Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Механизмы обеспечения регуляторного баланса в комплексе естественных цитотоксических реакций

Р Г Б

2 О

ОД

На правах рукописи

ЧЕКНЁВ

Сергей Борисович

МЕХАНИЗМЫ ОБЕСПЕЧЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНОГО БАЛАНСА В КОМПЛЕКСЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научный консультант: член-корреспондент РАМН, профессор А.Я.Кульберг

Официальные оппоненты: академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилин, доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидзе, доктор медицинских наук, профессор Е.Л.Насонов

Ведущее учреждение:

ГНЦ Институт медико-биологических проблем Минздрава России

Защит; состоится . . 1997 :

часов на заседании Диссертационного совета

состоится

г.

Д 001.07.01 в НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН по адресу: 123098, г.Москва, ул. Гамалеи, дом 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Функционирование системы естественной цитотоксичности (ЕЦТ) в организме человека и животных в качестве универсального механизма контроля пролиферации и дифференцировки клеток (Фукс Б.Б. и др., 1984; Hanna N., 1985; Hcrbcrman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Kiessling R. et al., 1984), рассматривающегося с эволюционных позиций как наиболее древний фактор иммунобиологического надзора (Cooper E.L. et al., 1992; Du Pasquier L., 1993; Herberman R.B., Holden H.T., 1979), определяет постоянное внимание исследователей к этому клеточному феномену (Du Pasquier L., 1993; Grossman Z, Hcrbcrman R.B., 1986; Hcrbcrman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Hcrbcrman R.B. et al., 1980; Herccnd T., Schmidt R.E., 1988; Karre 1С. et al., 1991; Lanier L.L. et al., 1992; Mane J.L., 1980; Trinchieri G., 1989; Whiteside T.L., Hcrbcrman R.B., 1989).

С уровнем активности естественных киллеров (ЕК) обоснованно связывают резистентность к вирусным инфекциям и опухолевому росту (Herberman R.B., 1978; Herberman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Marx J.L., 1980; Whiteside T.L., Hcrbcrman R.B., 1989), эффективность процессов отторжения и регенерации тканей (Ono M. et al., 1984; Rolstad В. et al., 1985; Waterfall P.M. et al., 1985), элиминации функционально устаревших клеточных форм (Пухова Я.И. и др., 1984).

Продуцирующие широкий спектр иммуноактивных цитокинов (Allavena P. et al., 1985; Djcu J.Y. et al., 1982; Kasahara T. et al., 1983; Lewis C.E. et al., 1991; Naumc B. et al., 1992, 1993a; Perussia B. et al., 1992; Serrate S.A. et al., 1987), связанные многочисленными взаимодействиями с клетками лимфоидной и нелимфоидной природы (Гордиснко С.М. и др., 1987; Bloom Е.Т., Babbitt J.T., 1985; Bloom Е.Т. et al., 1986; Chehimi J. et al, 1992, 1993; Holmberg L.A. et al., 1984; Minato N. et al., 1985; Mortari F. ct al., 1986; Radomska D.M. et al., 1989; Seaman W.E. et al, 1982; Toossi Z. ct al., 1989), способные к прямому цитотоксичсскому действию на Т- и В-лимфоциты, отдельные субпопуляции клеток костного мозга, а также прилипающие пе-ритонеальные клетки и трансформированные фибробласты (Grossman Z, Herberman R.B, 1986; Hcrbcrman R.B, 1982; ICatz P. et al, 1989; Robles C.P, Pollack S.B, 1986) ЕК формируют важное звено регуляции гемо-, лимфопоэза и иммуногенеза (Dickinson A.-M. et al, 1988; Hansson M. et al, 1988; Herberman R.B., 1982; Holmbcrg L.A. ct al, 1984; Suzuki R. ct al, 1985).

Не удивительно, поэтому, что развитие иммунодефицита по ЕК, обусловленное блокированием созревания эффекторов ЕЦТ (Чекнев С.Б, 1993а; Combe В. et al, 1985; Gascón P. et al, 1986; Herman J. ct al, 1984, 1985a, 1985b; Ueno Y. et al, 1985a), дефектами ферментных систем, обеспечивающих программирование и реализацию отдельных стадий литичсского цикла (Bonavida В. et al, 1986; McGarry R.C. ct al, 1984; Roder J.C. ct al, 1983; Steinhauer E.H. ct al, 1982), либо изменением регуляторных влияний нейроэндокринных факторов (Сухих Г.Т, 1985; Dclafucnte J.C, 1985; Doria G, 1988; Dunn A.J, 1988; Irwin M, 1994), сопровождается нарушением функциональных взаимосвязей в иммунной системе организма,

активацией механизмов аутоагрессии или возникновением общей иммунологической недостаточности (Чскнсв С.Б., 1993а, 1994; Combe В. et al., 1984; Evans D.L. et al., 1992; Galli M. et al., 1989; Kott E. ct al., 1990; Provinciali M. ct al., 1991; Rabinowich H. et al., 1985; Vitale M. ct al., 1992; Yu F. ct al., 1991; Zwciman В., Lisak R.P., 1986). Патогенез синдрома хронической усталости напрямую связывают с неэффективностью реализации цитотоксичсского потенциала ЕК против инфицированных вирусом клеток-мишеней (KM) (Aoki R. ct al., 1987; Caligiuri M. ct al., 1987; Whiteside T.L., Herberman R.B., 1989).

Несмотря на многолетние, активно ведущиеся исследования по проблеме ЕЦТ (Чскнёв С.Б., 1993а; Herberman R.B., 1982; Herberman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Hcrccnd Т., Schmidt R.E., 1988; Кагтс К. ct al., 1991; Li H. ct al., 1994; Ortaldo J., 1993; Whiteside T.L., Herberman R.B., 1989), современная клиническая практика не располагает средствами иммунотерапии избирательного пролонгированного воздействия на популяцию ЕК. Отсутствуют, следовательно, экспериментальные и клинические подходы, использование которых позволяло бы восстанавливать не только цитотоксичность отдельных эффекторных клеток, но и утрачиваемые в условиях иммунодефицита контактные и дистантные взаимосвязи системы ЕЦТ, обеспечивающие в физиологическом режиме выполнение сю функций иммунобиологического надзора (Dianzani Е, 1992; Golub S.H. et al., 1982; Hirsch R.L., Johnson K.P., 1985; Ho M. ctal., 1981; Talmadgc J.E. ctal., 1985; Tank B. ct al., 1985). Это обстоятельство объясняется, по-видимому, выраженной способностью системы ЕЦТ к внутренней компенсации, определяющей возможность относительно автономного функционирования и реализации специализированной активности вне непосредственной связи с процессами индуцированного иммуногенеза. Поскольку с этих позиций цитотоксическис и регуляторные взаимодействия, опосредуемые ЕК, не рассматривались в предшествующих исследованиях, сведения о механизмах аутокринной регуляции системы ЕЦТ и особенностях се функционирования в физиологических условиях практически отсутствуют.

Неизученность механизмов установления и поддержания регу-ляторного баланса в комплексе естественных цитотоксичсских реакций не позволяет ответить на два принципиальных вопроса: каким образом в организме обеспечивается уровень ЕЦТ, необходимый для эффективного осуществления иммунобиологического надзора, и каким образом определяется физиологическая достаточность уровня активности ЕК, исключающая проявление цитотоксичности против неизмененных собственных клеток организма (Пухова Я.И. и др., 1989; Abruzzo L.V. et al., 1986; Dickinson A.-M. et al., 1988; Gatcly M.K. et al., 1988; Hansson M. et al., 1988; Herberman R.B., 1982; Katz P. ct al., 1989; Mason P.D. et al., 1988; Ono M. ctal., 1984; RadomskaD.M. ctal., 1989). Вскрытие указанных механизмов способствовало бы разработке средств и способов целенаправленной коррекции функционального состояния ЕК в эксперименте и клинике.

Наличие в каскаде иммуноактивных цитокинов, вырабатываемых ЕК под влиянием внешних индукторов или факторов гомеостатичсской

регуляции, интерферона (ИФН)-а, ИФН-у и интерлейкина (ИЛ)-2 (Allavena Р. ct al., 1985; Djeu J.Y. ct al., 1982; Kasahara T. et al., 1983; Lewis C.E. ct al., 199,1; Pistoia V., Ferrarini M„ 1988; Serrate S.A. ct al., 1987; Young H., Ortaldo J., 1987), являющихся наиболее значимыми медиаторами, контролирующими дифференцировку самих эффекторов ЕЦТ и реализацию их цитотоксического потенциала (Чекнсв С.Б., 1993а; Abbud-Filho М. ct al., 1986; Li Н. ct al., 1989; Ortaldo J.R. et al., 1984; Saksela E. et al., 1979; Targan S„ Dorcy F., 1980; Warren H.S. et al., 1993), подтверждает существование механизмов аутокринной регуляции ЕК. С другой стороны, оно предполагает возможность вовлечения системы ЕЦТ в процессы эндогенной биологической ретрансляции (ЭБР), очевидно, лежащие в основе нецитотоксических взаимодействий ЕК с клетками лимфоидной и нслимфоидной природы. Особенности функциональной организации системы ЕЦТ, обеспечивающие выполнение ею роли эндогенного биологического ретранслятора, воспринимающего и формирующего идентичные молекулярные сигналы, и механизмы контроля ЭБР через систему ЕЦТ остаются неизвестными. Их установление позволило бы существенно дополнить современные представления об общих принципах иммунорегуляции в организме, значимых в опенке патогенеза и прогнозировании течения патологических процессов, ассоциированных с развитием недостаточности ЕК и нарушением иммунного гомсостаза.

Целью исследования явилось изучение механизмов поддержания регуляторного баланса в системе ЕЦТ и установление факторов внесистемного рационального ограничения цитотоксической активности ЕК.

Достижение указанной цели исследования предполагало постановку и решение следующих конкретных задач.

1. Оценки вариабельности цитотоксической активности ЕК и чувствитель-

ности эффекторов ЕЦТ к действию факторов костномозгового и химического происхождения, иммуноактивных пептидов, у-глобулина и взаимодействующих с ним компонентов сыворотки крови, иптерлейкинов.

2. Изучения функциональных взаимосвязей системы ЕЦТ и ИФН:.параметров, определяющих ответ ЕК на действие ИФН; корреляции цито-токсичности и продукции ИФН при взаимодействии ЕК:КМ; влияния ИФН vi его ингибиторов на чувствительность КМ к ЕК-отюсрсдованному цитолизу.

3. Установления возможностей регуляции цитотоксической активности ЕК

на стадии распознавания и связывания КМ эффектором ЕЦТ в литичсском цикле. ■" ■ !

4. Оценки изменений и динамики цитотоксичности ЕК и подателей ИФН-

схахуса организма в ходе иммунотерапии при заболева'ниях|'п;атогснсги-чески или вторично ассоциированных с функциональной недосхахочно-схью сисхемы ЕЦТ.

5. Изучения влияния на цихохоксическую акхивносхь ЕК и бласттрансфор-. мацию лимфоцитов (БТЛ) человека in vitro связанных с у-глобулином сыворотки крови факторов, участвующих в транспорте и обмене катионов металлов. ' ■■■'■■

6. Оценки влияния фракций мсталлосвязывающих (МС) пептидогликанов

цианобактсрий (ПГЦБ) на уровень функционирования системы ЕЦТ: действия на ЕК-активность и БТЛ человека in vitro; действия на ЕК-активность, бластгрансформацию спленоцитов и показатели ИФН-статуса лабораторных животных в хронических опытах in vivo.

7. Осуществления сравнительного статистического популяционного анализа

динамики цитотоксической активности ЕК в условиях глобальной экспансии цианобактсрий.

Научная новизна выполненного комплекса исследований определяется реализованным в работе принципиально новым подходом, обосновывающим возможность функционирования системы ЕЦТ человека и высших животных в относительно автономном режиме и се вовлечения в процессы ЭБР, осуществляющиеся в условиях нсцитотоксичсских взаимодействий ЕК с клетками лимфоидной и нелимфоидной природы и значимые в поддержании иммунного гомеостаза.

