Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Местный синтез и содержание хемокинов, регулирующих ангиогенез, при ревматоидном артрите

На правах рукописи

ЖЕБРУН Дарья Анатольевна

Местный синтез и содержание хемокннов, регулирующих ангиогенез, при ревматоидном артрите

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2014

1 3 НОЯ 2014

005554950

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора и в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Тотолян Арег Артемович

Официальные оппоненты:

Снмбирцев Андрей Семенович, доктор медицинских наук, профессор, директор Федерального государственного унитарного предприятия "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства

Козлов Иван Генрихович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии педиатрического факультета Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт ревматологии имени В.А. Насоновой" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИР им. В.А. Насоновой" РАМН)

Защита состоится «/// »^^/¿¿Ь-д/У^ 2014 года в часов на заседании диссертационного совета Д208.046.02 при Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10

Автореферат разослан ОалИкЯ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

я

кандидат медицинских наук ' Новикова Лидия Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Ревматоидный артрит (РА) - хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся поражением соединительной ткани, преимущественно суставов. Особенностью ревматоидного артрита является образование паннуса, представляющего собой гипертрофированную синовиальную оболочку (СО) сустава, инфильтрированную клетками воспаления, где активно идет процесс ангиогенеза. Набор медиаторов, участвующих в развитии и поддержании воспаления и ангиогенеза при ревматоидном артрите, чрезвычайно широк. В последнее время интенсивно изучается роль хемокинов в патогенезе ревматоидного артрита, в том числе их участие в ангиогенезе при формировании и распространении паннуса. Хемокинами называют семейство небольших цитокинов, играющих ключевую роль как в нормальных, так и в патологических процессах в организме (Esche С., 2005). Главной функцией хемокинов является хемотаксис лейкоцитов. Хемокины необходимы на этапе миграции лейкоцитов через стенку сосуда в ткань синовиума, а далее обеспечивают хемотаксис лейкоцитов по градиенту концентрации (Alón R., 2011). Показано, что хемокинами, вовлеченными тем или иным образом в процессы воспаления и ангиогенеза при РА, являются CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, CCL3/MIP-la, CCL4/M1P-1, CCL23/MIP-3, а также CXCLl/Gro-а, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1, CXCL13/BCA-1 и СХЗСЫ/фракталкин (Новиков А.А. и соавт., 2010; Szekanecz Z. et al., 2010). Основными продуцентами СС-хемокинов являются моноциты, Т-лимфоциты и эндотелиальные клетки, СХС-хемокинов - макрофаги, фибробласты и эндотелиоциты. Механизмы индукции ангиогенеза хемокинами могут быть совершенно различными. Так, CCL2/MCP-1 способен симулировать миграцию клеток эндотелия через рецептор CCR2, усиливать экспрессию VEGF (Airoldi I., 2011), а также стимулировать ангиогенез через TGF-p (Ma J. et al., 2001). CCL23/MIP-3 участвует в секреции матриксных металлопротеаз (Son К. et al., 2006), CXCL8/IL-8 прямо вызывает миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток через рецептор CXCR2 (Koch A. et al., 2001). CXC12/SDF-1 продуцируется при гипоксии и стимулирует образование VEGF (Santiago В. et al., 2006). Ангиогенный эффект CCL11/эотаксина был показан на аорте крыс in vivo, a CCL16/SCYA16 усиливал дифференцировку эндотелиоцитов в капилляро-подобные структуры in vitro (Strasly M., 2004; Airoldi I., 2011). Ангиогенные хемокины CXCL9/MIG, CXCLIO/IP-IO и CXCL11/ITAC являются лигандами рецептора CXCR3, и через него подавляют пролиферацию эндотелиоцитов и ингибируют ангиогенез. Они могут

образовывать так называемую регуляторную петлю с VEGF (Boulday G. et al., 2006).

Несмотря на достаточное количество работ в данной области, их подавляющее большинство проводится либо на культурах клеток, либо на экспериментальных моделях индуцированного артрита у животных (Blades М. et al., 2002; Pierer М. et al., 2004). В клинико-иммунологических исследованиях основным биоматериалом являются периферическая кровь или синовиальная жидкость (Hitchon С.А. et al., 2004). Но в связи с локализацией воспалительного процесса внутри сустава наибольший интерес представляет изучение хемокинов именно в синовиальной оболочке. Исследования с использованием синовиальной оболочки немногочисленны и в основном представлены работами зарубежных авторов (Schmutz С. et al., 2005; Yoshida S. et al, 2012). При этом, при исследовании образцов синовиальной оболочки, существенной проблемой является определение нормального, или контрольного уровня мРНК хемокинов, поскольку по этическим соображениям не представляется возможным получить образцы синовиальной оболочки от практически здоровых лиц.

В связи с этим представляется актуальным изучить особенности внутрисуставного синтеза и содержания ангиогенных и ангиостатических хемокинов и их рецепторов у пациентов с ревматоидным артритом. Для этого сначала необходимо провести определение границ значений экспрессии мРНК в относительно «нормальной» синовиальной оболочке, а также значений содержания хемокинов в относительно «нормальной» синовиальной жидкости. В данном случае рациональным представляется исследовать образцы, полученные от пациентов с травмами в анамнезе без признаков системного или внутрисуставного воспалительного процесса и гипертрофии синовиума. В качестве группы сравнения целесообразно исследовать группу пациентов с остеоартрозом (OA), поскольку при остеоартрозе основным патологическим процессом является поражение суставного хряща, а признаки гипертрофии синовиума и ангиогенеза существенно менее выражены, чем при ревматоидном артрите, или отсутствуют.

Цель исследования: изучение иммунопатогенетической роли ангиогенных и ангиостатических хемокинов и их рецепторов в развитии ревматоидного артрита для поиска новых биомаркеров заболевания.

Задачи исследования 1. Определить значения экспрессии мРНК ангиогенных (CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, CCL11/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2, ССЬ26/эотаксин-3, CXCLl/Gro-a, CXCL2/Gro-ß, CXCL3/Gro-y, CXCL5/ENA78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL12/SDF-1, СХСЗСЫ/фракталкин) и

ангиостатических (ССЬ21/8ЬС, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1РЮ, СХСЫ1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1) хемокинов и их рецепторов в синовиальной оболочке пациентов с ревматоидным артритом по сравнению с пациентами с остеоартрозом и контрольной группой.

2. Определить содержание ангиогенных (ССЬ2/МСР-1, ССЬ5/Н.ЛМТЕ8, ССЬ11/эотаксин, СС1_,24/эотаксин-2, ССЬ26/эотаксин-3, СХСЫ-З/Сго, СХСЬ5/ЕКА78, СХСЬ6/ССР-2, СХСЬ7/МАР-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЫ2/50Р-1 и СХЗСЫ/фракталкин) и ангиостатических (ССЬ21/5ЬС, СХСЬ9/МГС, СХСЫ0/1Р10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1) хемокинов в синовиальной жидкости и сыворотке крови пациентов с ревматоидным артритом по сравнению с пациентами с остеоартрозом и контрольной группой.

