Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Диагностическая значимость лабораторных тестов, используемых в диагностике иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом

На правах рукописи

Топчиева Зинаида Серафимовна

Диагностическая значимость лабораторных тестов, используемых в диагностике иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом

14.00,46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов-2007

003158536

работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель;

доктор медицинских наук,

профессор Гладили» Геннадий Павлович.

Официальные оппоненты;

доктор медицинских наук.

профессор Коршунов Геннадий Васильевич;

кандидат медицинских наук Бережнова Ирина Анатольевна.

Ведущая организация:

ГОС ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей Росздрава»,

Защита состоится « О&Ы^йКЯ.2007 года __ час о и

на заседании диссертационного совета К 208.094.01 при ГО У ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу: 410012, г.Саратов, ул.Б.Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан «_» ____2007.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Бородулин В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ревматоидный артрит является распространенным ревматическим заболеванием, приводящим к инвалидизации и сокращению продолжительности жизни больных (Беневоленская Л И, Бржезовский М М, 1988)

По уровню первичной инвалидизации в нашей стране заболевания костно-мышечной системы стоят на третьем месте после болезней системы кровообращения и злокачественных новообразований, а в контексте причин временной потери трудоспособности уступают только заболеваниям верхних дыхательных путей, травмам и отравлениям (Насонова В А, Фоламее-ва О М, Амирджанова В Н, 1992)

В настоящее время ревматоидный артрит рассматривается как аутоиммунное заболевание Воспалительный процесс при ревматоидном артрите представляет собой каскад биохимических и иммунологических процессов Характерной особенностью ревматоидного артрита является дисбаланс между продукцией провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, у-ИНФ) и противовоспалительных ИЛ-4, ИЛ-10 и др (Насонова В А , Бунчук Н В , 2001)

В последние годы широко изучается значение различных клинических, биохимических и инструментальных показателей в оценке активности болезни и раннего прогнозирования исходов ревматоидного артрита до развития клинических и рентгенологических признаков прогрессирования костной деструкции (Насонов Е Л , Чичасова Н В , 1997)

Ведущая роль в патогенезе ревматоидного артрита отводится нарушениям клеточного и гуморального иммунитета, для исследования которых применяется ряд методов, в том числе определение различных субпопуляций лимфоцитов (Насонова В А, Бунчук Н В , 1997)

В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании патогенеза ревматоидного артрита, а также в разработке современных технологий и средств иммунодиагностики, им-муномониторинга и иммунопрогнозирования, составляющих, по

мнению большинства исследователей, основу современных лечебно-реабилитационных программ Тем не менее, проблемы ранней и дифференциальной диагностики, критерии прогнозирования течения исхода заболевания, выбор обоснованной схемы этиопатогенетического лечения таких больных сохраняют свою актуальность (Сучков С В и соавт, 2004)

Однако при отборе наиболее достоверных диагностических и лечебных технологий из потока разнообразных предложений целесообразно принимать во внимание лишь те источники, которые отвечают определенным критериям, обеспечивающим «качество доказательности» (Флетчер С , Вагнер Э , 1998)

Лабораторный тест должен отвечать требованиям клинической информативности, своевременности и аналитической надежности (Меньшиков В В , 2003) Степень патогномоничности лабораторных отклонений весьма вариабельна, так как формы и выраженность самого патологического процесса различны от одного случая заболевания к другому Одним из наиболее используемых подходов в настоящее время является расчет диагностической чувствительности и специфичности лабораторного теста Алгоритмы и руководящие принципы клинической практики разрабатываются для того, чтобы клиницисты использовали принцип последовательности в выборе диагностических тестов Исследования показывают, что доля клинически информативных тестов и экономическая эффективность лабораторного обследования повышаются, когда стандартная комбинация тестов расширяется за счет осмысленного добавления к ней некоторых специфических тестов соответственно характеру патологии (Такетига V , 1999)

Цель исследования. Изучение диагностической значимости лабораторных тестов, используемых в диагностике иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом, создание алгоритма диагностики этих нарушений Задачи исследования.

1 Оценить характер и степень нарушения основных звеньев иммунной системы при ревматоидном артрите

2 Оценить уровень цитокинов (ФНО-ос, у-ИНФ, ИЛ-4) при ревматоидном артрите

3 Выявить особенности иммунопатологии при ревматоидном артрите в зависимости от степени активности, серопринад-лежности заболевания

4 Оценить диагностическую ценность лабораторных исследований, используемых в диагностике ревматоидного артрита

5 Разработать алгоритм диагностики ревматоидного артрита

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Ревматоидный артрит является заболеванием, обусловливающим ряд характерных изменений в функциональном состоянии основных звеньев иммунитета клеточного, гуморального Выраженность этих изменений зависит от степени активности воспалительного процесса

2 Больные ревматоидным артритом имеют достоверно повышенный уровень цитокинов (ИЛ-4, у-ИНФ, ФНО-а), который возрастает с увеличением степени активности процесса

3 Анализ диагностической значимости лабораторных тестов, определение корреляционных связей между показателями активности ревматоидного артрита и показателями иммунных нарушений позволили определить группу наиболее информативных лабораторных тестов и разработать алгоритм диагностики иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом

Научная новизна исследования. Определены сравнительная информативность и диагностическая ценность гематологических, иммунологических показателей, уровня цитокинов у больных ревматоидным артритом

Разработан диагностический алгоритм иммунных нарушений при ревматоидном артрите

Практическая значимость Выявлены наиболее информативные лабораторные тесты фактор некроза-а, иммунорегуля-торный индекс, интерлейкин-4, у-интерферон, лейкоцитарно-Т-лимфоцитарный индекс, которые могут быть включены в стандарт обследования больных ревматоидным артритом Разработанный алгоритм диагностики иммунных нарушений при ревматоидном артрите позволяет оценить функциональное состояние