Установлено, что опосредуемые эффекторами ЕЦТ реакции иммунобиологического надзора обеспечиваются на основе высокой вариабельности цитотоксической активности ЕК, выявляющейся на клеточном, половом, возрастном и популяционном уровне; широкого диапазона чувствительности клеток к действию иммуноактивных пептидов костномозгового и тими-чсского происхождения, ИФН, интерлейкинов, С-реактивного белка и компонентов сыворотки крови; способности эффекторов ЕЦТ к осуществляемой в условиях существенного вклада прилипающих клеток (ПК) выработке ИФН и независимой от нее реализации цитотоксичсского потенциала.

Изучение функциональных взаимосвязей системы ЕЦТ и ИФН позволило обнаружить сопровождающую выработку ИФН продукцию клетками крови не известного ранее ингибитора регулирующего действия ИФН на активность ЕК (ИРДИ); этот ингибитор полностью блокирует эффекты ИФН-а и ИФН-у в отношении аутологичных (ауто-) ЕК. Доказана возможность независимого от продукции ИФН осуществления цитотоксической функции ЕК - в условиях воздействия in vitro синтетического гекса-ncnTiiflaCys-(Pro)3-Glu-Lcu, проявляющего в культуре лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека свойства индуктора ИФН-у, а в реакции ЕЦТ отменяющего выработку ИФН и повышающего цитотоксичность ЕК. Впервые установлена зависимость влияния ИФН и его ингибиторов на устойчивость КМ в реакции ЕЦТ от чувствительности КМ к антивирусному действию ИФН и обнаружено, в частности, что ингибитор ИФН воспроизводит эффект ИФН в отношении резистентных к последнему мышиных КМ, протектируя их от ЕК-опосрсдованного цитолиза.

В работе впервые показано, что действие таких стимуляторов ЕК, как ИФН-у (препарат гаммаферон), С-реактивный белок и гексапсптид Cys-(Pro)3-Glu-Leu реализуется уже на стадии распознавания и связывания КМ эффектором ЕЦТ в литичсском цикле. Оно проявляется диссоциацией конъюгатов, сформированных в процессе нсспецифической адгезии, по-видимому, цитотоксичсски не активными ЛПК, и последующим повышением

эффективности цитолиза, сопровождаемым ростом корреляции интенсивности конъюгатообразования и цитотоксической деструкции КМ.

Клинико-иммунологические исследования устанавливают, что при заболеваниях, сопровождающихся развитием функциональной недостаточности ЕК, наблюдаются изменения чувствительности эффекторов ЕЦТ к действию факторов физиологической регуляции in vitro, вклада ПК в суммарную цитотоксичность и продукцию ИФН в ходе ЕК-опосрсдованного цитолиза, взаимосвязей системы ЕЦТ и ИФН. Рассматриваемый в качестве симпто-мокомплекса, патогенетически связанного с иммунодефицитом по ЕК, рассеянный склероз (PC) обоснованно представляется болезнью, ассоциированной с нарушением процессов ЭБР. В соответствии с впервые полученными данными, PC характеризуется стадио-специфическими изменениями цито-токсичности ЕК, отражающими тип течения процесса и степень инвалидиза-ции больных; выраженным в динамике заболевания снижением продукции индуцированных ИФН-ии ИФН-у; недостаточностью ИРДИ. В условиях сохранения лимфоцитами больных нормального уровня реагирования на действие иммунокорригирующих препаратов положительный клинический эффект средств иммунотерапии при PC, заболеваниях печени, вызванных вирусом гепатита В, и рецидивирующем герпесе гениталий сопровождается восстановлением in vitro цитотоксического потенциала ЕК.

В работе получены приоритетные данные, свидетельствующие о возможности внесистемного негативного контроля цитотоксичности ЕК эндогенными и экзогенными факторами, участвующими в транспорте и обмене катионов металлов. Последнее находит свое подтверждение при сопоставлении действия на ЕК-активность ЛПК человека in vitro соответствующей по составу псптидо(протео)гликанам ассоциированной с у-гло-булином сыворотки крови фракции, освобождаемой в условиях воздействия хелатирующего агента; гепарина; обладающих металлосвязывающими свойствами фракций ПГЦБ, выделяемых из культуральной жидкости Anabaena variabilis и проб водопроводной воды, полученных из различных источников.

Значимость подобных соединений в обеспечении достаточного для эффективного выполнения функций иммунобиологического надзора и вовлечения в процессы ЭБР уровня активности системы ЕЦТ устанавливается впервые осуществленными хроническими опытами на лабораторных животных in vivo, предполагающими наблюдение за состоянием иммунорсактивности белых беспородных мышей, поддерживаемых на питье с заданным содержанием МС-компонснтов, входящих во фракцию ПГЦБ водопроводной воды. Она также подтверждается детальным анализом результатов статистического исследования, проведенного для отдельных регионов мира и включающего оценку динамики популяционного уровня ЕЦТ человека в условиях глобальной экспансии цианобактсрий.

Теоретическая значимость исследования. В работе выдвинуты и доказаны следующие фундаментальные положения.

1. Рсгуляторный баланс в комплексе естественных цитотоксичсских реакций обеспечивается эффективными внутренними клеточными и гумораль-

ными механизмами системы ЕЦТ, совокупность которых определяет возможность ее функционирования в относительно автономном режиме и вовлечения в процессы ЭБР, по-виднмому, лежащие в основе нсцитоток-сичсских взаимодействий ЕК с клетками лимфоидной и нелимфоидной природы.

2. Значимые в осуществлении аутокринной и паракринной регуляции актив-

ности ЕК эффекты ИФН ограничиваются семейством его ингибиторов. Сочстанный дефицит ИФН и ИРДИ является ведущим звеном развития недостаточности ЕК, патогенетически связанной с формированием им-мунорегуляторного дисбаланса при PC, представляющимся патологией ЭБР, опосредуемой через систему ЕЦТ. В определенных экспериментальных условиях цитотоксическая функция ЕК может реализоваться и даже усиливаться in vitro на фоне исключения выработки ИФН ЛПК.

3. Негативный контроль комплекса естественных цитотоксичсских реакций

в организме человека и высших животных обеспечивается эндогенными механизмами и факторами экосистемы, устанавливающими и поддерживающими определенный вектор транспорта и обмена катионов металлов в микроокружении клетки и, возможно, управляющими, тем самым, окислительно-восстановительными процессами, протекающими через стадию короткоживущих радикалов кислорода, потребляемых в реакциях ЕК-опосрсдованного цитолиза.

Практическая значимость работы. Обоснована необходимость учета индивидуальной (половой и возрастной) вариабельности цитотоксической активности ЕК при оценке уровня ЕЦТ лимфоцитов и назначении средств иммунотерапии, предполагающем воздействие на функциональные параметры системы ЕЦТ. Подтверждена целесообразность сохранения в натуральных медицинских препаратах ИФН-а всего комплекса цитокинов, вырабатывающихся одновременно с ИФН в условиях адекватной индукции последнего. Установлено, что сохранение ЕК больных способности к ответу на действие иммунокорригирующих препаратов может использоваться в качестве ориентирующего критерия в прогнозе эффективности иммунотерапии. Патогенетически обоснована разработка способов применения препаратов ИФН в комбинации с ИРДИ в иммунотерапии PC. На основе полученных в работе результатов исследований разработан алгоритм использования оценки цитотоксической активности ЕК и уровня Р-белка в сыворотке крови для диагностики атипичных форм PC и их дифференцирования с онкологическим процессом. На основании теоретических разработок и практических результатов, связанных с выполнением исследований по теме диссертации, а также осуществленных в предшествующие годы, предложены: способ дифференциальной диагностики стволового и полушарного ишемичсского инсульта при нарушении мозгового кровообращения (Авт. свидст. СССР № 1455317 от 1 октября 1988 г.), способ дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей головного мозга (Авт. свидет. СССР № 1482102 от 22 января 1989 г.), способ определения индивидуальной чувствительности к иммуномодулирующим препаратам у больных злокачест-

венными лимфопролиферативными заболеваниями (Авт. свидет. СССР № 1628702 от 15 октября 1990 г.).

Внедрение в практику. Результаты исследований, полученные в ходе выполнения темы докторской диссертации, используются в лаборатории препаратов интерферона НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН при разработке новых лекарственных форм натурального ИФН-сх. Они внедрены в клиническую практику кафедр неврологии и нейрохирургии №1 и №2 лечебного факультета РГМУ (диагностика и прогнозирование эффективности иммунотерапии при рассеянном склерозе и других заболеваниях нервной системы). Результаты работы используются специалистами кафедры кожных болезней ММА им.И.М.Сеченова для оценки иммунного и ИФН-статуса, а также в контроле эффективности терапевтических мероприятий у больных рецидивирующим герпесом гениталий. Теоретические разработки и экспериментальные данные, содержащиеся в работе, включены в курс лекций для студентов и спец. курс по иммунологии кафедры иммунологии РГМУ.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты исследований представлены и обсуждены на VI Международном иммунологическом конгрессе (Торонто, 1986), Всес. симпозиуме "Иммунодефицита и аллергия" (Москва, 1986), Всес. конференциях "Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований" (Ангарск,

1987) и "Возрастные изменения в иммунном балансе" (Ташкент, 1987), X региональном симпозиуме соц. стран по интерферону (Юрмала, 1988), IX и XI Европейских иммунологических конгрессах (Рим, 1988 и Хельсинки, 1991), VIII Всес. съезде невропатологов, психиатров и наркологов (Москва,

1988), I Конгрессе иммунологов Эстонии (Тарту, 1989), Ежегодных Совещаниях Международного Общества исследования интерферона (и цитокинов) (Флоренция, 1989, Ницца, 1991 и Токио, 1993), Выездн. объедин. Пленуме пробл. комиссий АМН СССР "Иммуномодуляторы в профилактике и лечении инфекционных заболеваний" (Юрмала, 1989), Симпозиуме Ассоциации исследователей интерферона СССР "Интерфсрон-90" (Ленинград, 1990), Всес. симпозиуме "Новые методы прогноза патологического процесса" (Курск, 1991), Симпозиуме "Нсйроиммунология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 1993), Международной конференции "СПИД: от фундаментальной науки к превентивной диагностике и терапии" (Флоренция, 1994), 2-м Симпозиуме Общества естественного иммунитета "NK-клетка и се взаимодействие с иммунными и неиммунными клетками" (Таормина, 1994) и ряде других отечественных и международных конференций и симпозиумов. В 1991 г. результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на персональных авторских семинарах в Институте вирусологии (Рим), Институте иммунобиологии Общества Макса Планка (Фрайбург) и Институте токсикологии Общества Фраун-хофера (Ганновер); они включены составной частью в итоговый отчет о стажировке по стипендии ВОЗ. Разработки по диагностике и коррекции интсрфс-роновых дефицитов отмечены премией Ленинского комсомола 1989 г. Апробация диссертационной работы состоялась на межлабораторной научной конференции НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, протокол от 8 апреля 1997 г.

Публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации отражены в 58 научных публикациях (из них 13 - в зарубежных изданиях), включены в 7 авторских обзоров, использованы в монографиях "Иммунобиология гормонов тимуса" под ред. Ю.А.Гринсвича и В.Ф.Чебо-тарсва (Киев, Здоровья, 1989) и - А.Я.Кульбсрга "Экологический кризис: стратегия выживания" (М, Русская энциклопедия, 1994).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 341 странице машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 4 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Иллюстрирована 37 таблицами и 55 рисунками. Указатель литературы содержит 664 источника, из них -115 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили мононуклеарные клетки (МНК), выделенные с использованием градиентов плотности из проб периферической венозной крови или лейкомассы человека, нсприлипающис к пластику МНК периферической крови человека, обогащенные ЕК (CD16'CD56+ клетками) лимфоциты человека, полученные на основе многокомпонентных схем негативной сепарации, сплсноциты мышей, а также различающиеся по чувствительности к ИФН клетки перевиваемых стандартных линий человека и мыши, длительно поддерживаемые в культуре in vitro.