3. Провести сопоставление относительной экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в синовиальной оболочке, а также содержания хемокинов в синовиальной жидкости и сыворотке крови при ревматоидном артрите с клинико-лабораторными показателями активности заболевания.

4. Оценить информативность содержания хемокинов в синовиальной жидкости как новых биомаркеров для дифференциальной диагностики ревматоидного артрита.

Научная новизна

Впервые была определена экспрессия хемокинов и хемокиновых рецепторов в относительно нормальной синовиальной оболочке, установлены границы контрольных значений экспрессии. Установлены особенности экспрессии генов хемокинов и их рецепторов в синовиальной оболочке при ревматоидном артрите по сравнению с относительно нормальной синовиальной оболочкой и синовиальной оболочкой при остеоартрозе. Впервые проведено определение содержания широкого спектра хемокинов в синовиальной жидкости в контрольной группе, представленной пациентами с травмами суставов в анамнезе без признаков воспалительного процесса и гипертрофии синовиума. Впервые на клиническом материале показана повышенная экспрессия мРНК ССЫ 1/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2 и ССЬ26/эотаксина-3 в синовиальной оболочке и повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 и ССЬ26/эотасксина-3 в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите по сравнению с контрольной группой и остеоартрозом. Впервые показано, что экспрессия мРНК ССЯ2, ССЯ4, СХСШ и СХСЫЗ/ВСА-1 в синовиальной оболочке выше в группе ревматоидного артрита с низкой/средней степенью активности по индексу ЭА528 по сравнению с группой с высокой активностью. Обнаружена корреляционная связь экспрессии мРНК ССЬ2/МСР-1 с индексом ОА528. Впервые обнаружена зависимость экспрессии мРНК рецепторов ССЯ5, СХСЛЗ и СХСЯ5 в синовиальной оболочке от наличия ревматоидного фактора,

причем в группе с серопозитивным ревматоидным артритом экспрессия СХСИЗ была выше, чем в группе с серонегативным, тогда как для ССЯ5 и СХСЯ5, наоборот - ниже. Показана зависимость экспрессии мРНК ССЬ2/МСР-1 и ССЬ24/эотаксина-2 в синовиальной оболочке от рентгенологической стадии ревматоидного артрита. Выявлена корреляционная связь экспрессии СХСЫ1/1-ТАС в синовиальной оболочке с содержанием С-реактивного белка в сыворотке крови. Показано, что уровни СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС в синовиальной жидкости могут быть использованы как новые биомаркеры ревматоидного артрита.

Теоретическая и практическая значимость работы

В данной работе освещены некоторые аспекты иммунопатогенеза ревматоидного артрита: участие ангиогенных и ангиостатических хемокинов и их рецепторов в формировании и поддержании воспаления синовиальной оболочки, а также в процессах ангиогенеза в паннусе. Получены данные о повышенном синтезе мРНК некоторых хемокиновых молекул в синовиальной оболочке, подтвержденные повышенным содержанием этих хемокинов в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите по сравнению с контрольной группой и/или остеоартрозом: ССЬ5/ЯАЫТЕ8, С С Ь2 4/эота кс и н а-2, ССЬ26/эотаксина-3, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1. Результаты говорят в пользу важной роли представителей подсемейства эотаксинов (в частности, ССЬ24/эотаксина-2), а также нескольких лигандов рецептора СХСЯЗ (СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1) в иммунопатогенезе ревматоидного артрита. Полученные результаты позволяют рекомендовать использование границ «нормальных» значений содержания хемокинов в синовиальной жидкости в качестве контрольных значений при обследовании больных с воспалительными заболеваниями суставов различной этиологии. Определение содержания СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС в синовиальной жидкости рекомендуется в качестве дополнительных критериев при дифференциальной диагностике ревматоидного артрита с остеоартрозом в сложных случаях в клинической практике медицинских, лабораторий ревматологического профиля и аутоиммунной диагностики. Показано, что возможным биомаркером активности ревматоидного артрита может являться ССЬб/ЯАМТЕБ, определение его содержания в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом можно рекомендовать для уточнения активности заболевания.

Результаты диссертации используются в цикле лекций и практических занятий в рамках научно-образовательного курса "Высокотехнологичные методы в биомедицинских исследованиях", проводимого в ФГБУ «ФМИЦ имени В.А. Алмазова» для ординаторов и аспирантов.

Получена приоритетная справка на изобретение «Способ диагностики ревматоидного артрита» (заявка №2014121267 от 26.05.14).

Работа была поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга в сфере научной и научно-технической деятельности в 2012 г., Минобрнауки в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 гг. (№14.132.21.1316) и РФФИ («Мой первый грант» №12-04-32237 в 2012-2013 гг.)

Методология и методы исследования

Количество пациентов, у которых были получены биообразцы для исследования, составило 65. Все пациенты проходили стационарное лечение в ФГБУ «ФМИЦ имени В.А. Алмазова» Минздрава России, СПб ГУЗ «Городской гериатрический медико-социальный центр», а также в СПб ГУЗ «Городская туберкулезная больница №2». На проведение исследования было получено согласие Этического комитета ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. В основную группу вошли 28 пациентов с ревматоидным артритом (РА) (средний возраст 44,7±13,4 года), в группу сравнения - 22 пациента с остеоартрозом (OA) (средний возраст 66,0±10,6 лет). Для формирования контрольной группы (относительная «норма») исходно был обследован 21 пациент с травмами суставов в анамнезе. У 15 из них на момент взятия биоматериала отсутствовали признаки воспаления по общелабораторным показателям (нормальные значения СОЭ, СРБ, количества лейкоцитов в анализе крови), и не обнаруживался синовит артроскопически. Эти 15 пациентов были определены в контрольную группу (средний возраст 46,4±22,2 лет). В этом случае СО считалась условно «нормальной». У 6 человек из 21 обнаружились один или несколько признаков воспаления, и данные пациенты исключались из дальнейшего исследования. Постановка диагноза РА осуществлялась на основании клинической картины, рентгенологического исследования (определение стадии заболевания по Штейнброкеру), анамнестических данных, лабораторного обследования (концентрации РФ, АЦЦП, СРБ в сыворотке крови, СОЭ, количества лейкоцитов). Для определения активности РА были использованы индекс DAS28 (Disease activity score-28) и оценка состояния здоровья по 100 миллиметровой визуальной аналоговой шкале (ВАШ). Пациенты с РА подразделялись на подгруппы: с низкой/средней активностью заболевания (DAS28: 2,6 — 5,1) или с высокой активностью (DAS28>5,1); со 2 рентгенологической стадией заболевания или с 3-4.