различных звеньев иммунной системы, используя только информативные для данной категории больных методы

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции общества молодых ученых и студентов клиники госпитальной хирургии лечебного факультета «Актуальные вопросы медицины» (Саратов, 2003), на областной научно-практической конференции специалистов по клинической лабораторной диагностике (Саратов, 2004), на заседании общества специалистов по клинической лабораторной диагностике (Тамбов, 2005, 2006), на научно-практическом симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2007)

По теме диссертации опубликованы 3 работы

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в практическую работу

- Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО Саратовского ГМУ,

- кафедры клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС СГМУ,

- терапевтического отделения и клинико-диагностической лаборатории МЛПУ «Городская больница № 4» г Тамбова

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, включая 22 таблицы, 1 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы, включающего 113 отечественных и 73 зарубежных источника

Содержание работы

Материалы и методы исследований. В соответствии с поставленными целью и задачами были обследованы 70 больных ревматоидным артритом, находившихся на лечении в ревматологическом отделении Тамбовской областной больницы Критериями включения были достоверно установленный ревматоидный артрит, а также согласие пациента на участие в исследова-

нии. Критериями исключения являлись наличие тяжелой сопутствующей патологии, наличие обострения хронических процессов в момент исследования, прием гормональных препаратов, беременность Контрольную группу составляли 24 практически здоровых лица, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными равматоидным артритом, не страдающих сахарным диабетом, бронхиальной астмой, аллергическими заболеваниями

Диагноз «ревматоидный артрит» устанавливался в соответствии с критериями Американской ревматологической ассоциации Возраст больных к началу исследования в среднем составил 47 ± 9 лет, длительность заболевания в среднем составила 5,3 ± 4,3 года Большинство больных составляли женщины -52 человека (74%)

У 19 (27,1%) пациентов была диагностирована 1-я степень активности ревматоидного артрита Большинство пациентов -27 человек (38,5%) имели 2-ю степень активности ревматоидного артрита 3-я степень активности ревматоидного артрита установлена у 24 больных (34,4%) Всем больным проводилось лабораторное обследование, включающее клинический анализ крови, биохимический анализ крови (билирубин, креатинин, холестерин, общий белок и белковые фракции, аланин и аспартат-аминотрансферазы, серомукоиды), общий анализ мочи

Концентрацию С-реактивного белка в сыворотке крови больных ревматоидным артритом определяли иммунотурбоди-метрическим методом с использованием наборов реактивов фирмы «Хоффманн-ла-Рош» на биохимическом анализаторе «Кобас интегра-400», ревматоидный фактор (РФ) определяли полуколичественно латекс-тестом (набор реактивов ДАС-БреЙготес!)

Иммуноглобулины класса А, М, в исследовали методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини

Для определения циркулирующих иммунных комплексов использовали физико-химический метод осаждения их раствором полиэтиленгликолем (Гриневич Ю А , Алферов АН, 1981)

Фагоцитарную функцию нейтрофильных гранулоцитов определяли с помощью теста восстановления нитросинего тетразо-лия в сочетании с дополнительной функциональной нагрузкой в виде стимулятора - зимозана (Виксман М Е , Маянский А Н , 1979)

Состояние клеточного звена иммунной системы оценивали путем определения популяций лимфоцитов и субпопуляций Т-лимфоцитов в реакции непрямой иммунофлюоресценции При этом использовали 5 видов моноклональных антител СБ3, СБ4, СБ8, СБ 16, СО20

Определение мембранного фенотина лимфоцитов периферической крови (КешЬегг Е Ь а1, 1979) включает в себя выделение лимфоцитов в градиенте плотности, а также постановку непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции в центрифужных пробирках

Методика выделения лимфоцитов в градиенте плотности. В центрифужную пробирку вносится 3 мл раствора Фиколл-Гипака, на его поверхность осторожно наслаивается 6-7 мл предварительно разведенной физраствором (11) крови Смесь центрифугируется в течение 30 мин при комнатной температуре (+18-25 °С) По окончании центрифугирования незамедлительно собирается с визуально различимой границы раздела двух жидких фаз лимфоцитарное «кольцо», лимфоциты трижды промываются забуферным (РН 7,4) физиологическим раствором (ЗФР), затем ресуспендируются в 1,0 мл ЗФР, затем подсчитывается количество клеток в камере Горяева

Методика постановки непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции в центрифужных пробирках. Клеточные суспензии изолированных лимфоцитов незамедлительно использовали для проведения реакции иммунофенотипирова-ния В центрифужную пробирку вносили 20 мкл рабочего раствора моноклональных антител и 50 мкл предварительно подготовленной клеточной суспензии, содержащей 0,8-1,2 млн клеток в 1 мл Инкубировали 30 минут при комнатной температуре (+18-25 °С), затем 1 раз отмывали в 1 мл ЗФР, осаждали центрифугированием в течение 7-10 минут Супернатант удаляли,

а клеточный осадок суспендировали в 20 мкл рабочего раствора ФТЦ-конъюгата и инкубировали в течение 30 минут при 1 +2-8 °С После двукратного отмывания ЗФР клетки суспендировали в 50 мкл раствора глицерина; результаты реакции учитывались под микроскопом Для этого в полоске парофильма размером с предметное стекло микроскопа трубчатым пробойником пробивали 12-16 отверстий диаметром 5 мм, перфорированную полоску помещали на обезжиренное предметное стекло и слегка подогревали в пламени газовой горелки, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл рабочего раствора поли-Ь-лизина и инкубировали 30 минут в термостате при 1 +37 °С

