Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Метаболические закономерности развития дизадаптационных синдромов в раннем постнатальном онтогенезе

На правах рукописи

Попова Алла Симоновна

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗВИТИЯ ДИЗАДАПТАЦИОННЫХ СИНДРОМОВ В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

(экспериментально-клиническое исследование) 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

17 АПР 2014

Иркутск - 2014

005547114

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор

доктор биологических наук, профессор

Колесникова Любовь Ильинична Цейликман Вадим Эдуардович

Официальные оппоненты:

Корьтов Леонид Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор (Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры нормальной физиологии).

Пивоваров Юрий Иванович, доктор медицинских наук, профессор (Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, ведущий научный сотрудник научного отдела коронарного атеросклероза).

Львовская Елена Ивановна, доктор медицинских наук, профессор (Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный университет физической культуры» Министерства спорта Российской Федерации, заведующая кафедрой биохимии).

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «25» июня 2014 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003, г.Иркутск, ул.Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.nzmedek.ru Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

/У

Автореферат разослан « ' » ¿7 (¿¿ьеЛ2014 г.

Ученый секретарь

диссертациошюго совета,

доктор медицинских наук,

профессор Шолохов Леонид Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Охрана здоровья матери и ребенка - приоритетное направление Российского здравоохранения (Колесников СМ. с соавт., 2005; Стародубов В.И. с соавт., 2009). Успехи в его решении во многом связаны со снижением заболеваемости и смертности, особенно в раннем постнатальном периоде. Проблеме раннего постнатапьного периода в последние годы уделяется мало внимания. Многие вопросы, связанные с данной тематикой, освещены недостаточно, несмотря на большое число исследований (Червакова Т.В., Тохиян А.А., 2000; Фролова О.Г. с соавт., 2005). До 70% инвалидности с детства - результат патологии перинатального периода (Барашнев Ю.А., 2000; Барашнев Ю.А. с соавт., 2007).

Первой критической фазой постнатального развития является акт родов и период ранней адаптации новорожденного к условиям самостоятельного существования (Дементьева Г.М., Вельтищев Ю.Е., 2003). Переход на внеутробное существование является серьезным испытанием зрелости всех функциональных систем новорожденного. Поэтому вопросам адаптации новорожденных в последние годы уделяется большое внимание (Стрижаков О.Н. с соавт., 2006; Нароган М.В., 2007; Чернышев В.Н. с соавт., 2008). В родах ребенок испытывает нарастающую гипоксию. Для него радикально меняются условия жизни по сравнению с теми, в которых он развивался, что сопровождается изменениями практически во всех органах и системах организма. Эти «перестройки» заложены генетически, но все же требуется определенное время, чтобы малыш приспособился к внешним условиям.

Состояния, отражающие процесс адаптации к новым условиям жизни, называют переходными (пограничными) состояниями новорожденных. Для этих состояний характерно то, что они появляются в родах или сразу после рождения и затем проходят. Пограничными эти состояния называют потому, что, обычно физиологичные для новорожденных, они при определенных условиях могут принимать патологические черты. Транзиторных состояний довольно много, т.к. каждая функциональная система адаптируется к новым условиям по-своему. Есть переходные состояния, которые наблюдаются у всех новорожденных, а есть такие, которые встречаются не всегда и часто связаны с нарушением процессов адаптации. Это токсическая эритема, кровоизлияния в кожу, синдром срыгивания и руминации, болевой синдром, синдром угнетения, синдром гипервозбудимости, кардио-респираторная депрессия (КРД). Переходу пограничных состояний в патологию нередко способствуют самые разные причины; неблагоприятное течение беременности и родов, стрессовые условия после рождения.

В настоящее время есть единичные работы, в которых пытаются дать объяснение появления тех или иных синдромов. Так, Brunton P.J. et al. (2008), исходя из результатов экспериментальных исследований, предполагают, что ранние события в жизни животного могут определяться состоянием повышенной реактивности в стрессовых ситуациях. Они объясняют это изменениями в чувствительности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы к регулирующим сигналам со стороны стрессорных гормонов и цитокинов во время беременности. Шаляпина В.Г. с соавт. (2001), Н.Э.Ордян и С.Г.Пивина (2002, 2003, 2004), Bergman К .et al. (2010), Дюжикова Н.А. с соавт. (2011), O'Donnell K.J. et al. (2012), Ордян Н.Э. с соавт.(2013) также указывают на нарушение процессов адаптации после перенесенного стресса в антенатальном онтогенезе у животных. Однако, работы, проведенные на животных, нуждаются в экстраполяции полученных данных на человека, т.е. требуют клинических исследований.

В условиях гипоксии, сопровождающей переходные состояния новорожденных, необходима одновременная регуляция большого количества метаболических процессов, практически любой из которых, прямо или опосредовано, регулируется глюкокортикоидами (Sapolsky R.M. et al., 2000). Известно, что длительное воздействие патологического фактора приводит к угнетению функции коры надпочечников и

снижению адаптивных возможностей организма новорожденного. К настоящему времени отсутствуют работы, в которых определение уровня кортизола в пуповинной крови сопоставлялось бы в дальнейшем с развитием конкретного состояния дизадаптации у новорождеш1ых. Между тем, использование такого подхода представляется перспективным для объективной оценки и прогноза адаптационных процессов. Много работ о влиянии различных факторов внешней и внутренней среды на плод (Любьшцев К.С. с соавт., 1971; Пигалов А.Т., 1987; Савельева Г.М., Панина О.Б., 2005), однако эти работы касаются органических нарушений со стороны органов и систем ребенка. Взаимосвязи этих влияний и особенностей ранней адаптации с развитием синдромов дизадаптации новорожденных не освещаются.

Не все исследования можно провести на детях. Для выяснения механизмов развития дизадаптационных синдромов в нашей работе мы использовали «модельных» животных, на которых, в той или иной степени, можно воспроизвести особенности раннего постнатального периода у новорожденных детей. Всегда возникает вопрос о возможности экстраполяции полученных результатов на человеческую популяцию. Наиболее подходят в этом отношении свиньи. Процесс родов у свиней является естественной моделью интранатальной гипоксии, т. к. у них наблюдаются затяжные опоросы (Lederer R. et al., 1991). Крупицкой Л.И. (1988) была показана идентичность нарушений в гемопоэзе при интранатальной гипоксии, прослеженной на свиньях, и ранней постнатальной гипоксии на крысах двух линий.

Указанные обстоятельства легли в основу выбора нами для экспериментов с новорожденными животными крыс, которые по ряду своих биологических свойств удовлетворительно отвечают поставленным нами научным задачам.

Исходя из наблюдений, что почти в каждом помете рождаются животные с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами, их выделили в отдельную опытную группу. Отклонения в формировании данных рефлексов могут быть результатом либо общей задержки развития ЦНС, либо стойких повреждений отделов мозга, контролирующих данные формы поведения.

В связи с вышеописанным считаем, что представленные модели (ранняя постнатальная гипоксия и животные с нарушенными СДР) являются валидными для их использования и переноса полученных данных на новорожденных детей.

Валидность представленных моделей для экстраполяции результатов на новорожденных детей обусловлена и тем фактом, что нарушение сенсорно-двигательных рефлексов у крыс являются хорошей моделью -развития перинатальной мозговой депрессии (нервной гиповозбудимости) или перинательной мозговой гипервозбудимосги, т. е. тех синдромов, которые сейчас вошли в МКБ-10.

Нужно отметить, что не все пограничные состояния и не у каждого ребенка переходят грань физиологической адаптации, и поэтому необходимо иметь какие-либо критерии, указывающие на необходимость более пристального внимания к данному новорожденному. На сегодняшний день актуальным является выявление нарушений до появления клинически выраженных признаков болезни (Царегородцев А.Д., Сухоруков B.C., 2006). Все вышесказанное позволило сформулировать цель и задачи исследования.

Цель исследования

Установить метаболические закономерности манифестации дизадаптационных синдромов в экспериментальных условиях и у новорожденных детей для повышения эффективности диагностики и прогнозирования их развития.

Задачи исследования

1. Изучить закономерности метаболизма под влиянием гилоксической гипоксии (5 об.% Ог) у новорожденных крыс линий Август и Вистар.

2. Провести сравнительный анализ течения метаболических процессов у новорожденных крыс чистых линий, родившихся с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами.

3. По концентрации кортизола в пуповинной крови у новорожденных детей провести кластерный анализ множества значений его концентрации (К-теаш) и выявить сочетание определенных синдромов с уровнем глюкокортикоида.

4. Оценить состояние метаболических механизмов у новорожденных детей с разными типами дизадаптационных синдромов, ассоциированных с различным уровнем кортизола.

5. Установить вклад различных обменных процессов в формирование интегральной дизадаптации новорожденных при сочетании асфиксии с другими синдромами.

6. Выявить метаболические факторы, которые могут выступать в качестве предикторов для дифференциального прогнозирования развития дизадаптационного синдрома определенного типа.

Научная новизна

Впервые установлено, что острая гипоксическая гипоксия при нахождении новорожденных крыс линии Август в воздушной среде с низким содержанием кислорода (5 об.% О2) вызывает выраженный окислительный стресс, который через ряд метаболических стадий приводит к гипорегенераториой анемии, обусловленной дисбалансом эритроидных элементов вследствие снижения активности гемсинтезирующих ферментов и активации перекисного гемолиза.

Аналогичные эксперименты с новорожденными крысами линии Вистар, в отличие от животных линии Август, продемонстрировали повышение активности супероксиддисмутазы со снижением активности пероксидазы, что, вероятно, свидетельствует о более высоком уровне антиоксидантной защиты у этой линии. Это подтверждают и полученные результаты о стабильном уровне перекисного гемолиза в этих условиях. Вместе с тем, высокая длительность гексеналового сна у крыс этой линии свидетельствует о снижении активности микросомальной системы печени, что может негативно сказаться на процессах детоксикации метаболитов, появляющихся в процессе гипоксического поражения организма.

Приоритетными являются данные о взаимосвязи нарушения функций центральной нервной системы в виде сенсорно-двигательных расстройств у новорожденных крыс с процессами метаболизма, которые включают: развитие окислительного стресса, цитолитический синдром печени, нарушение синтеза гема и снижение активности микросомальных ферментов деметилазы и р-анилингидроксилазы.

Установлено, что новорожденные дети по исходному уровню кортизола в пуповинной крови делятся на 5 групп, и что для каждой группы характерно появление тех или иных дизадаптационных синдромов или их сочетаний. Такой методологический подход уже в самые ранние сроки после рождения ребенка может прогнозировать возможность появления определенного сочетания дизадаптационных синдромов, опираясь на результаты измерения концентрации глюкокортикоида в крови.

Доказано, что в основе появления и развития дизадаптационных синдромов новорожденных лежит нарушение фундаментальных метаболических механизмов, которые представлены ключевыми ферментами и факторами, обеспечивающими редокс-гомеостаз целостного организма, в частности системой «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита». Эта закономерность справедлива как для моносиндромов дизадаптации, так и для их сочетания.

Впервые выявлена клинически доказанная возможность прогнозирования появления и развития дизадаптационных синдромов путем определения в крови новорожденных, наряду с содержанием кортизола, концентрации серотонина и

активности некоторых ферментов, генерирующих активные формы кислорода или защищающих от их негативных эффектов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты проведенной работы позволяют расширить представления о фундаментальных аспектах течения адаптивных и дизадаптивных реакций животного организма и человека, в частности в такой критический период его онтогенеза как период ранней новорожденности. Совокупность экспериментальных и клинических данных, полученных в настоящей диссертационной работе, позволила разработать новые диагностические и прогностические подходы, которые повышают эффективность ведения новорожденных в ранний период онтогенеза. Кроме того, автором предложен новый методический прием на уровне патента РФ, который позволяет существенно повысить чувствительность и упростить способ определения активности ксантиноксидазы крови, которая является одним из наиболее активных источников пероксида водорода, сдвигающим редокс-статус организма в прооксидантную сторону.

Теоретическая и практическая значимость исследования подтверждается грантом Челябинской области, финансировавшим разработку инновационных тест - систем для диагностики патологий у новорожденных. Итогом выполнения заданий по этому гранту явилось внедрение в практику отделений новорожденных родильных домов биохимического мониторинга с целью прогнозирования развития процессов адаптации.

Работа проводилась в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013гг, в рамках мероприятия 1.3.1. Программы, грантом РФФИ № 11-04-01378-а и ГК № 2012055-Г316 ГК № 2012055-Г316, а также ГК№ 2012055-Г316 и ГК №2014/252 в рамках государственного задания на выполнение работ в сфере научной деятельности.

Основные положения диссертации используются при чтении лекций на кафедре биохимии для педиатрического факультета и по неонатологии Южно-Уральского государственного медицинского университета (г. Челябинск).

Методология и методы исследования

Работа включает экспериментальный и клинический разделы.

Экспериментальный раздел работы выполнен на крысятах двух линий периода новорожденности - Вистар (п = 959) и Август (п=1012). Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (Strasbourg, 1986). Для моделирования изучаемых состояний применялась модель интранатальной гипоксии (Speiser Z. et al., 1983; Шпайзер 3. с соавт., 1983).

В цельной крови животных и плазме, полученной из нее, определяли маркеры окислительного стресса, активность антиоксидантных ферментов, маркеры функции печени, содержание липидов (общие липиды), свободного гемоглобина плазмы, количество эритроцитов и гемоглобина, перекисную резистентность эритроцитов. В ткани печени определяли ферменты второй фазы детоксикации ксенобиотиков. Кроме того, прижизненно определяли состояние цитохрома Р450 по гексеналовой пробе. В печени и костном мозге определяли активность гемсинтезирующих ферментов - АЛК-синтазы, AJIK-дегидратазы и феррохелатазы. Подсчитывали парциальную миелограмму с вычислением индексов созревания. В легких определяли состояние сурфактантной системы по коэффициенту стабильности. Поведенческие реакции животных изучались по становлению сенсорно-двигательных рефлексов и с использованием актографа «открытое поле».