Основные группы обследованных. Группа практически здоровых доноров включала 292 человека (135 мужчин и 157 женщин) в возрасте от 16 до 77 лет; в динамике обследовано 18 человек. Группа больных рассеянным склерозом - 114 человек (41 мужчину и 73 женщины) в возрасте от 15 до 59 лет с различными типом течения процесса и степенью инвалидизации, длительностью заболевания от 6 мес. до 23 лет; в динамике наблюдения обследовано 16 пациентов, в ходе и по окончании курса иммунотерапии -17. Группа больных с острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМК) ишсмичсского характера (ишсмичсским инсультом) включала 52 человека (27 мужчин и 25 женщин) в возрасте от 42 до 82 лет со стволовой или полушарной локализацией очага поражения. Группа больных опухолью мозга - 32 человека (17 мужчин и 15 женщин) в возрасте от 30 до 76 лет с доброкачественным, злокачественным процессом или метастазами опухоли внутренних органов в мозг. Группа больных вегетативно-сосудистой дистопией (ВСД) по гипертоническому типу включала 13 человек (9 мужчин и 4 женщины) в возрасте от 17 до 48 лет. Группа больных инфекцнонно-аллергичсским церебральным васкулитом (ИАЦВ) - 5 человек (1 мужчину и 4 женщины) в возрасте от 18 до 52 лет. Группа больных очаговой склеродермией (СД) включала 40 человек (8 мужчин и 32 женщины) в возрасте от 16 до 72 лет с различными формами заболевания и давностью

процесса от 1 года до 5 лет. Группа больных системной склеродермией (ССД) - 9 человек (1 мужчину и 8 женщин) в возрасте от 24 лет до 71 года. Группа больных рецидивирующим герпесом гениталий (РГГ) включала 29 человек (17 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 22 до 65 лет с тяжелой формой заболевания, обследованных в фазе ремиссии или рецидива; в динамике иммунотерапии наблюдали 28 пациентов. Группа больных хроническим алкоголизмом (ХА) 2 стадии - 23 человека (мужчины) в возрасте от 22 до 40 лет с длительностью болезни от 2 до 10 лет. Группа больных с установленным хроническим инфицированием вирусом гепатита В (ВГВ), сочетавшимся или не сочетавшимся с дельта-инфекцией или гепатитом С, включала 11 человек (9 мужчин и 2 женщины) в возрасте от 17 до 32 лет с высокой или средней степенью активности процесса; в динамике иммунотерапии обследовано 8 пациентов.

Лабораторные животные. Группа экспериментальных животных включала 50 белых беспородных мышей, самцов, весом от25 до 36 г (в среднем 30,7±0,66 г), полученных из Центрального питомника РАМН.

Клеточные линии, поддерживаемые в культуре in vitro и использованные в качестве объекта цитотоксического воздействия ЕК. К-562, линия эритромислобластов человека, полученная из плеврального экссудата у больных хроническим мислолсйкозом в стадии бластного криза (Klein Е. et al., 1976); высокочувствительна к действию ЕК. J-96, полученная из крови больного подострой моноцитарной лейкемией (Osgood Е.Е., Brooke J.H., 1955); чувствительна к ИФН человека. J-41, сублиния, полученная путем многократного воздействия массивными дозами вируса Коксаки В на клетки линии J-96 (Соловьев В.Д., Гулсвич Н.Е., 1966); обладает пониженной чувствительностью к ИФН-сх и ИФН-ß человека (Хесин Я.Е. и др., 1979). L-929, перевиваемая линия мышиных фибробластов (Earle W.R., 1947); высокочувствительна к мышиному ИФН. МСВ, эмбриональная линия клеток, полученная от мышей С57В1/6 (Гудима О.С. и др., 1984); нечувствительна к действию ИФН.

Иммуномодуляторы и другие иммуноактивные соединения. В качестве гуморальных факторов регуляции функциональной активности ЕК использовали: человеческий лейкоцитарный ИФН для интраназалыюго применения (ЧЛИ(и/н)), лейкинферон, цитоферон, ЧЛИ для инъекций, натуральный человеческий ИФН-у (все - НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН), рсаферон, гаммаферон (оба - НПО "Фермент"), рекомбинантные (р) человеческие ИЛ-2, ИЛ-3, ГМ-КСФ (все - Институт токсикологии Общества Фра-унхофера, Ганновер), препараты С-реактивного белка (СРБ), Т-активин (или тактивин, НИИ ФХМ МЗ РФ), В-активин (или мислопид, Институт иммунологии МЗ РФ); даларгин (Кардиол. научн. центр РАМН), сывороточный у-глобулин человека, фибронектин (ФН) человека (оба - Serva), синтетический гексапсптид Р-07 с последовательностью аминокислот Cys-(Pro)3-Glu-Lcu; мышиный сывороточный ИФН-oi/ß, человеческие индуцированные ИФН-« и ИФН-у, мышиный ингибитор антивирусного действия ИФН (ИДИ); ПГЦБ, содержащиеся в культуралыюй жидкости A.variabilis и пробах водопроводной

воды; МС-псптидогликаны, извлеченные из препарата сывороточного у-гло-булина человека, а также - его агрегированной и лишенной агрегатов белка фракций; гепарин (Spofa).

Общий объем исследования. Представленные в работе результаты исследований обобщают материал, полученный от 292 здоровых доноров, 328 больных с 13 нозологическими формами инфекционных (вирусных), онкологических, инфекционно-аллергических, аутоиммунных, дсмислинизи-рующих и сосудистых заболеваний (всего 620 человек) и 50 лабораторных животных (мыши). В экспериментах использованы 5 клеточных линий, длительно поддерживаемых в культуре in vitro, и 34 гуморальных фактора регуляции активности ЕК. С учетом использования широкого диапазона соотношений эффектор:мишснь (Э:М) и постановки опытов в параллелях общее число осуществленных наблюдений составило 18727. Статистический анализ динамики ЕЦТ в 80-е годы на популяционном уровне суммирует собственные данные, а также данные, почерпнутые из 157 научных публикаций в 57 отечественных и зарубежных изданиях, и содержит информацию по не менее чем 2524 здоровым донорам.

Основные методы исследования.

МНК выделяли из периферической венозной крови пациентов в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина или Ficoll-Paquc (Pharmacia Fine Chemicals), d=l,077 г/см3, по методу A.Bóyum (1968). Для удаления ПК полученную с использованием градиентного центрифугирования суспензию МНК инкубировали в известном режиме в пластиковых чашках Петри (Nunc), предварительно обработанных сывороткой эмбрионов коров (НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН).

Выделение и обогащение суспензии МНК периферической венозной крови большими гранулярными лимфоцитами (БГЛ) осуществляли с применением многокомпонентной техники негативной сепарации, включавшей использование модифицированного одноступенчатого градиента плотности Ficoll-Paquc (Pharmacia Fine Chemicals), одновременное удаление прилипающих и фагоцитирующих частицы железа (Tcchnicon) клеток, удаление В-лимфоцитов на колонке с нейлоновой ватой, обогащение суспензии МНК клетками легких фракций в двухступенчатом (60,6% и 45%) или трехступенчатом (60,6%), 45% и 30,3%) градиенте плотности перколла (Pharmacia Fine Chemicals), удаление Т-лимфоцитов с использованием иммуномагнитной сепарации на микробусах М450 PanT(CD2) (Dynal), покрытых анти-СБ2 антителами. Определение количества CD 16 'CD56' лимфоцитов на каждом этане обогащения осуществляли методом двойной иммунофлюорссцснции клеток, окрашенных флюоресцентно меченными моноклональными анти-С016 и анти-С056 антителами тест-наборов "Simultest IMK Plus Reagents" (Becton Dickinson) на проточном цитофлюоримстрс "Facscan" (Becton Dickinson).

Цитотоксичсскую активность ЕК в суспензии МНК периферической крови человека или спленоцитов мыши оценивали радиометрическим методом Y.Hashimoto, H.Sudo (1971) в модификации М.П.Рыковой и др.

(1981) против меченных Н3-уридином в дозе 3 мкКи/мл КМ стандартных линий человека или мыши. Совместное инкубирование МНК и КМ в ячейках 96-луночных круглодонных микропланшетов проводили в течение 14 час при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО,. Постановку цитоток-сической реакции, как и реакции БТЛ, обогащение суспензии МНК БГЛ и длительное поддержание КМ в культуре in vitro осуществляли в полной питательной среде (ППС), приготовленной на основе RPMI-1640 по стандартной прописи, с антибиотиками. По истечении срока инкубации содержимое лунок осаждали на стекловолоконные фильтры с диаметром пор 2,5 мк (Whatman) 12-канальными собирателями биологических фракций типа "Dynatech". Остаточную радиоактивность па фильтрах учитывали в толуольном сцин-тилляторе известного состава с использованием различных сцинтилляцион-ных (^-счетчиков. Цитотоксичсский индекс (ЦИ) для каждого из тестированных соотношений Э:М рассчитывали по формуле Y.Hashimoto, Н. Sudo (1971). Интегральным показателем активности ЕК служила площадь под кривой цитотоксичности, рассчитанная согласно методу T.P.Shceran ct al. (1988).

Для оценки пролиферативной активности ЕК суспензии МНК в ППС, обогащенные CD16fCD56+ клетками и индуцированные рИЛ-2, рИЛ-3 или рГМ-КСФ, инкубировали в ячейках 96-луночных плоскодонных микропланшетов (Nunc) в течение 72 час при 37°С в С02-инкубаторе "Hcraeus". По истечении срока инкубации в лунки вносили Н3-тимидин в дозе 1 мкКи/мл и инкубировали суспензию еще в течение 24 час в том же режиме, после чего осаждение содержимого лунок на стекловолоконные фильтры и учет остаточной радиоактивности осуществляли, как описано выше.

Продукцию ИФН в ходе цитотоксической реакции определяли тестированием протективного эффекта супернатантов, извлеченных из лунок микропланшетов после 14 час совместной инкубации МНК с не меченными изотопом КМ, на зараженной вирусом везикулярного стоматита (штамм Индиана) монослойной культуре диплоидных фибробластов человека М 19 или М 21 по методу В.Д.Соловьева и Т.А.Бектемирова (1979). Отнесение обнаруживаемого ИФН к a-типу стандартно обосновывали его кислото- и термостабильностью. Аналогично определяли содержание ИФН в сыворотке крови и индуцированных к выработке ИФН человеческих клеточных суспензиях.

О способности ЕК распознавать и связывать КМ судили по интенсивности конъюгатообразования в первые 10 мин контакта МНК и КМ в цитотоксической реакции. Для подсчета конъюгатов Э:М использовали метод T.Haliotis et al. (1980) с некоторыми модификациями.

При постановке реакции спонтанной БТЛ суспензии МНК доноров или спленоцитов мышей инкубировали с Н'-тимиднном (10 мкКи/мл) в ППС в ячейках 96-луночных круглодонных микропланшетов в течение 18 час при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО,. Индукцию БТЛ осуществляли с использованием известных доз фитогемагтлютинина (ФГА) М (Serva) или конканавалина А (Кон A) (Sigma), внесенных в лунки микропланшета. Суспензии клеток с фитомитогенами инкубировали в течение 72 час в указанном режиме. За 24 час до истечения срока инкубации добавляли Н3-тимидин в дозе 10 мкКи/мл.

Индукцию ИФН осуществляли в суспензии ЛПК человека in vitro по методу В.Д.Соловьева и Т.А.Бсктсмирова (1979) или в образцах цельной крови с использованием метода H.Kirchner et al. (1982) в модификации С.С.Григорян и др. (1988). Выработку ИФН-а стимулировали вирусом болезни Ньюкасла (штамм Канзас) в известном режиме с последующей инактивацией вируса-индуктора. Выработку ИФН-у, стандартно идентифицируемого по кислото- и термолабильности, стимулировали ФГА Р (Difco) или стафилококковым энтсротоксином А (СЭА) (НИИ ЭМ нм.Н.Ф.Гамалси РАМН).

Дополнительные методы исследования.

Содержание Р-бслка в сыворотке крови человека и его продукцию в ходе цитотоксичсской реакции оценивали методом А.Я.Кульбсрга и др. (1986) по ингибиции исследуемым образцом реакции гемагглютинации между Rh' эритроцитами 1(0) группы крови и анти-Р-сывороткой, полученной при иммунизации кролика Р-белками человека.

Содержание ИФН в сыворотке крови мышей и супернатантах индуцированных мышиных спленоцитов устанавливали аналогично человеческой тсст-системс, за исключением оценки протектнвного эффекта ИФН - на зараженном вирусом мышиного энцсфаломиокардита трехдневном монослос мышиных фибробластов (L-клсток). Индукцию ИФН-а осуществляли аналогично ЛПК человека, для индукции ИФН-у применяли СЭА (НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН).