Материалом для исследования экспрессии хемокинов и их рецепторов служили биоптаты СО, получаемые при плановом оперативном вмешательстве (ревизионная артроскопия, диагностическая артроскопия, эндопротезирование, артроскопическая синовэктомия). В течение нескольких минут после взятия

материала СО замораживались в жидком азоте. Выделение РНК из СО проводилось методом гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции с использованием тризола (TRIzol® Reagent, Invitrogen, США). После выделения РНК проводили ее качественную и количественную оценку методом оптической денситометрии на спектрофотометре Nanodrop ND-100 (NanoDrop Technologies Inc., США) и на биоанализаторе Bioanalyzer 2100 с использованием чипов RNA Nano Chips (Agilent Technologies Inc., США) с определением индекса целостности RIN. В дальнейшую работу поступали образцы, имеющие RIN>6 (РНК высокого качества). РНК обрабатывали ДНКазой (Fermentas, Германия) при 37°С в течение 30 минут и проводили реакцию обратной транкрипции с использованием набора Revertaid (Fermentas, Германия). Методом количественной ПЦР в реальном времени на кДНК проводили определение экспрессии. Реакционная смесь содержала 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, 1,5 мкл каждого праймера (10 пмоль/мкл), 2 мкл флуоресцентного зонда TaqMan (5 пкмоль/мкл), 5 мкл MgCb (25 мМ), 2,5 мкл dNTP (10 мМ), 0,3 мкл Taq-полимеразы, 5,7 мкл деионизированной воды (все реактивы - Синтол, Россия) и 4 мкл кДНК. Реакцию проводили при следующих условиях: 50°С - 5 минут; 95°С - 10 минут; 40 циклов амплификации (96°С - 15 секунд; 58-60°С -60 секунд). Праймеры и зонды подбирались с помощью программ NCBI/Primer-BLAST и Primer Express 3,0 (Applied Biosystems, США) так, чтобы один из праймеров располагался на стыке экзонов, или два праймера располагали в разных экзонах. Для каждого образца реакцию проводили на двух технических репликатах. Анализ результатов проводился по методу относительного подсчета (метод дельта Ct) с нормализацией сразу по двум эндогенным референс-генам (GAPDH и HPRT).

Для определения содержания хемокинов в синовиальной жидкости и сыворотке крови использовали технологию мультиплексного анализа хМАР и наборы с магнитными частицами MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Panel I-III (Millipore, США).

Анализ результатов и статистическую обработку проводили в программах GRAPH Pad Prism 5.0 и 6.02, GMP 11.0 и MS Excel. При наличии нормального распределения использовали параметрические t-тесты для независимых выборок, корреляцию Пирсона, при отсутствии — непараметрический тест Манна-Уитн», ранговую корреляцию Спирмена. Для оценки качества предлагаемых диагностических маркеров РА проводили анализ кривых операционной характеристики (ROC), вычисляли площадь под кривой операционной характеристики (ППК) и оценивали ее по экспертной шкале, проводили расчет отношения правдоподобия положительного результата (ОПП). Достоверными считались различия между группами при р<0,05, что является стандартным уровнем для медико-биологических исследований.

Положения, выносимые на защиту

1. Для ревматоидного артрита характерным является повышенный внутрисуставный синтез хемокинов и их рецепторов, имеющих иммунопатогенетическое значение для регуляции ангиогенеза (ССЬ5/КАЫТЕ5, ССЬ24/эотаксина-2, СХСЫ/Сго-а, СХСЬ6/ССР-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1, ССЯ1, ССЯ2, ССЯ4, ССЯ5, СХС115), и повышенное внутрисуставное содержание ССЬ24/эотаксина-2, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1.

2. Синтез и содержание ангиогенных и ангиостатических хемокинов и их рецепторов взаимосвязаны с активностью и серологическим статусом ревматоидного артрита: экспрессия мРНК ССЬ2/МСР-1 и ССЬ24/эотаксина-2 в синовиальной оболочке взаимосвязана с рентгенологической стадией; экспрессия мРНК СХСЫЗ/ВСА-1, СХСЯ1, ССЯ2, ССЯ4 в синовиальной оболочке или содержание ССЬ5/ЯА1ЧТЕ8 в синовиальной жидкости взаимосвязаны с активностью по ВАБ28/ВАШ; экспрессия мРНК ССЯ1 в синовиальной оболочке или содержание ССЬ2/МСР-1, СХСЬ5/'ЕМЛ78 и СХСЬ7/МАР-2 в синовиальной жидкости взаимосвязаны с наличием антител к цитруллинированному пептиду; экспрессия мРНК ССЯ5, СХСЯЗ, СХСЯ5 в синовиальной оболочке взаимосвязана с наличием ревматоидного фактора; экспрессия мРНК СХСЫ 1/1ТАС в синовиальной оболочке взаимосвязана с концентрацией СРБ в сыворотке крови.

3. На основании данных о повышенном внутрисуставном синтезе и содержании хемокинов, регулирующих ангиогенез, установлено, что три лиганда СХСЯЗ (СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10 и СХСЫ 1/1-ТАС) могут рассматриваться в качестве новых потенциальных биомаркеров ревматоидного артрита, повышенный уровень которых в синовиальной жидкости является информативным критерием для дифференциальной диагностики РА и ОА.

Степень достоверности и апробация результатов О достоверности полученных результатов свидетельствует методическая база: использование современных высокочувствительных молекулярно-биологических, иммунологических методов исследования с автоматизированным учетом и оценкой результатов, использование адекватных методов статистической обработки результатов. Диссертация апробирована на совместном заседании Ученого Совета ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера с участием с членов Проблемной комиссии ФГБУ «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В.А.Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол № 2 от 26 февраля 2014 года). Основные положения исследования были доложены и обсуждены на 13-ой Северо-Западной научно-практической конференции ревматологов "Актуальные вопросы ревматологии" (Санкт-

9

Петербург, 2013), на семинарах ФГБУ «ФМИЦ имени В.А. Алмазова» в 20112013 гг., на конференции Scientific Symposium of the Institut Pasteur International Network «Paving the way for research on Global Health and One Health» (Париж, 2014) и на XIV Северо-Западной научно-практической конференции «Междисциплинарный подход в диагностике и лечении ревматических заболеваний» (Санкт-Петербург, 2014).

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликованы 4 печатные работы в научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикаций основных результатов диссертационных исследований.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно выполнено выделение мРНК из биоптатов СО, проведение обратной транскрипции, подбор праймеров и зондов in silico, определение экспрессии мРНК хемокинов и рецепторов методом ПЦР в реальном времени, статистическая обработка результатов. Данные исследования выполнены в ФГБУ «ФМИЦ имени В. А. Алмазова» Минздрава России. Анализ содержания хемокинов в синовиальной жидкости и сыворотке крови методом мультиплексного анализа проводился автором в ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной иммунологии и сероэпидемиологии Арсентьевой H.A. и Любимовой Н.С. Подбор больных для исследуемых групп, взятие биоматериала и предоставление информации, в соответствии с протоколом исследования осуществляли врачи ФГБУ «ФМИЦ имени В. А. Алмазова» (к.м.н. Маслянский A.JL, к.м.н. Титов А.Г.), СПб ГУЗ «Городской гериатрический медико-социальный центр» (Патрухин А.П), СПб ГУЗ «Городская туберкулезная больница №»2 (к.м.н. Титов А.Г.).