Затем раствор поли-Ь-лизина удаляли с помощью пипетки, стекло подсушивали на воздухе

В лунки вносили по 50 мкл клеточной суспензии (1-2 млн клеток в 1 мл) и инкубировали в течение 30 минут во влажной камере в термостате при I + 37 °С для оседания клеток и прилипания их к стеклу Затем стекло промывали ЗФР, и в лунки добавляли по 20 мкл рабочего раствора соответствующих моно-клональных антител, инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре во влажной камере

По окончании инкубации стекло дважды промывали ЗФР и в лунки вносили по 20 мкл рабочего раствора ФИТЦ-конъюгата, инкубировали в течение 30 минут во влажной камере при температуре +2-8 °С По окончании инкубации стекла четырежды промывали ЗФР

Для оценки иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом были рассчитаны и использованы индексы иммуноре-гуляторный индекс (С1)47СВ8"), индексы помощи (3-лимфо-цитам (СБ4+/СВ1б+, С087СБ,6+), лейкоцитарно-Т-лимфоци-тарный индекс (Л/С03+) Состояние цитокинового уровня в сыворотке крови больных ревматоидным артритом оценивали, определяя содержание ИЛ-4, у-ИНФ, ФНО-а с использованием имму-ноферментных тест-систем ЗАО «Вектор Бест», г.Новосибирск

Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови (ИЛ-4, у-ИНФ, ФНО-а). Длгя определения уровня цито-

кинов в сыворотке крови использовали иммуноферментные тест-системы ЗАО «Вектор Бест», г Новосибирск

Подготовили необходимое количество стрипов Вносили во все лунки по 100 мкл раствора для разведения В лунки А-1, В-1, С-1, D-l, Е-1, F-l, G-l, Н-1 вносили по 100 мкл исследуемых проб Стрипы закрывали, плотно прижав пленку, помещали в шейкер Инкубировали 120 минут при t +37°С Затем стрипы промывали 5 раз раствором для промывки, в каждую лунку при этом вносили не менее 300 мкл раствора в процессе одного промывания В каждую лунку стрипов вносили по 100 мкл конъю-гата № 1, помещали в шейкер Инкубировали 60 минут при t +37°С Затем 5 раз промывали стрипы и вносили по 100 мкл в каждую лунку конъюгата № 2, инкубировали 30 минут при t +37°С

Промывали стрипы 5 раз раствором для промывки Вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) Стрипы помещали в защищенное от света место и оставляли при комнатной температуре (18-15 °С) на 30 минут Затем реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и немедленно измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 450 нм

Строили калибровочный график, с помощью которого определяли концентрацию цитокина в исследуемых пробах (пг/мл)

Для определения информативности лабораторных тестов, используемых в диагностике ревматоидного артрита, вычисляли диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность (Меньшиков В В, 1996), коэффициент диагностической значимости, степень изменения параметров (Земсков А М , 1997)

Диагностическая чувствительность - это процентное выражение встречаемости истинно положительных результатов у больных данной болезнью Диагностическая специфичность позволяет оценить процентное выражение частоты истинно отрицательных результатов у здоровых лиц

Для более полного представления участия каждого из компонентов патогенеза ревматоидного артрита нами был использован

расчетный показатель степени изменения параметров, который определяется по формуле (Мб/Мк -1) х 100%, где Мб - среднее значение показателя в группе больных, Мк - среднее значение показателя в группе контроля

Следующим шагом к оценке информативности показателей является расчет коэффициента диагностической значимости (КДЗ) по формуле

КДЗ = (8i2 + 522) / (М2 - М2), где 8i2 - среднеквадратное отклонение параметров здоровых лиц, 822 - то же больных лиц, Мь М2 -соответственно средние значения показателей С помощью КДЗ все изучаемые показатели выстраивались по модулю величины Параметры, имеющие минимальное значение КДЗ, являются наиболее информативными

Методы статистической обработки материала. Статистическую обработку проводили с применением компьютерного программного пакета «Microsoft Exel» Использовались описательная статистика, двухсторонний t-тест, корреляционный анализ Различие между изучаемыми параметрами признавалось достоверным при Р<0,05

Результаты исследований и их обсуждение Состояние гуморального звена иммунной системы и факторов неспецифической защиты. В результате анализа полученных данных нами отмечено повышение концентрации иммуноглобулинов класса М, G, а также ЦИК в сыворотке больных ревматоидным артритом (Р<0,05) Необходимо отметить, что статистически достоверных отличий в концентрации JgA у больных ревматоидным артритом не обнаружено При серопозитивном ревматоидном артрите отмечается более высокий уровень содержания в крови JgM, G и ЦИК (серопозитивный ревматоидный артрит JgM - 2,4 ± 0,2, JgG - 14,6 ± 0,4, ЦИК 0,22 ± 0,005, серонегативный ревматоидный артрит JgM - 2,04 ± 0,1, JgG - 14,8 ± 0,5, ЦИК 0,19 ± 0,005) Однако достоверным в этой группе больных было только изменение в содержании ЦИК (Р<0,05) Повышение содержания JgM, JgG и ЦИК происходит параллельно нарастанию активности ревматоидного артрита. Для оценки активности фагоцитоза, связанного с кислород-