Методы препаративной биохимии. Применяли стандартное фракционирование препарата человеческого сывороточного у-глобулина (Serva) в 0,15 М растворе NaCl центрифугированием на препаративной ультрацентрифуге "Bcckman LS-65" в роторе SW-40; освобождение фракции пептидогликанов водопроводной воды от МС-компонснтов пропусканием через колонку с хслатирующей смолой DOWEX (Serva); получение МС-пептидогликанов из препарата человеческого сывороточного у-глобулина (Serva), а также - его агрегированной и лишенной агрегатов белка фракций, пропусканием белка через колонку с хслатирующей смолой DOWEX (Serva) и фильтрацией элюата через молекулярные ультрафильтры "Ccntriflo CF-25" (Amicon) с последующим концентрированием фильтрата на молекулярном ультрафильтре "Diaflo UC-05" (Amicon) или только фильтрацией элюата через молекулярные ультрафильтры "Diaflo ХМ-50" (Amicon). Спектральные характеристики фракций в процессе сепарации получали с использованием сканнирующсго спектрофотометра "PU 8730 UV/VIS" (Philips); содержание у-глобулина в образцах устанавливали по уровню поглощения в ультрафиолете при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0,7); содержание углеводного компонента оценивали эквивалентом глюкозы по Грогеру. Модификацию гепарина (Spofa) осуществляли пропусканием препарата в де-ионизованной воде через колонку с отмученной и отмытой дсионизованной водой гидроокисью алюминия.

Особенности постановки отдельных экспериментов и методы иммунотерапии описаны в соответствующих разделах текста диссертации (глава 2).

Математическая обработка результатов исследования. Использовали общепринятые методы вариационной статистики. Достоверность различия средних величин определяли с помощью t-критерия Стъюдента. Индекс вариабельности (ИВ) рассчитывали как отношение максимального отклонения к среднему значению. Ранговые коэффициенты корреляции (р) устанавливали по Спирману. Эффекты иммуномодуляторов в гетерогенной по уровню ЕЦТ in vitro группе обследованных оценивали с использованием т.н. показателей регулирования (ПР), общих ПР (ОПР) и отрицательной поправки к ним (Чскнсв С.Б., 19936; Чскнёв С.Б. и др., 1990а). ПР представлял собой абсолютное изменение ЦИ, отнесенное к исходной ЕК-активности МНК, взятое с соответствующим знаком и рассчитанное индивидуально как среднее арифметическое из всех примененных соотношений Э:М. ОПР вычисляли, усредняя индивидуальные ПР, взятые с соответствующим знаком.

Статистический динамический популяционный анализ. Для сопоставления собственных данных, полученных в течение 1985-1995 гг. при обследовании здоровых доноров г.Москвы, с динамикой уровня ЕЦТ в России и других регионах планеты использовали формирующие расширенную выборку результаты независимых исследований, почерпнутые из научных публикаций, вышедших за период с 1981 г. по 1989 г. и содержащих оценку цитотоксичсской активности ЕК in vitro у здоровых доноров или практически здоровых добровольцев. Из более чем 1000 обнаруженных публикаций для анализа отобраны только работы, совпадающие по: методу выделашяизпериферичсской крови эффекторов ЕЦТ; базовому методу оценки цитотоксичности ЕК; применяемому для мечения КМ изотопу; опухолевой линии КМ; диапазону тестированных соотношсшш Э:М, позволяющему рассчитать показатель площади под кривой цитотоксичности.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности и механизмы функционирования системы ЕЦТ в режиме эндогенной биологической ретрансляции

Функциональные особенности системы ЕЦТ. обеспечивающие возможность ретрансляции биологического сигнала.

Показатели цитотоксичсской активности ЕК в произвольно выбранной группе здоровых доноров характеризуются нарастанием ЦИ при увеличении числа МНК, приходящихся в экспериментальной системе на 1 КМ. При этом уровень ЕЦТ у здоровых доноров колеблется в широких пределах. Статистический интервал 2а составил на различных соотношениях Э:М от 24,0 до 33,0, разброс значений ЦИ - от 2 до 82%, что практически перекрывает всю возможную область изменения активности ЕК. Расчет

Таблица 1.

Показатели цитотоксической активности ЕК и ее вариабельности у здоровых мужчин и женщин (М±т).

Соотношение Э:М

Группа доноров 100:1 50:1 25:1 12:1 6:1

Мужчины (п=106)

ЦИ,% 60,5±1,5 56,1±1,6 48,5±1,6 35,9±1,9 28,1±2,1

ИВ 0,82 0,89 0,90 1,51 2,06

Женщины (п=101)

ЦИ,% 55,2±1,5 50,7±1,4 40,4±1,5 31,7±1,5 22,5±1,5

ИВ 0,75 0,58 0,98 1,48 1,76

Р (ЦИ) <0,02 <0,02 <0,001 <0,1 <0,05

вариабельности активности ЕК обнаруживает, что с уменьшением соотношения Э:М ИВ последовательно увеличивается с 0,45 при 100:1 до 1,28 при 6:1. Тем самым, в менее насыщенной суспензии МНК повышается вероятность распознавания КМ отдельными эффекторами ЕЦТ, и возможности реализации цитотоксического потенциала единичного киллера становятся значимо выше.

Анализ уровня функционирования системы ЕЦТ в обследованной группе лиц с учетом возрастного фактора показывает, что, начиная с пожилого возраста, активность ЕК у здоровых доноров снижается, более выражение при соотношениях Э:М 6:1-25:1 (Чекнсв С.Б., 1987). Еще более выражено снижение с возрастом ИВ показателей активности ЕК. Уже в зрелом возрасте на низких соотношениях Э:М ИВ составляет 65% от показателей юношеского. В пожилом возрасте снижение ИВ наблюдается на всех соотношениях Э:М, в том числе - отражающих функциональное состояние популяции ЕК (Чскнсв С.Б., 1987,1989). У лиц старческого возраста отмечено 5-кратнос уменьшение ИВ по сравнению с донорами в юношеском возрасте.

Расширенная выборка здоровых доноров включала 106 мужчин и 101 женщину в возрасте от 16 до 76 лет. Результаты исследования обнаруживают, что показатели цитотоксической активности ЕК в группе здоровых мужчин достоверно выше, чем у женщин (табл. 1). В обследованных группах доноров выявляется сильная положительная корреляция показателей ЦИ (р=0,9). Обращает внимание, что при разведении клеточной суспензии от соотношения Э:М 100:1 до 6:1 у мужчин ИВ последовательно увеличивается с 0,82 до 2,06, тогда как менее выраженное увеличение ИВ у женщин (с 0,75 при 100:1 до 1,76 при 6:1) не является в той же степени монотонным.

Разница в уровне функционирования системы ЕЦТ у мужчин и женщин проявляется уже в возрастной группе не старше 20 лет и особенно усиливается в возрасте от 41 года до 70 лет. Указанные различия, касающиеся

как функциональной активности ЕК, так и интенсивности их созревания из клсток-предшествснников, по всей видимости, отражают существенное отличие в гормональном статусе мужчин и женщин, т.к. практически все гормоны являются эффективными регуляторами иммунных функций.

У мужчин с возрастом отмечается снижение цитотоксической активности ЕК. Достоверные различия по сравнению с группой не старше 20 лет появляются в возрасте от 31 года до 40 лет, наиболее выраженные - в возрасте от 51 года до 70 лет. У женщин возрастные изменения функционирования системы ЕЦТ также проявляются в снижении активности ЕК. В отличие от мужчин, достоверные сдвига по сравнению с группой не старше 20 лет отмечаются несколько позже - в возрасте от 41 года до 50 лет, с последующим углублением дефицита, характеризующимся не только изменением интенсивности созревания ЕК, но и снижением цитотоксичности отдельных клеток, тестируемой при соотношениях Э:М 25:1-100:1 (Чекнсв С.Б., 1987, 1989).

Анализ возрастной вариабельности с учетом полового признака обнаруживает разнонаправленные сдвиги компенсаторных возможностей системы ЕЦТ у мужчин и женщин. У мужчин с возрастом отмечается 2-3-кратное снижение ИВ на всех тестированных соотношениях Э:М. У женщин, наоборот, с возрастом ИВ увеличиваются, достигая в группе 41-50 и 61-70 лет значений, превышающих таковые в возрасте не старше 20 лет в 4-4,5 раза. Таким образом, значимое, выраженное сильнее, чем у мужчин, снижение цитотоксичности ЕК у женщин сопровождается в зрелом, пожилом и старческом возрасте повышением вариабельности системы ЕЦТ.

Результаты проведенного исследования убедительно свидетельствуют о существовании высокоэффективных механизмов внутренней адаптации и компенсации системы ЕЦТ, реализующихся на основе широкой нормы реакции и высокой вариабельности показателей цитотоксической активности ЕК, блокирование которых с возрастом ассоциировано с возникновением патологических процессов, обусловленных развитием имму-норегуляторного дисбаланса (Canónica G.W. ct al., 1985; De Paoli P. et al., 1988; Doria G., 1988; Hirokawa K., 1985; Krishnaraj R., Blandford G., 1988).

Изучение действия рсаферона на функционирование ЕК in vitro показывает, что у здоровых доноров активность ЕК под действием человеческого рИФН-u, увеличивается в значительно меньшей степени, чем при использовании натурального препарата ЧЛИ (125 МЕ/мл). ОПР реаферона составил 20%, ОПР ЧЛИ 143% (Чекнёв С.Б. и др., 1990а). У больных PC действие рсаферона соразмерно эффекту ЧЛИ, соответствующие ОПР составили: реаферона 30%, ЧЛИ 24%.

Т-активин у здоровых доноров в дозе 1,0 мкг/мл выраженно стимулирует ЕК, ОПР 127%. Сочетание реаферона и Т-активина снижает активность ЕК с ОПР -27%. При действии Т-активина у. больных PC в дозах 1,0 и 10,0 мкг/мл ОПР составляет, соответственно, 36 и 42%). Комбинация Т-активина с реафероном повышает активность ЕК с ОПР 75%. ОПР миелопида в дозе 10,0 мкг/мл составляет у здоровых доноров 58%, в дозе 1,0 мкг/мл -12%, сочетание миелопида и реаферона стимулирует ЕК с ОПР

42%. У больных PC миелопид в дозе 1,0 мкг/мл оказывает стимулирующее действие на активность ЕК с ОПР 70%. В дозе 10,0 мкг/мл ОПР миелопида составляет 37%. Сочетание миелопида с рсафероном приводит к снижению эффективности действия миелопида до 25% ОПР. У здоровых доноров даларгин, а также его комбинация с рсафероном неэффективны в регуляции активности ЕК. У больных PC ОПР даларгина составляет около 70% при действии обеих доз препарата, сочетание даларгина с рсафероном приводит к увеличению ЕК-активности на 30% ОПР.

Представленные результаты, с позиций стадио-спсцифической регуляции дифференцировки ЕК, свидетельствуют о том, что созревание этих клеток находится под контролем не только ИФН, но также факторов тнмического происхождения и костного мозга. Рассматривая систему ЕЦТ как регуляторное звено иммунитета, способное к трансляции сигналов, обеспечивающих поддержание иммунного гомсостаза, естественно утверждать, на основании приведенных данных, что в постоянно меняющихся условиях инициации пролиферации и дифференцировки лимфоцитов (Шубин-ский Г.З, Лозовой В.П., 1984; Ярилин A.A., 1985,1987; Grossman Z.,Herbcr-man R.B., 1986) система ЕЦТ, испытывая физиологические влияния факторов тимуса, костного мозга и нейротрансмиттсров, эффективно реализует внутренние механизмы адаптации, меняя режим функционирования в зависимости от активности тимуса и костного мозга, а также интенсивности межклеточного обмена, управляемого посредством нейроэндокринных связей.