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 21 таблицу и 31 рисунок. Список литературы включает 129 источников, в том числе 104 — на английском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Внутрисуставная экспрессия и содержание хемокинов и их рецепторов в норме

По этическим соображениям достаточно проблематично получить образцы СО и синовиальной жидкости от практически здоровых лиц. В связи с этим, для определения нормальных значений экспрессии мРНК хемокинов и их

10

рецепторов, а также содержания хемокинов в синовиальной жидкости и сыворотке крови была сформирована контрольная группа, в которую вошел 21 пациент с травмами суставов в анамнезе. При этом у 15 из них на момент взятия биоматериала отсутствовали признаки системного или внутрисуставного воспалительного процесса. В этом случае СО считалась относительно «нормальной», и эти 15 пациентов были включены в исследование в составе окончательной контрольной группы. Обнаружено, что в практически нормальной СО экспрессия большинства исследованных молекул наблюдается в крайне низких пределах и составляет десятитысячные (СС1Л 1/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2, ССЬ26/эотаксин-3, СХСЫ1/1-ТАС, СХСЯ5), тысячные (СХСЫЗ/ВСА-1, СС113) или сотые (ССЬ5/ЯАЫТЕ8, СХСЫЛЗго-а, СХСЬЗ/Сго-у, СХСЬ5/ЕЫА78, СХСЬ7/ЫАР-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, ССЯ2, ССЯ4, ССЯ5, СХСШ, СХСЯ2, СХСЯЗ, СХЗСШ, СХЗСЫ/фракталкин) доли от экспрессии мРНК референс-генов. Экспрессия лишь некоторых молекул (ССЬ2/МСР-1, СХСЫ2/80Р-1, ССШ) сравнима с экспрессией генов домашнего хозяйства.

У 9 из 15 пациентов сформированной контрольной группы была получена не только СО, но также синовиальная жидкость и сыворотка крови, в которых проводили определение содержания хемокинов. В синовиальной жидкости нами были выявлены наименьшие значения (пикограммы) для ССЬ26/эотаксин-3 и СХСЫ 1/1-ТАС, а наибольшие (нанограммы) - для ССЬ2/МСР-1, СХСЬ7/ЫАР-2, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ2/50Р-1 и СХЗСЫ/фракталкин. В доступной нам мировой литературе лишь в единичных работах приводятся значения некоторых хемокинов в синовиальной жидкости условно здоровых лиц. В большинстве работ контрольная группа вообще отсутствует, и основная группа (РА) сопоставляется с группой сравнения - ОА. В нашей работе результаты по содержанию целого ряда хемокинов (ССЬ24/эотаксин-2, ССЬ26/эотаксин-3, ССЬ21/5ЬС, СХСЫ-З/Ого, СХСЬ5/ЕИА78, СХСЬб/ССР-2, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ 1/ 1-ТАС, СХСЫ2/ВОР-1 и СХСЫЗ/ВСА-1) в относительно нормальной синовиальной жидкости были получены впервые.

Результаты исследований разных авторов по содержанию хемокинов и цитокинов в нормальной сыворотке крови очень различаются. К тому же, для некоторых хемокинов, таких как СХСЬ8/1Ь8, СХСЫ/Ого-а, ССЫ 1/эотаксин, СХСЫ2/51ЭР-1 и др., наблюдаются различия в содержании даже в зависимости от воздействия таких внешних факторов, как возраст, курение и загрязнение воздуха. В целом, в нашей работе для ССЬ2/МСР-1, ССЫ 1/эотаксина, СХСЬ8/1Ь8, СХСЫ0/1Р-10 и СХСЬ5/ЕКА78 в контрольной группе были показаны результаты, сравнимые с результатами других исследователей. Для некоторых хемокинов концентрации, полученные в ходе нашего анализа,

оказались несколько выше по сравнению с другими работами, в частности, для ССЬ5/ ЯАЫТЕБ, СХСЫ 1/1-ТАС.

2. Внутрисуставная экспрессия и содержание СС-хемокинов и их рецепторов при ревматоидном артрите

По сравнению с условно нормальной СО экспрессия трех из шести проанализированных СС-хемокинов (ССЬ5/11АМТЕ8, ССЫ 1/эотаксина и ССЬ24/эотаксина-2) была выше в группе с РА (Рисунок 1).

30л

' и 20

5 О

ас ж л Г) с

10

ЕЪ

РА яо сравнению с £ остеоартрозом

по сравнению с контрольной группэй ,

СУ

И*

30 20Н

10

.......

ссга

ССИэ

Рисунок 1 - Изменение экспрессии мРНК СС хемокинов и их рецепторов в СО при РА по сравнению с контрольной группой и группой с ОА. Примечание - Значение экспрессии в группах сравнения считается равным 1; * р < 0,05, **р<0,01.

Особенно это было выражено для ССЬ5/ЯАМТЕ8: различия в экспрессии составили примерно в 19 раз. Также было выявлено статистически значимое увеличение экспрессии ССЬ5/ЯАМТЕ8, ССЬ24/эотаксина-2 и ССЬ26/эотаксина-3 в СО при РА по сравнению с ОА. Для всех пяти проанализированных рецепторов экспрессия оказалась повышенной в СО при РА по сравнению с нормальной СО. Аналогичные результаты для всех рецепторов, за исключением ССЯЗ, были получены и при сравнении РА с ОА.

В синовиальной жидкости концентрация ССЬ5/КА>1ТЕ8 и ССЕ26/ эотаксина-3 была выше в группе с РА по сравнению с контрольной группой (Рисунок 2). Концентрация ССЬ24/эотаксина-2 была выше в группе с РА, чем в обеих группах сравнения. Уровень ССЬ2/МСР-1 и ССЬ21/8ЕС в синовиальной жидкости не отличался у больных РА, ОА и в контрольной группе. В сыворотке крови были найдены различия только в концентрации ССЬ5/ЯА]ЧТЕ8 между контрольной группой и РА. При этом уровень этого хемокина был выше в последней группе.

й ми о

lû

1

ЕШ РА

SB ocnseapnws I I контрольная группа

rffn

CCL2i;C'OT3 KÎHH-?

CCL2S/3DT3

Рисунок 2 - Содержание СС-хемокинов в синовиальной жидкости пациентов из группы РА по сравнению с контрольной группой и группой с ОА. Примечание- *р<0,05.