В клиническом разделе работы обследовано 2930 новорожденных (с диагнозом «здоров» и с различными синдромами дизадаптации). Для биохимического исследования

проводили взятие пуповинной крови в пробирку в объеме 10 мл со стабилизатором (гепарин) сразу после рождения плода и пересечения пуповины, до отделения плаценты. Наблюдали за новорожденными до выписки или до перевода в другие отделения и фиксировали его состояние в раннем постнатальном периоде. В цельной крови и плазме, полученной из нее, определяли маркеры окислительного стресса, активность антиоксидантных ферментов, содержание кортизола, серотонина и гисгамина, маркеры состояния печени, содержание глюкозы, общих липидов, общего белка, магния, тропошша I. В эритроцитах определяли содержание глутатиона, активность глутатионтрансферазы, в лейкоцитах - активность миелопероксидазы и сукцинатдегидрогеназы, в тромбоцитах - активность моноаминоксидазы (МАО).

Положения, выносимые на защиту:

1. Ответ организма экспериментальных животных на интранатальную и раннюю постнатальную гипоксию зависит от стратегии адаптации на действие чрезвычайных факторов и отражает основные черты течения гипоксических поражений у новорожденных детей.

2. Метаболический и системный ответы новорожденных животных с нарушенными сенсорно-двигательными расстройствами соответствуют таковым при дизадаптационных синдромах новорожденных детей, обусловленных нарушением функций ЦНС.

3. Характер метаболической реакции при возникновении дизадаптационных моно- и дисиндромов у новорожденных детей связан с глюкокортикоидной регуляцией.

4. Концентрация серотонина и активность ферментов редокс-метаболизма являются предикторами развития дизадаптационных синдромов определенного типа у новорожденных детей.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.

Степень достоверности полученных результатов диссертации подтверждается их теоретическим анализом, личным участием автора во всех экспериментах, проведенных с помощью современных методик, использованием сертифицированного оборудования и реактивов, актами внедрения результатов работы в учебный процесс, получением патента и внедрением в работу практического здравоохранения, проверкой первичной документации, статистической обработкой полученных данных и публикацией материалов диссертации в статьях и докладах на научных конференциях.

Основные положения работы изложены и представлены на Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И.Лифшица, «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); I конгрессе акушеров-гинекологов Урала с международным участием «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2009); конгрессе терапевтов «УРАЛ-2009» к 100-летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2009); IV Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию Управления здравоохранения Администрации г. Челябинска, «Современные медицинские технологии в здравоохранении» (Челябинск, 2012); V Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2013).

В диссертации представлены результаты исследований, выполненных при личном участии автора на кафедре биохимии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государствишый медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Клинический материал набирался лично автором в родильном отделении

муниципального бюджетного учреждения здравоохранения городской клинической больнице №6 г. Челябинска. Кроме того, личный вклад автора в настоящую работу состоит в постановке целей и задач, планировании экспериментов, анализе клинического материала, обработке, анализе, обобщении полученных результатов, а также в написании журнальных статей и оформлении текста докторской диссертации.

Публикации

Соискатель имеет 43 опубликованные работы, из них по теме диссертации опубликовано 26 научных работ общим объемом 1,7 печатных листа, в том числе 18 статей в научных журналах и изданиях для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателю выдан патент на изобретение № 2488120 «Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции». Приоритет изобретения 30 декабря 2011г. Зарегистрировано 20 июля 2013 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 283 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 597 источников: 406 на русском языке и 191 на иностранном. Работа содержит 72 таблицы, 96 рисунков, 1 приложение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена на кафедре биохимии ЮжноУральского медицинского университета в период 2007-2012 гг. Животные содержались в виварии, который соответствовал всем требованиям, предъявляемым к структурам подобного типа (содержание, кормление животных, соблюдение ветеринарных правил). Работы с экспериментальными животными (крысы чистых линий Вистар и Август) проводились в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации процедур с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Strasbourg, 1986). Для подтверждения генетических различий между двумя линиями крыс проведено тестирование животных по адаптации к максимальной респираторной и циркуляторной нагрузкам. Интранатальная гипоксия воспроизводилась на модели ранней постнатальной гипоксии. Животных сразу после рождения помещали в камеру, содержащую 95% азота и 5% кислорода. Исходя из того, что почти в каждом помете рождаются животные с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами (СДР), их выделяли в отдельные подопытные группы, которые служили моделью расстройств ЦНС в постнатальный период у новорожденных детей. Период новорожденности у крыс составляет 3-5 суток. Всего в работе было использовано 959 крысят линии Вистар и 1012 крысят линии Август, которые при проведении экспериментов были разделены по времени после родов на 4 группы (15-30 мин; 1 день, 3 дня и 14 дней), на две серии с гипоксическим воздействием и две группы с нарушением СДР. Подопытные группы и контрольные серии были сопоставимы по численности.

Обследование новорожденных детей было проведено в 7 этапов на базе МБУЗ ГКБ № 6 г. Челябинска. Для исследования использовали пуповинную кровь, взятую сразу после перерезки пуповины, со стабилизатором. Для получения плазмы кровь центрифугировали и плазму замораживали. Если показатели рассчитывались на клетку, то их подсчет проводили в свежей крови (эритроциты) или в плазме, обогащенной лейкоцитами, в течение 10-12 часов после забора крови. На каждого ребенка заполнялась учетная карта. Обследование проводилось «слепым методом». Всего обследовано 2930 новорожденных. Углубленному анализу подверглись новорожденные дети, у которых

были выявлены синдромы дизадаптации: единичные (моносиидромы) или в сочетании с асфиксией (дисиндромы). Из статистической обработки исключили детей с синдромом ЗВУР, с моносиндромами с Апгар менее 7 баллов (за исключением детей с КРД, у которых показатель по шкале Апгар сразу после рождения 6), с асфиксией с Апгар менее 4 баллов, с дисиндромами без асфиксии, недоношенных, с гемолитическим конфликтом, родовой травмой, врожденными пороками, при наличии более 2-х синдромов дизадаптации, от многоплодных беременностей. Таким образом, всего проанализировано 2930 историй родов и новорожденных, в статистическую обработку вошли 1240 историй родов и новорожденных.

Дизайн исследования представлен в общем виде на рисунке 1.

Эксперимеиталыю-лабораторпые методы исследования

В экспериментальных группах у новорожденных животных определяли массу, смертность, сенсорно-двигательные рефлексы, состояние процессов ПОЛ, состояние эритрона и некоторые биохимические показатели. Исследование проводилось через 15-30 минут после рождения, на 1, 3 сутки жизни. Двигательную активность и координацию определяли на 14 сутки только у животных с постнатальной гипоксией, т.к. животные с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами до 14 дней не доживали.

Для оценки становления безусловно-рефлекторной деятельности у животных определяли рефлекс сцепления, рефлекс переворачивания и число спонтанных мышечных подергиваний сразу после рождения, в 1-е и 3-й сутки. На 14 сутки определяли двигательную активность общепринятым методом «открытое поле».

Определение гематологических показателей и подсчет парциальной эритрограммы проводилось общепринятыми методами, а суточную продукцию эритроцитов и их суточный гемолиз проводили по методике Мосяшной Е.И. (1962). Неэффективный эритропоэз оценивался по проценту ШИК-положительных эритробластов (Хейхоу Ф„ Кваглино Д.,1983).

Форму эритроцитов и подсчет процента каждой группы клегок определяли в световом микроскопе после фиксации клеток глутаровым альдегидом. Параллельно определяли индекс трансформации (ИТ) и показатель компенсаторной трансформации (ПКТ), которые отражают соотношения разных форм эритроцитов и их модификаций.

О синтезе гема в костном мозге и печени судили по активности синтазы 8-аминолевулиновой кислоты (АЛК-синтаза) (Aoki Y. et al.,1973), дегидратазы АЛК (Павловская Н.А. с соавт., 1981), феррохелатазы (Bottomly S.,1968). Данные ферменты определяли с целью выявления взаимоотношений в синтезе гемсинтезирующих ферментов костного мозга и микросомальных ферментов.

Прижизненную оценку активности микросомального окисления проводили биологической пробой по продолжительности гексеналового сна (изоформа CYP 2В1/2), Гексенал вводили внутрибрюшинно в виде 5% водного раствора из расчета 15 мг на га-массы, а длительность сна оценивали по времени нахождения животных в боковом положении.

В ткани печени определяли активность ферментов микросомального окисления по скорости деметилирования N-диметиланилина (изоформа цитохрома Р450 - CYP2E) и р-анилингидроксилазной активности (изоформа цитохрома Р450 - CYP2E1) (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977).

Маркеры цитолиза печени, гистидазу и 5-нуклеотидазу определяли соответствешш по Таболину В.А. с соавт. (1977) и Мансуровой И.Д, Стосман Р.З. (1973). Определение активности гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) проводили на финском анализаторе Labsistem ФП-901 М. Тимоловую пробу, содержание общего белка и глюкозы в плазме крови определяли общепринятыми методами. Содержание общих липидов измеряли колориметрически фосфованилиновым методом.

Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по Волчегорскому И.А. с соавт. (2000, 2003). Определение проводили в гептановой и изопропанольной фазах по отдельности. Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.): Е232/Е220 - относительное содержание диеновых коньюгатов (ДК) и Е278/Е220 - уровень кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ). Диеновые коньюгаты в эксперименте определяли по Плацеру (2004) и рассчитывали на единицу массы липидов. Проведено также параллельное определение первичных и вторичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фазе при индукции аскорбат - зависимого ПОЛ (Львовская Е.И, 1998). Концентрацию ТБК-активных продуктов (на мг липидов) определяли по общепринятой методике с тиобарбитуровой кислотой (Камышников B.C., 2004). Содержание оснований Шиффа определялось методом Львовской Е.И. с соавт. (1991).

Сурфактант легких в эксперименте определяли микроскопическим методом Pattie (Овчинин А.Ф., 1974) с вычислением коэффициента стабильности.

Концентрацию свободного гемоглобина плазмы и показатель перекисной резистентности измеряли общепринятым методом.

Определение окислительной модификации белков (ОМБ) проводили по методу, описанному Вьюшиной В.В. с соавт. (2002). Параллельно определяли процент сохранности белков, индуцируя их окисление in vitro Fe

Активность фосфолипазы А2 определяли по методу Тужилина С.А. и Салуэнья А.И. (1975), заменив яичный желток чистым лецитином.

Концентрацию кортизола определяли в сыворотке пуповинной крови сразу после рождения с помощью набора «КОРТИЗОЛ - ИФА - БЕСТ» (Вектор - Бест, Россия).

Содержание биогенных аминов (гистамин и серотонин) определяли флюоромегрическим методом с использованием о - фталевого диальдегида в качестве флюорофора (Каракулова Ю.В., Шутов A.A., 2006; Камышников B.C., 2007).

Определение МАО-Б (КФ 1.4.3.4.) в тромбоцитах проводили в модификации, описанной Волчегорским И.А. с соавт. (2000), с использованием в качестве субстрата бензиламина. Активность фермента выражали в нмоль продукта на мл тромбоцитов.

Активность ксантиноксидазы (ХО) (КФ 1.2.3.2.) определяли по методу, описанному Hashimoto в модификации Beckman J.S. (1974). Данная методика очень информативна, однако трудна для использования в клинике. С этой целью нами был предложен способ ее определения с помощью композиции реактивов и получен патент РФ № 2488120. В отличие от аналога, из реагентной композиции исключен оксонат калия, предназначенный для ингибирования уриказы - фермента, содержащегося в тканях некоторых животных и препятствующего накоплению продукта ксантиноксидазной реакции - мочевой кислоты. В тканях человека (в том числе и в крови) данный фермент не содержится, поэтому нет необходимости включать в состав реагентной смеси ее ингибитор (оксонат калия). Кроме того, наличие оксоната калия в реагентной смеси сделает невозможным регистрацию продукта при помощи стандартного уриказного метода.

Концентрацию витамина Е определяли по защите этим антиоксидантом двойных связей в ненасыщенных жирных кислотах (Меньшикова Е.Б. с соавт., 2006). Активность супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1.) определяли методом, описанным Дубининой Е.Е. с соавт. (1983). Содержание церулоплазмина (ЦП, оксидоредуктаза (КФ 1.16.3.1.)) измеряли по методу Равина с р-фенилендиамином (Камышников B.C., 2004). Активность каталазы (КФ. 1.11.1.6) определялась по методу Королюк М.А.(2002). Активность глутатионпероксидазы (ГП) (КФ 1.11.1.9.) и глутатионтрансферазы (глутатион S-трансферазы КФ 2.5.1.18) (ГТ) определяли в эритроцитах по методам, описанным Власовой С.Н с соавт. (1990). Концентрацию глутатиона определяли с помощью набора реактивов фирмы CALBIOCHEM Glutathione. Определение миелопероксидазы (КФ 1.11.1.7) проводили модифицированным методом Симакова П.В. (1971).

Аденозинтрифосфатазы (КФ 3.6.3.9): Ыа+,К+-АТФазу, Са2*-АТФазу, Mg^-АТФазу по методу Федотова Э.А. (1984).

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1) определяли в суспензии клеток белой крови по методике, описанной Гершанович В.Н. с соавт. (1961).

Тропонин I, белок сердечной мышцы, определяли с помощью тест-кассеты ACON Biotech Со,Ltd (номер по каталогу СТ1-402).

Магний сыворотки определяли с использованием набора реактивов фирмы «Витал Диагностик СПб».

Методы математической обработки

Данные обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и ее стандартной ошибки (ш). Оценка

достоверности различий осуществлялась с помощью параметрических и непараметрических критериев. Для оценки различий средних использовались t-критерий Стьюдента и критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (U) (после проверки изучаемой выборки на нормальность распределения (критерий Шапиро-Уилкса) и равенство дисперсий (критерий Левши)). Статистически достоверными считались различия при р < 0,05 (Зайцев В.М. с соавт., 2003). Для проведения кластерного анализа использован метод К-средних (K-means). Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (Rs). Для обработки результатов исследования использован пакет прикладных программ Statistica 6.0 for Windows.

Результаты собственных исследований

Адаптация животных линий Август и Вистар в норме

Любые роды активируют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Дещекина М.Ф., 1988; Tsukahara Н„ 2006). Активация процессов ПОЛ приводит к изменению содержания липидов сыворотки, ТБК-АП и к изменению содержания первичных продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов (ДК). В то же время изменяется активность антиоксидантной системы. В таблице 1 приведены данные по состоянию процессов ПОЛ и антиоксидантной системы в период новорожденности у крыс линий Август и Вистар в норме.