У больных PC на фоне описанных нами изменений в системе ЕЦТ, развивающихся по типу ИФН-зависимого дефицита (Чскнёв С.Б., 1987, 1993а; Чскнёв С.Б., Ковальчук Л.В., 1989), наблюдается функциональная недостаточность ЕК, связанная со снижением продукции ИФН практически всеми вовлеченными в этот процесс клетками (Сорокин A.M. и др., 1987; Чскнёв С.Б., 1987). Как показывают результаты проведенного исследования, при этом ЕК теряют in vitro чувствительность к Т-активину, повышается степень активации клеток миелопидом и возникает реакция на даларгин, отсутствующая у здоровых доноров. У больных PC реаферон отменяет in vitro стимуляцию ЕК миелопидом, а при использовании комбинаций реафе-рона с даларгином и реаферона с Т-активином отмечается эффект кумуляции.

При онкологических процессах, сосудистых нарушениях в ткани головного мозга и ИАЦВ наблюдается изменение функции цитотоксичсских лимфоцитов. При этом все три типа патолог ических состояний характеризуются функциональной недостаточностью эффекторов ЕЦТ, проявляющейся в снижении ЕК-активности МНК in vitro при соотношениях Э:М 25:1-100:1 (Чскнёв С.Б., 1987,1989). У больных с опухолью мозга абсолютное снижение значений ЦИ составило от 14,7 до 21,8% (р<0,01-0,02) и сопровождалось утратой ЕК чувствительности к действию Т-активина in vitro. У больных с ОНМК ишсмичсского характера (ишемическим инсультом) абсолютное изменение показателей ЦИ составило от 12,2 до 17,1% (р<0,02). Т-активин не изменял активность ЕК in vitro. Эффективность В-активнна, по сравнению с МНК здоровых доноров (Чекнсв С.Б., 1987; Чекнёв С.Б. и др., 1987), возрастала: препарат не только стимулировал ЕК при соотношении Э:М 6:1

(р<0,1), но и восстанавливал нормальный уровень ЕК-активности при 50:1, что важно, т.к. данное соотношение Э:М относится к функциональным параметрам тестирования ЕЦТ (Чекнёв С.Б, 1987, 1989). При ИАЦВ абсолютное снижение значений ЦИ составило от 10,5 до 14,3% (р<0,05-0,1). Однако, при соотношении Э:М 6:1 активность ЕК повышается по сравнению с нормальными показателями на 7,3%. Действие Т-активина на ЕК-активность МНК у больных ИАЦВ in vitro во многом повторяет его эффект у здоровых доноров (Чекнёв С.Б, 1987; Чекнёв С.Б. и др, 1987) -активность ЕК при соотношении Э:М 100:1 снижается на 15,3% (р<0,05). Одновременно нормализуются значения ЦИ при соотношении Э:М 6:1.

Результаты исследования показывают, что у больных ХА 2 стадии активность ЕК снижена. Абсолютное изменение ЦИ составило 13,016,6% (р<0,01-0,05). При соотношении Э:М 6:1 ЦИ повышен на 12,6% (р<0,05). Влияние Т-активина in vitro на активность ЕК у больных ХА как в условиях предварительной обработки МНК, так и при совместном инкубировании в системе ЕК:КМ отсутствует. Таким образом, способный изменять структуру биологических мембран этанол может рассматриваться как фактор, обусловливающий изменение спектра чувствительности ЕК к действию физиологических регуляторов, что с необходимостью способствует утрате системой ЕЦТ потенциала адаптации, определяющего ее функционирование в организме в качестве механизма иммунобиологического надзора и ретрансляции. Напротив, расширение диапазона реагирования ЕК на действие факторов физиологической регуляции должно способствовать восстановлению нормального уровня цитотоксической активности ЕК, что подтверждается in vitro коррекцией Т-активином цитотоксичности МНК у больных ИАЦВ.

Выявленный эффект лечения больных PC мислопидом, коррелирующий с нормализацией в ходе терапии функциональной активности ЕК и отменой ингибирующего влияния факторов сыворотки на функции МНК, свидетельствует о том, что стимуляция мислопидом ЕК in vitro представляет собой один из вариантов компенсации в системе ЕЦТ, позволяющий, по-видимому, восстановить нормальную линию дифференцировкн цитоток-сичсских эффекторов, блокированную при PC недостаточностью системы ИФН и связанных с индукцией ИФН-гснсза цитокинов. С другой стороны, представленные результаты, демонстрирующие улучшение клинического состояния больных на фоне восстановления in vitro функций эффекторов ЕЦТ, подтверждают существенный вклад системы ЕЦТ в обеспечение регуляторного баланса, поддерживаемого многочисленными связями ЕК с другими клетками иммунной системы под контролем широкого спектра регулирующих влияний факторов тимуса, костного мозга и нсйротрансмиттсров.

В соответствии с полученными данными, продукция ИФН в системе взаимодействия ЕК:КМ у здоровых доноров возрастает с увеличением количества эффекторов, приходящихся на 1 КМ. Закономерность роста показателей соответствует таковой ЦИ и характеризуется высокой вариабельностью параметра. ИВ продукции ИФН с уменьшением соотношения Э:М, в отличие от значений ЦИ, уменьшается с 0,71 при 100:1 до 0,25 при 6:1.

При этом связь цитотоксической и ИФН-продуцирующсй активности ЕК у здоровых доноров характеризуется in vitro как сильная положительная, р=0,87±0,05. Реципрокныс изменения функций ЕК в зависимости от соотношения Э:М могут существенно сказываться на силе их связи при отдельных функциональных нагрузках или патологических состояниях и представляют основу расщепления биологического сигнала в системе ЕЦТ, детерминированного, таким образом, широким диапазоном функциональной активности, обеспечивающим условия ретрансляции в организме.

В наших исследованиях 1984-1987 гг. выявлена диссоциация цитотоксической и ИФН-продуцирующсй активности ЕК у больных PC. Диссоциация обнаруживалась на фоне общего снижения показателей как цитотоксичности ЕК, так и продукции ИФН при взаимодействии ЕК:КМ (Сорокин A.M. и др., 1987; Чскнсв С.Б., 1987) с сохранением в среднем положительной корреляции функций (р=0,57±0,12, р>0,05) и проявлялась повышением продукции ИФН при снижении показателей ЕЦТ (р=0,79±0,11) или резким снижением продукции ИФН при незначительном уменьшении цитотоксической активности ЕК (р=0,44±0,18, р>0,05). У больных различными формами очаговой СД снижение цитотоксической активности ЕК (Чскнсв С.Б., 1987; Чскнсв С.Б. и др., 1989) не сопровождается изменениями ИФН-продуцирующей функции при взаимодействии с КМ. Выработка ИФН сохраняется в пределах нормы, даже с некоторой тенденцией к повышению (р=0,56±0,18, р>0,05). В группе лиц с заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС) индивидуальный анализ цитотоксичности выявляет возникновение аномальной ЕК-активности, характеризующейся пиком на низких соотношениях Э:М со снижением функции клеток на точках 50:1 и 100:1. Такие изменения активности ЕК выявлены у больных ВСД, пациентов с ОНМК, а также у некоторых практически здоровых доноров. При этом значения ЦИ на пике достигали 67%, т.е. превышали максимальные показатели активности ЕК, регистрируемые у большинства здоровых доноров на низких соотношениях Э:М. Пикообразнос увеличение цитотоксичности ЕК на низких соотношениях Э:М не сопровождается соответствующим ростом продукции ИФН. Диссоциация функций ЕК характеризуется в обследованной группе лиц р=0,15±0,01 (р<0,001), свидетельствуя, что при изменениях вегетативной регуляции в иммунной системе может стимулироваться пролиферация функционально неполноценных клеточных форм. Поскольку содержание ИФН в сыворотке крови пациентов, ЕК которых аномально отвечают in vitro на аллогенную индукцию, колеблется от 12 до 48 ЕД/мл, составляя в среднем 24,6±4,3 (р<0,001), а в сыворотке крови здоровых доноров ИФН практически не обнаруживается (1,3±0,7 ЕД/мл), естественно предполагать, что у обследованных больных аномальное развитие ЕК инициируется появлением в сыворотке избытка фактора дифференцировки, ускоряющего созревание предшественников с формированием в периферической крови пула функционально неполноценных эффекторов ЕЦТ. Выявленные формы диссоциации функций в системе ЕЦТ могут рассматриваться в качестве вариантов естественной реакции функциональных комплексов, задействованных в поддержании иммунного и общего гомеостаза, на пато-

логические сдвиги, ассоциированные с изменением активности отдельных компартментов иммунной системы.

Но если диссоциация функций в системе ЕЦТ является физиологическим состоянием клеток, обеспечивающим вариабельность реакции на экзогенные влияния и внутренние факторы индукции, то она может поддерживаться лишь физиологическими стимулами, уровень формирования которых относительно стабилен и не связан непосредственно с активацией или супрессией иммунного ответа. Предметом нашего исследования стал синтетический гек-сапептид Р-07, структура которого Cys-(Pro)3-Glu-Leu воспроизводит строение С-концевого участка пепсинового Fab-фрагмента (Су2 домена), локализованного в районе талии молекулы IgG кролика (Кульберг А.Я., 1994).

Как видно на рис. 1, гексапсптнд Р-07 достоверно повышает цито-токсичсскую активность ЕК здоровых доноров в условиях 1 час обработки МНК с последующей отмывкой препарата. Эффект регистрировался на функциональных соотношениях Э:М (25:1-100:1) и характеризовался обратной дозовой зависимостью. Полученные независимые результаты свидетельствуют о способности исследованного гексапептида индуцировать продукцию ИФН ЛПК, инкубированными с Р-07 в течение 72 час. Индуцированное гексапептидом антивирусное действие соответствовало эффектам традиционно используемых высокомолекулярных индукторов ИФН и многократно ослаблялось в результате пропускания полученных супсрнатантов через колонку с иммобилизованными антителами против ИФН-у человека. В то же время, обработка МНК гексапептидом Р-07 практически полностью отменяла продукцию ИФН в цитотоксическом тесте.

Тем самым, получено важнейшее свидетельство возможности протекания реакции ЕЦТ без сопутствующей индукции ИФН-гснсза. Отмена выработки ИФН происходит под влиянием фактора, сопоставимого по способности стимулировать биосинтез ИФН-у с традиционными высокомолекулярными индукторами ИФН. Расщепление сигнала в системе ЕЦТ обретает, таким образом, реальный биологический смысл: в условиях локального возмущения и наличия фактора, вызывающего активацию клеток, выработка ИФН блокируется и, по-видимому, цитотоксическос действие реализуется, а эффект-достигается, за счет вовлечения в литичсский цикл активированных EK(Sakscla Е. etàl., 1979; Targan S., Dorcy F., 1980) без индукции дозревания прс-ЕК в активные формы. Следовательно, с одной стороны, исключается возможность двойного усиления и избыточной активации ЕК, способных лизировать и аутологичные, интенсивно пролиферирующие (не онкотрапс-формированные) клетки (Holmberg L.A. et al., 1984; James К., Ritchic B.W.S., 1984; Robles С.P., Pollack S.В., 1986), с другой, - отсутствует протсктивнос действие ИФН в отношении KM (Leiden J.M. et al., 1989; Powell J. et al., 1989), чем в высокой степени обеспечивается эффективность реакции ЕЦТ. Диссоциация цнтотоксической и ИФН-продуцирующей функций лимфоцитов достигается под влиянием соединения, подобного продуктам катаболитного расщепления белков, естественно образующимся как обязательный компонент плазмы крови, и является, таким образом, физиологической составляющей ретрансляции через систему ЕЦТ.

о

1

*

1

1

1

25:1

100:1

50:1

Соотношение Э:М

Рис.1

Цитотоксическая активность ЕК во взвеси МНК здоровых доноров, обработанных in vitro гексапептидом Р-07 (М±т, п=6). Дозы Р-07: 1 - 0,05; 2 - 0,5; 3 - 5,0 мкг/мл. Штриховка - контроль. *р<0,01; **р<0,02; ***р<0,001 по сравнению с контролем.

Оценка динамики показателей активности ЕК и ИФН-статуса у больных РГГ в ходе лечения ридостином показывает, что изменения активности ЕК и продукции стимулированного ИФН не коррелировали. В состоянии ремиссии заболевания, перешедшем под влиянием терапии ридостином в длительный межрецидив, а у некоторых пациентов - и реконвалссцснцию, определена сильная отрицательная связь активности ЕК и продукции ИФН-сх(р=-0,8). Именно больные РГГ, получавшие рпдостин в состоянии ремиссии, на фоне разобщения двух систем неспецифической противовирусной резистентности, практически не имели рецидивов заболевания в течение последующих 1-2 мес. наблюдения. Получено подтвержденное

клинической практикой свидетельство формирования диссоциации цитотоксичсской активности ЕК и продукции ИФН в организме физиологическими стимулами и поддержания ее вовлечением внутренних механизмов регуляции, обеспечивающих, таким образом, возможность расщепления сигнала в процессе ЭБР через систему ЕЦТ.