Поиск новых биомаркеров РА остается актуальным до сих пор, т.к. в дебюте РА поражение суставов сходно с поражением при других ревматических и неревматических заболеваниях, и в отдельных случаях возникают сложности при проведении дифференциальной диагностики с ОА, системной красной волчанкой, подагрой, псориатическим атритом, анкилозирующим спондилоартритом, реактивным артритом. Поскольку повышение экспрессии ССЬ24/эотаксина-2 сопровождалось увеличением его содержания в синовиальной жидкости при РА по сравнению как с нормой, так и с ОА, для обоснования значимости ССЬ24/эотаксина-2 как предполагаемого маркера РА в синовиальной жидкости были построены характеристические ROC — кривые и рассчитаны основные диагностические показатели. ППК оказалась равной 0,71 (ДИ: 1-0,91), что говорит о хорошем качестве данной модели. При условном значении специфичности в 87.5%, пороговом значении 876,6 пг/мл, чувствительность такого определения была не очень высокой — 52,6%, а ОПП —4,21 (что говорит о недостаточной ценности данного теста). Но, учитывая, что в данной работе впервые на клиническом материале были показаны повышенный синтез и содержание ССЬ24/эотаксина-2 при РА. то его определение в синовиальной жидкости в качестве диагностического теста требует дальнейшего изучения.

Зависимость экспрессии и содержания СС-хемокинов и их рецепторов при ревматоидном артрите от его активности и серологического статуса

В группе с 3 - 4 рентгенологической стадией РА экспрессия мРНК CCL2/MCP-1 была выше, чем в группе со 2 стадией, и чем в контрольной группе.

! Щ 10

т

□ р«« i \ «НУ! «ЙНЧВЛ; ш стадия 2

Ш рентген©потчес кая стадия 5-4

о оз »

____

--лг--------

I"

сс1г«мср-1 За

36

ШЭ 2, £ - 5.1

1.« п.я-

1

ж ^

6

ССЯ2

ШЗ РЧ>+ СЗ РФ-

ССЯЯ Зг

IН

IК

6 ь о.

.У*

• СС12/МСР-1 р =0,0340

ЛЦЦП К Д

Зя

ЙЭ концентрации АЦЦП ЕЛлп

Зе

5£ са к

Щ 3-о. |2. х

о

о

Г5 = 0,5062

р " 0 ооаз

400Э-

а

с

ЗООЙ-

о са

| 2000-з

о.

х 1000-

о.в

1од ОАв28

ОА520; 2.6-3.1 ОА328>5,1

Зэ

Рисунок 3 - Относительная экспрессия в СО и содержание в синовиальной жидкости СС-хемокинов и их рецепторов в зависимости от клинических характеристик РА.

Примечание - показаны медианы (За, 36, Зв, Зг) или средние значения (Зз).* р<0,05 ** р<0,01. ге — коэффициент корреляции Спирмена.

При разделении больных с РА по величине индекса ЭА828 экспрессия мРНК рецепторов ССЯ2 и ССЯ4 оказалась выше в подгруппе с низкой/средней активностью болезни (ОА828: 2,6 - 5,1), как по сравнению с подгруппой РА с высокой активностью (ОА828>5,1), так и по сравнению с контрольной группой (Рисунок Зв). Экспрессия мРНК ССЯ5 была выше в группе с серонегативным по РФ РА по сравнению с серопозитивным (Рисунок Зг). При этом в обеих

группах РА экспрессия ССЯ5 была значительно выше, чем в нормальной СО. Также была обнаружена положительная корреляция между относительной экспрессией рецептора ССИЛ и концентрацией АЦЦП в сыворотке крови (Рисунок Зд). Содержание хемокинов в синовиальной жидкости также было взаимосвязано с некоторыми клинико-лабораторными характеристиками РА. Во-первых, была показана корреляционная зависимость между концентрацией ССЬ2/МСР-1 в синовиальной жидкости и уровнем АЦЦП в сыворотке крови (Рисунок Зе). Во-вторых, содержание ССЬ5/Р1АМТЕ8 в синовиальной жидкости положительно коррелировало с индексом ЭА828 (Рисунок Зж), а также показателем ВАШ (не показано), при этом оно было выше у пациентов с высокой активностью РА (ОА828>5,1) (Рисунок Зз).

3. Внутрисуставная экспрессия и содержание СХС-хемокинов и их рецепторов при ревматоидном артрите

По сравнению с условно нормальной СО экспрессия 11 из 12 проанализированных СХС-хемокинов была статистически значимо выше в группе с РА (Рисунок 4). Особенно это было выражено для СХСЬ6/ССР-2 (различие в экспрессии более 20 раз) и для СХСЬ9/МЮ (различие в экспрессии около 30 раз).

5 й-

РА Щ •

СГ5 РА V

ЯП.....(Ы ■ ¿Е.....

¿3

&

«V #

#

#

я /

§

Т

#

ж 8-1

§ Ч

£ Ш

« с.

<& ®

11

х 8

а О «

АЛ

аоЗаЛ

-Г с

# /

/ /

р

Рисунок 4 - Изменение экспрессии мРНК СХС хемокинов в СО при РА по сравнению с контрольной группой и группой с ОА.

Примечание — значение экспрессии в группах сравнения считается равным 1; * р < 0,05, **р < 0,01.

При сравнении РА с ОА, было выявлено статистически значимое увеличение экспрессии мРНК 7 из 12 хемокинов: СХСи/вго-а, СХСЬ6/ОСР-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1.

Почти для всех анализируемых хемокинов эти различия были менее выражены, чем при сравнении с контрольной группой и составляли не более 16 раз.

При оценке характера экспрессии мРНК рецепторов было обнаружено значимое увеличение экспрессии СХСЯ2, СХСЯЗ. СХСЯ4 и СХСЯ5 при РА по сравнению с контролем. При сравнении с ОА, экспрессия мРНК была увеличена только для СХСЯ5.

В синовиальной жидкости больных РА концентрации ангиостатических хемокинов СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р10 и СХСЫ 1/1ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1 были значительно выше по сравнению с контрольной группой, а также с группой ОА. Уровень СХСЬ8/1Ь-8 в синовиальной жидкости был выше при РА, чем при ОА, но не отличался от такового в контрольной группе (Рисунок 5).

В сыворотке крови больных РА концентрации ангиостатического хемокина СХСЫЗ/ВСА-1 была значительно выше по сравнению с группой с ОА, а концентрация ангиогенного СХСЬ/71МАР-2 была выше при РА по сравнению с контрольной группой.

! 28000 : 20000

г

гппп РА ШЭ ОА

Г.У.Т1 контрольная группа

В

С10000

с

* о 800

ш

с: 600

н 400

"Т

X 200

ЕЩ РА I

а ш р

СП контрольная групи

СХС|_11Л-ТАС

СХС1.13/ВСА-1

Рисунок 5 — Содержание СХС-хемокинов в синовиальной жидкости пациентов из группы РА по сравнению с контрольной группой и группой с ОА. Примечание - * р < 0,05, **р < 0,01.