Таблица 1 - Показатели процессов ПОЛ и ферментативные антиоксиданты у здоровых новорожденных крысят линии Август и Вистар (М±т) _

Возраст/показатели 15-30 мин 1 сутки 3 сутки

Август п=36 11=58 п=62

Вистар п=46 п=5б п=58

Общие липиды, г/л 16,40+1,800 13,40±1,800 12,00+1,000*

2,90+0,220 2,74±0,170 2,68±0,500

Диеновые коньюгаты, 0,24±0,013 0,13±0,008* 0,16±0,007*

ед/г липидов 0,18±0,080 0,22±0,011 0,23±0,015

ТБК-АП, 0,24±0,080 0,52±0,060* 0,48±0,020*

Мкмоль/г липидов 0,36±0,090 0,42±0,050 0,44±0,060

сод, 0,67+0,038 0,74±0,063 0,71 ±0,030

фмоль/с на эритроцит 0,78±0,068 0,84+0,062 0,72±0,044

Каталаза, 56,00±2,400 48,00±3,800 44,00±1,400

фмоль/с на эритроцит 64,00±б,300 58,00±2,800 48,00±1,200*

Пероксидаза, 0,44+0,062 0,64+0,083 1,12±0,560*

пмоль/с на гранулоцит 0,66±0,082** 0,89±0,061** 1,24+0,180*

* р < 0,05 - достоверность по Стьюденту

** р < 0,05 - достоверность по Стьюденту у разных линий_

Таким образом, после рождения у обеих линий крыс наблюдается активация процессов ПОЛ, не ведущая к нарушению адаптации животных. Это подтверждается состоянием нервной системы по сенсорно-двигательным рефлексам, т.к. именно они указывают на адаптивные процессы сразу после рождения; печени по активности гистидазы плазмы крови (рисунок 2), ферментам микросомалыюго окисления (таблица 2), гемсинтезирующим ферментам (рисунок 3). Наблюдается более высокая активность ключевого фермента АЛК-синтазы и низкая активность АЛК-дегидратазы у животных линии Вистар. Активность гемсинтетазы статистически значимо не отличается у этих двух линий.

Активность, мкмоль/л. с

2.10 1.90 1,70 1.60 1,30 1,10

0,90

...........-Т

-Август

---- Вистар

новорожденные (15) 1 - дневные (15) 3 - дневные (14)

Возраст

Рисунок 2 - Активность гистидазы крови крысят в период новорожденности в

норме

Таблица 2 - Активность ферментов микросомального окисления печени крысят в период новорожденности в норме (М±ш)___

Возраст/Показатели Август Вистар 15-30 мин п=20 п=20 1 сутки п=20 п=20 3 сутки п=16 п=16

Деметилаза, нмоль/мг белка / мин 2,790±0,142 4,320±0,123 ** 2,710+0,131 5,220+0,178* ** 2,650+0,149 8,620±0,177* **

р-анилингидроксилаза, нмоль/мг белка /мин 0,096+0,011 0,194±0,008** 0,086±0,009 0,196±0,008 ** 0.083+0,011 0.223+0,003* **

* р < 0,05 - достоверность по Манна-Уитни в одной группе. ** р < 0,05 - достоверность по Манна-Уитни у разных линий

АЛК-синтаза и АЛК - дегидратаза Активность, нмоль/мг белка мин *

0,3 -

0,25 -0,2 0,15 -0,1

; □ АЛК-синтаза

• в АЛК-дегидратаза

Август (16) Вистар (16)

Группы

Гемсинтетаза

■

Активность, пмоль/мг белка/мин

14

13,5 13 12,5 12 11,5 11 10,5 10

Август (16) Вистар (16)

Группа

Рисунок 3 - Активность гемсинтезирующих ферментов печени крысят в норме

Несмотря на сбалансированность процессов ПОЛ, в норме наблюдаются проявления гемолитических процессов. У животных линии Август: перекисный гемолиз статистически достоверно увеличен только в первые сутки и к 3-им суткам возвращается

к исходным цифрам, перекисная резистентность соответственно - 16+0,9 % (и = 20), 25±1,0 %* (п = 20), 16±0,9 % (и = 18), свободный гемоглобин плазмы статистически достоверно увеличивается во время всего периода новорожденности - 3,8±0Д1 мг/л (п = 20), 5,2+0,06* мг/л (п = 20), 8,0±0,11* мг/л (п = 18). У животных линии Вистар: перекисная резистентность постепенно снижается, и к третьим суткам это снижение статистически достоверно - 22±0,6% (п = 20), 21+0,6% (п = 20), 20+0,6* % (п = 18), содержание свободного гемоглобина плазмы в это же время 4,2±0,08 мг/л (п = 20), 4,8±0,08 мг/л (п = 20), 6,3±0,23* мг/л (п = 18), т.е. он постепенно статистически достоверно повышается к 3-им суткам, однако это повышение статистически достоверно ниже, чем у животных линии Август. Известно, что мишеиыо активных кислородных метаболитов является мембрана эритроцитов (Войтенко В.П. , 1984; Мажитова М.В., 2010). На рисунке 4 представлено количественное соотношение между различными формами эритроцитов у крыс линий Август и Вистар в период новорожденности.

Количество дискоцитов у линии Вистар статистически достоверно выше весь период новорожденности, статистически достоверно ниже количество стоматоцитов и сфероцитов. Количество пойкилоцитов у обеих линий одинаково. Индекс трансформации меньше у линии Вистар. Одинаков у обеих линий показатель компенсаторной трансформации, который не изменяется ни на один срок.

Рисунок 4 - Сравнение формы эритроцитов двух линий крыс в норме

Изначально у крыс линии Вистар эритроциты более чувствительны к гемолизу, т.к. перекисный гемолиз у них выше. Из полученных результатов видно, что гемолиз эритроцитов нельзя связать только с активацией перекисного окисления. Существуют и другие причины усиления гемолиза. Эритроциты, образовавшиеся до рождения, не обеспечивают потребности организма после рождения. Ускоренному обновлению состава циркулирующих эритроцитов способствует сочетание повышенного уровня эритропоэза и эритродиереза (Назаров С.Б., 1995). Суточная продукция и суточный гемолиз в норме у крыс разных линий представлены на рисунке 5 и рисунке 6. У разных линий динамика эритропоэза несколько отличается. У животных линии Август суточная продукция статистически достоверно постепенно нарастает. У линии Вистар этого не наблюдается. Гемолиз у линии Август также статистически достоверно нарастает. У линии Вистар гемолиз статистически достоверно нарастает только к 3 суткам. Таким образом, у линии Август увеличены и те и другие процессы, в то время как у линии Вистар суточная продукция не меняется, но увеличивается суточный гемолиз, и он более выражен, что приводит к большему снижению эритроцитов в период новорожденности (рисунок 7).

Суточная продукция

Рисунок 5 - Суточная продукция в норме у разных линий крыс

Рисунок 6 - Суточный гемолиз в норме у разных линий крыс

Рисунок 7 - Эритроциты в период новорожденности у крыс в норме

У животных линии Август гемоглобинизация эритроцитов в период новорожденности не изменяется. У животных линии Вистар к концу периода новорожденности наблюдается снижение гемоглобинизации эритроцитов, у них МСН статистически достоверно уменьшается (рисунок 8).

*8.СЮ <7.00 «,00 ■[ттттгттт МСН _т ..I 1

I-виствр | |

$ й

Возрют 3 диммья*

Рисунок 8 - Гемоглобинизация эритроцитов в период новорожденности у крыс в

норме

За весь период новорожденности у линии Август в норме количество ретикулоцитов постепенно снижается. У линии Вистар наблюдается снижение ретикулоцитов, подобное линии Август, однако к 3 суткам их количество статистически достоверно выше. Это можно объяснить разным темпом созревания эритроцитов (рисунок 9, рисунок 10).

Рисунок 9 - Ретикулоциты по группам зрелости у линии Август в норме

Кривыесозревания эритроцитов линии Вистар

300,00

%250,00 т...........

(,1200,00 г, .

§150,00 —

Ц 100,00

¥ 50,00 -0,00

новорожденные

1 дневные Возраст

3 дневше

---1 гр

----2 гр

Зф - 4 гр

Рисунок 10 - Ретикулоциты по группам зрелости у линии Вистар в норме

Несмотря на более высокие цифры количества ретикулоцитов по группам зрелости у животных линии Август, к концу периода новорожденности темп созревания эритроцитов у них выше.

При изучении костномозгового кроветворения выявлены отличия в системе эритрона у данных линий в период новорожденности. Наблюдается замедление созревания эритробластов к 3 суткам у линии Вистар (рисунок 11, рисунок 12).

У обеих линий имеется постепенное снижение активности гемсинтезирующих ферментов (рисунок 13, рисунок 14), что согласуется с данными Назарова С.Б. (1995) об уменьшении интенсивности эритропоэза сразу после рождения. У линии Вистар падение активности ферментов к 3 суткам более выражено, что согласуется с данными, приведенными выше. Сопоставляя изученные показатели по двум линиям крыс, можно говорить об особенностях периода новорожденности у них. Это заключается в различиях активности процессов ПОЛ, гемсинтезирующих ферментов костного мозга и гемсинтезирующих ферментов печени, что приводит к разной активности микросомапьных ферментов и разному уровню эритропоэза.

Рисунок 11 - Кривые созревания эритробластов у 1 дневных животных в норме

Кривые созревания эритробластов у 3 дневных животных

Рисунок 12 - Кривые созревания эритробластов у 3 дневных животных в норме

О Август АЛКочтмд Шлв/уст ЛЛК-д«гмарвгам ОВиегвр АЛК-симтам О бисгар АЛК-д«1ирвгам

Рисунок 13 - Активность гемсинтезирующих ферментов КМ в период новорожденности у крыс

Активность, нмоль/л.с 0,45 .

0.35 0.30 0,25 020

Гемсинтетаза

ковороадвнныв

Рисунок 14 - Активность гемсинтетазы КМ в период новорожденности у крыс

18

Адаптация животных линий Август и Вистар после ранней постнаталъной гипоксии

Влияние ранней постнаталъной гипоксии на течение периода новорожденное™ у крыс двух линий выявило у крыс линии Август статистически достоверное увеличение смертности в период новорожденное™ и снижение массы к 14 дню по сравнению с контролем (К- 23,4±0,85г, п = 42; Оп- 18,2±0,29* г, п = 35). У крыс линии Вистар смертность в период новорожденное™ не отличалась от контрольной группы. Снижение массы тела у них также наблюдалось только к 14 суткам (К- 31,4±0,24г, п = 35; Оп-23,1±0,56*г, п = 33). Перенесенная дополнительная гипоксия усугубила активацию ПОЛ (таблица 3).

Таблица 3 - Показатели процессов ПОЛ и ферментативные антиоксиданты у животных, перенесших гипоксию (М±т) __1__

Возраст/показатели Август Вистар Контроль 1 сутки Опыт 1 сутки Контроль 3 сутки Опыт 3 сутки

Общие липиды, г/л 13,40± 1,800 2,74+0,170 6,00±0,960* 2,01±0,150 12,00+1,000 2,68±0,500 8,00+1,200* 1,44±0,250*

Диеновые коньюгаты, ед/г липидов 0,13±0,008 0,22±0,011 0,07±0,006 0,14+0,008 0,16±0,007 0,23±0,015 0,11+0,009 0,16+0,011

ТБК-АП, мкмоль/г липидов 0,52+0,060 0,42+0,050 3,70±0,720* 2,80+0,110* 0,48+0,020 0,44±0,060 1,90+0,120* 1,72±0,130*

СОД, Фмоль/с на эритроцит 0,74±0,063 0,84+0,062 0,82±0,027 1,19+0,039* 0,71 ±0,030 0,72±0,044 0,58+0,021* 0,98±0,027*

Каталаза, Фмоль/с на эритроцит 48,00±3,800 58,00+2,800 34,00+1,800* 46,00±3,200 44,00+1,400 48,00±1,200 31,00±2,400* 36,00±1,800*

Пероксидаза, Пмоль/с на гранулоцит 0,64+0,083 0,84±0,061 0,44+0,021* 0,34±0,160* 1,12±0,56 1,24±0,18 0,62+0,028 0,28+0,021*

* р < 0,05 - достоверность по Стьюденту по отношению к контролю

У животных линии Август, перенесших гипоксию, высокий уровень ПОЛ реализуется на фоне отчетливого снижения активное™ антаоксидантных ферментов -СОД и каталазы. У животных линии Вистар, перенесших гипоксию, наблюдается снижение общих липидов сыворотки, которое коррелирует с количеством ДК -0,529543, р - 0,0423), увеличение ТБК-АП, со стороны ферментативных антиоксидантов у них наблюдается разнонаправленность: увеличение актавноста СОД и резкое снижение клеточных антиоксидантов - каталазы и пероксидазы.

Активация процессов ПОЛ должна привести к повреждению клеток различных органов. Очень чувствительны к пероксидации клетки легких, печени, мозга и эритроциты. Изменения со стороны ЦНС у животных выявлены по изменению сенсорно-двигательных рефлексов. Рефлекс сцепления у животных, перенесших гипоксию, отсутствует у 1 и 3 дневных животных. Однако к концу первой недели он восстанавливается. Животные, перенесшие гипоксию, плохо координированы, у них увеличивается время переворачивания. Число спонтанных мышечных подергиваний увеличено.

С целью выяснения возможности остаточных нарушений со стороны ЦНС определялась двигательная активность и координация на 14 сутки (таблица 4). Ввиду большого разброса показателей горизонтальной двигательной активности у линии Вистар провели кластерный анализ (К-теап). Выявлено 2 группы: в первой группе (16 животных) число пробегаемых квадратов 27,7±1,5*, во второй группе (22 животных) -41±1,5*. Это подтверждает, что линия Вистар более разнородная по своему составу, и

горизонтальная двигательная активность статистически достоверно увеличена после гипоксии. Можно сделать заключение, что нарушения со стороны ЦНС остаются у животных до конца периода молочного кормления.

