пробирки добавляли по 0,5 мл PBS-буфера и центрифугировали их при 2000xg, 4°С в течение 5 мин. (центрифуга РС-6), надосадочную жидкость удаляли водоструйным насосом, а осадки после 3 последовательных отмываний 1 мл PBS при 4°С радиометрировали на счетчике Cobra-II Autogamma ("Packard", Австралия). Специфическое связывание меченого ЭФР с рецептором рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Содержание РЭФР выражали в

фмоль/мг мембранного белка. РЭФР-положительными считали опухоли, содержащие не менее 10 фмоль/мг мембранного белка. В каждой серии из 10 определений РЭФР в мембранной фракции опухолей костей исследовали содержание РЭФР в препаратах мембран плаценты человека, являющихся стандартным контрольным материалом.

Определение ЭФР-подобных пептидов* в цитозолыюй фракции остеогенной саркомы. Определение концентрации ЭФР проводили радиорецепторным методом. В качестве связывающей системы использовали суспензию мембран плаценты человека, содержащую большое количество рецепторов ЭФР (3261+172 фмоль/мг белка). В данном методе определяется суммарное содержание всех пептидов, взаимодействующих с РЭФР (самого ЭФР, а-ТФР, амфирегулина, cripto и др.)- Для построения калибровочной кривой в качестве стандарта использовали ре-комбинантный человеческий а-ТФР ("Sigma", США). Проводили инкубацию и осаждение лиганд-рецепторных комплексов гидроксилапатитом, как описано в методе определения РЭФР. Просчитывали радиоактивность осадков на у-счетчик*1, строили калибровочные кривые зависимости связанной с рецептором радиоактивности от количества добавленного в пробу а-ТФР и рассчитывали содержание ЭФР в исследуемых образцах, выражая его в пг/мг ДНК. Ткань считали содержащей ЭФР, если полученная концентрация лигандов была отличной от 0 пг/мг ДНК.

Статистическая обработка данных. Оценка корреляционной зависимости проводилась путём расчёта коэффициента корреляции. Оценка достоверности различия между частотой встречаемости признаков проводилась по критерию Фишера, между средними - по методу Стью-дента. Анализ выживаемости проводился методом Каплана-Мейера с оценкой достоверности по Коксу.

* в дальнейшем для краткости изложения «ЭФР-подобные пептиды» будут условно обозначаться «ЭФР»

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ экспрессии РЭФР, ЭФР и РГК в различных клинико-морфологических группах больных ОС. РЭФР были выявлены в 68,1% опухолей (табл.1). При этом их минимальный уровень составил 10,0 фмоль/мг белка, максимальный - 605,0 фмоль/мг белка, средний -178,5+28,3 фмоль/мг белка.

Среди всех проанализированных клинико-морфологических групп нами было обнаружено достоверное различие частоты экспрессии РЭФР только между больными мужского и женского пола (73,3% и 58,8%, соответственно, р=0.03).

Не было обнаружено корреляционной зависимости между экспрессией РЭФР и основными клинико-морфологическими параметрами, а также экспрессией в опухолях РЭФР и РГК и ЭФР. РЭФР определялись несколько чаще у больных с ЭФР+ опухолями, чем у пациентов с отсутствием экспрессии ЭФР (73,1 и 53,8%, соответственно), однако различия были недостоверны.

Было обнаружено различие частоты экспрессии РЭФР в РГК" опухолях по сравнению с РГК+опухолями (80,0 и 58,3%, соответственно), однако эти различия также были статистически недостоверны. Подтвердить неслучайный характер полученных различий на данном этапе не представляется возможным.

При оценке клинического значения РЭФР в опухолях больные ОС были разделены на три условные группы в зависимости от уровня экспрессии РЭФР (РЭФР", РЭФР>150 и 10<РЭФР<150 фмоль/мг белка). При оценке отдалённых результатов практически во всех рассмотренных группах больных ОС наиболее неблагоприятной оказалась группа с концентрацией РЭФР в опухолях от 10 до 150 фмоль/мг белка. Неблагоприятный РЭФР-фенотип чаще встречался в РГК" опухолях (50,0%) по сравнению с РГК+ опухолями (29,2%).