Четыре СХС-хемокина показали сочетанное повышение экспрессии в СО и концентрации в синовиальной жидкости при РА по сравнению как с контрольной группой, так и с группой с ОА: СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1. Для них были построены ЯОС - кривые и рассчитаны основные диагностические показатели: чувствительность, специфичность, ППК и ОПП (Рисунок 6, Таблица 1). Оказалось, что три СХС-хемокина - СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС - могут предварительно рассматриваться в качестве дополнительных биомаркеров РА, так как все они обладали достаточно высокой ППК (>0,8), что говорит об очень хорошем качестве модели. Для сравнения информативности выявленных биомаркеров были выбраны такие пороговые значения, при которых достигалась специфичность 87,5%.

Таблица 1 - Уровни содержания потенциальных биомаркеров в группах РА и ОА. Расчет чувствительности и порогового значения при фиксированной специфичности с применением ЯОС-кривых_____

Хемокин Ревматоидный зтрит, пг/мл, Me Остеоаргроз. пг/мл, Me Р ППК (ДИ) НПО Пороговое ¡начение. пг/мл Специфичность, % Чувствительность, %

в

CXCL9/M1G 15653 1717 0,003 0,87(0,66 -1,09) 7,58 4461 87,5 94,7

CXCL10/ IP-10 6759 1306 0,012 0,82(0,59-1,04) 6,32 3893 87,5 78,5

CXCL11/ITAC 75,98 13,20 0.003 0,87(0,66 -1,07) 7,58 31,92 87,5 94,7

CXCL13/BCA-1 329,1 93,22 0,043 0,80(0,55 -1,05) 5,60 213,4 87,5 80,0

CXC.UCI/4P10

s 40-

ь

-Г/*

1 - Специфичность % CXCL11/ITAC

# S> Ф 4

1 Специфичность, % CXCL13'ВСА-1

1 - Специфичность. %

^ £

Î - Специфичное |ь, с

Рисунок 6 - ROC-кривые, характеризующие зависимость чувствительности и специфичности определения СХС хемокинов в синовиальной жидкости, при сравнении групп с РА и ОА.

Примечание - ППК - площадь под характеристической ROC кривой.

Наибольшая чувствительность достигалась для CXCL9/MIG и CXCL11/I-ТАС (94,74%), для CXCL13/BCA-1 она составила 80%, и для CXCL10/IP-10 -78,5%. Практически для всех аналитов ОПП составляло > 6, что говорит о хорошей диагностической информативности и что данные тесты могут стать полезными в диагностике РА. Однако данные подходы, несомненно, требуют дальнейшего изучения, валидации и стандартизации.

СХСЬ9/МГС, СХСЫ0/1Р-10 и СХСЫ 1/1-ТАС - это три родственных молекулы, представляющие собой индуцируемые интерфероном хемокины с ангиостатическими функциями, которые опосредуют свое действие через рецептор СХСЯЗ. Видимо, такое увеличение экспрессии и содержания ангиостатических медиаторов может отражать компенсаторные процессы при патологическом ангиогенезе и воспалении внутри СО.

Зависимость экспрессии и содержания СХС-хемокинов и их рецепторов при ревматоидном артрите от его активности и серологического статуса

Экспрессия СХСЫЗ/ВСА-1, а также рецептора СХСШ оказалась ниже в подгруппе РА с БА828>5,1, чем в подгруппе с ОА828: 2,6 - 5,1 (Рисунок 7а).

- 0 3

I «

Л £

о в

£ & -0.2-

0.10.0-

ш »«еде

7а

Т в

ЗСШЛТАС

р - 3.0

?{1 40 ВП

СРБ. нг«1 7д

76

ШБ РФ+ I-1 Рф- Й и

8 I

II

СХСЯ9

¡¡»«.9574

о 1 г з

Ьд РФ. ыЕшп

ь

5 В Ш-

ка АЦЦ ! I -

га

Те

Рисунок 7 - Относительная экспрессия в СО и содержание в синовиальной жидкости СХС-хемокинов и их рецепторов в зависимости от клинических характеристик РА.

Примечание - показаны медианы (7а, 7в) или средние значения (76, 7е ). р<0,05, **- р<0,01. ге - коэффициент корреляции Спирмена. г - коэффициент корреляции Пирсона.

При сравнении пациентов с серопозитивным и серонегативным по РФ РА, экспрессия мРНК рецепторов CXCR3 и CXCR5 отличалась: в группе с серопозитивным РА экспрессия CXCR3 была выше, чем в группе с серонегативным, но не отличалась от таковой в контрольной группе, а для CXCR5, наоборот — экспрессия была выше в группе с серонегативным РА, при этом в обеих подгруппах РА превышала экспрессию в группе контроля (Рисунок 76, 7в). В подтверждение этих результатов для CXCR5 была показана отрицательная корреляция между экспрессией и уровнем РФ в сыворотке крови (Рисунок 7г). Для относительной экспрессии CXCL11/I-TAC найдена положительная корреляционная зависимость с содержанием СРБ в сыворотке крови (Рисунок 7д). Содержание CXCL5/ENA78 и CXCL7/NAP-2 различалось в синовиальной жидкости пациентов с серопозитивным и серонегативным по АЦЦП ревматоидным артритом (Рисунок 7е).

4. Внутрисуставная экспрессия и содержание СХЗС-хемокинов и нх рецепторов в синовиальной оболочке при ревматоидном артрите

Экспрессия СХЗСЫ/фракталкина и его рецептора CX3CR1 не отличалась в группе РА по сравнению с контрольной группой. В то же время, по сравнению с ОА, экспрессия мРНК СХЗСЫ/фракталкина была несколько снижена. Также не было найдено различий в содержании СХЗСЫ/фракталкина в синовиальной жидкости или в сыворотке крови при РА по сравнению как с контрольной группой, так и с группой с ОА. Данные о роли СХЗСЫ/фракталкина в иммунопатогенезе РА достаточно противоречивы. В последнее время появляются работы, свидетельствующие о его участии в процессах ангиогенеза и воспаления при РА, описывающие повышенную экспрессию этого хемокина и его рецептора в синовиуме больных РА, а также его повышенное содержание в синовиальной жидкости (Ruth J., 2001). Однако есть работы, в которых не было показано достоверного увеличения экспрессии СХЗСЫ/фракталкина в СО при РА по сравнению с пациентами без РА (Schmutz С., 2005). Более того, при исследовании клеток периферической крови экспрессия СХЗСЫ/фракталкина на CD4+, на CD8+ и на CD56+ клетках не отличалась у пациентов с РА и здоровых доноров, а количество CD 14+ моноцитов, экспрессирующих СХЗСЫ/фракталкин было выше у здоровых доноров (Blaschke S., 2003). Недавно было показано, что при ОА СХЗСЫ/фракталкин также играет важную роль, вызывая хемотаксис и миграцию фибробластов, что возможно и объясняет относительно высокий уровень экспрессии этого хемокина в СО при ОА (Klosowska К., 2009).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе были установлены контрольные показатели экспрессии мРНК СС-, СХС- и СХЗС-хемокинов и их рецепторов в относительно нормальной синовиальной оболочке, было определено содержание ряда хемокинов в относительно нормальной синовиальной жидкости и сыворотке крови. Был проведен анализ внутрисуставной экспрессии и содержания широкого ряда хемокинов и их рецепторов у больных ревматоидным артритом по сравнению с контрольной группой и пациентами с остеоартрозом. Показано, что в синовиальной оболочке в группе с ревматоидным артритом повышена экспрессия хемокинов ССЬб/ЯАМТЕБ, ССЬ24/эотаксин-2, СХСЫЛЗго-а, СХСЬ5/ЕЫА78, СХСЬ6ЛЗСР-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1 по сравнению с контрольной группой и группой с остеоартрозом (Таблица 2).