Таблица 4 - Двигательная активность и координация перенесенной гипоксии у крысят (М±ш)

норме и после

Показатели Август Вистар

Горизонтальная активность, Число пробегаемых квадратов Вертикальная активность, количество вертикальных стоек Время движения по полоске, Мин

Контроль п=35 Контроль п=42

17,00+0,120 12,00+1,200

1,14+0,165 1,60±0,180

10,50+0,320 7,20±0,290

Опыт п=33 Опыт п=38

25,00±1,390* 35,80±8,200

4,44+0,246* 3,10±0,690

17,00+1,080* 11,80±0,480*

Число падений с полоски при прохождении до ее конца__

0,36±0,110 0,33±0,140

4,67±0,210* 5,16+0,350*

' р < 0,05 - достоверность по Стьюденту по отношению к контролю.

О реакции печени на гипоксию судили по появлению в крови гистидазы. При исследовании крови животных, перенесших гипоксию, обнаружено значительное увеличение ее активности, что является показателем цитолитического синдрома (рисунок 15).

Гистидам крови Август

■5 6.00 | 5Ю

«(15.14) Эднмиыв(Н.1г)

Гистидаэ» крови Вистар

м

1' 5 «

§ 2 < 15 ---з: *>ч

Но.оро-й.^ь- 1 су™. 3 сутки

Воарест — — —-Комгрога. 1

Рисунок 15 - Активность гистидазы крови крысят в период новорожденное™ в норме и после перенесенной гипоксии

Одновременно выявляется и изменение в процессах микросомапьного окисления (таблица 5).

Таблица 5 - Активность ферментов микросомального окисления в период

Возраст/Показатели 15-30 мин 1 сутки 3 сутки

Август Контроль/ Опыт Вистар Контроль/ Опыт п=20 п=20 п=20 п=20 п=16 п=16 п=16 п=16 п=14 п=14

Деметилаза, Нмоль/мг белка / мин 2,79±0,14 4,32+0,12 2,71+0,13 5,22±0,18 2,44+0,09 2,65±0,15* 2,65±0,15 8,62±0,18 2,01±0,10* 2,70±0,16*

Р-анилингидроксилаза, нмоль/мг белка /мин 0,1 ±0,01 0,19±0,01 0,09±0,01 0,20+0,01 0,06±0,01* 0,09±0,01* 0,08+0,01 0,22±0,01 0,07 ±0,01 * 0,09±0,01*

* достоверность по Манна-Уитни по отношению к контролю

К процессам пероксидации чувствительны легкие, т.к. основным компонентом сурфактанта являются фосфолипиды. При определении состояния сурфактанта легких выявили его повреждение (таблица 6).

Таблица 6 - Сурфактант легких в норме и после перенесенной гипоксии у крыс (М±т)_

Возраст/Показатели 15-30 мин 1 сутки 3 сутки

Август Контроль/ Опыт Вистар Контроль/ Опыт п = 35 п = 35 п = 35 п = 35 п = 32 п = 32 п = 32 п = 32 п = 29 п = 25

Сурфактант, усл. Ед. 0,93±0,01 0,85±0,01 0,93+0,01 0,87±0,01 0,73+0,01* 0,84±0,01 0,92+0,01 0,94±0,01 0,83±0,02* 0,88+0,01

* достоверность по Стьюденту по отношению к контролю.

Изменения со стороны легких в .1 сутки коррелируют с количеством ТБК-АП (К, -0.921522, р - 0.0048), т.е. можно говорить о повреждении сурфактанта в связи с активацией ПОЛ, но к 3 суткам повреждение уменьшается. Состояние сурфактанта коррелирует также с активностью пероксидазы (К5- -0.514944, р - 0.0494). Это означает, что легкие чувствительны как к повышенной концентрации ДК и ТБК-АП, так и к снижению ферментативных антиоксидантов. Повышение активности гистидазы также коррелируют с количеством ТБК-АП как в 1, так и на 3 сутки (И*- 0.873456, р - 0.0006 и 0.863444, р-0.0003).

Известно, что мишенью активных кислородных метаболитов является мембрана эритроцитов. На рисунке 16 представлена форма эритроцитов после перенесенной гипоксии у линии Август. Количество дискоцитов уменьшается, уже начиная с 1 -х суток. К 3 суткам увеличивается количество стоматоцитов, показатель компенсаторной трансформации ниже нормы, что указывает на недостаточность компенсации. Трансформация эритроцитов наблюдается за счет сфероцитов (индекс трансформации выше нормы). Увеличение после острой гипоксии с первых суток количества сфероцитов говорит об увеличении клеток, готовых к гемолизу. У линии Вистар (рисунок 17) после перенесенной гипоксии также количество дискоцитов уменьшается, к 3 суткам это уменьшение статистически достоверно. С первых суток статистически достоверно увеличивается количество стоматоцитов. У животных после острой гипоксии к 3 суткам увеличено количество сфероцитов, что также говорит об увеличении клеток, готовых к гемолизу и коррелирует с активностью каталазы (Яь -0.596109, р - 0.0244). Количество пойкилоцитов постепенно увеличивается с первых суток и коррелирует с количеством ТБК-АП.

Форма эритроцитов

дискоцкты сгоматоциты сфероцигы пойкилоциты

Виды клеток

Рисунок 16 - Форма эритроцитов после перенесенной гипоксии у линии Август

Рисунок 17 - Форма эритроцитов после перенесенной гипоксии у линии Вистар

Система эритрона принимает участие в адаптивных реакциях организма и реагирует на действие экстремальных факторов в раннем постнатальном периоде. Кинетика эритропоэза у крыс линии Август и у крыс линии Вистар отражена в рисунке

Кинетика эритропоэза п

/

/

Кинетика эритропоэза после острой гипоксии (Вистар)

( ----Суточная продукций

| .......Суточный п

новорожденные! дневные (Ю) 3 дневные (£

«5>

Рисунок 18 - Кинетика эритропоэза у разных линий крыс после гипоксии

У животных обеих линий после острой гипоксии снижается суточная продукция в течение всего периода новорожденное™. Суточный гемолиз у крыс линии Август только к третьим суткам статистически достоверно увеличен, а у животных линии Вистар суточный гемолиз практически остается на прежнем уровне.

Крысы рождаются с низким количеством эритроцитов, и в период новорожденное™, в течение первых трех дней, у них наблюдается дальнейшее снижение числа эритроцитов. После перенесенной гипоксии падение эритроцитов более выражено.

В норме НЬ снижается медленно. У животных после острой гипоксии снижение гемоглобина интенсивнее. У контрольных животных гемоглобинизация эритроцитов в период новорожденное™ не изменяется. У подопытных животных обеих линий к концу периода новорожденное™ наблюдается идентичное снижение гемоглобинизации эритроцитов. МСН статистически достоверно уменьшается (рисунок 19).

Рисунок 19 - Гемоглобинизация эритроцитов в норме и после гипоксии у крыс обеих линий

Уменьшение числа эритроцитов может быть обусловлено наличием как гемолитического компонента, так и снижением пролиферативных процессов. Увеличение гемолиза подтверждено ранее увеличением свободного гемоглобина плазмы и перекисного гемолиза. Однако падение числа эритроцитов и концентрации гемоглобина не может быть объяснено только гемолитическими процессами. При изучении костномозгового кроветворения мы выявили нарушения в системе эритрона. Рассматривая кривые созревания эритробластов у линии Август, обращает на себя внимание замедление их созревания и в 1, и в 3 сутки, причем созревание нарушено на ранних стадиях. У крыс линии Вистар после перенесенной гипоксии в первые сутки увеличено созревание, которое к 3 суткам замедляется (рисунок 20).

Рисунок 20 - Кривые созревания эритробластов в норме и после гипоксии у крыс

Анализируя полученные данные, можно говорить о постепенном снижении активности гемсинтезирующих ферментов, что согласуется с данными Назарова С.Б. (1995) об уменьшении интенсивности эритропоэза сразу после рождения. После острой гипоксии у обеих линий крыс идентично резко снижается активность ключевого фермента - АЛК-синтазы в первые трое сугок, уменьшается активность гемсинтетазы и активность АЛК-дегидратазы (рисунок 21).

Гемоаые ферменты

Рисунок 21 - Активность гемсинтезирующих ферментов КМ у крыс обеих линий в норме и после гипоксии

Изменение активности вышеуказанных ферментов привело к увеличению неэффективного эритропоэза в 2,5 раза у одной и у другой линии после гипоксии.

Становление механизмов стрессорной реакции в онтогенезе крыс линий Август и Вистар характеризуется генетически детерминированными различиями чувствительности к пренатальному нарушению баланса гормонов коры надпочечников. Судя по гибридам первого поколения исследованных линий, наличие чувствительности к гормону является доминантным признаком (Науменко Е.Е., 1990; Глущенко Г.С., 1992; Пшенникова М.Г., 2001).

Адаптация животных линий Август и Вистар с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами (СДР)

Среди новорожденных крысят в многоплодных пометах, вследствие нарушений пренатального онтогенеза в сочетании с родовым стрессом, появляются особи с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами, формирование которых, по-видимому, происходит в критические периоды развития плода. Столь глубокие расстройства безусловно-рефлекторной деятельности снижают адаптивные возможности животных в постнатальном онтогенезе. Животные с нарушенными СДР погибали в течение 14 дней после рождения, плохо набирая массу в течение периода новорожденное™ (таблица 7).

Таблица 7 - Динамика массы крысят с нарушенными СДР в течение периода новорожденности, г (М±т)_____

Возраст Август Контроль Опыт Вистар Контроль Опыт

15-30 мин после рождения 5,7±0,09 п = 50 5,9+0,01 п = 50

1 - дневные 5,8±0,10 п = 42 5,9±0,08 п = 19 6,0±0,01 п = 50 5,8±0,08 п = 29

3 - дневные 6,0±0,10 п = 48 5,7±0,06*п= 15 б,3±0,09 п = 48 5,7±0,09* п = 22

* р < 0,05 - достоверность по Манна-Уитни по отношению к контролю

В таблице 8 приведены данные по состоянию процессов ПОЛ и антиоксидантной системы у новорожденных в контроле и в подопытной группах.

Таблица 8 - Показатели процессов ПОЛ и ферментативные антиоксиданты при нарушении СДР и в контроле (М±ш)______

Возраст/Показатель Август Вистар 1 сутки Контроль п = 58 п = 56 1 сутки Опыт п= 10 п= 14 3 сутки Контроль п = 62 п = 58 3 сутки Опыт п = 8 п — 11

Общие лилиды, г/л 13,40±1,800 2,74+0,170 6,00±0,960* 2,14+0,150* 12,00±1,000 2,68±0,500 5,90±0,520* 1,94±0,094*

Диеновые коньюгаты, ед/г липидов 0,!3±0,008 0,22+0,011 0,07+0,006* 0,14±0,008 0,16±0,007 0,23+0,015 0,10+0,003 0,14+0,013

ТБК-АП, мкмоль/г липидов 0,52±0,060 0,42±0,050 3,70±0,720* 2,80±0,И0* 0,48±0,020 0,44±0,060 3,40±0,290* 2,44+0,180*

СОД, Фмоль/с на эритроцит 0,74±0,063 0,84±0,062 0,72±0,029 0,94±0,022* 0,71+0,030 0,72±0,044 0,56±0,022* 0,92±0,033*

Каталаза, Фмоль/с на эритроцит 48,00+3,800 58,00±2,800 34,00+1,800* 50,00±3,200 44,00± 1,400 48,00± 1,200 32,00±2,900* 44,00+2,100

Пероксидаза, Пмоль/с на гранулоцит 0,64±0,083 0,84±0,061 0,43±0,020* 0,44±0,160* 1,12±0,560 1,24±0,180 0,44+0,020* 0,48+0,160*

* р < 0,05 - достоверность по Манна-Уитни по отношению к контролю.

У подопытных животных в обеих линиях наблюдается снижение общих липидов сыворотки, увеличение ТБК-АП. Наблюдается снижение активности пероксидазы, что указывает на некомпенсированность процессов ПОЛ.

Изменения со стороны ЦНС у животных выявлены по изменению сенсорно-двигательных рефлексов. У всех животных наблюдались стереотипные нарушения рефлекторной деятельности. Рефлекс сцепления отсутствует у 1 дневных и у 3 дневных животных и не восстанавливается вплоть до гибели животных. Подопытные животные плохо координированы, у них увеличивается время переворачивания, запаздывает поворот головы. Число спонтанных мышечных подергиваний у линии Август у 1 дневных опытных животных - 7,7±0,18/мин (п = 19). На 3 сутки у опытных крысят число спонтанных мышечных подергиваний снижено - 5,2±0,12*/мин (п = 15). Это указывает на торможение двигательной активности подопытных животных. У линии Вистар число спонтанных мышечных подергиваний у 1 дневных опытных животных не изменено -7,2±0ДЗ/мин (п = 29). На 3 сутки у опытных крысят число спонтанных мышечных подергиваний снижено - 5,2±0,08*/мин (п = 22), что также указывает на снижение мышечной активности у опытных животных.

О состоянии процессов детоксикации судили по функции печени. У подопытных животных линии Август обнаружено значительное увеличение активности гистидазы в 7 раз, а у линии Вистар в 2 раза, что является одним из показателей цитолитического синдрома. Активность микросомальных ферментов представлена в таблице 9.

Таблица 9 - Активность ферментов микросомального окисления в период новорожденности в норме и при нарушении СДР (М±т)__

Возраст/Показатель 15-30 мин 1 сутки 3 сутки

Контроль Контроль Опыт Контроль Опыт

Август Вистар п = 20 п = 20 п = 20 п = 20 п = 15 п = 15 п= 16 п = 16 п = 13 п= 13

Деметилаза, Нмоль/мг белка 2,79±0,14 4,32±0,12 2,71±0,13 5,29+0,16 2,56+0,09 1,81+0,08* 2,65±0,15 8,68+0,15 2,52+0,10 1,80+0,07*

р-анилингидроксилаза, нмоль/мг белка 0,10±0,01 0,20±0,01 0,09+0,01 0,20±0,01 0,06±0,01 0,06±0,01* 0,08+0,01 0,22+0,00 0,05+0,01* 0,08±0,01*

* р < 0,05 - достоверность по Манна-Уитни по отношению к контролю.