зависимыми бактерицидными механизмами, нами был использован тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) С увеличением степени активности ревматоидного артрита отмечалось снижение спонтанного и индуцированного НСТ-теста, что было расценено как снижение факторов неспецифической защиты у больных данной патологией (при I степени активности НСТ-спонтанный 8,5 ± 0,3 (Р<0,05), НСТ-индуцированный 30,0 ± 2,9 (Р<0,05), при II степени активности НСТ-спонтанный 7,4 ± 0,2 (Р<0,05), НСТ-индуцированный 16,9 ± 1,6 (Р<0,05), при III степени активности НСТ-спонтанный 6,3 ± 0,6 (Р<0,05), НСТ-индуцированный 16,3 ± 1,4 (Р<0,05))

При сравнительном анализе показателей клеточного звена иммунной системы у больных ревматоидным артритом мы не выявили значительного повышения CD4+ лимфоцитов в периферической крови по сравнению с контрольной группой (у больных ревматоидным артритом CD4+ - 44,2 ±2,1, контрольная группа -41,8 ± 1,2, Р>0,05), однако в группе больных ревматоидным артритом, серопозитивных по РФ, наблюдается увеличение CD4+ лимфоцитов (41,8 ± 1,2 - контрольная группа, 46,6 ± 1,5 - больные ревматоидным артритом серопозитивные (Р<0,05) У больных ревматоидным артритом выявлено уменьшение CD8+ лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (у больных ревматоидным артритом CD8+ - 20,8 ± 1,2, контрольная группа CDg+ - 29,4 ±1,1, Р<0,05), при этом различие между серопозитив-ным и серонегативным вариантами заболевания были недостоверны (у больных серопозитивным ревматоидным артритом CDg+ - 20,1 ± 0,6, у больных серонегативным ревматоидным артритом CDS+ - 21,0 ± 0,5, Р>0,05)

С увеличением степени активности заболевания (табл 1) отмечается статистически значимое уменьшение содержания СБ8+лимфоцитов у больных ревматоидным артритом по сравнению с группой контроля (контрольная группа CDg+ - 29,4 ±1,1, больные ревматоидным артритом с I степенью активности CDg+ - 22,9 ±2,1, Р<0,05, больные ревматоидным артритом со

II степенью активности CDg+ - 20,7 ± 0,7, Р<0,05, больные с

III степенью активности CD8+ - 18,8 ± 1,0, Р<0,05)

Таблица 1

Показатели, характеризующие клеточное звено иммунной системы, при различной степени активности ревматоидного артрита

Показатель Контрольная группа, п = 24 Степень активности

I (п= 19) II (п = 27) III (п = 24)

со3+ (%) 66,4 ± 2,9 68,6 ± 2 Р[>0,05 67,9 ± 1,4 Р1>0,05 Р2>0,05 65,2 ±2,4 Р]>0,05 Р2>0,05 Рз>0,05

СБ4+ (%) 41,8 ±1,2 41,3 ±2,3 Р,>0,05 44,3 ± 1,9 Р,>0,05 Р2>0,05 46,8 ±2 Р!<0,05 Р2>0,05 Р3>0,05

со8+ (%) 29,4 ± 1,1 22,9 ±2,1 Р,>0,05 20,7 ±0,7 Р,<0,05 Р2>0,05 18,8 ± 1,0 Р1<0,05 Р2>0,05 Р3>0,05

св]6+ (%) 14,8 ± 0,8 14,3 ±2,1 Р[>0,05 18,2 ±1,3 Р,>0,05 Р2>0,05 14,7 ± 1,2 Р,>0,05 Р2>0,05 Р3>0,05

съ20+ (%) 10 ±0,5 15,8 ±1,9 Р,<0,05 13,2 ±0,9 Р!<0,05 Р2>0,05 17,7 ± 1,7 Р1<0,05 Р 2>0,05 Р3<0,05

В группе больных ревматоидным артритом отмечается увеличение В-лимфоцитов (СБ2о+ лимфоциты), Р<0,05, достигая максимального своего значения у больных с Ш степенью активности процесса (контрольная группа СБ20+ - 10 ± 0,5, больные ревматоидным артритом с I степенью активности СБ2о+ - 15,8 ± 1,9, Р<0,05, больные ревматоидным артритом со П степенью активности СО20+ - 13,2 ± 0,9, Р<0,05, больные с III степенью активности СБ20+ - 17,7 ± 1,7, Р<0,05)

У больных ревматоидным артритом с увеличением степени активности отмечаются снижение индексов СБа^/СО^, Л/СБ3+ и возрастание иммунорегуляторного индекса (С047СБ8+), что свидетельствует о нарушении регуляторных механизмов иммунологической реактивности у больных ревматоидным артритом (табл 2)

Таблица 2

Показатели, характеризующие иммунорегуляторный индекс, индексы помощи В-лимфоцитам и лейкоцитарно-Т-лимфоцитарный индекс

Показатель Контрольная группа, п = 24 Степень активности

I (п=19) II (п = 27) III (п = 24)

СБ4 / СБ^ 31,0 ±0,2 4,2 ± 0,75 Р]>0,05 2,7 ±0,2 Р,>0,05 Р2>0,05 3,6 ± 0,29 Р,>0,05 Р2>0,05 Р3>0,05

СВ8/СБ16 2,1 ±0,1 2,1 ±0,4 Р,>0,05 1,3 ±0,1 Р!<0,05 Р2<0,05 1,4 ±0,1 Р,<0,05 Р2<0,05 Р3>0,05

СБ4 / СБ8 1,4 ± 0,08 1,8 ±0,10 Р]<0,05 2,2 ±0,10 Р!<0,05 Р2<0,05 2,6 ± 1,9 Р,<0,05 Р2<0,05 Р3>0,05

Лейкоцитарно-Т-лимфоцитарный индекс (Л/С03+) 5,1 ±0,2 4,0 ±0,4 Р]<0,05 1,2 ±0,5 Р,<0,05 Р2<0,05 2,2 ±0,6 Р,<0,05 Р2<0,05 Р3>0,05

У серопозитивных больных ревматоидным артритом иммунорегуляторный индекс (ИРИ) был выше, чем в группе больных серонегативным ревматоидным артритом (больные серопози-тивным ревматоидным артритом ИРИ - 2,4 ± 0,2, больные серо-негативным ревматоидным артритом ИРИ - 2,0 ± 0,1, Р<0,05)

Состояние цитокинового уровня у больных ревматоидным артритом оценивали путем определения содержания в сыворотке крови больных у-ИНФ, ИЛ-4, ФНО-а.