В синовиальной жидкости повышено содержание ССЬ24/эотаксина-2, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1 при ревматоидном артрите по сравнению с контрольной группой и группой с остеоартрозом (Таблица 2). Данные для подсемейства эотаксинов (повышенная экспрессия мРНК ССЫ 1/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2 и ССЬ26/эотаксина-3 в синовиальной оболочке и повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 и ССЬ26/эотасксина-3 в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите по сравнению с контрольной группой и остеоартрозом) были получены впервые на клиническом материале и требуют дальнейшего изучения.

На основании повышенного содержания в синовиальной жидкости в совокупности с повышенной экспрессией мРНК в синовиальной оболочке при ревматоидном артрите как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой с остеоартрозом было выделено 5 потенциальных маркеров ревматоидного артрита: ССЬ24/эотаксин-2, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС и СХСЫЗ/ВСА-1. По результатам ЯОС-анализа показано, что три СХС-хемокина - СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС - могут предварительно рассматриваться в качестве дополнительных биомаркеров ревматоидного артрита, так как все они обладали достаточно высокими показателями ППК, ОПП и чувствительности.

Установлены зависимости между экспрессией хемокинов и хемокиновых рецепторов или содержанием хемокинов в синовиальной жидкости и показателями активности ревматоидного артрита: экспрессия мРНК СХСЫЗ/ВСА-1, СХСШ, ССЯ2, ССЯ4 в синовиальной оболочке и содержание ССЬ5/ЯАМТЕБ в синовиальной жидкости зависит от активности по ОА528, содержание ССЬ5/ЯАКТЕ8 в синовиальной жидкости положительно коррелирует с индексом ОАБ28 и показателем ВАШ, экспрессия мРНК

ССЬ2/МСР-1 отрицательно коррелирует с ОА828, а экспрессия мРНК рецептора СХСИЛ отрицательно коррелирует с ВАШ.

Таблица 2 - Изменение экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в синовиальной оболочке и содержания хемокинов в синовиальной жидкости и сыворотке крови в группе с ревматоидным артритом по сравнению с группой с остеоартрозом и контрольной группой

Хемокнн, хемокиновый рецептор РА по сравнению с контрольной группой РА по сравнению с ОА

Экспрессия мРНКв СО Содержание в синовиальной жидкости Содержание в сыворотке крови Экспрессия мРНКв СО Содержание в синовиальной жидкости Содержание в сыворотке крови

ССЬ2/МСР-1 4—» > Т

ССЬ5/11АЫТЕ5 тт т 1 ТТ

ССЫ 1/эотаксин Т > 4—*

ССЬ24/)отаксин-2 тт т тт т

ССХ26/')отаксш1-3 т тт 4~* 4—►

ССЬ21/5ЬС 4—► 4-> «—► 4—*

СХСиЛЗго-а тт тт

СХСЬ2/Сго-Р т <—> <-> 4—► 4—+

СХС1-3/Ого-у т «-» «—» >

СХСЬ5/ЕКА78 т т ч—► <—►

СХ(Х6/ССР-2 тт 4—> 4—> тт

СХСЬ7/ЫАР-2 ► ТТ <—►

СХСЬ8/1Ь-8 т тт т

СХСЬ9/МЮ тт тт <—» тт тт

СХСЫ0/1Р-10 тт тт <—У тт т

СХСЫ1/1-ТАС тт тт тт тт 4—*

СХС1Л2/50Р-1 т *—► 4—► 4—* 4—►

СХСЫЗ/ВСА-1 тт тт <—> т Т Т

С ХЗС1.1/фрактал кии <—► 1 *

ССЯ1 тт - - тт -

ССЯ2 т — — тт - —

ССЯЗ т _ — <-► — —

ССЯ4 тт — — т — —

ССК5 тт _ — тт — —

СХСЯ1 — — <-» — —

СХСЯ2 т — — <—* — —

СХСКЗ т — - — -

СХСЯ4 т _ — . * — —

СХС115 тт _ — тт — -

СХЗСЯ1 - - - -

Примечание - содержание рецепторов не определялось

Экспрессия мРНК ССЬ2/МСР-1 и ССЬ24/эотаксина-2 в синовиальной оболочке зависит от рентгенологической стадии ревматоидного артрита. Обнаружены взаимосвязи синтеза и содержания хемокинов или хемокиновых рецепторов с серологическим статусом ревматоидного артрита: экспрессия мРНК ССШ в синовиальной оболочке и содержание ССЬ2/МСР-1, СХСЬ5/ЕЫА78 и СХСЬ7/ЫАР-2 в синовиальной жидкости взаимосвязаны с содержанием АЦЦП в сыворотке крови, а экспрессия мРНК ССЯ5, СХСЯЗ, СХСЯ5 в синовиальной оболочке — с содержанием ревматоидного фактора в сыворотке крови. Таким образом, результаты данной работы говорят в пользу важной роли ангиогенных и ангиостатических хемокинов и их рецепторов в иммунопатогенезе ревматоидного артрита. В частности, наибольший интерес по результатам работы представляют ССЬ24/эотаксин-2, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1, которые могут служить биомаркерами заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при ревматоидном артрите по сравнению с контрольной группой в синовиальной оболочке повышена экспрессия мРНК хемокинов ССЬ5/ЯАКТЕБ, ССЫ 1/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2, СХСЫ/Сго-а, СХСЬ2ЛЗго-р, СХСЬЗ/Ого-у, СХСЬ5/Е^78, СХСЬ6/ССР-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЫ2/80Р-1, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1, а также рецепторов ССШ, ССЯ2, ССЯЗ, ССЯ4, ССЯ5, СХС112, СХС113, СХСЯ4, СХСЯ5.

2. Установлено, что при ревматоидном артрите по сравнению с остеоартрозом в синовиальной оболочке повышена экспрессия мРНК хемокинов ССЬ5/ЯАОТЕ5, ССЬ24/эотаксин-2, ССЬ2б/эотаксин-3, СХСЫ/Сго-а, СХСЬ6/ССР-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1, а также рецепторов ССШ, ССЯ2, ССЯ4, ССЯ5 и СХСК5.