У крыс линии Август достоверно снижена активность р-анилингидроксилазы, а активность деметилазы ДМА не изменена. Это указывает на частичное нарушение метаболизма ксенобиотиков. У крыс линии Вистар резко снижены активность деметилазы ДМА и р-анилингидроксилазы, которые зависят от изоформы СУР2Е, что указывает на нарушение метаболизма ксенобиотиков. Выявлена корреляционная связь между активностью деметилазы и ТБК-АП (И,, - 0.581537, р - 0.0473).

На рисунке 22 представлена активность гемсинтезирующих ферментов печени на 3 сутки в норме и при нарушении СДР у крыс линии Август и Вистар._

1» ф*рм«нты (вистар)

Ш АЛ К-дегияратоа!

ЙГ

Опы! (10)

Г«мсинтвгяэа (Вист су)

К00

12.00 . Г . -ц.

10.00 Г .

3,00

е'°° ■ шшшш

4,00 ■ 2.00 -

0,00 -^ '^-----' --1

контроль^ 1 Г| опыг(1С!

Рисунок 22 - Активность гемсинтезирующих ферментов печени в норме и при нарушении СДР

У крыс Август - тенденция к снижению активности АЛК-синтазы и АЛК-дегидратазы, однако это снижение статистически недостоверно. Снижение активности гемсинтетазы статистически достоверно, что объясняет неравномерное изменение активности микросомальных ферментов у линии Август. У линии Вистар наблюдается снижение активности ключевого фермента АЛК-синтазы. Активность АЛК-дегидратазы даже выше исходных показателей. Активность гемсинтетазы имеет тенденцию к снижению, но статистически недостоверно. Изменение активности АЛК-синтазы печени напрямую коррелирует с активностью р-анилингидроксилазы (Кя- 0.622654, р - 0.0213).

Снижение стабильности сурфактанта легких может быть связано с активацией пероксидации (таблица 10). Имеется корреляционная связь между количеством липидов и сурфактантом (Я5 - 0.639356, р - 0.0465) у линии Август, а у линии Вистар снижение сурфактанта легких коррелирует с количеством ТБК-АП (^-0.646801, р - 0.0314).

Таблица 10 - Сурфактант легких в норме и при нарушении СДР (М±т)

Возраст/Показатели 15-30 мин 1 сутки 3 сутки

Август Контроль/Опыт Вистар Контроль/Опыт п = 35 п = 35 п = 35 п = 35 п = 21 п = 21 п = 32 п = 32 п= 18 п = 18

Сурфактант, усл. Ед. 0,93±0,01 0,85+0,01 0,93±0,01 0,87+0,01 0,74+0,01* 0,84+0,01* 0,92±0,01 0,94±0,01 0,73+0,01* 0,83+0,01*

* р < 0,05 - достоверность по Манна-Уитни по отношению к контролю

Гамсинтвэирующив ферменты (Август)

вща IШ АПК -дегщрзгаза | 1.1

Гвмеиктваир!

Г0мси<|О1с1э (А&густ)

У животных Август и Вистар с нарушенными СДР наблюдается одинаковая активация гемолитических процессов. Высокие величины свободного гемоглобина

плазмы могут быть связаны не только с пероксидацией, а и с синтезом эритроцитов с дефектной мембраной (рисунок 23).

Рисунок 23 нарушенными СДР

Форма эритроцитов в крови животных Август и Вистар с

У обеих линий количество дискоцитов уменьшается, увеличивается количество стоматоцитов, что говорит о включении компенсаторных механизмов, однако с первых суток увеличено количество сфероцитов, что указывает на увеличение клеток, готовых к гемолизу, что мы и наблюдаем (увеличен свободный НЬ плазмы), и имеется корреляционная связь между ними (И,- 0.822724, р - 0.0121).

О состоянии эритрона судили по кинетики эритропоэза (рисунок 24).

---- Суточная продукция

-— Суточный гемопиэ I

I Сутсмная пр I-----Суточный ге

появрояленлы»

1 Лнмны» (10) 3 Дневные (9)

Новорожденны« 1 Дневные (13) Здневиые(12) (15)

Во>раст

Рисунок 24 - Суточная продукция и суточный гемолиз у крыс при нарушении СДР

У животных линии Август резко уменьшена суточная продукция в течение всего периода новорожденное™, а суточный гемолиз только к третьим суткам статистически достоверно увеличен. У животных линии Вистар также резко уменьшена суточная продукция в течение всего периода новорожденное™, суточный гемолиз начиная с первых суток имеет тенденцию к увеличению.

У животных линии Август с нарушенными рефлексами в первые трое суток резко снижается активность ключевого фермента - АЛК-синтазы, активность АЛК-дегидратазы практически не изменяется (рисунок 25), резко снижается активность гемсинтетазы (рисунок 27). У крыс линии Вистар наблюдается резкое снижение активности АЛК-синтазы, которая коррелирует с количеством общих липидов 0.680137, р - 0.0304), также снижается активность АЛК-дегидратазы (рисунок 26), уменьшается и активность гемсинтетазы (рисунок 27).

3 дневные

□ Контроль АЛК-синтеэа

■ Контроль АЛК-дегидратаэа I О Опыт АЛК-синтаза

□ Опыт АЛК-дегидратаза |

Рисунок 25 - Активность гемсинтезирующих ферментов в норме и при нарушении СДР у линии Август

Гемсинтезирующие ферменты

О -1

№ э —«ЙИ-с

АЛК-синтаэа

<-дап,драгаза ДЛК-си«таэа АЛК-даподш' Коктрог*. Опыт Опыт

О новорожденны!

Рисунок 26 - Активность гемсинтезирующих ферментов в норме и при нарушении СДР у линии Вистар

Рисунок 27 - Активность гемсинтетазы в период новорожденное™ в норме и при нарушении СДР в обеих линиях

В наших исследованиях у новорожденных с нарушенными СДР общими признаками является одновременное снижение количества эритроцитов и ретакулоцитов при одновременном неравномерном угнетении гемсинтезирующих ферментов. У крысят линии Август снижение гемоглобина более значительное, чем у животных линии Вистар.

У контрольных животных гемоглобинизация эритроцитов в период новорожденное™ не изменяется. У опытных животаых к концу периода новорожденное™ наблюдается снижение гемоглобинизации эритроцитов только у линии Август. У линии Вистар гемоглобинизация не нарушена (рисунок 28).

и Вистар "Х-. N |----К»>р(л|

Рисунок 28 - МСН при нарушении СДР и в норме

Отсутствие статистически значимых различий по концентрации гемоглобина между контрольными новорожденными и новорожденными с нарушенными СДР в обеих группах позволяет предположить, что нарушение синтеза гема не является ведущим в основном механизме снижения мощности кислород-транспортной системы. Вероятно, имеющая место супрессия эритрона связана с наличием неэффективного эритропоэза и гемолиза. Неэффективный эритропоэз имеет межлинейные различия. У крысят линии Август нарушен переход в оксифильные нормобласты, что проявляется увеличением содержания эритробластов, базофильных и хроматофильных нормобластов. У крысят линии Вистар нарушена дальнейшая дифференцировка оксифильных нормобластов. Такое различие вероятнее всего связано с разной длительностью жизни этих животных и, соответственно, с разным темпом реларативных процессов (Божков А.И., 2010). Таким образом, у крысят опытных групп имеет место замедление созревания эритроидных элементов и снижение их пролиферативной активности, но в разной степени выраженности. Эти изменения более выражены у животных линии Август. У животных линии Вистар имеются компенсаторные механизмы, позволяющие смягчить супрессию эритрона. Адаптивным у них является низкий уровень внутрисосудистого гемолиза. Можно предположить у них наличие внесосудистого гемолиза. Одновременно имеет место присоединение внутрисосудистого гемолиза у животных линии Август.

Появление в пометах обеих линий животных с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами и, соответственно, с нарушением адаптации в постнатальном периоде, вероятнее всего, не связано непосредственно с состоянием самки и влиянием ее на потомство, т.к. таких крысят в многоплодных пометах немного.

В связи с вышеописанным считаем, что представленные модели (ранняя постнатальная гипоксия и животные с нарушенными СДР) являются валидными для использования и переноса полученных данных на новорожденных детей.

Роль кортизола в развитии синдромов Аизадаптации « раннем постнатальном периоде у новорожденных детей

К настоящему времени отсутствуют работы, в которых определение уровня кортизола в пуповинной крови сопоставлялось бы в дальнейшем с развитием конкретно го состояния дизадаптации у новорожденных. Между тем, использование такого подхода представляется перспективным для объективной оценки и прогноза адаптационных процессов. С этой целью было проведено исследование уровня кортизола в пуповинной крови (таблица 11). С целью систематизации показателей проведен кластерный анализ (рисунок 29).

По исходному уровню кортизола в пуповинной крови выделено 3 группы:

— синдромы с нормальным уровнем кортизола: синдромы токсической эритемы и кровоизлияние в кожу; отдельно выделили группу условно инфицированных детей;

— синдромы с высоким уровнем кортизола: болевой синдром и синдром гипервозбудимости;

— синдромы с низким уровнем кортизола: синдромы срыгивания, угнетения, КРД и асфиксии.

Таблица 11 - Кортизол пуповинной крови в норме и при синдромах дизадаптации (М±ш)____

Синдромы Кортизол нмоль/л п

Контроль (диагноз - здоров) 351+21 33

Операция кесарево сечение экстренная (диагноз - здоров) 243+31* 17

Операция кесарево сечение плановая (диагноз - здоров) 137+ 81* 13

Условно инфицированные (диагноз - здоров) 310+35 15

Синдром срыгивания 261+11* 26

Синдром болевой 956±75* 20

Синдром гипервозбудимости 474±48* 21

Синдром угнетения 195±64* 8

Кардио-респираторная депрессия (КРД) 152±21* 14

Синдром кровоизлияния в кожу 287±47 17

Синдром токсической эритемы 313±42 16

Асфиксия 151+19* 12

* р < 0,05 по отношению к контролю по критерию Манна-Уитни (Л)

кластерам.

Синдромы дизадаптации с нормальным уровнем кортизола

Условно инфицированные дети

К условно инфицированным детям отнесли новорожденных, у которых был положительный посев с головки и / или с плаценты, и выписанных с диагнозом «здоров». Почти все показатели у данной группы детей не отличались от показателей здоровых новорожденных, но некоторые из них не соответствовали контролю. Это послужило предпосылкой не включать данную группу в группу контрольных детей.

Увеличение активности глутатионтрансферазы у условно инфицированных детей можно объяснить наличием токсичных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Увеличение активности фермента указывает на напряженность процессов, и дополнительная нагрузка лекарственными препаратами приведет к еще большему напряжению системы детоксикации, что, при незрелости системы микросомального окисления, может спровоцировать нарушение метаболизма билирубина и удлинение времени физиологической жел тухи, что не всегда благоприятно для ребенка.

Снижение миелопероксидазной активности у этих детей является результатом двух процессов: либо у них изначально снижена бактериальная защищенность и имеет место проникновение микроорганизмов через плаценту, либо проникновение

микроорганизмов приводит к подавлению активности фермента из-за незрелости системы иммунной защиты, либо имеют место оба процесса. Однако, для ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования.

Тем не менее, активность глутатионтрансферазы в пуповинной крови новорожденных может быть надежным лабораторным маркером напряжения системы детоксикации, а активность миелопероксидазы - нарушений функционального статуса нейтрофилов.

В таблице 12 представлены особенности пероксидации и антиоксидантных ферментов при синдромах дизадаптации с нормальным уровнем кортизола.

Таблица 12 - Перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, активность антиоксидантных ферментов при синдромах дизадаптации с нормальным уровнем кортизола в пуповинной крови (М±т)___

Показатели Контроль Токсическая эритема Кровоизлияние в кожу

Кортизол, нмоль / л 373,00±26,02 312,05±42,11 287,13±47,21

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 2,25 ±0,02 п =80 2,35±0,08 п =54 2,55±0,07* п=60

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,13±0,003 п =80 0,14±0,01 п =54 0,07 ±0,003* п=60

Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,07±0,004 п =80 0,20±0,01* п =42 0,38±0,03* п=56

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,56+0,004 п =87 0,95±0,05* п =40 0,55±0,03 п=54

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,26±0,004 п =87 0,08±0,005* п =40 0,23±0,01* п=54

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,14±0,001 п =87 0,38+0,02* п =40 0,19±0,01* п=54

ТЕК - активные продукты, Мкмоль/л 32,41+1,04 п=108 39,80±1,56* п =42 35,50±0,92* п=80

Уровень Ре+"/ аскорбат -индуцированного ПОЛ, % 92,30+4,50 п=30 55,20±4,20* п =28 68,40±3,70* п=33

Окислительная модификация белка, мкмоль/г 0,38+0,02 п =68 0,48±0,03* п =18 0,33±0,310 п=21

Окислительная модификация белка (индукция Ре+2/Н202), % 54,60*1,50 п =68 60,10±2,30 п =18 57,90+5,00 п=21

Супероксиддисмутаза (СОД), усл.ед./мл эрит/мин 208,00±6,80 п=48 301,01 ±24,51* п =17 343,30±22,70* п=24

Церулоплазми (ЦП), мг/л 119,11±3,71 п =103 172,25±21,01* п =36 132,12+12,90 п=34

Катал аза, Ммоль/мл эритр. /мин 103,23±8,90 п=40 105,17±8,80 п =28 115,23±3,90 п=36

Глутатионпероксидаза (ГП), ммоль/мл эритр. /мин 0,51±0,03 п=84 0,69+0,09 п =24 0,84±0,12* п=24

Миелопероксидаза (МП), пкмоль/клетку/мин 0,45±0,03 п=84 0,34±0.03 п =17 0,55±0,05 п=31

Глутатионтрансфераза (ГТ), мкмоль/г НЬ/мин 2,76±0,13 п=26 2,92±0,13 п =27 4,22±0,28* п=30

* р - < 0,05 по отношению к контролю (0

Заканчивая рассмотрение синдромов с нормальным уровнем кортизола, можно говорить о вполне адекватной адаптации таких новорожденных. Активация процессов ПОЛ, присущая всем новорожденным, компенсируется ферментными антиоксидантами.

У новорожденных с токсической эритемой повышена окислительная модификация белка, но антиоксидантной защиты хватает и не наблюдается увеличение ее при дополнительной стимуляции. При синдроме кровоизлияния в кожу выявлена умеренная активация ПОЛ без прироста ОМБ. Параллельно снижаются процессы клеточного транспорта в связи с повреждением мембранных структур (снижение активности АТФ-аз).