У больных ревматоидным артритом отмечается достоверное увеличение у-интерферона, интерлейкина-4, фактора некроза опухоли-а по сравнению с группой контроля (у-ИНФ у больных ревматоидным артритом - 19,36 ± 3,13, контрольная группа -8,45 ± 0,83, Р<0,05, ИЛ-4 соответственно 10,08 ± 1,8 и 2,84 ± 0,26, Р<0,05, ФНО-а у больных ревматоидным артритом 1,87 ± 0,21, контрольная группа 0,69 ± 0,002, Р<0,05)

По мере нарастания активности ревматоидного артрита наблюдается повышение уровня у-интерферона и интерлейкина-4 в сыворотке крови больных (табл 3)

Таблица 3

Показатели, характеризующие уровень цитокинов у больных ревматоидным артритом при различной степени активности процесса

Показатели Контрольная группа, п = 24 Степень активности

I (п= 19) II (п = 27) III (п = 24)

ФНО-а, пг/мл 0,69 ±0,02 2,39 ±0,3 Р]<0,05 1,57 ±0,1 Р1<0,05 Р2<0,05 1,65 ±0,1 Р!<0,05 Р2<0,05 Р3>0,05

-у-ИНФ, пг/мл 8,45 ±0,8 22,65 ± 1,6 Р,<0,05 22,0 ±2,0 Р!<0,05 Р2<0,05 27,4 ±5,1 Р,<0,05 Р2<0,05 Р3<0,05

ИЛ-4, пг/мл 2,84 ±0,2 6,05 ± 1,0 Рг<0,05 11,08 ± 1,6 Р(<0,05 Р2<0,05 13,11 ±2,9 Р!<0,05 Р2<0,05 Р3<0,05

Р] - достоверность различий с показателями контрольной группы

Р2 - достоверность различий с показателями пациентов с I степенью активности

Р3 - достоверность различий с показателями пациентов со II степенью активности

Гематологические и иммунологические показатели, используемые при диагностике ревматоидного артрита. С повышением активности воспалительного процесса у больных снижаются количество эритроцитов и содержание гемоглобина, значительнее - в группе больных с III степенью активности ревматоидного артрита (Р<0,05). В исследовании выявлено повышение СОЭ у больных ревматоидным артритом по сравнению со здоровыми лицами (Р<0,05)

Количество лейкоцитов в периферической крови достоверно выше по сравнению с группой контроля С увеличением степени активности отмечаются достоверное увеличение палочкоядерных ней-трофилов, моноцитов, снижение лимфоцитов по сравнению с группой контроля (Р<0,05)

Иммунологические показатели у больных ревматоидным артритом значительно отличаются от данных контрольной группы Анализ полученных результатов показал, что у большинства пациентов в крови выявляются маркеры иммунного воспаления (СРБ, РФ, ЦИК) Степень активности ревматоидного артрита ассоциируется с частотой их выявления (Р<0,05)

Для определения информативности используемых лабораторных тестов при ревматоидном артрите был произведен расчет диагностической чувствительности и диагностической специфичности (табл 4)

Таблица 4

Диагностическая информативность лабораторных тестов при различной степени активности ревматоидного артрита

Показатели Диагностическая специфичность (%) Диагностическая чувствительность при различной активности ревматоидного артрита (%)

I II III

у-ИНФ 94,6 50 94 95

ИЛ-4 96 92,8 96,2 87,5

ФНО-а 96,7 98,1 99,0 99,2

СБР 95,8 57,1 92,5 95,8

ЦИК 91,6 64,2 66,6 87,5

JgM 95,8 28,5 74,0 75,1

JgG 91,6 35,7 83,3 87,5

cd8+ 90,8 92,0 92,5 95,8

cd20+ 88,2 78,5 74,0 95,8

HCT индуц 89,2 58,3 65,4 74,0

ИРИ 88,3 85,7 92,5 95,6

HCT спон 85,2 65 70,1 82,0

РФ 93,5 88,4 92,5 94,1

л/со3+ индекс 89,5 90,1 90,3 92,5

CD87CD16+ индекс 87,5 84,4 90,2 94,6

Диагностическая чувствительность одного и того же показателя не является стабильной величиной и изменяется при различной степени активности ревматоидного артрита Высокой диагностической чувствительностью обладают тесты, характеризующие состояние Т-клеточного звена иммунитета (ИРИ, Л/СБ3+, С08+/С01б+) и тесты, отражающие цитокиновый профиль (ФНО-а, ИЛ-4, у-ИНФ) Чтобы оценить роль каждого из компонентов патогенеза ревматоидного артрита использован расчетный показатель степени изменения параметров.