Таблица 1

Частота выявления и средине уровни РЭФР в остеогенной саркоме

Группы больных Общее чис- Количество Средний

ло больных РЭФР+ уровень,

опухолей, фмоль/мг

% (М±ш)

общая группа 47 68.1 178.5±28.3

Пол больных женский 17 58.8 147.0±41.8

мужской 30 73.3 192.8+36.7

Гистологический вариант опухоли остеобластический 22 68.2 183.6+42.7

телеангиоэктатический 3 66.6 252.0±230.(

хондробластический 5 60.0 207.3±122.<

мелкоклеточный 8 62.5 145.7±57.6

анаплазированный 7 85.7 170.5±63.1

ЗФГ-подобный 2 50.0 81.0

Возраст больных от13 до 18 лет 32 62.5 151.6+29.8

старше 18 лет 15 80.0 223.4156.3

Протяженость опухоли ио КМК менее 10 см 12 75.0 199.6+65.3

более 10 см 24 66.7 208.1±40.0

ЭФР ЭФР" опухоли 26 73.1 147.6+32.8

ЭФР' опухоли 13 53.8 149.1+54.7

РГК РГК4' опухоли 24 58.3 171.6+39.1

РГК' опухоли 20 80.0 160.4142.1

При исследовании общей 1руппы первичных больных ОС количество ЭФР+ опухолей составило 26 (66,7%), ЭФР" - 13 (33,3%) (табл.2). Средний уровень экспрессии ЭФР в опухолях составил 2356,4+687,0 пг/мг ДНК.

Концентрация ЭФР в опухолях колебалась в широких пределах: от 28,9 до 12703,2 пг/мг ДНК. Отмечалась тенденция к более частой экспрес-

сии ЭФР в опухолях у больных мужского пола, а также больных с телеан-гиоэктатическим и анаплазированным вариантами ОС. Среди различных гистологических вариантов ОС ЭФР определялся наиболее редко в мелкоклеточном варианте ОС.

Таблица 2

Частота выявления и средние уровни ЭФР в остеогсниой саркоме

Группы больных Общее ЭФР+ Средний

число опухолей, уровень,

больных % фмоль/мг (М+ш)

обшая группа 39 66.7 2356.4+687.0

Пол женский 14 57.1 3012.1+835.4

больных М>'ЖСКОЙ 25 72.0 2065.0+926.1

остеобласшчеекий 15 60.0 3089.9+1372.8

Гистологический телеангнозклатический 3 100.0 4444.9+4129.2

вариант хондробластичесюш 4 75.0 3031.7+1771.4

опухоли мелкоклеточнып 8 37.5 1567.2+916.0

анаплазированный 7 100.0 884.1+284.1

ЗФГ-подобный 2 50.0 137.8+

Возраст от 13 до 18 лет 27 66.7 2152.6+733.1

больных старте 18 лет 12 66.7 2815.1+1471.0

Протяженность менее 10 см 9 66.7 3005.5+1991.4

опухоли по КМК более 10 см 19 78.9 2639.9+897.6

РЭФР РЭФР+опухоли 26 73.1 2197.4+867.8

РЭФР" опухоли 13 53.8 2788.1+1059.9

РГК РГК+ опухоли 20 75.0 2442.4+914.6

РГК" опухоли 17 64.7 2239.2+1089.6

Не было выявлено никаких закономерностей экспрессии ЭФР в зависимости от возраста больных. Определялась зависимость концентрации ЭФР от гистологического варианта опухоли: наиболее высокие уровни

ЭФР определялись в телеангиоэктатическом, наиболее низкие - в ЗФГ-подобном и анаплазированном вариантах ОС (табл.2).

Была обнаружена тенденция к более частой встречаемости ЭФР в РЭФР* и в РГК" опухолях по сравнению с РЭФР" и РГТС опухолями, однако различия были недостоверны.

Таблица 3

Частота выявления и средние уровни РГК в остсогенной саркоме

Группы больных Общее число Количество Средний

больных РГК" уровень,

опухолей, фмоль/м!