Факторы и механизмы внутреннего усиления в системе F.IIT.

При оценке действия отечественных медицинских препаратов натурального ИФН-а на активность ЕК здоровых доноров in vitro отмечается тенденция к повышению значений ЦП под действием ЧЛИ (и/н) в дозах 50 и 100 МЕ/мл при соотношениях Э:М 50:1 и 6:1, а также ЧЛИ в дозе 50 МЕ/мл при соотношении Э:М 100:1. В отличие от других исследованных лекарственных форм ИФН-а цитоферон достоверно стимулировал ЕК в общей группе здоровых доноров. Значения ЦИ увеличивались при соотношении Э:М 100:1 с 52,8±0,74 до 70,0±5,5% (р<0,05) при действии дозы 2 МЕ/мл и до 66,2± 1,85% (р<0,001) под влиянием 50 МЕ/мл. Цитоферон является наиболее полным комплексом цитокинов, вырабатываемых в ответ на адекватную индукцию ИФН, обладает наименьшей эффективной регулирующей концентрацией и в наибольшем числе случаев восстанавливает нормальный профиль кривой цитотоксичности. Поэтому, если исходить из способности препаратов ИФН-а контролировать функции ЕК как одного из важных рс-гуляторных звеньев иммунной системы, рациональным следует считать сохранение в лекарственных формах ИФН всего комплекса цитокинов, синтезируемых индуцированными лейкоцитами в процессе ИФН-гснеза.

Результаты дальнейших исследований показывают, что не только вырабатываемый в системе ЕК:КМ ИФН, но и весь связанный с адекватной индукцией ИФН-генсза комплекс цитокинов сыворотки вовлекаются в стимуляцию эффекторов ЕЦТ, поддерживая физиологический уровень диффе-ренцировки ЕК и обусловливая избыточную активацию клеток системы ЕЦТ при патологических состояниях, связанных с гипериндукцией и избыточной продукцией в сыворотку крови ИФН и ассоциированных цитокинов.

Установлено, что при заболеваниях печени, вызванных ВГВ, относительно краткий курс комбинированного применения лейкинферона и ЧЛИ обусловил у больных значимые сдвиги уровня функционирования системы ЕЦТ, проявившиеся не только нарастанием в 1,5-3,9 раза цитотоксичности практически на всех тестированных соотношениях Э:М (р<0,()01-0,05), но и превышением сю показателей здоровых доноров при соотношениях Э:М 12:1 и 25:1 в 1,8 раза (р<0,02). Клинические результаты лечения оцениваются как обнадеживающие, поскольку эффект ИФН-тсрапии состоял не только в объективном улучшении состояния больных и определенной динамике кли-нико-лабораторных показателей. У 8 из 14 больных, получавших комплексные препараты ИФН-а и цитокинов, отмечали ссроконверсию с исчезновением одного или двух маркеров репликации вируса (Крсль П.Е. и др., 1993).

Как и следовало ожидать, имея в виду полученные нами данные, более выраженный эффект, как клинический, так и иммунокорригирующий, наблюдали при использовании лейкинферона. При этом исходно сниженная

выработка индуцированных ИФН-а и ИФН-у клетками крови больных полностью нормализовалась. В ряду иммунологических показателей, не связанных функционально с системой взаимодействия ЕК-ИФН (розстко-образование Т- и B-лимфоцитов, содержание иммуноглобулинов, фагоцитоз), существенных изменений на фоне применения препаратов ИФН не произошло.

Последнее обстоятельство позволяет установить еще одну важнейшую особенность функционирования в организме системы ЕЦТ: в определенных условиях, связанных с хроническим патологическим процессом, развивающимся по типу вторичного иммунодефицита, система ЕЦТ может реализовать свой цитотоксичсский и регуляторный потенциал автономно, вне связи, в определенном смысле, с другими звеньями иммунной системы, что еще раз подчеркивает се особую биологическую значимость.

Удаление ПК из взвеси МНК периферической крови у здоровых доноров in vitro снижает цитотоксичсскую активность ЕК в среднем на 19% по отношению к контролю (р<0,02-0,05). Снижение равномерно распределено по соотношениям Э:М, кроме 6:1. После удаления ПК резко снижается продукция ИФН-а в системе ЕК:КМ. Эффект равномерно распределен по веем функциональным соотношениям Э:М и составляет в среднем 92,4% (р<0,01-0,02). У больных PC после удаления ПК из взвеси МНК цнтотокси-чсская активность ЕК снижается в среднем в 2 раза. Абсолютное изменение ЦИ составило от 16 до 24% (р<0,05-0,1). Эффект выражен на всех тестированных соотношениях Э:М, кроме 100:1. ИФН-продуцирующая активность ЕК после удаления ПК у больных PC снижается (как и цитотоксичсская) в среднем на 50% (р<0,05) по сравнению с контролем. Абсолютное изменение при отдельных соотношениях Э:М составило от 48 до 96 ЕД/мл.

Полученные результаты позволяют заключить, что ПК, порядка 90% которых составляют моноциты, вносят определенный вклад в общую ЕЦТ и являются важным компонентом продукции ИФН-сх в системе ЕК:КМ. При патологических процессах, связанных с развитием иммунодефицита по ЕК, к каковым относится PC (Чскнсв С.Б., 1993а; Neighbour P.A. et al., 1982; Stöger I. et al., 1982; Uchida A. et al., 1982), ЕЦТ моноцитов (или ПК) может усиливаться, компенсируя снижение цитотоксичсскон активности ЕК. Тем самым, подтверждается положение о возможности функционирования ПК в качестве фактора усиления в системе ЕЦТ. Кроме того, ЕЦТ ПК и ведущий вклад этих клеток в выработку ИФН-сх при взаимодействии ЕК:КМ может обоснованно рассматриваться как фактор внутреннего усиления системы. Результаты работы свидетельствуют, что современные многоэтапные схемы обогащения суспензии МНК человека ЕК, реализующие последовательную негативную сепарацию контаминирующих клеток, не позволяют получить суспензию ЕК (CDlö'CDSö1 клеток), полностью освобожденную от моноцитов, содержание которых в конечной суспензии составляет не менее 2,74%, а даже 2% моноцитов в суспензии оказывают выражен-ное действие на активность ЕК и продукцию ИФН (Arbeit R.D. et al., 1982). По-видимому, именно моноцитами, контаминирующими легкие фракции градиента плотности перколла, передастся зарегистрированный в

работе (ко)стимулирующий пролиферацию ЕК (CD16'CD56' клеток) сигнал рИЛ-3.

Обработка реафероном в дозе 2000 ME/мл КМ человеческой линии J-96, чувствительных к ИФН, приводит к снижению в 2,5-3 раза цитотоксичсс-кой активности ЕК против этих КМ. Абсолютное изменение ЦИ составляет от 18,9 до 26,1% (в среднем 21,8%) и является достоверным (р<0,05) при соотношениях Э:М 12:1 -100:1. Резистентные к ИФН КМ линии J-41 после обработки реафероном становятся в 1,5-2,5 раза более чувствительными к цитотокенчее-кому действию ЕК. Абсолютное изменение ЦИ составляет от 16,0 до 43,8% (в среднем 27,4%) и является достоверным (р<0,05) при соотношениях Э:М 12:150:1. Следовательно, ИФН способен не только протестировать КМ человека от цитотоксического действия ЕК (Lahat N. et al, 1988; Leiden J.M. et al, 1989; Powell J. et al, 1989), но и усиливать лизис таковых, причем - обладающих пониженной чувствительностью к антивирусному действию фактора.

В присутствии гаммаферона в реакционной смеси цитотоксическая активность ЕК здоровых доноров in vitro увеличивается на 9-15%. При этом распознавание и связывание КМ характеризуется снижением на 44-80% числа конъюгатов, образующихся в системе ЕК:КМ. Анализ состава конъюгатов позволяет рассматривать систему ЕК:КМ, формирующуюся в присутствии рИФН-у, как соответствующую высокообогащснной суспензии ЕК, содержащей более 98% CD16f клеток, являющихся активными эффекторами ЕЦТ (Garcia-Pcnarrubia Р. et al, 1989). Выявленные закономерности полностью воспроизводятся при изучении препаратов СРБ. В присутствии CF^ активность ЕК увеличивалась на 22-36%, в то время как число конъюгатов Э:М снижалось на 28-58%. СРБ, повышал активность ЕК на 12-43% с одновременным снижением интенсивности конъюгатообразования в системе ЕК:КМ на 14-52%. При этом угнетение процесса распознавания и связывания КМ характеризовалось прямой дозовой зависимостью. Обработка МНК периферической крови здоровых доноров гексапептидом Р-07 аналогично приводит к повышению ците-токсической активности ЕК, отмечаемому на фоне 25-50% снижения в диапазоне доз препарата 0,5-50,0 мкг/мл числа конъюгатов Э:М, образующихся в первые 10 мин контакта эффекторов ЕЦТ и КМ. При этом степень диссоциации конъюгатов Э:М, индуцированной под влиянием Р-07, прямо зависела от использованной дозы гсксапсптида, в отличие от регистрируемого в аналогичных условиях эффекта рИФН-у, процесс деструкции "ложных" конъюгатов Э:М в присутствии которого характеризовался обратной дозовой зависимостью.

Регуляция активности ЕК и динамика литичсского взаимодействия эффекторов ЕЦТ с КМ, с учетом представленных результатов, описываются каскадом активирующих влияний, обеспечивающим поддержание определенного уровня функционирования пула активных ЕК: пре-ЕК + ИФН-« —» активные ЕК (экспрессия СРБ) + КМ эффективные и неэффективные конъюгаты Э:М + ИФН-у + СРБ или + эндогенные аналоги Р-07 с редокс-активными протеогликанами (ПрГ) -4» диссоциация неэффективных конъюгатов Э:М -» эффективные конъюгаты Э:М + ИФН-у + СРБ или + эндогенные аналоги Р-07 с редокс-активными ПрГ —» лизис КМ, продукция

ИФН-а в системе ЕК:КМ -» рсциклинг ЕК —» активные ЕК -» следующий литический цикл.

Факторы и механизмы внутреннего торможения в системе ЕЦТ.

Как показывают результаты исследования, обработка КМ мышиной линии L-929, чувствительных к ИФН, мышиным сывороточным ИФН-o/ß в дозе 100 ME/мл приводит к снижению в 1,5-2 раза цитоток-сической активности ЕК человека против этих КМ. Абсолютное изменение ЦИ составляет от 12 до 22,3% (в среднем 17,1%) и определяется как достоверное (р<0,05) на соотношениях Э:М 50:1 и 100:1. Резистентные к ИФН КМ линии МСВ после обработки ИФН также (в отличие от человеческой линии J-41 ) становятся в 1,5 раза менее чувствительными к цитотоксичсскому действию ЕК. Абсолютное изменение показателей ЦИ составляет от 2 до 22,5% (в среднем 10,1%), являясь достоверным (р<0,05) при соотношениях Э:М 25:1 и 100:1. Можно констатировать, что ИФН протестирует in vitro КМ не только в аллогенной (Leiden J.M. et al., 1989; Powell J. et al., 1989), но и кссногенной системе.

Выявляемые во фракции ПК макрофаги супрессируют цитоток-сическую активность ЕК. У больных ССД, в условиях функциональной недостаточности эффекторов ЕЦТ (Чскнсв С.Б., 1987), после удаления ПК из взвеси МНК активность ЕК не меняется при соотношениях Э:М 100:125:1 in vitro. В то же время, на соотношениях Э:М 12:1 и 6:1, характеризующих количество активных эффекторов в популяции ЕК, ЦИ увеличивается, превышая показатели даже в группе здоровых доноров. Значения составили при соотношениях Э:М 12:1 и 6:1, соответственно, 48,3±2,5 (р<0,05) и 52,8±3,8% (р<0,02).