Таблица 5

Степень изменения иммунологических показателей при ревматоидном артрите, %

Показатель I степень активности II степень активности III степень активности

у-ИНФ 49,7 160,0 224,0

ФНО-а 246,0 127,0 139,0

ИЛ-4 113,0 290,0 361,0

СБР 77,1 197,0 571,0

ЦИК 21,4 57,1 78,5

JgM 9,0 10,0 20,0

JgG 18,2 30,4 70,4

CDS+/CD16+ индекс 23 30,1 38,1

JI/CD3+ индекс 85,0 105,1 120,2

ИРИ 28,5 57,1 85,1

HCT индуц 17,3 28,2 33,4

СОЭ 200 636 1052

HCT спон 15,3 20,3 22,1

РФ 100 100 100

Из таблицы 5 видно, что наиболее высокая степень изменения в показателях СОЭ, ФНО-а, у-ИНФ, ИЛ-4, СРБ

С увеличением степени активности ревматоидного артрита, возрастает средняя степень изменения величины определяемых параметров, указывающая на повышение их диагностической значимости

Следующим этапом по оценке информативности показателей является расчет коэффициента диагностической значимости, с помощью которого все изучаемые показатели выстраиваются по модулю величины. Параметры, имеющие минимальное значение КДЗ, являются наиболее информативными (Земсков А М, 1997)

В группах больных с различной степенью активности ревматоидного артрита получены неодинаковые последовательности лабораторных показателей (по убыванию степени информированности)

В группе больных ревматоидным артритом с I степенью активности

ФНО-а -> ИРИ Л/СБз+ —► РФ —> С037С016+ ^ - количество лейкоцитов —» ИЛ-4 —> СРБ —> СОЭ —> СВ2о+ — у-ИНФ —> НСТ спон —> количество эритроцитов —> НСТ индуц -»^М ЦИК

В группе больных ревматоидньм артритом со П степенью активности

ФНО-а -»• ИРИ СРБ РФ -» Л/С03+ СО^/СЪи количество лейкоцитов —> СОЭ —» НСТ спон —» JgM —> ИЛ-4 —» у-ИНФ —»• СБ2о+ —» НСТ индуц —> —» количество эритроцитов —* ЦИК

В группе больных ревматоидным артритом с Ш степенью активности

ФНО-а СОЭ ИРИ -»■ СРБ ЛУСБ3+ С087СБ16+

—> —РФ —> количество лейкоцитов —» ИЛ-4 —> НСТ спон —»■ С02о —* НСТ индуц —> у-ИНФ —»■ количество эритроцитов-> ЦИК

По степени убывания информативности (независимо от степени активности ревматоидного артрита) показатели располагаются в следующей последовательности (табл 6)

Таблица 6

Сравнительная информативность изучаемых показателей у больных ревматоидным артритом

Показатель Среднее значение КДЗ в группах (отн ед) Степень информативности показателя

ФНО-а 0,68 1

ИРИ 0,82 2

СОЭ 1,2 3

си8+/со16+ 2,3 4

л/со/ 2,5 5

СБР 3,8 6

РФ 4,2 7

Лейкоциты 4,0 8

ИЛ-4 4,3 9

Ш 6,9 10

у-ИНФ 7,3 И

180 7,6 12

НСТ спон 9,6 13

СБ20+ 9,8 14

НСТ индуц 10,0 15

Эритроциты 14,2 16

ЦИК 14,6 17

Учитывая результаты информативности изучаемых показателей, можно выделить

- группу наиболее информативных показателей (ФНО-а, ИРИ, индекс /СИХ6+, индекс Л/СВ3+), которые могут быть включены в диагностический стандарт обследования больных ревматоидным артритом,

- группу менее информативных показателей (ЦИК, СВ2о+, количество эритроцитов), диагностическая значимость которых меньше, чем у СРБ, РФ, СОЭ, - основных лабораторных показателей степени активности процесса

Взаимосвязь показателей активности ревматоидного процесса и иммунологических показателей. С помощью корреляционного анализа были выявлены связи при I степени активности ревматоидного артрита между такими показателями, как

ФНО-а и у-глобулины (г = + 0,6, Р<0,05), ИРИ и СОЭ (г = 0,56, Р<0,05), СРБ и у-ИНФ (г — + 0,8, Р<0,05), у-ИНФ и СОЭ (г = 0,44, Р<0,05)

При II степени активности ревматоидного артрита выявлены корреляционные связи между ИРИ и СОЭ (г - 0,6, Р<0,05), ЦИК и ^М (г = 0,53, Р<0,05), СРБ и ИРИ (г = 0,8, Р<0,05)

При Ш степени активности ревматоидного артрита большое количество корреляционных связей между СРБ и у-ИНФ (г = + 0,55, Р<0,05), ИЛ-4 и а 2-глобулины (г = + 0,7, Р<0,05), у-ИНФ и количество лейкоцитов (г = + 0,8, Р<0,05), ФНО-а и количество эритроцитов (г = + 0,61, Р<0,05), СОЭ и ФНО-а (г = + 0,63, Р<0,05), ИЛ-4 и ФНО-а (г = - 0,7, Р<0,05), СБ20+лимфоциты и СОЭ (г = + 0,5, Р<0,05)

Выявленные нами сильные корреляционные связи между показателями активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите, гематологическими и иммунологическими показателями, а также определение диагностической чувствительности, специфичности, коэффициента диагностической значимости лабораторных тестов, позволили нам предложить алгоритм диагностики иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом (рис 1)

Оценка клеточного иммунитета.