% (М+ш)

общая группа 44 54.5 60.8+15.5

Пол больных женский пол 14 57.1 100.9+39.«

мужской пол 30 53.3 40.7±10.2

Гистологический вариант опухоли остеобластический 19 63.2 41.5+11.0

телеангиоэктатический 3 66.6 34.1+13.0

хондробластический 5 40.0 113.6+0.7

мелкоклеточный 8 37.5 132.5+116.

апаплазированный 7 57.1 48.8126.3

ЗФГ-подобиый 2 50.0 76.1+

Возраст больных от 13 до 18 лет 30 63.3 67.4+19.3

старше 18 лет 14 35.7 35.9+11.6

Протяженность опухоли по КМК менее 10 см 10 60.0 58.2+18.0

более 10 см 23 43.5 43.8+12.0

РЭФР РЭФР+опухоли 30 46.7 67.3-25.3

РЭФР" опухоли 14 71.4 51.8+13.1

ЭФР ЭФР+ опухоли 26 57.7 79.1+23.6

ЭФР" опухоли 11 45.5 29.7+11.7

При исследовании общей группы первичных больных остеогенной саркомой РГК были обнаружены в опухолях 24 больных ОС (54,5%), 20 опухолей были РГК" (45,5%) (табл.3). При этом средний уровень РГК в опухолях составил 60,8+15,5 фмоль/мг белка. Концентрации РГК в опухолях колебались от 12,4 до 364,8 фмоль/мг белка. Частота экспрессии РГК не зависела от пола больных и протяженности опухоли по костномозговому каналу. Обнаружена тенденция к более частому обнаружению РГК в опухолях больных моложе 18 лет (р=0.08).

РГК встречались чаще в телеангиоэктатическом и остеобластиче-ском вариантах ОС, наиболее редко - в мелкоклеточном варианте ОС. Наиболее высокие средние уровни РГК выявлялись в опухолях больных мужского пола, при этом отмечалась тенденция к достоверности результата (р-0.06). Также наиболее высокие средние уровни РГК наблюдались у больных с мелкоклеточным и хондробластическим вариантами ОС. Подводя итог вышесказанному, можно заключить, что частота экспрессии РГК в опухолях у больных ОС зависит от возраста пациентов и гистологического варианта опухоли, а уровень РГК в опухолях зависит от пола больных и гистологического варианта опухоли.

В РЭФР+ опухолях РГК определялись реже, чем в РЭФР' (46,7% - 14 опухолей и 71,4% - 10 опухолей), однако различие было статистически недостоверно. Средние уровни РГК в этих группах также достоверно не отличались. Колебания концентрации РГК были более значительными в РЭФР+ опухолях.

В ЭФР" опухолях экспрессия РГК выявлялась несколько чаще, а их концентрация была выше, чем в ЭФР" опухолях, однако эти различия недостоверны. Колебание концентрации РГК было более значительным в ЭФР+ опухолях. Таким образом, экспрессия РГК достоверно не зависела от РЭФР и ЭФР, однако отмечена тенденция к более редкому обнаружению РГК в РЭФР+ и в ЭФР" опухолях больных ОС.

Клиническое значение исследования РЭФР, ЭФР и РГК в остсогенной саркоме

Отдалённые результаты лечения были оценены у 43 больных ОС. Был проведён сравнительный анализ обшей и безрецидивной (до наступления местного рецидива или появления метастазов) выживаемости больных ОС в зависимости от экспрессии РГК, РЭФР и ЭФР в опухоли.

В общей группе больных нам не представилось возможным оценить влияние РЭФР на общую выживаемость при границе рецепторположи-тельности равной 10 фмоль/мг белка, в связи с недостаточным количеством РЭФР" опухолей; при условной границе рецепторположитсльности равной 30 фмоль/мг белка достоверного различия сроков общей выживаемости между больными с РЭФР" и РЭФР' опухолями обнаружено не было (р--0.46).

Достоверного влияния экспресии РЭФР на безрецидивную выживаемость при границах рецепторположительности 10 и 30 фмоль/мг белка также не было обнаружено (р>0.05).