Синдромы дизадаптации с высоким уровнем кортизола

В таблице 13 представлены данные по содержанию продуктов свободнорадикального окисления и активности антиоксидантных ферментов при синдромах с высоким уровнем кортизола.

Таблица 13 - Перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, активность антиоксидантных ферментов при синдромах дизадаптации с высоким уровнем кортизола в пуповинной крови (М±т) ___

Показатели Контроль Болевой синдром Гипервозбудимость

Кортизол, нмоль / л 373,54±26,11 956,38+75,35* 474,12±48,10*

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 2,25+0,02 п=80 3,11+0,15* п =49 3,46+0,25* п=38

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,135±0,003 п=80 0,20±0,01* п=49 0,17+0,01* п=38

Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,07+0,01 п=80 0,19+0,02* п=45 0,18+0,02* п=42

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,56+0,01 п=87 0,76±0,04* п=58 0,79+0,04* п=29

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,26+0,004 п=87 0,15±0,01* п=58 0,29+0,01 п =29

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,14+0,001 п=87 0,17+0,03* п =44 0,26+0,02* п=42

ТБК - активные продукты, мкмоль/л 32,401,04 п=108 50,70+2,75* п=46 50,60±1,23* 11=26

Уровень аскорбат -индуцированного ПОЛ, % 92,30±4,50 п=30 88,40+2^0 п=38 45,40±4,80* п=19

Окислительная модификация белка, мкмоль/г 0,38±0,02 п=68 0,64+0,04* п =18 0,37±0,04 п=18

Окислительная модификация белка (индукция ?е*г№гОг\ % 54,60±1,50 п=68 49,60+3,20 п=18 49,50+3,10 п=18

Супероксиддисмутаза (СОД), усл.едУмл эритУмин 208,09±6,80 п=48 295,45±10,30* а =20 268,05±52Д5 п =10

Церулоплазми (ЦП), мг/л 119±3,7 п=103 97,80+6,30 п =43 137,34±12,40 п=27

Каталаза, Ммоль/мл эритр. /мин 103,11±8,90 п=40 90,60+4,70 п =46 91,40+6,60 п=26

Глутатионпероксидаза (ГП), ммоль/мл эритр. /мин 0,51±0,03 п=84 0,96+0,08* п =28 0,89±0,11* п =23

Миелопероксидаза (МП), пкмоль/клетку/мин 0,45±0,03 п=84 0,82±0,10* п=10 0,44±0,05 п =21

Глутатион, Пкмоль/ гр. НЬ 36,10±3,10 п =42 9,26±1,04* п =30 12,30±1,19* п =16

Глутатионтрансфераза (ГТ), мкмоль/г НЬ/мин 2,76±0,13 п =26 5,25±0,25* п=24 2,81±0,21 п=24

* р - < 0,05 по отношению к контролю (Ц

Таблица 14 характеризует особенности энергетического обмена при синдромах с высоким уровнем кортизола.

Таблица 14 - Показатели энергетического обмена при синдромах дизадаптации с высоким уровнем кортизола в пуповинной крови (М±т)__

Показатели Контроль Болевой синдром Гипервозбудимость

Кортизол, нмоль / л 373,54±26,11 95б,38±75,35* 474,12±48,10*

Общие липиды, 2,75±0,06 2,97±0,18 2,72±0,37

г/л п =94 п =36 п=23

Глюкоза крови, 3,14±0,08 3,96±0,32* 2,62±0,25*

Ммоль/л п=112 п =29 п=17

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ), пг/клетку/мин 0,08±0,01 п =85 0,03+0,002* п =16 0,04±0,005* п=22

Ыа,К-АТФ-аза, 7,67±0,18 3,94±0,34* 7,30±0,79

мкгРн/мл/мин п =57 п =24 п=22

Ме-АТФ-аза, 24,36±0,33 5,90±0,41* 6,65±0,87*

мкгРн/мл/мин п =57 п =24 п=22

Са-АТФ-аза, 14,83±0,41 3,17±0,23* 6,56±0,79*

мкгРн/мл/мин п =68 п =24 п=22

Магний сыворотки, Ммоль/л 0,84±0,02 п =55 0,42±0,002* п =36 0,63+0,02* п=22

* р - < 0,05 по отношению к контролю (1)

Рассматривая синдромы с высоким уровнем кортизола, нужно разделить эти два синдрома. В основе развития болевого синдрома лежат: высокий уровень кортизола, активация ПОЛ с частичной компенсацией ферментативными и неферментативными антиоксидантами, нарушение транспортной функции мембран, гипомагниемия и незначительная активация карбонилирования белков. Активность ХО при болевом синдроме не отличается от нормальных цифр. Если активность ХО при нем резко возрастает, то к болевому синдрому с высокой вероятностью может присоединиться любой другой синдром. Поскольку диагноз болевого синдрома ставится сразу после рождения, а часть синдромов проявляется позднее (на 2-3 сутки, например, синдром срыгивания), высокая активность ХО при болевом синдроме является предиктором развития дополнительных синдромов дизадаптации.

Синдром гипервозбудимости по своим проявлениям похож на болевой синдром. При нем нет такого резкого увеличения кортизола плазмы. При данном синдроме снижены 1^-АТФаза и Са-АТФаза, что определяет гипомагниемию и снижение гликолитических процессов (глюкоза крови снижена). При данном синдроме в окислительные процессы не вовлечены белки (ОМБ в норме). Несмотря на данные изменения, процесс адаптации у таких новорожденных проходит вполне адекватно.

Синдромы дизадаптации с низким уровнем кортизола

К данной группе относятся несколько синдромов, не похожих в своих клинических проявлениях. В таблице 15 показано изменение уровня биологических аминов при синдроме срыгивания.

Таблица 15 - Содержание серотонина и гистамина в пуповинной крови новорожденных с синдромом срыгивания (М±т)_

Показатели Контроль Синдром срыгивания

Серотонин, мкмоль/л 0,41±0,01 п=106 0,44+0,01* п=18

Гистамин, мкг/л 105,34±4,0 п=50 82±1,2* п=16

* р - < 0,05 по отношению к контролю (0

В таблице 16 показаны изменения процессов свободнорадикального окисления при КРД и синдроме угнетения.

Таблица 16 - Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков при синдромах КРД и угнетения (М+т)___

Показатели Контроль КРД Синдром угнетения

Кортизол, нмоль / л 373,08±26,12 141,12+13,60* 195,66±64,01*

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 2,25±0,02 п=80 2,40±0,16 п=15 3,87+0,78* п=8

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,13±0,003 п=80 0,32±0,06* п=15 0,25+0,07* п=8

Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,07±0,004 п=80 0,18+0,01* п =18 0,31±0,03* п=8

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,56+0,004 п=87 0,79±0,06* п=8 0,74±0,05* п=15

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,26±0,004 п=87 0,23±0,02 п=15 0,15+0,01* п=8

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,14±0,001 п=87 0,26±0,03* п =16 0,70±0,005* п=6

ТБК - активные продукты, мкмоль/л 32,40±1,04 п=108 57,80±3,80* п =15 52,40±5,10* п=9

Уровень аскорбат -индуцированного ПОЛ, % 92,30+4,50 п=30 39,60±3,40* п =14 43,40±11,60* п=8

Окислительная модификация белка, мкмоль/г 0,38+0,02 п=68 0,52±0,01* п =12 0,42±0,07* п=8

Окислительная модификация белка (индукция Ре+2/Нг02),% 54,60±1,50 п=68 62,40±1,10* п =12 49,80±5,00 п=8

* р - < 0,05 по отношению к контролю (0

Изучение состояния процессов перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков, антиоксидантной защиты, энергетического обмена, функции печени не показало ничего специфического. Однако определение серотонина выявило его увеличение только при двух синдромах - кровоизлияния в кожу и срыгивание. Таким образом, повышенное содержание серотонина, на наш взгляд лежит, в основе развития синдрома срыгивания и во многом определяет его клинические проявления.

Так как при нарушении процессов адаптации наблюдаются изменения со стороны сердечно-сосудистой системы, то при кардио — респираторной депрессии необходимо было выяснить, имеются ли при данном синдроме органические гипоксические нарушения (Ангар при рождении у них 6 баллов) или имеют место функциональные изменения. С этой целью определяли уровень Тропонина I в венозной крови через 10 - 16 часов после рождения. Ни в одном случае (40) Тропонин I не был выше контрольных значений.

Таким образом, снижение уровня кортизола при синдромах угнетения и кардио -респираторной депрессии демонстрирует истощение стресс - регулирующих систем новорожденного, что на основании наблюдения за данными детьми указывает на снижение их адаптационных возможностей. Важной особенностью свободнорадикальных процессов у новорожденных с синдромами угнетения и кардио - респираторной депрессии было выраженное увеличение, по сравнению с другими исследованными группами, оснований Шиффа и ТБК-АП.

При синдроме асфиксии выявлены особенности, которые представлены в таблице

Таблица 17 - Перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков и активность антиоксидантных ферментов в пуповинной крови при синдроме асфиксии (М±т)_

Показатели Контроль Синдром асфиксии

Кортизол, нмоль / л 373,47±26,17 151,09±19,44*

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 2,25+0,02 п =80 2,16+0,11* п =22

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,13+0,003 п =80 0,26+0,02* п =22

Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,07±0,004 п =80 0,22±0,02* п =22

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,56+0,004 п=87 0,70+0,03* п =22

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,2б±0,004 п =87 0,22+0,008* п =22

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,14±0,001 п =87 0,777±0,08* п =22

ТБК - активные продукты, мкмоль/л 32,40±1,04 п =108 40,20±3,20 п =22

Уровень Ре+"7 аскорбат -индуцированного ПОЛ, % 92,30±4,50 п =30 35,30±4,70* п =22

Окислительная модификация белка, мкмоль/г 0,38±0,02 п =68 0,36±0,04 п =21

Окислительная модификация белка (индукция Ие^/НгОг), % 54,60+1,50 п =68 57,10±3,10 п =21

Супероксиддисмутаза (СОД), усл.ед./мл эритУмин 208,67±6,80 п=48 293,37±13,01* п=12

Церулоплазми (ЦП), Мг/л 119,16±3,70 п =103 226,07±21,25* п=12

Катал аза, ммоль/мл эритр. /мин 103,56±8,90 п =40 85,11±7,80 п=12

Глугатионпероксидаза (ГП), ммоль/мл эритр. /мин 0,51+0,03 п =84 0,21±0,001* п=12

Миелопероксидаза (МП), пкмоль/клетку/мин 0,45±0,03 п =84 0,48±0,09 п=12

Гдутатион, пкмоль/ гр. НЬ 36,10±3,10 п =42 33,80*3,50 п=12

Глутатионтрансфераза (ГТ), мкмоль/г НЬ/мин 2,76±0,13 п =26 6,90±0,10* п=12

* р - < 0,05 по отношению к контролю (t)

При асфиксии в чистом виде адаптация новорожденных должна проходить вполне адекватно. Присоединение после перенесенной асфиксии других синдромов может отягощать течение раннего постнатального периода.

Дисиндромы

Появление любого другого моносиндрома после перенесенной асфиксии утяжеляет его течение (таблица 18).

Таблица 18 - Изменения уровня продуктов липопероксидации в пуповинной крови при развитии моносиндромов дизадаптации и их сочетаний с асфиксией у новорожденных, е.и.о. (М±т) _____.

Синдромы ДК 1 КД и CT 1 шо ДК | КД и CT | шо

Гептаиовая фаза Изопропанольная фаза

Контроль, п=40 2,25±0,02 0,13±0,08 0,07±0,01 0,56±0,01 0,25±0,0б 0,14±0,005

Болевой синдром, п=49 3,11+0,15 * 0,20±0,02 * 0,19±0,02 * 0,7б±0,04 * 0,15±0,08 * 0,17±0,03 *

Болевой синдром и асфиксия, п=9 3,13±0,25* 0,403±0,02 * ** 0,14±0,03 * 0,79±0,04 * 0,31 ±0,07 * ** 0,20±0,03 * **

Синдром гипервозбудимости, п=38 3,46±0,25 * 0,17±0,01 * 0,18±0,02 * 0,79±0,04 * 0,27±0,01 0,26±0,02 *

Синдром гипервозбудимости и асфиксия, п=15 3,13±0,54 * 0,58±0,01 * ** 0,10±0,02 ** 0,80±0,06 * 0,31 ±0,07 * ** 0,17±0,03 * **

Синдром срыпивания, п=50 2,95±0,12 * 0,31 ±0,05 * 0,16±0,01 * 0,91±0,04 * 0,05±0,004 * 0,бЗ±0,01 *

Синдром срыгивания и асфиксия , п=11 2,87±0,22 0,20±0,01 * ** 0,17±0,02 * ** 0,57*0,01 * ** 0,25±0,01 ** ОДОЮ,08 * **

* р - < 0,05 по отношению к контролю (U); ** р - < 0,05 по отношению к моносиндрому (U); ДК - диеновые конъюгаты; КД и CT - кетодиены и сопряженные триены; 1110 -шиффовы основания.

Асфиксия утяжеляет процесс ранней адаптации новорожденных. Для сочетанных синдромов дизадаптации с асфиксией характерно увеличение содержания всех молекулярных продуктов ПОЛ как в гептановой, так и в изопропанолъной фазе. Таким образом, мы видим более выраженную активацию процессов ПОЛ по сравнению с моносиндромами. Параллельно наблюдается увеличение содержания церулоплазмина. Особенностью энергетического обмена у новорожденных является повышенная чувствительность к адреналину. Адреналин — один из гормонов, определяющий течение стрессовой реакции, т.к. родовый стресс приводит к абсолютно максимальным значениям катехоламинов (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П.,2001). ЦП - белок острой фазы, обладающий более выраженной СОД - активностью. Кроме того, считается, что его роль также -гашение свободных радикалов и участие в разрушении биогенных аминов, прежде всего адреналина (Добротина H.A. с соавт.,1999; Ким Л.Б., Колмыкова Е.Ю.,2006). Полученные результаты свидетельствуют об универсальности данных изменений.