Больные РА

I степень СОЭ-12,1-15,5 СРБ-5,4-7,0 аг глобулины ¡¡,2-12,2

II степень СОЭ-31,8-36,0 СРБ-8,5-12,3 аг глобулины 12,5-14,1

Ш степень СОЭ-45-58,8 СРБ-19,6-27,4 аг глобулины 14,9-16,1

Оценка гуморального иммунитета

Рис 1 Алгоритм диагностики иммунных нарушений при ревматоидном артрите

Выводы

1 У больных ревматоидным артритом наблюдается угнетение Т-клеточного звена иммунной системы в основном из-за понижения уровня Т-цитотоксических лимфоцитов (СБ/), что приводит к повышению иммунорегуляторного индекса (СВ47СВ8+). по сравнению с группой контроля

2 При ревматоидном артрите выявлена активация гуморального звена иммунной системы, что проявляется увеличением содержания В-лимфоцитов (СБ2о+), и сопровождается достоверным повышением содержания 1§М и классов в сыворотке крови и увеличением количества ЦИК по сравнению с контрольной группой, максимальное значение анализируемых показателей выявлено при III степени активности заболевания

3 У больных ревматоидным артритом с увеличением степени активности отмечено достоверное снижение спонтанного и индуцированного НСТ-теста, что свидетельствует о снижении метаболических функций лейкоцитов

4 У больных ревматоидным артритом обнаружено увеличение содержания в сыворотке крови цитокинов ИЛ-4, у-ИНФ, ФНО-а. Концентрация ИЛ-4, у-ИНФ в крови больных возрастает с увеличением степени активности патологического процесса Уровень содержания ФНО-а у больных ревматоидным артритом с минимальной степенью активности выше, чем у больных с высокой степенью активности

5 Диагностическая информативность лабораторных показателей, в том числе иммунологических, при ревматоидном артрите неодинакова и зависит от степени активности процесса

6 Наиболее информативными показателями иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом являются ФНО-а, ИРИ, СС8+/СБ16+, ИЛ-4, у-ИНФ, Л/СБз+

7 Созданный алгоритм диагностики иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом позволяет провести целенаправленное обследование больных и назначить иммуннокорригирую-щее лечение

Практические рекомендации

1 Показатели, характеризующие состояние клеточного звена иммунной системы и цитокинового уровня, рекомендуется использовать для оценки активности ревматоидного артрита

2 Для диагностики иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом рекомендуется использование разработанного алгоритма

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Топчиева, 3 С Сравнительная оценка лабораторных тестов, используемых для диагностики ревматоидного артрита / 3 С Топчиева, Г.П Гладилин // Актуальные вопросы медицины Материалы научно-практической конференции Саратов, 2003 — С 90

2 Топчиева, 3 С Возможности эхокардиографии коленных суставов в определении степени активности ревматоидного артрита (3 С Топчиева, Е Ю Мишенева, Г П Гладилин // Актуальные проблемы клинической лабораторной диагностики Материалы научно-практической конференции Саратов, 2004 -С 92

3 Топчиева, 3 С Уровень некоторых цитокинов у больных ревматоидным артритом / 3 С Топчиева, Г П Гладилин, Н И Зрячкин // Клиническая лабораторная диагностика 2007 -№9 С 25-27

Подписано в печать 12 09 2007 г Формат 60x48/16 Объем 1,33 п л Тираж 100 экз Заказ № 1232 Бесплатно 392008, г Тамбов, ул Советская, 190г Издательство Тамбовского государственного университета им Г Р Державина.

Актуальность проблемы.

Ревматоидный артрит (РА) является распространенным ревматическим заболеванием, приводящим к инвалидизации и сокращению продолжительности жизни больных (Беневоленская Л.И., Бржезовский М.М., 1988.)

По уровню первичной инвалидизации в нашей стране заболевания костно-мышечной системы стоят на третьем месте после болезней системы кровообращения и злокачественных новообразований, а в контексте причин временной потери трудоспособности уступают только заболеваниям верхних дыхательных путей, травмам и отравлениям (Насонова В.А., Фоламеева О.М., Амирджанова В.Н., Логинова, 1992).

В настоящее время ревматоидный артрит рассматривается как аутоиммунное заболевание. Воспалительный процесс при ревматоидном артрите представляет собой каскад биохимических и иммунологических процессов. Характерной особенностью ревматоидного артрита является дисбаланс между продукцией провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNFa, IFNy) и противовоспалительных (IL-4, IL-10 и др.) (Насонова В.А., Бунчук Н.В., 2001).

В последние годы широко изучается значение различных клинических, биохимических, и инструментальных показателей в оценке активности болезни и раннего прогнозирования исходов РА до развития клинических и рентгенологических признаков прогрессирования костной деструкции (Насонов Е.Л., Чичасова Н.В., 1997).

Ведущая роль в патогенезе РА отводится нарушениям клеточного и гуморального иммунитета, для исследования которых применяется ряд методов, в том числе определение различных субпопуляций лимфоцитов (Насонова В.А., Бунчук Н.В., 1997).

В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании патогенеза РА, а также в разработке современных технологий и средств иммунодиагностики, иммуномониторинга и иммунопрогнозирования, составляющих, по мнению большинства исследователей, основу современных лечебно-реабилитационных программ. Тем не менее, проблемы ранней и дифференциальной диагностики, критерии прогнозирования течения исхода заболевания, выбор обоснованной схемы этиопатогенетического лечения таких больных сохраняют свою актуальность (Сучков С.В., Хитров А.Н., Наумова Т.Е. и соавт., 2004).

Однако при отборе наиболее достоверных диагностических и лечебных технологий из потока разнообразных предложений целесообразно принимать во внимание лишь те источники, которые отвечают определенным критериям, обеспечивающим «качество доказательности» (Флетчер Флетчер С., Вагнер Э., 1998). Лабораторный тест должен отвечать требованиям клинической информативности, своевременности и аналитической надежности (Меньшиков В.В., 2003).