При оценке влияния уровня РЭФР на прогноз безрецидивной выживаемости нам удалось разделить всех пациентов на 3 группы: па рецепто-ротрицательных, на больных с экспрессией РЭФР в ОС в пределах от 10 до 150 фмоль/мг белка и больных с экспрессией РЭФР более 150 фмоль/мг белка.

Безрецидивная выживаемость больных остеогенной в зависимости от уровня РЭФР в опухоли

1201------.-

100'

-9

о

О 300 600 900 1200 '1500

рэфр>150фмоль/мг рэфр<10 фмоль\мг 10<рэфр<150 фмоль\м

Дни - время наблюдении 42 больных

График 1

-достоверность различия безрецидивной выживаемости мр исду пациентами с

РЭФ1Т опухолями и с концентрацией РЭФР >150 фмоль/мг белка: р=0.404; -достоверность различия безрецидивной выживаемости между пациентами с РЭФР опухолями и с концентрацией 10 < РЭФР < 150 фмоль/мг белка: р=0.036;

-достоверностьразличия выживаемости между пациентами с концентрацией РЭФР в опухолях>150 фмоль/мг и 10 <РЭФР < 150 фмоль/мг белка: р-0.016;

Была обнаружена статистически достоверная лучшая безрецидивная выживаемость больных с экспрессией РЭФР более 150 фмоль/мг белка и больных, опухоли которых не имели РЭФР, по сравнению с пациентами с концентрацией РЭФР в опухолях от 10 до 150 фмоль/мг белка (график 1).

Влияние уровня РЭФР на безрецидивную выживаемость было особенно выражено в группе пациентов в возрасте до 18 лет (график 2). Таким образом, экспрессия 10<РЭФР<150 фмоль/мг белка является прогностически неблагоприятной. Концентрация РЭФР в опухолях, превышающая 150 фмоль/мг белка, не ухудшает прогноз больных ОС.

Безрецидивная выживаемость больных остеогенной саркомой в зависимости от уровня РЭФР в опухолях возрастная группа: 13-18 лет

120 100' 80 60 40 20 0

300

600

900

1200

1S00

рэфр>150фмоль/мг рэфр-

10<рэфр<150фмоль/мг

время, дни

28 больных

График 2

-достоверность различия, безрецидивной выживаемости между пациентами с РЭФР опухолями и концентрацией РЭФР > 150 фмоль/мг белка: р=0.283; -остоверностъ различия безрецидивной выживаемости между пациентами с РЭФР опухолями и концентрацией 10 < РЭФР < 150 фмоль/мг белка: р=0.020;

-достоверность различия безрецидивной выживаемости между пациентами с концентрацией РЭФР в опухолях > 150 фмоль/мг и 10 < РЭФР < 150 фмоль/мг белка: 0.0004;

При оценке прогностического значения экспрессии ЭФР в общей группе больных, независимо от полученного лечения, удалось проанализировать общую выживаемость больных при концентрации ЭФР в опухоли более 250 пг/мг ДНК (график 3).

Экспрессия ЭФР в опухолях больных ОС не влияла на их безрецидивную выживаемость (р>0.05). Напротив, наличие в опухоли ЭФР было статистически достоверным благоприятным прогностическим признаком для прогноза общей выживаемости больных ОС (график 3).

При анализе общей группы больных ОС было установлено, что наличие в опухолях РГК благоприятно влияет на продолжительность безрецидивной и общей выживаемости (график 4 а,б).

Общая выживаемость больных остеогенной саркомой в зависимости от наличия ЭФР-подобных пептидов в опухоли

80

о 60

40

20

300

\ \ р=0.043

\ \ -0——» • эфр+

600

900

время, дни

35 бальных, рп>250

1200 1500 ЭФР"

График 3

Наибольшее прогностическое значение этот показатель имел у больных ОС с протяженностью опухолевого процесса по КМК более 10 см. В этой группе больных представилось возможным проанализировать показатели как безрецидивной, так и общей выживаемости: больные с РГЮ опухолями выживали достоверно лучше по сравнению с больными, в опухолях которых РГК не выявлялись (график 5а,б).