Заключение

Самый высокий риск для жизни, здоровья и развития человека сопряжен с ранними этапами онтогенеза, пренатальным и ранним неонатальным, когда вмешательство множества повреждающих агентов может повлиять на жизнеспособность и пожизненное здоровье человека. В то же время известно, что взаимосвязь между внутриутробным стрессом и программированием его последствий после рождения во многом определяют процессы свободнорадикального окисления (Арутюнян A.B. с соавт., 2001; Волчегорский И.А. с соавт., 2007; Thompson L.P., 2012). В наших исследованиях во всех без исключения группах наблюдались различные проявления оксидативного стресса. Следует особо отметить факт изменения уровня продуктов липопероксидации при индукции ПОЛ in vitro Fe2+/ аскорбат, предшествовавшие развитию нарушений адаптации. Изменения данных показателей характерны для всех без исключения исследованных синдромов дизадаптации новорожденных.

Нарушения адаптации, протекающие на фоне нормального содержания кортизола (токсическая эритема и кровоизлияния в кожу), сопровождались усилением липопероксидации. Синдром токсической эритемы развивался на фоне повышения содержания первичных и конечных продуктов липопероксидации, ТБК - активных продуктов и уровня ОМБ, при этом увеличивалась и активность ферментативных антиоксидантов: супероксиддисмугазы и церулоплазмина. Подобные, но менее выраженные изменения (за исключением усиления ОМБ), наблюдались и при кровоизлиянии в кожу. При данном синдроме дизадаптации, как и при токсической эритеме, выявлено усиление активности ферментативных антиоксидантов: глугатионпероксидазы и супероксиддисмугазы. Поэтому отличием данных синдромов дизадаптации, протекающих на фоне нормального уровня кортизола, можно считать относительно невысокий уровень ТБК-активных продуктов и окислительной модификации белка.

При синдромах с высоким уровнем кортизола (болевой и синдром гипервозбудимости) наблюдались более выраженные изменения иероксидации. В пуповинной крови новорожденных с болевым синдромом наблюдалось одновременное увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновые конъюгаты, шиффовы основания) и уровня окислительной модификации белка. При этом наблюдалось статистически значимое увеличение активности глугатионпероксидазы на фоне сниженного уровня восстановленного глутатиона, снижение содержания церулоплазмина, увеличение активности СОД. Подобные изменения (за исключением усиления ОМБ) наблюдались и при синдроме гипервозбудимости. Данный синдром дизадаптации отличался также низким уровнем каталазы. Особенностью синдрома гипервозбудимости стало снижение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ. При этом снижение содержания диеновых конъюгатов в ответ на индукцию Бе2+/ аскорбат было характерно и для других синдромов дизадаптации. Но уровень вторичных продуктов (кетодиеноа и сопряженных триенов) был статистически значимо выше контрольных значений во всех исследованных группах (за исключением синдрома гипервозбудимости).

Наиболее выраженные проявления оксидативного стресса наблюдались на фоне синдромов дизадаптации, сопровождающихся снижением уровня кортизола в пуповинной крови. Синдром срыгивания развивался на фоне повышенного количества всех категорий продуктов ПОЛ и ТБК - активных продуктов. Данный синдром сопровождался только повышением содержания продуктов перекисного окисления липидов, но не окислительной модификации белка. При этом достаточно эффективно функционировала антиоксидантная система: повышалась активность супероксиддисмугазы, глугатионпероксидазы (на фоне сниженного содержания глутатиона), церулоплазмина. Активность каталазы была снижена. При синдроме угнетения дополнительно увеличивался базальный уровень окислительной модификации белка. При КРД было выявлено усиление как базальной, так и металл - катализируемой ОМБ. Следует обратить внимание, что выраженность этих изменений зависела от уровня кортизола: гипокортикоидным синдромам соответствовало максимальное увеличение содержания вторичных продуктов ПОЛ. Снижение уровня кортизола при синдромах срыгивания, угнетения и КРД демонстрирует истощение стресс - регулирующих систем новорожденного, что на основании наблюдения за данными детьми указывает на снижение их адаптационных возможностей. Важной особенностью свободнорадикальных процессов у новорожденных с синдромами срыгивания, угнетения и КРД было выраженное увеличение, по сравнению с другими исследованными группами, оснований Шиффа и ТБК-АП.

Анализ корреляционных взаимосвязей позволяет сделать выводы о том, что повышенный уровень кортизола связан с изменениями активности одного из ключевых антиоксидантных ферментов - глугатионпероксидазы. При этом выявлена обратная

корреляционная взаимосвязь (Ее = - 0.60, Р = 0,008) между активностью глутатионпероксидазы и содержанием гептан-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов, а также диеновых конъюгат (Ив = - 0,51, Р = 0,03). Следовательно, в данном случае можно говорить о том, что высокий уровень кортизола имеет адаптивный эффект, направленный на повышение активности глутатионпероксидазы, что, в свою очередь, способствует ограничению липопероксидации. Снижение уровня кортизола сопровождается появлением новых корреляционных взаимосвязей между уровнем кортизола и свободнорадюсальным окислением, а корреляционная взаимосвязь с активностью глутатионпероксидазы уменьшается, вплоть до ее исчезновения. Следовательно, при нарушениях адаптации, протекающих на фоне низкого содержания кортизола, возможно нарушение глюкокортикоидной регуляции глутатионпероксидазы.

Одной из проблем постнатального ведения новорожденных является отсутствие достаточно надежных, объективных методов оценки адаптационного процесса. Использование экспериментальных моделей дало возможность более полно охарактеризовать механизм нарушения адаптации новорожденных.

При рождении животные линий Август и Вистар не отличались по массе. У животных исходно генетически детерминированы различия по уровню общих липидов сыворотки. В связи с этим липопероксидация у них выражена в разной степени. Она наиболее выражена у животных линии Август, имеющих более напряженный липидный обмен. Усиление липопероксидации сочетается с более низкой активностью антиоксидантных ферментов.

У животных с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами нарушен режим питания, т.к. они недостаточно получают материнское молоко в связи с их ограниченной подвижностью. Однако, это не является причиной активации процессов пероксидации. В работах Магсгик-Кгушска О. е1 а1. (2003), Бурова П. Г. с соавт. (2011), Кузьменко Д. И. с соавт. (2012) показано, что на протяжении первых двух суток голодания в печени крыс сохранялась высокая функциональная активность антиоксидантной системы. Только на 3-и сутки голодания в печени наблюдали признаки активации процессов ПОЛ: рост концентрации продуктов процесса пероксидации липидов на фоне сохраняющихся высоких значений активности каталазы и концентрации восстановленного глутатиона. Эти работы проведены на взрослых животных и без учета разницы в липидном обмене разных линий. В наших исследованиях у новорожденных животных общими признаками были одновременное снижение количества эритроцитов и ретикулоцитов, а также кинетики эритропоэза при одновременном неравномерном угнетении гемешггезирующих ферментов. Отсутствие статистически значимых различий по концентрации гемоглобина между контрольными новорожденными и новорожденными с нарушенными СДР в обеих линиях позволяет предположить, что нарушение синтеза гема является ведущим фактором в основном механизме снижения мощности кислород-транспортной системы. Вероятно, имеющая место супрессия эритрона связана с наличием неэффективного эритропоэза и гемолиза, которые усугубляются нарушениями в биосинтезе гема и глобина. Неэффективный эритропоэз имеет межлинейные различия. У крысят линии Август нарушен переход в оксифильные нормобласты, что проявляется увеличением содержания эритробластов, базофильных и хроматофильных нормобластов. У крысят линии Вистар нарушена дальнейшая дифференцировка оксифильных нормобластов. Таким образом, у крысят опытных групп имеет место замедление созревания эритроидных элементов и снижение их пролиферативной активности, но в разной степени выраженности. Эти изменения более выражены у животных линии Август. У животных линии Вистар имеются компенсаторные механизмы, позволяющие смягчить супрессию эритрона.

Появление в пометах обеих линий животных с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами и, соответственно, с нарушением адаптации в постнатальном периоде, вероятнее всего, не связано непосредственно с состоянием самки и влиянием ее

на потомство, т.к. таких крысят в многоплодных пометах немного. Появление в многоплодном потомстве свиней И] (ландрас и крупная белая) идентичных животных описано Крупицкой Л.И. (1988), а на овцах - 1е11утап 1.К. е1 а1. (2004). Скорее всего, это связано с состоянием самки в критические периоды антенатального онтогенеза данного новорожденного. Гипотеза «критических периодов» высказана достаточно давно и обозначает этапность в формировании нормально развивающихся животных в пренатальном и постнатальном онтогенезе (Анохин П.К., 1948; Аршавский И.А., 1982). Различные внешние воздействия, влияющие на организм матери, исходя из вышеописанных теорий, могут привести либо к рождению детей с морфологическими нарушениями, либо способствовать развитию различных заболеваний во взрослом состоянии, что не имеет отношения к синдромам дизадаптации. Важно отметить, что, по нашим экспериментальным данным, наибольшее внимание необходимо уделять новорожденным детям, у которых нарушение адаптации ассоциируется с наиболее напряженным липидным метаболизмом, что в итоге приводит к оксидативному стрессу, супресии эритрона и активации внесосудистого гемолиза.

В связи с вышеописанным считаем, что представленные модели (ранняя постнатальная гипоксия и животные с нарушенными сенсорно-двигательными рефлексами) являются валидными для использования и переноса полученных данных на новорожденных детей.

В работе практического здравоохранения необходимо иметь какие-либо показатели, которые помогли бы выделить детей, нуждающихся в более пристальном внимании. Исходя из полученных нами данных, можно выделить 4 показателя, которые указывают на нарушение адаптации:

1. Определение активности ксантиноксидазы помогает сразу выявить новорожденных, потенциальных по развитию синдромов дизадаптации. Активность ХО увеличена при всех синдромах, за исключением болевого синдрома. Болевой синдром диагносцируется сразу после рождения, и, если у ребенка с таким синдромом повышена активность ХО, можно прогнозировать присоединение к нему какого-либо еще синдрома.

2. Уровень миелопероксидазы в лейкоцитах и снижение ее активности указывает на несостоятельность бактериальной защиты;

3. Увеличение активности глутатионтрансферазы эритроцитов коррелирует с напряженностью процессов детоксикации;

4. Увеличение в крови уровня серотонина сочетается с синдромом кровоизлияния в кожу и с синдромом срыгивания. Синдром кровоизлияния в кожу диагносцируется хорошо. Синдром срыгивания возникает через 2-3 дня после рождения, и определение серотонина поможет прогнозировать его возникновение.

Суммируя результаты экспериментального и клинического разделов работы и ориентируясь на выявленные метаболические закономерности развития изученных состояний, приводим общую схему патогенеза дизадаптационных синдромов новорожденных животных и новорожденных детей (рисунок 30).

а

ю О

s

Рн

о о. о

m

о s

о

а н о §

С « о 5

m

с I .

и с

п. 2

£ с к

н S О

в g я

О.

к 3 а

о g

5 н

О S

о. 5

ч

»4 —

rags

& 4 и

о о «

с м

0 в й

у о> В

" й z

1 41 о * « «о 3 е о. 5 g

^ X н

Pj и и

ч « о

В g S

Я о =

2 S 8

3 ■ u

* СЧ «2

у ч? Л О

Л

Я И

а о

5 с*

е г>

2 ч к

у Ьй

fe ° ё S4 л

н 9 и

61

g- &

Й S

гипоксия

ИНДИВИДУАЛЬНОЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕ ПРОГРАММИРОВАНИЕ

СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ КОРТИЗОЛА

Незначительное i уровня кортизола

Не яечятельны Я дисбаланс системы

ПОЛ-АОС

f уровня серотонина. снижение иагяяц i нейронах

t проводимости нервных импульсов

«пне

Гнперрефлскси, рвота

Ч О S в

ж S г°

П Q, п. г

« О U Я

Он Н н г

g is «

п. СЗ ES

О а S3

ю я о

Й ХЮ

ч о о

Клиника синдрома срыгивання

Умеренное 1 уровня кортизола

Умеренный днсбалаяс системы

ПОЛ-АОС

уровня серотонина а нейрокал

| проводимости нернных импу льсов

»цнс

1 ыишетвого тонуса ДВИГЭТеЛкНОЙ

активности

Клиника синдрома угнетения

Резкое i уровня кортизола

Резкий днс$а.инс системы ПОЛ-АОС

f мт ГТ, j уровня

глуптюна. повышение урови*

маганя кардноммоштах н пневмоцитах

f arr ГТ. норм, глутатяон. | уровня нагни* в серого mot в клетках ДМХ центра

Нарушение процесса обраюваоти сурф»*пнта и работы мяокарда

Нарушение ф> мхцн> лых.исктра

Дыхательная недостаточность, нарушение гемодккамюл

Клиника синдрома КРД

Клиника синдрома асфиксии

НОРМАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ УРОВНЯ КОРТИЗОЛА

Умеренная активация ПОЛ компенсируется АОС

Поврсацевне мембран тучи их клеток

оолюжяоХ

соединительной ткани

Дггрэиу.иим* 7учмих

клеток оодгажной сое дни ктельмо А ткан и

В «деление БАВ

Повреждение мембран тромбоцитов

Повышение уровня тромбоцктарных факторов свёртывай их

Активация системы гемостата

Аллергоподобная peanut«

Клиника синдрома токсической эритемы

Появление геморрагия

Клиника синдрома кровоизлияния в кожу

ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ КОРТИЗОЛА JEZ

Умеренное Т Выраженное f

уровня уровня

кортизола кортизола

4 ♦

Умеренная Выраженная

активация ПОЛ «тивашиПОЛ

+ *

j восстановленного 1 восстановленного

уровня глутатнона, уровня глутатмона,

норм, активность ГТ 1 активности l 1

в ЦНС ЦНС

Умеренное Секитншши

порахяие ЦНС нейронов

Клиника синдрома

гипер-возбудимости

Патологическое возбуждение ЦНС

Клиника болевого синдрома

выводы

1. Моделирование у новорожденных крыс линии Август острой постнатальной гипоксической гипоксии сопровождается повышением концентрации ТБК-АП почти в 7 раз на фоне стабильных величин АОЗ и состоянием гипорегеператорной анемии, которая ассоциирована с нарушением дифференцировки и созревания эритроидных элементов, снижением активности гемсинтезирующих ферментов КМ более, чем в 2 раза, а также повышением скорости перекисного гемолиза к третьему дню эксперимента на 30%, по сравнению с контрольными величинами.