3. При ревматоидном артрите по сравнению с контрольной группой в синовиальной жидкости повышено содержание ССЬ5/11АМТЕ8, ССЬ24/эотаксина-2, ССЬ26/эотаксина-3, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1, а по сравнению с группой с остеоартрозом -содержание ССЬ24/эотаксина-2, СХСЬ8/1Ь-8, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1-ТАС, СХСЫЗ/ВСА-1.

4. Установлена зависимость между продукцией некоторых хемокинов или хемокиновых рецепторов и показателями активности ревматоидного артрита: экспрессией мРНК ССЬ2/МСР-1, ССЬ24/эотаксина-2 в синовиальной оболочке и рентгенологической стадией; экспрессией мРНК СХСЫЗ/ВСА-1, СХСЯ1, ССЯ2, ССЯ4 в синовиальной оболочке или содержанием ССЬ5/11АМТЕ8 в синовиальной жидкости и активностью по РА878/НАIII

5. Установлена зависимость между продукцией некоторых хемокинов или хемокиновых рецепторов и серологическим статусом ревматоидного артрита: экспрессией мРНК ССЯ1 в синовиальной оболочке или содержанием ССЬ2/МСР-1, СХСЬ5/ЕЫА78 и СХСЬ7/ЫАР-2 в синовиальной жидкости и содержанием антицитруллиновых антител в сыворотке крови; экспрессией мРНК ССЯ5, СХСЯЗ, СХСЯ5 в синовиальной оболочке и содержанием ревматоидного фактора в сыворотке крови.

6. Установлена зависимость между экспрессией мРНК СХСЫ1/1ТАС в синовиальной оболочке и концентрацией СРБ в сыворотке крови при ревматоидном артрите.

7. При проведении дифференциальной диагностики между ревматоидным артритом и остеоартрозом наибольшая диагностическая информативность установлена для показателей содержания в синовиальной жидкости трех лигандов СХСЯЗ: СХСЬ9/МЮ, СХС1Л0/1Р-10 и СХСЫ 1/1-ТАС

Практические рекомендации

Определенные в данной работе границы «нормальных» значений содержания хемокинов в синовиальной жидкости рекомендуется использовать в качестве контрольных показателей при обследовании больных с воспалительными заболеваниями суставов различной этиологии (ревматоидный артрит, остеоартроз, псориатический артрит, спондилоартрит и пр.). Определение содержания СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10 и СХСЫ 1/1-ТАС в синовиальной жидкости рекомендуется использовать для дифференциальной диагностики ревматоидного артрита, что наиболее значимо в дебюте заболевания. Также определение концентрации ССЬ5/ЯАЫТЕ8 в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите рекомендуется использовать для уточнения активности заболевания.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Полученные данные о ведущей роли хемокинов, регулирующих ангиогенез, и впервые установленный повышенный синтез и содержание ССЬ24/эотаксина-2 являются основой для более детального изучения роли этих хемокинов в развитии РА. Полученные в работе контрольные значения показателей в СО и синовиальной жидкости можно использовать для проведения дальнейших клинико-иммунологических исследований при различных заболеваниях суставов. Работа заложила основы для дальнейшего поиска биомаркеров ревматоидного артрита среди хемокинов. Учитывая полученные результаты о повышенном синтезе лигандов СХСЯЗ, необходимо провести изучение роли СХСЯЗ+ клеток периферической крови, синовиальной жидкости и синовиальной оболочке при ревматоидном артрите.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жебрун, Д.А. Определение мРНК ангиогенных и ангиостатических хемокинов и их рецепторов в синовиальной оболочке методом количественной ПЦР в реальном времени / Д.А. Жебрун, A.JI. Маслянский, А.Г. Титов, А.П. Патрухин, A.A. Костарева, И.С. Гольцева, Арег А. Тотолян // Медицинская иммунология. — 2013. — Т. 15. — №6. — С. 525-534.

2. Жебрун, Д.А. Содержание некоторых хемокинов в нормальной синовиальной жидкости / Д.А. Жебрун, A.JÏ. Маслянский, А.Г. Титов, А.П. Патрухин, A.A. Костарева, И.С. Гольцева, H.A. Арсентьева, Н.С. Любимова, Арег А. Тотолян // Медицинская иммунология. - 2014.- Т. 16. -№2. -С. 189-194.

3. Жебрун, Д.А. Синтез ангиогенных и ангиостатических СХС-хемокинов и их рецепторов в синовиальной оболочке при ревматоидном артрите / Д.А. Жебрун, Арег А. Тотолян, А.Л. Маслянский, А.Г. Титов, А.П. Патрухин, A.A. Костарева, И.С. Гольцева // Цитокины и воспаление. — 2014. - Т. 13. - № 2. - С. 39-44.

4. Жебрун, Д.А. Синтез некоторых СС-хемокинов и их рецепторов в синовиальной оболочке при ревматоидном артрите / Д.А. Жебрун, Арег А. Тотолян, А.Л. Маслянский, А.Г. Титов, А.П. Патрухин, A.A. Костарева, И.С. Гольцева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2014. - Т. 158. - № 8. - С. 153-158.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЦЦП - антитела к циклическому цитруллинированному пептиду ВАШ — визуально-аналоговая шкала ДИ — доверительный интервал OA — остеоартроз

ОПП — отношение правдоподобия положительного результата

ППК — площадь под характеристической кривой

РА — ревматоидный артрит

РФ — ревматоидный фактор

СО — синовиальная оболочка

СОЭ - скорость оседаний эритроцитов

СРБ - С-реактивный белок

CCR — СС chemokine receptors (рецептор СС-хемокинов) CD — cluster of differentiation (кластер дифференцировки) Ct — пороговый цикл

CXCR - СХС chemokine receptors (рецептор СХС-хемокинов) CX3CR — СХЗС chemokine receptor (рецептор СХЗС-хемокинов) DAS28 - Disease Activity Score 28 (индекс активности заболевания - 28)

ROC — кривая операционной характеристики (receiver-operating-characteristic curve)

VEGF - Vascular endothelial growth factor (Фактор роста эндотелия сосудов) хМар — мультиплексный анализ

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор глубоко признателен к.м.н. Костаревой A.A. за помощь в налаживании контактов с врачами-хирургами и профессиональные советы при выполнении работы, к.м.н. Васильевой Е.В. за помощь в статистическом анализе результатов, Арсентьевой H.A. и к.м.н. Любимовой Н.С. за помощь в проведении мультиплексного анализа, врачам-травматологам и ревматологам к.м.н. Маслянскому А.Л., к.м.н. Титову А.Г., Патрухину А.П., сотрудникам отделения ревматологии ФГБУ «ФМИЦ имени В. А. Алмазова», сотрудникам СПб ГУЗ ГГЦ и СПБ ГУЗ ГТБ №2 за осуществление подбора пациентов и взятие биоматериала.

ш

Подписано в печать 29.10.2014г. Формат 60x84/16 У.п.л. 1,75 Уч.-изд.л 1,75 Тир. ЮОэкз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. toroussel@mail.ru Зак. № 13559 от 29.10.2014г.