При оценке клинического значения РГК в опухоли больные ОС были разделены на три условные группы в зависимости от уровня экспрессии РГК (РГК", РГК>50 и 10<РГК<50 фмоль/мг белка). Во всех рассмотренных группах больных ОС наиболее благоприятной по показателю безрецидивной выживаемости оказалась группа пациентов с концентрацией РГК от 10 до 50 фмоль/мг белка (график 6). Этот фенотип встречался релсе в опухолях больных женского пола (21,4%), при мелкоклеточном варианте ОС (25,0%), у больных старшей возрастной группы (28,6%), в РЭФР+ опухолях (33,3%).

Общая выживаемость больных остеогенной саркомой в зависимости от наличия РГК в опухоли

р=0.013

300

600 время, ДШ1

40 больных

900

1200

1500

ркг+ ргк-

Безрецидивная выживаемость больных остеогенной саркомой в зависимости от наличия РГК в опухоли

120

р=0.002

300

600 время, дни

39 больных

900

1200

1500

ргк+ ркг-

График 4 а, б

Общая выживаемость больных остеогенной саркомой в зависимости

от наличия РГК в опухоли больные с протяженностью опухоли по костномозговому более 10 см

О 300 600 900 1200 1500 Ргк"

время, дни

23 больных

Безрецидивная выживаемость больных остеогенной саркомой в зависимости от наличия в опухоли РГК больные с протяженностью опухолевого процесса по костномозговому каналу более 10 сантиметров

время, дни

22 больных

График 5 а,б

При анализе одновременной экспрессии РЭФР, ЭФР-подобных пептидов и РГК были обнаружены все 8 возможных фенотипов, причём наиболее часто встречались опухоли с одновременной экспрессией всех трёх исследуемых показателей (21,6%).

Анализируя полученные результаты, можно предположить, что изменение нормального фенотипа РГК+, характерного для нетрансформиро-ванных остеобластов может проходить с полной потерей РГК или с увеличением уровня экспрессии РГК. При этом наиболее неблагоприятным событием является полная потеря РГК.

При сравнительном анализе безрецидивной выживаемости больных ОС мелкоклеточным, остеобластическим и анаплазированным вариантами было установлено, что метастазы и местный рецидив у больных мелкоклеточным вариантом наступали достоверно раньше по сравнению с больными, опухоли которых относились к двум другим гистологическим вариантам ОС (р=0.036 и р=0.020, соответственно). Возможно, это определяется следующими факторами: экспрессия РГК и ЭФР- благоприятных факторов прогноза, а также сочетание ЭФР+РГК* в опухолях мелкоклеточного варианта ОС встречались более редко, чем в остеобластическом и анаплазированном.

Безрецидивная выживаемость больных остеогенной саркомой в зависимости от уровня РГК в опухоли

120

100%

время, дни

44 больных

ргк>50фмоль/мг ргк-

10<ргк<50фмоль/мг

График 6

- достоверность различия безрецидивной выживаемости между пациентами с

РПС опухолями и концентрацией РГК > 50 фмоль/мг белка: р=0.112;

- достоверность различия безрецидивной выживаемости между пациентами с

РПС опухолями и концентрацией 10 < РГК < 50 фмоль/мг белка: р=0.0004;

- достоверность различия безрецидивной выживаемости между пациентами с

концентрацией РГК в опухолях > 50 фмоль/мг и 10 < РГК < 50 фмоль/мг белка: р=0.055.

ВЫВОДЫ

1. Рецепторы эпидермального фактора роста выявлены в мембранной фракции опухолей у 68,1% обследованных больных остеогенной саркомой; уровни РЭФР колебались в широких пределах от 10,0 до 605,0 фмоль/мг белка, их средний уровень составил 178,5+28,3 фмоль /мг белка.

2. ЭФР-подобные пептиды выявляются в опухолях больных остеогенной саркомой с частотой 66,7%, уровни ЭФР-подобных пептидов в опухолях колебались в широких пределах от 28,9 до 12703,2 пг/мг ДНК, их средний уровень составил 2356,4+687,0 пг/мг ДНК.