2. В отличие от линии Август, новорожденные животные линии Вистар в опытах острой постнатальной гипоксической гипоксии характеризуются повышением активности супероксиддисмугазы и снижением активности пероксидазы от 2 до 4,5 раз на фоне стабильного уровня перекисного гемолиза и повышения длительности гексеналового сна более, чем в 3 раза, по сравнению с контрольными величинами.

3. У новорожденных крыс линии Август с сенсорно-двигательными расстройствами, по сравнению с контролем, к 3-му дню жизни отмечается повышение концентрации ТБК-АП в 7,1 раз с одновременным снижением активности пероксидазы на 62%. У этих животных наблюдается также повышение активности маркерного фермента цитолиза печени гистидазы более, чем в б раз, со снижением активности гемсинтстазы на 46%.

4. У новорожденных крыс линии Вистар с нарушением сенсорно-двигательных рефлексов, по сравнению с контролем, в 3-х дневном возрасте выявляется активация ПОЛ с повышением содержания ТБК-АП в 5,5 раз и с параллельным снижением активности пероксидазы на 61%. Установлено также, повышение активности гистидазы почти в 3 раза и снижение показателей активности р-анилингидроксилазы и деметилазы (соответственно на 65,0 и 79,3%).

5. При проведении кластерного анализа методом К-средних (K-means) было установлено, что по исходному содержанию кортизола (нмоль/л) в пуповинной крови 212 новорожденных детей их можно разделить на 5 групп: повышенный уровень 1031 ± 47 (п =31), сдвиг в сторону верхней границы нормы 449 ± 9 (п =54), сдвиг в сторону нижней границы нормы 261 ± 5 (п =74), умеренного снижения 133 ± 2 (п =45), резкого снижения 76 ± 3 (п =17) уровня кортизола.

6. Нормальное содержание кортизола в пуповинной крови отмечается при синдромах токсической эритемы и кровоизлияниях в кожу. Высокий уровень кортизола ассоциируется с болевым синдромом и синдромом гипервозбудимости, а низкое содержание глюкокортикоида наблюдается при синдромах срыгивания и руминации, угнетения, кардио-респираторной депрессии, асфиксии.

7. Установлены метаболические особенности течения каждого дизадаптациохшого синдрома, которые включают в себя изменение наиболее информативных показателей: концентрации серотонина, гистамина, уровня Fe+2/ аскорбат - индуцированного ПОЛ, ТБК-АП, основания Шиффа (обе фракции), активности супероксиддисмугазы, глутатионтрансферазы, миелопероксидазы, МАО - Б, ксантиноксидазы.

8. Для сочетанных синдромов дизадаптации с асфиксией характерно статистически значимое увеличение содержания всех молекулярных продуктов ПОЛ как в гептановой, так и в изопропанольной фазах.

9. Присоединение болевого синдрома к асфиксии сопровождается снижением активности супероксиддисмугазы и глутатионпероксидазы (соответственно на 33 и 45%), присоединение синдрома гипервозбудимости к асфиксии также снижает активность этих ферментов, но приводит к повышению активности церулоплазмина на 58,4%, а присоединение синдрома срыгивания и руминации к асфиксии характеризуется снижением глутатионпероксидазной (соответственно на 5 и 45%) и

супероксиддисмутазной (соответственно на 15 и 25%) активности, как в сравнении с контрольной группой, так и с моносиндромом.

10. Для прогнозирования развития дизадаптационного синдрома или присоединения к нему дополнительного синдрома в зависимости от характера нарушения приспособительных механизмов выявлена клиническая целесообразность использования определение у новорожденных 4 метаболических показателей: активность миелопероксидазы в лейкоцитах, активность глутатионтрансферазы в эритроцитах, активность ксантиноксидазы, а также концентрация серотонина в крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи из перечня российских рецензируемых научных журналов:

1. Крупицкая, Л.И. Ксантиоксидаза как показатель адаптации новорожденных / Л.И.Крупицкая, В.Э. Цейликман, A.C. Попова, А.И. Синицкий, Т.Н. Голощапова, В.П.Дубровская, И.М.Гузема Н Клиническая лабораторная диагностика,-2008.- №12.-С.16-17.

2. Попова, A.C. Состояние функции печени у новорожденных с различными синдромами, развивающимися в раннем постнатальном периоде / А.С.Попова, Л.И.Крупицкая, В.П.Дубровская, А.Б. Горностаева // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.- 2009.- Т. 8. - № 4. -С. 28-30.

3. Крупицкая, Л.И. Реакция крыс линий Август и Вистар на раннюю постнатальную гипоксию / Л.И.Крупицкая, В.Э.Цейликман, А.С.Попова, А.И.Синицкий, А.Б. Горностаева // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2009,- Т. 95.-№7.-С. 773-778.

4. Попова, А.С Относительные риски развития пограничных состояний у новорожденных / А.С.Попова, А.Б.Горностаева, Л.И.Крупицкая, Т.В.Соломатова, А.И. Синицкий // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2010.- Т. 9. - № 3. -С. 77-78.

5. Цейликман, В.Э. Активность моноаминоксидазы тромбоцитов, Mg - АТФ-азы эритроцитов и содержание магния в сыворотке крови у новорожденных в острый период адаптации / В.Э.Цейликман, А.С.Попова, Л.И.Крупицкая, А.И. Синицкий // Клиническая лабораторная диагностика.- 2010,- №5,- С.14-16.

6. Цейликман, В.Э. Вариабельность микросомального окисления и порфиринового обмена у крыс / В.Э.Цейликман, В.Е. Рябинин, А.С.Попова, Л.И.Крупицкая, А.И. Синицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2010,- Т. 150. - № 8.-С. 140-141.

7. Цейликман, В. Э. Состоятельность антиоксидантной системы при развитии дисиндромов у новорожденных / В.Э.Цейликман, В.В.Хасанова, Т.П.Шевлюкова, А.С.Попова, А.Б. Горностаева // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - Т. 11,-№1,-С.88-91.

8. Tseilikman, V.E Variability of microsomal oxidation and porphyrin metabolism in rats / V.E.Tseilikman, V.E.Ryabinin, L.I.Krupitskaya, A.I.Sinitsky, A.S. Popova // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2010. -T. 150. - № 2. - C. 178-179.

9. Хасанова, B.B Роль оксидативного стресса в прогнозировании развития дисиндромов у новорожденных / В.В.Хасанова, А.С.Попова, Л.И.Крупицкая, Т.П.Шевлюкова, В.Э.Цейликман, О.Б. Цейликман // Современные проблемы науки и образования (электронное научное издание).- 2012. - № 4 - URL: tittp'7/www.science-education.ru/104-6710

10. Хасанова, В.В. Особенности окислительного стресса при сочетании синдромов срыгивания и гипервозбудимости у новорожденных / В.В. Хасанова, Л.И.Крупицкая, А.С.Попова, Т.П.Шевлюкова, Т.В.Соломатова, А.Б.Горностаева,

Д.А.Козочкин //Вестник уральской медицинской академической науки. - 2012. - № 2(39). - С. 83-84.

11. Цейликман, В.Э. Состояние эритрона у новорожденных крысят с нарушенными сенсомоторными рефлексами / В.Э.Цейликман, А.С.Попова, Л.И.Крупицкая, А.Б. Горностаева, А.И.Синицкий, Д.А. Козочкин //Росс.физиолог. журнал им. И.М. Сеченова. -2012.-Т. 98. -№ 4. -С. 535-541.

12. Цейликман, В.Э. Изменение уровня Fe+2 /аскорбат - индуцированнового ПОЛ при синдромах асфиксии, гипервозбудимости, срыгивания, болевом синдроме и их сочетаниях у новорожденных/ В.Э. Цейликман, В.В. Хасанова, A.C. Попова Л.И. Крупицкая, Т.П.Шевлюкова, А.И. Синицкий / Современные проблемы науки и образования (электронное научное издание).- 2012.- №6 - URL: http://www.science-education.ru/106-7497.

13. Попова, A.C. Состояние энергетического обмена у новорожденных в норме и при развитии нарушений адаптации в раннем постнатальном периоде / A.C. Попова Л.И. Крупицкая, В.Э.Цейликман, В.Е.Рябинин, А.И.Синицкий, Р.В.Деев // Клиническая лабораторная диагностика.- 2013.- №1.- С.22-24.

14. Крупицкая, Л. И Содержание серотонина и гистамина в крови новорожденных при развитии нарушений адаптации в раннем постнатальном периоде / Л.И. Крупицкая, A.C. Попова, В.Э.Цейликман, А.И. Синицкий, Р.В.Деев, Д.А. Козочкин // Росс.вестник перинатологии и педиатрии. - 2013. - № 2.- С.35-36.

15. Попова, A.C. Клиническое значение активности миелопероксидазы, глутатионтрансферазы и содержания глутатиона у новорожденных / А.С.Попова, Л.И. Крупицкая, В.Э. Цейликман, А.И. Синицкий, Р.В. Деев, В.П. Дубровская, Т.Н. Голощапова //Вопросы практической педиатрии. - 2013.- № 4,- СЛ 8-20.

16. Колесникова, Л.И. Перекисное окисление липидов и состояние эритрона у новорожденных крысят в норме и при нарушении сенсорно-двигательных рефлексов // Л.И.Колесникова, А.С.Попова, А.И, Синицкий, А.Б. Горностаева, Т.В. Соломатова // Бюлл.эксперим. биологии и медицины. - 2013.- № 10.- С.430-432.

17. Колесникова, Л.И Содержание кортизола в пуповинной крови при различных нарушениях адаптации новорожденных / Л.И.Колесникова, А.С.Попова, А.И. Синицкий, Д.А.Козочкин, А.Б. Горностаева // Вестник РАМН.-2013 - №12.- С.41-43.

18. Kolesnikova, L.I. Lipid peroxidation and state erythron in neonatal rats in normal and inappropriate sensorymotor reflexes / L.I. Kolesnikova, , A.S. Popova, A.LSinitskii, A.B. Gornostaeva, T.V. Solomatova, // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2014. -Vol. 156- №.4- P. 445-447.

Публикации в прочих изданиях:

19. Хасанова, B.B. Ксантиноксидаза как предикгорный показатель дисиндромов у новорожденных / В.В.Хасанова, В.Э.Цейликман, Т.П.Шевлюкова, А.С.Попова // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Росс, конф., посвящ. 80-летию со дня рождения Р.И.Лифшица. - Челябинск, 2009. - С. 203.

20. Цейликман, В.Э. Активность моноамиооксидазы-Б тромбоцитов и показатели перекисного окисления липидов у новорожденных с различными синдромами / В.Э. Цейликман, A.C. Попова, Л.И. Крупицкая, А.И.Синицкий // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Росс, конф., посвящ. 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. - Челябинск, 2009. -С.188-189.

21. Хасанова, В.В.Прогностическое значение ксантиноксидазы (ХО) в развитии дисиндромов у новорожденных / В.В.Хасанова, Т.П.Шевлюкова, ВЗ.Цейликман, А.С.Попова // «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка»: I конгресс акушеров-гинекологов Урала с международным участием. -Екатеринбург, 2009.- С.79.

22. Шевлюкова, Т.П Применение ксантиноксидазы в качестве предикторного фактора в развитии дисиндромов у новорожденных / Т.П.Шевлюкова, В.В.Хасанова, А.С.Попова, Л.И.Крупицкая // «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов»: Конгресс терапевтов «УРАЛ-2009». К 100-летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов.- Тюмень, 2009. -С.129-130.

23. Хасанова, В.В.Современные биохимические исследования в перинатальной медицине / В.В.Хасанова, Т.П.Шевлюкова, А.С.Попова, Л.И.Крупицкая // IV Региональный научн. форум «Мать и дитя». - Екатеринбург, 2010. -С .311-312.

24. Попова, A.C. Энергетический обмен у новорожденных в раннем постнатальном периоде / A.C. Попова // Современные медицинские технологии в здравоохранении. Всерос. научно-практ. конференции с международным участием, посвященной 85-летию Управления здравоохранения Администрации г. Челябинска. -Челябинск, Издательство «Челябинская государственная медицинская академия», 2012. -XI выпуск. - T.2. - С.82-85.

25. Попова, A.C. Миелопероксидаза и глутатионтрансфераза у новорожденных с риском развития синдромов дезадаптации / А.С.Попова, В.П.Дубровская, Т.Н. Голощапова // Сб.научн.-практич. работ, посвященных 70-летию ГКБ № б. - Челябинск, 2013,- С.30-31.

26. Попова, A.C. Содержание серотонина и гистамина в крови новорожденных при развитии нарушений адаптации в раннем постнатальном периоде / A.C. Попова // Здоровье человека в XXI веке. V-я Российская науч.-практ. конф. - Казань, 2013,- С. 741776.

Патент

27. Попова, A.C. / Попова A.C., Крупицкая Л.И., Цейликман В.Э., Синицкий А.И., Горностаева А.Б., Козочхин Д.А., Деев Р.В. // Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции. Патент на изобретение № 2488120. Приоритет изобретения 30 декабря 2011г. Зарегистрировано 20 июля 2013 г.

Список использованных сокращений:

АЛК - аминолевулиновая кислота АТФ аза - аденозинтрифосфатаза

ГП - глутатионпероксидаза

ГТ - глутатион - S - трансфераза ДК - диеновые коныогаты КД и CT - кетодиены и сопряженные триены

КРД - кардиореспираторная депрессия

МАО - моноаминоксидаза МП - миелопероксидаза

белков

липидов

СДР рефлексы СОД ТБК

так

продукты

ЦП-

ШО ХО-

ОМБ - окислительная модификация ПОЛ - перекисное окисление сенсорно-двигательные

- супероксиддисмутаза

- тиобарбитуровая кислота ■АЛ - ТБК - активные

церулоплазмин

- шиффовы основания ксантиноксидаза

Подписано в печать 12.03.2014. Формат 60x84 '/щ. Бумага для множительных аппаратов. Печать на ризографе. Усл. печ. л. 2,56. Тираж 100 экз. Заказ № 89029.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Абрис-принт». 454008, г.Челябинск, Комсомольский пр.,2, оф.203.