Представленные на рис.2А данные показывают, что ауто-ИФН не увеличивают в суспензии МНК, полученных из крови здоровых доноров, цитотоксичсскую активность ЕК. ОПР ауто-ИФН-ос составил -8±16 и ауто-ИФН-у 6± 10%). В то же время у больных PC ауто-ИФН оказывали выраженное стимулирующее действие на МНК, обладающие активностью ЕК (рис.2Б). ОПР соответствовали: ауто-ИФН-ос 28±11 (р<0,05) и ауто-ИФП-у 56±26% (р<0,05). Хотя дозировку ИФН регулировали объемом вносимого в суспензию МНК супсрнатанта, содержащего ИФН, использованные для активации МНК здоровых доноров и больных PC концентрации ауто-ИФН практически не различались (Chcknev S.B. et al., 1994) и совпадали с повышающими цитотоксичность ЕК in vitro дозами коммерческих препаратов ИФН (Чекнёв С.Б. и др., 1990а). Поскольку контрольные опыты исключают возможность изменения в использованной системе оценки не только свойств ИФН, но и уровня функционирования МНК, обладающих активностью ЕК, в ходе постановки эксперимента, а также чувствительности клеток к регулирующему действию ИФН (Chcknev S.B. et al., 1994), обоснованно полагать, что в работе впервые получены свидетельства существования ИРДИ, продуцируемого одновременно с ИФН-а и ИФН-у в ответ на индукцию последних.

Эффекты супернатантов, предположительно, содержащих наряду с ИФН ИРДИ, тестировали в режиме инкубации (экспозиция 1 час при 37°С)

А

1 (6)

2(6)

Б

1 (10)

2(9)

-40 -20 0 20 40 60 80 100

Olli', %

Рис.2

Действие ауто-ИФН-а (1) и ауто-ИФН-у (2) на цитотоксическую активность ЕК у здоровых доноров (А) и больных PC (Б) in vitro (M±t). В скобках - число наблюдений; штриховка - р<0,05 по сравнению с показателями у здоровых доноров.

и в дозах, соответствовавших индуцированным ауто-ПФН, внесением в суспензию МНК одновременно с последними. Добавленные к МНК больных PC содержащие ИФН супсрнатанты, полученные на клетках здоровых доноров, полностью отменяли стимулирующее влияние ауто-ИФН на цитотоксичность ЕК, опосредуемую клетками больных PC. Равные 6±5% (р<0,05) для ИФН-а и -9±7% (р<0,05) для ИФН-у результирующие ОПР свидетельствовали о возвращении системы в исходное состояние и, тем самым, - полном блокировании эффектов ауто-ИФН. Природа ИРДИ остае тся неизвестной. Тем не менее, его выработка, ассоциированная с индукцией ИФН, независимость эффективности блокирующего влияния от исходной ЕК-активности МНК и отсутствие в коммерческих препаратах ИФН указывают на определенное сходство ИРДИ с семейством описанных ранее ИДИ (Марченко В.И. и др., 1975; Flcischmann W.R., Jr. et al., 1979). Однако, в отличие от ИДИ, блокирующих антивирусное действие ПФРI, свойства ИРДИ проявляются отменой стимулирующих влияний ИФН-а и ИФН-у на МНК, обладающие активностью ЕК.

Результаты дальнейших исследований показывают, что ИДИ, вырабатываемый в ответ на индукцию ИФН, обладает выраженными регуля-торными свойствами в отношении активности ЕК в условиях предварительной обработки им КМ. Регулирующее действие ИДИ на КМ в реакции ЕЦТ

зависит от их чувствительности к антивирусному эффекту ИФН. ИДИ функционирует как ИРДИ, отменяя протсктивнос действие ИФН на клетки высокочувствительной к нему линии L-929, и как ИФН, предохраняя КМ резистентной к ИФН линии МСВ от опосредованного ЕК цитолиза. При этом обе исследованные линии КМ обладают выраженной чувствительностью к лизису в реакции ЕЦТ (Чскнёв С.Б. и др., 19906). Полученные данные позволяют заключить, что семейство ингибиторов действия ИФН включает факторы, которые могут вовлекаться в регуляцию активности ЕК в условиях появления избытка ИФН в тканях и жидкостях организма и реализуют важный механизм внутреннего торможения в системе ЕЦТ. Отсутствие ИРДИ у больных PC, с учетом способности самих ЕК в условиях адекватной индукции вырабатывать ИФН, по-видимому, обусловливает избыточное содержание ИФН в плазме крови и спинномозговой жидкости (СМЖ), проявление активации системы ЕЦТ на ранних этапах заболевания, аномальные ответы ЕК на обработку экзогенным ИФН, а возможно - и развитие обострений патологического процесса, спровоцированных применением в терапии PC препаратов ИФН-у (Johnson K.P., 1988; Panitch H.S. et al., 1987).

Недостаточность системы ИФН у больных PC не только определяет снижение цитотоксичсской активности ЕК in vitro (Сорокин A.M. и др., 1987; Чскнёв С.Б., 1993а), но также ассоциирована с изменениями динамики конъ-югатообразования в системе ЕК:КМ, отражающей эффективность распознавания и интенсивность связывания КМ в реакции ЕЦТ. При 17,0±2,15 коныогата Э:М, формирующихся в норме в системе ЕК:КМ на 100 КМ, у больных PC подобных комплексов образуется в 1,6 раза меньше, причем в значительно большей степени падает число конъюгатов, образуемых активными эффекторами ЕЦТ. В присутствии в реакционной смеси 50 МЕ/мл гаммаферона цитотоксическая активность ЕК у больных PC in vitro снижается на 9%, а распознавание и связывание КМ характеризуется увеличением на 68% числа конъюгатов, образующихся в системе ЕК:КМ. При этом в ходе цитотоксичсской реакции у больных PC не образуется ни одного конъюгата Э:М, сформированного активными эффекторами ЕЦТ, тогда как образование комплексов, свойственных нефракционированной суспензии МНК, увеличивается почти в 2 раза. Присутствие СРБ (2,0 мкг/мл) снижает цитоток-сичсскую активность ЕК у больных PC in vitro на 33% с одновременным увеличением интенсивности конъюгатообразования в системе ЕК:КМ на 22%. Введение в систему ЕК:КМ препарата ФН человека (0,1 мкг/мл) резко изменяет динамику и направленность реакции ЕЦТ. Не влияющий на протекание реакции ЕЦТ у здоровых доноров ФН повышает на 24% цитотоксичность ЕК у больных PC in vitro с одновременным увеличением на 50% числа конъюгатов Э:М, образующихся в ходе цитотоксичсской реакции. Отсутствие функционального сближения фракции МНК, взаимодействующей с КМ в присутствии ФН, с обогащенной по активным эффекторам ЕЦТ суспензией лимфоцитов, а также уменьшение р до -0,85 свидетельствует о достижении регистрируемого повышения эффективности цитотоксичсской реакции за счет стимуляции нсспсцифичсской адгезии. ФН, следовательно, может рассматриваться как фактор компенсации иммунодефицита по ЕК у больных PC.

В то же время, однако, активность ЕК у больных PC оценивается как сниженная, и недостаточность системы ЕЦТ способствует развитию им-мунорегуляторного дисбаланса (ЧекнёвС.Б, 1993а; ЧскнёвС.Б. и др., 1989; Neighbour P.A. et al„ 1982; Stöger I. et al, 1982; Uchida A. et al„ 1982). Возникает закономерный вопрос о причинах неэффективности у больных PC вскрытого компенсаторного механизма. Рационально рассмотрение проблемы с позиции возможности интенсификации в условиях дсмиелинизации ката-болитного расщепления ФН в циркуляции, индуцированного, скорее всего, его избыточным отложением в патологических очагах (Sobel R.A, Mitchell М.Е, 1989). В соответствии с данными И.А.Завалишина и Б.Т.Хайдарова (1990), Р.Р.Оганяна и др. (1990), демиелинизирующие процессы сопровождаются увеличением в плазме крови больных тигра Р-белков, обладающих супсроксиддисмутазной (СОД)-активностыо (Кульберг А.Я. и др., 1988; Петяев И.М, Кульберг А.Я, 1988), сродством к ФН и способностью участвовать в его расщеплении (Кульберг А.Я, 1990; Кульберг А.Я. и др., 1989).

Изучали цитотоксическую активность ЕК и интенсивность конъ-югатообразования в системе ЕК:КМ у здоровых доноров in vitro в ППС, дополненной 12% сыворотки больных ревматоидным артритом, содержащей повышенные почти в 4 раза (р<0,02) титры Р-белка. В присутствии сыворотки больных цитотоксичсская активность ЕК снижалась на 29%, в то время как интенсивность образования конъюгатов Э:М возрастала в 2,5 раза (р<0,05). Следовательно, накопление ферментативно активных Р-белков и, вероятно, продуктов частичной катаболитной деградации ФН в организме приводит к формированию in vitro большого числа "ложных" конъюгатов Э:М, в которых эффекторы ЕЦТ неспособны лнзировать КМ. Положительная корреляция показателей утрачивается.

Гомология участков молекул ФН и IgG, определяющая их эффективное взаимодействие друг с другом (Salvarrey М, Rostagno А, 1989) и с Р-белками (Кульберг А.Я. и др, 1989), снижающее, вследствие активации кагаболитного расщепления, их содержание в кровотоке (Кульберг А.Я, 1990), позволяет предполагать возможное сходство продуктов деградации ФН иу-глобулина плазмы в действии на метаболические процессы в клетках. Присутствие в суспензии МНКу-глобулипа человека приводит к повышению интенсивности спонтанной БТЛ у здоровых доноров in vitro. Дозовая зависимость эффекта препарата представляет собой колоколообразную кривую. Агрегированный у-глобулин в дозе 5x10 2 мкг/мл стимулировал БТЛ у здоровых доноров in vitro на 43%, что соответствовало действию той же дозы нативного препарата; при разведении эффект утрачивался. Присутствие освобожденной от агрегатов фракции у-глобулина в дозе 5x102 мкг/мл не изменяло уровень спонтанной БТЛ, в отличие от препарата нативного белка. В дозе 5x105 мкг/мл лишенный агрегатов белка у-глобулин усиливал спонтанную БТЛ у здоровых доноров in vitro, повышая включение I Р-тимидина в МНК на 33%, что соответствовало эффекту той же дозы нативного белка. В присутствии в реакционной смеси нативного у-глобулина человека в дозе 5x102 мкг/мл цитотоксичсская активность ЕК у здоровых доноров in vitro не изменялась, а при дозах 5х10 3 и 5х10 4 мкг/мл отмечали тенденцию к

снижению ЕК-активности МНК. В дозе 5x105 мкг/мл, значимо стимулировавшей спонтанную БТЛ, угнетение ЕК у-глобулином проявилось в уменьшении ЕК-активности на 40% и стало статистически достоверным (р<0,02). Разведение препарата до 5x10 мкг/мл привело к снижению активности ЕК на 53%) по сравнению с исходной (р<0,001).

Представленные результаты исследований свидетельствуют о возможности вовлечения системы ЕЦТ в обеспечение ЭБР, формирующей определенный уровень функциональных взаимодействий в иммунной системе, адекватный условиям внутренней индукции, опосредованной медиаторами иммунитета и различными другими регуляторными молекулами. Биологическую основу трансляции через систему ЕЦТ составляют: развернутый диапазон вариабельности функциональной активности ЕК, широкий спектр чувствительности клеток к действию факторов физиологической регуляции, а также детерминированная, по-видимому, генетически способность системы к расщеплению биологического сигнала, отражающая наличие механизмов внутренней регуляции и физиологической адаптации, реализующихся за счет многочисленных связей ЕК с клетками лимфоидной и нслимфоидной природы в режиме обеспечения иммунобиологического надзора.