Степень патогномоничности лабораторных отклонений весьма вариабельна, так как формы и выраженность самого патологического процесса различны от одного случая заболевания к другому. Одним из наиболее используемых подходов в настоящее время является расчет диагностической чувствительности и специфичности лабораторного теста. Алгоритмы и руководящие принципы клинической практики разрабатываются для того, чтобы клиницисты использовали принцип последовательности в выборе диагностических тестов. Исследования показывают, что доля клинически информативных тестов и экономическая эффективность лабораторного обследования повышаются, когда стандартная комбинация тестов расширяется за счет осмысленного добавления к ней некоторых специфичных тестов соответственно характеру патологии (Takemura V, 1999).

Цель настоящей работы: изучение диагностической значимости лабораторных тестов, используемых в оценке иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом, создание алгоритма диагностики этих нарушений.

Для достижения данной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Оценить характер и степень нарушения основных звеньев иммунной системы при ревматоидном артрите в зависимости от степени активности, возраста, длительности заболевания и иммунологического варианта.

2. Оценить уровень цитокинов (TNFa, IFNy, IL-4) при ревматоидном артрите в зависимости от степени активности, возраста, длительности заболевания и иммунологического варианта.

3. Выявить особенности иммунопатологии при ревматоидном артрите в зависимости от степени активности, серопринадлежности заболевания, возраста больного и продолжительности заболевания.

4. Оценить диагностическую ценность лабораторных исследований, используемых в диагностике ревматоидного артрита.

5. Разработать алгоритм диагностики иммунных нарушений при ревматоидном артрите.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Ревматоидный артрит является заболеванием, обусловливающим ряд характерных изменений в функциональном состоянии основных звеньев иммунитета: клеточного, гуморального. Выраженность этих изменений зависит от степени активности воспалительного процесса, иммунологического варианта, длительности заболевания и возраста больного.

2. Больные ревматоидным артритом имеют достоверно повышенный уровень цитокинов (IL-4, IFNy, TNFa), который возрастает с увеличением степени активности процесса, зависит от клинической формы заболевания.

3. Анализ диагностической значимости лабораторных тестов, определение корреляционных связей между показателями активности ревматоидного артрита и показателями иммунных нарушений позволили определить группу наиболее информативных лабораторных тестов и разработать алгоритм диагностики иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом.

Научная новизна исследования.

Разработаны критерии, устанавливающие влияние иммунных нарушений на течение ревматоидного артрита. Определены сравнительная информативность и диагностическая ценность гематологических, иммунологических показателей, уровня цитокинов у больных ревматоидным артритом.

Практическая значимость.

Выявлены наиболее информативные лабораторные тесты: TNFa, иммунорегуляторный индекс, IL-4, IFNy, лейкоцитарно-Т-лимфоцитарный индекс, которые могут быть включены в стандарт обследования больных ревматоидным артритом. Разработан диагностический алгоритм иммунных нарушений при ревматоидном артрите.

Апробация работы.

Материалы и основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции общества молодых ученых и студентов клиники госпитальной хирургии лечебного факультета «Актуальные вопросы медицины» (Саратов, 2003); на областной научно-практической конференции специалистов по клинической лабораторной диагностике (Саратов, 2004); на заседании общества специалистов по клинической лабораторной диагностике (Тамбов, 2005, 2006); на научно-практическом симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2007).

По теме диссертации опубликованы 3 работы.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты исследования внедрены в практическую работу: Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО Саратовского ГМУ; кафедры клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС СГМУ; клинико-диагностической лаборатории МЛПУ «Городская больница № 4» г.Тамбова.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 102 страницах, включая 15 таблиц, 7 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы, включающего 113 отечественных и 72 зарубежных источника.

Выводы

1. Больные серопозитивным ревматоидным артритом в возрасте моложе 40 лет и длительностью заболевания от 2-х до 5- лет с увеличением степени активности имеют достоверно более выраженные изменения в Т-клеточном звене иммунной системы по сравнению с больными серонегативным ревматоидным артритом.

2. У больных серопозитивным ревматоидным артритом при II и III степенях активности в возрасте моложе 40 лет и длительностью заболевания до 5 лет содержание иммуноглобулинов класса М и G, а также ЦИК было достоверно выше по сравнению с больными серонегативным ревматоидным артритом.

3. Больные серопозитивным ревматоидным артритом в возрасте моложе 40 лет с длительностью заболевания менее 2-х лет имеют более высокий уровень TNFa, принимая максимальное свое значение при III степени активности по сравнению с больными серонегативным ревматоидным артритом.

4. У больных ревматоидным артритом в возрасте моложе 40 лет содержание IL4 выше, чем в группе больных более старшего возраста, при этом отсутствует зависимость от длительности заболевания.

5. Содержание IFNy у больных серопозитивным ревматоидным артритом в возрасте моложе 40 лет и длительностью заболевания более 2 лет выше, чем у больных серонегативным ревматоидным артритом.

6. Диагностическая информативность лабораторных показателей, в том числе иммунологических, при ревматоидном артрите неодинакова и зависит от степени активности процесса.

7. Наиболее информативными показателями иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом являются TNFa, ИРИ, CD8+/CDi6+, IL4, IFNy, ЛТИ.

8. Созданный алгоритм диагностики иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом позволяет провести целенаправленное обследование больных и назначить иммуннокорригирующее лечение.

Практические рекомендации Показатели, характеризующие состояние клеточного звена иммунной системы и цитокинового уровня, рекомендуется использовать для оценки активности ревматоидного артрита.

2. Для диагностики иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом рекомендуется использование разработанного алгоритма.