3. Рецепторы глюкокортикоидов в цитозоле опухолей у больных остеогенной саркомой определяются с частотой 54,5%; концентрации РГК в опухолях колебались от 12,4 до 364,8 фмоль/мг белка, их средний уровень составил 60,8+15,5 фмоль/мг белка.

4. При анализе общей выживаемости больных остеогенной саркомой удалось установить, что больные, в опухолях которых определялись ЭФР-подобные пептиды, а также рецепторы глюкокортикоидов, особенно, если концентрация последних не превышала 50 фмоль/мг белка, выживали достоверно лучше.

5. При анализе безрецидивной выживаемости больных остеогенной саркомой наиболее неблагоприятный прогноз был отмечен у больных, в опухолях которых отсутствовали рецепторы глюкокортикоидов или определялись рецепторы эпидермального фактора роста в концентрации от 10 до 150 фмоль/мг белка.

6. При сравнении показателей безрецидивной выживаемости больных остеогенной саркомой в зависимости от гистологического варианта опухоли хуже всего выживали больные мелкоклеточным вариантом остеогенной саркомы по сравнению с остеобластическим и анаплази-рованным вариантами. Это сочеталось с более редким определением в опухолях мелкоклеточного варианта рецепторов глюкокортикоидов и ЭФР-подобных пептидов.

7. Обнаружение рецепторов эпидермального фактора роста, его лигандов и рецепторов глюкокортикоидов в опухолях больных остеогетшой саркомой, а таюке результаты оценки их клинического значения позволяют рассматривать вышеназванные показатели как дополнительные прогностические факторы, а, возможно, также подходить к лечению больных остеогенной саркомой с учётом фенотипа опухолей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gershtein E.S., Radtchenko A.A., Kushlinsky N.E. Epidermal Growth Factor Receptor and its Ligands Expression in Human Tumors // 16 International Cancer Congress, New Deli, India, 30 October- 5 November 1994.-p.359.

2. Kushlinsky N.E., Gershtein E.S., Kostyleva O.I., Radtchenko A.A. Evaluation of epidermal growth factor receptors in human tumors as a possible basis for new treatment modalities // Fifth International Congress on AntiCancer Chemotherapy. Paris, France, Jan.31st - Feb.3rd, 1995. - p.712.

3. Кушлинский H.E., Костылева О.И., Радченко А.А., Герштейн E.C., Макрецов H.A., Алиев М.Д. Рецепторы эпидермального фактора роста, эстрогенов и глюкокортикоидов в первичных опухолях костей // Вестник ОНЦ РАМН. - 1996. - N. 1. - с.20-26.

4. Kostyleva О., Kushlinsky N., Gershtein Е., Makretsov N., Radtchenko A., Aliev M. The study of epidermal growth factor receptors in osteosarcoma: correlation with other clinico-pathologic factors // 2-nd Osteosarcoma research conference., Bologna, Italy, November 19-22, 1996. - p.204.

5. Кушлинский H.E., Костылева О.И., Радченко A.A.., Герштейн E.C., Макрецов Н.А., Алиев М.Д.; Рецепторы эпидермального фактора роста и эстрогенов в первичных опухолях костей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1996. - N.7. - с.78-82.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА -бычий сывороточный альбумин

ГК -ГЛЮКОКОрТИКОИДЫ

кмк -костномозговой канал

ОС -остсогенная саркома

РЛ -рецепторы андрогенов

РА* -содержащий РА

РА" -не содержащий РА

РГК -рецепторы глюкокортикоидов

РОГ -содержащий РГК

РГК" -не содержащий РГК

РЭ -рецепторы эстрогенов

РЭГ -содержащий РЭ

РЭ' -ire содержащий РЭ

РЭФР -рецепторы эпидермального фактора роста

РЭФР+ -содержащий РЭФР

РЭФР" -не содержащий РЭФР

ТФР-а -трансформирующий фактор роста а

ЭФР -эпидермальный фактор роста, ЭФР-подобныс пептиды

ЭФР+ -содержащий ЭФР

ЭФР' - не содержащий ЭФР