Поддерживаемая эндогенно ИФН и вспомогательными клетками, система ЕЦТ реализует функциональную активность, в том числе, через низкоаффинные рецепторы ИФН, экспрсссирусмыс КМ, на основе избирательной селекции активных эффекторов, акцептируя сигналы муцинопо-добных МСПрГ, обеспечивающих за счет переменной рсдокс-активности конформацнонные перестройки, формирующие открытие свободных функциональных валентностей рецепторов и молекул адгезии. Динамическое равновесие устанавливается, с другой стороны, совокупностью факторов негативной регуляции, прежде всего, - семейством ингибиторов действия ИФН, ФН и взаимодействующими с ним компонентами сыворотки крови, блокирующими гиперактивацию эффекторов и восстанавливающими, тем самым, физиологический статус системы эндогенной ретрансляции. В условиях развития в организме патологических процессов, связанных в генезе с изменением функционирования компонентов системы ЕЦТ, активация механизмов внутреннего торможения, будь то возникающая под влиянием ИФН протекция КМ от цитотоксического действия ЕК или супрессия популяции эффекторов ЕЦТ фракцией ПК, существенно влияет на эффективность реализации цитотоксического и регуляторного потенциала ЕК, снижая возможности системы в обеспечении адекватного уровня иммунного ответа.

Селективная недостаточность системы ЕЦТ в механизме развития иммунопатологического процесса

Естественным развитием концепции биологической ретрансляции через систему ЕЦТ явилось изучение механизмов возникновения и поддержания, клинических проявлений и следствий патологического процесса, связанного с избирательным ингибированием популяции ЕК. В 1985-1986 гг. получены данные S.Sriram, L.Lanier, что анти-Lcu 7 антитела связываются с

ассоциированным с миелином гликопротсином (АМГ), признанно рассматривающимся в комплексе с основным белком миелина (ОБМ) и олигодендро-цигарным гликопротсином миелина (ОГМ) в качестве аутоантигена, индуцирующего хронически прогрессирующую или рсмиттирующую дсмиели-низацню, являющуюся ведущим звеном патогенеза РС, протекающего в условиях выраженного нарушения иммунорегуляторного баланса (СаШсг V. й а1., 1989; Э^ап-Кесп М. е1 а!., 1986; Ушг^оп С., ЬаБзтапп Н., 1987; МсРаг-1апс1 Н.К, ОЫЫаИли 8., 1989; Х1ао В.-О. е1 а1., 1991). В работе М.Тапака е1 а1. обнаружено ингибирование цитотоксичности ЕК против стандартных КМ мышиными анти-АМГ антителами, проявляющееся в той же степени, что и при воздействии антител против Ьси 7.

Иммунопатогснсз РС как процесс, в основе которого лежит ассоциированный с механизмами индукции дсмиелинизации дефект ЭБР, обеспечиваемой в физиологических условиях через систему ЕЦТ, с необходимостью определяет стадио-специфический характер изменений функциональной активности ЕК и выраженную корреляционную зависимость состояния клеток и продукции ИФН от тяжести заболевания. Поскольку большинством специалистов изменения системы ЕЦТ при РС рассматриваются как нсспецифические и представляющие собой комплекс вторичных проявлений, исследования функционирования популяции ЕК и связанного с ним уровня выработки ИФН с позиций стадио-спсцифичностн, в динамике процесса, не проводились, и соответствующие данные в мировой научной периодике отсутствуют.

Как показывают результаты исследования, цитотоксическая активность ЕК определенным образом связана с типом течения процесса. Рсмит-тирующес течение РС характеризуется нормальным уровнем цитотоксичности ЕК со снижением функции эффекторов ЕЦТ ¡п уйго у части больных в период обострения. При вторично- и первично-прогрессирующем течении РС активность ЕК снижена, соответственно, в 1,7 и 1,5 раза. В зависимости от степени инвалидизации больных активность ЕК реализовалась следующим образом. У больных 1-3 группы - оказалась повышенной по сравнению с контролем. Значения составили 134±11% (р<0,1). У больных 4-5 группы - в 1,8 раза (р<0,02) ниже, чем у здоровых доноров, и более чем в 2 раза (р<0,002) меньше таковой по сравнению с 1-3 группой пациентов. Значения составили 60±3%. В 6-8 группе больных не обнаружено достоверных отличий от 1-3 и контрольной групп, в то время как по сравнению с 4-5 группой инвалидизации показатели активности ЕК возросли почти в 2 раза (р<0,02).

При анализе цитотоксичсской активности ЕК и ее вариабельности у больных РС в различных возрастных группах наиболее выраженное снижение ЕК-активности МНК наблюдается у больных РС в возрасте 41-50 лет; юношеский и пожилой возраст не ассоциированы с недостаточностью системы ЕЦТ. Вариабельность активности ЕК в общей группе больных РС значительно превышает таковую у здоровых доноров. Наиболее выраженное увеличение ИВ отмечено у больных в возрасте 41-50 лет. Наоборот, в следующей возрастной группе (51-59 лет) значения ИВ активности ЕК в 1,7-2,8 раза снижены по сравнению с группой здоровых доноров. Оценивая

последовательно показатели ЦИ и ИВ в соответствующих возрастных группах больных РС, можно установить, что параметры изменяются рсципрокно: увеличение цитотоксичности совпадает со снижением вариабельности, а уменьшение активности ЕК - с расширением диапазона реагирования.

Полученные в работе данные свидетельствуют о наличии у больных РС выраженного дефицита продукции ИФН-у, связанного с длительностью процесса. У всех 3 пациентов в дебюте заболевания обнаружена примерно в 2 раза более низкая продукция ИФН-у, чем у здоровых доноров, а из 7 больных с давностью процесса более 10 лет у 6 отмечен еще в 2 раза более низкий уровень выработки ИФН-у ЛПК в ответ на ФГА. Можно ожидать, что в эти сроки меняется функционирование системы ЕЦТ, осуществляющей биологическую ретрансляцию в организме в режиме комплексной взаимосвязи с системой ИФН и саморегуляции через продукцию и рецепцию различных типов ИФН.

Анализ результатов свидетельствует о снижении ЕК-активности МНК в дебюте заболевания с последующей тенденцией к увеличению цитотоксичности ЕК пациентов с нарастанием длительности процесса и углублением неврологической симптоматики. В то же время, в группе пациентов, страдающих более 10 лет, отмечено снижение активности ЕК по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05), ассоциированное с тяжелым клиническим состоянием больных. Обоснованность рассмотрения недостаточности системы ИФН в качестве ведущего звена патогенеза иммунодефицита по ЕК у больных РС подтверждается в дальнейшем исключением возможности эндогенного, не связанного с недостаточностью ИФН, блокирования активности ЕК факторами сыворотки крови больных.

Клинико-иммунологичсские сопоставления показывают, что у 7 из 10 пациентов, ответивших на применение Т-актнвина и мислопида положительной клинической динамикой, улучшение состояния происходило на фоне исходно сниженной цитотоксичности ЕК т у^го, повышавшейся в ходе иммунотерапии. Результат подтверждает первичную вовлеченность системы ЕЦТ в патогенез заболевания и выявляет прямую корреляцию активности ЕК с клиническим состоянием пациентов и обратную - с тяжестью РС.

Совокупность представленных результатов исследований, авторских разработок 1984-1987 гг. и данных мировой научной периодики позволяет обоснованно рассматривать иммуносимптомокомплскс РС как патологию ЭБР, естественно ассоциированную с нарушением физиологических межклеточных взаимодействий и характеризующуюся множественностью форм и клинических проявлений. Обнаруживаются две стороны развития недостаточности системы ЕЦТ при этом заболевании, включающего как активирующие, так и ингибирующис влияния, усиливающиеся и усложняющиеся диссоциацией между первичными функциями ЕК (Чскнёв С.Б., 1994). Данные об отсутствии у больных РС ИРДИ, способного блокировать действие ИФН-а и ИФН-у на активность ЕК до полной его отмены у здоровых доноров (СЬекпеу Б.В. с! а1., 1994), позволяют описать связанную с механизмами инициации демиелиннзирующего процесса при РС функциональную дихотомию системы ЕЦТ как важнейшую особенность иммунопатогенеза забо-

левания, с большой вероятностью, лежащую в основе формирования в иммунной системе патологических циклов активации и угнетения (см. схему на рис.3).

Гипотетически, генетический HLA-детсрминизм, отягощенный рециркуляцией вируса, определяет, по крайней мерс, 3 первичных сдвига биологического равновесия в организме: 1) функциональный дефект системы ИФН, проявляющийся в снижении продукции ИФН практически всеми вовлеченными в этот процесс типами клеток; 2) отсутствие ИРДИ; 3) дефект мислинизации, ведущий к появлению антител против ряда компонентов миелина, в том числе - АМГ, способных взаимодействовать со структурами, экспрсссируемыми ЕК, с последующим угнетением их цитотоксичсской активности. 2 из 3 этих первичных проявлений клеточной недостаточности инициируют 2 порочных круга в системе ЕЦТ. Один из них, связанный с недостаточной продукцией ИФН, последовательно, через дефект ИФН-индуцированной дифференцировки ЕК и повышение чувствительности клеток к действию простагландинов (ПГ), известных антагонистов ИФН, ведет к формированию функциональной недостаточности ЕК и снижению продукции ими ИФН, обеспечивая, тем самым, дефицит системы ЕЦТ у больных PC. С другой стороны, отсутствие ИРДИ обусловливает активацию как спонтанного, так и стимулированного ИФН-генеза, приводя к появлению в сыворотке крови и СМЖ больных избытка ИФН, индуцирующего аномальное, ускоренное созревание ЕК с последующим образованием пула функционально неполноценных цитотоксичсских эффекторов, обладающих повышенными активностью и способностью к продукции ИФН, по крайней мерс, в периферической крови больных. Этот цикл формирует активированное состояние системы ЕЦТ при PC.

Одновременное развитие событий в системе ЕЦТ по двум указанным направлениям, естественно, проявляется диссоциацией между цито-токсической и ИФН-продуцирующей функциями ЕК, определяющей, в то же время, аномальную отвсчасмость ЕК на регулирующее действие ИФН. Поскольку система ЕЦТ представляет собой важное связующее и иммуно-регуляторное звено, описанные сдвиги и особенности ее функционирования логически ведут и отражаются развитием общего иммунного дисбаланса, обусловливающего множественность клинических форм заболевания и неэффективность иммунотерапии у больных PC.

Описанная A.M.Turnley et al. (1991) модель PC, полученная на линии трансгенных мышей wonkey и характеризующаяся отсутствием проявлений аутоиммунного механизма в патогенезе неврологического дефицита, при детальном рассмотрении с необходимостью предполагает, что демиелинизация, как таковая, оцениваемая в качестве ведущего звена развития симптомокомплекса PC, является следствием индукции аутоаг-рессии на миелин и ассоциированные с ним гликопротсины, вызываемой первичным дефектом мислинизации, не ассоциированным, как и показали авторы, с аутоиммунной реактивностью на ОБМ, АМГ, ОГМ. Тем самым, появление анти-АМГ антител, способных за счет перекрестного реагирования с детерминантами ЕК (Sriram S., Lanier L., 1986) ингибировать популяцию

Рис.3

РС как патология эндогенной биологической ретрансляции через систему ЕЦТ.

цитотоксических эффекторов (Тапака М. с! а1, 1985), становится как инициальным событием патологического цикла недостаточности в системе ЕЦТ, так и центральным звеном трансформации первичного, генетического дефекта миелинизации в последующий аутоиммунный демиелинизирующий процесс, индуцируемый открывающимися функциональными валентностями гликопротеинов комплекса миелина.

Описанные изменения обеспечения системой ЕЦТ иммунорегуля-торных взаимодействий в условиях дефекта миелинизации позволяют представить возможный механизм формирования порочных кругов и полагать, что если последовательность событий, связанная с иммунопатологией РС и трактуемая с позиций нарушения ЭБР, реализуется в организме, то коррекция функционирования системы ЕЦТ у больных РС требует использования ИФН и ИРДИ в комплексе с АМГ с целью блокирования всех 3 путей развития иммунодефицитного состояния. Если станет возможным восстановление статуса этого центрального звена взаимосвязи и иммунорегуляции у больных РС, примененный подход, вероятно, можно будет положить в основу алгоритма оценки динамики патологического процесса и поиска рациональных средств патогенетической коррекции иммунологической недостаточности у больных РС, обоснованно представляющимся как болезнь биологической ретрансляции.

Возможности контроля эндогенной биологической ретрансляции через систему ЕЦТ

Обобщая представленный материал, обоснованно заключить, что функционирование системы ЕЦТ в режиме ЭБР обеспсчивастся совокупностью факторов и механизмов внутреннего усиления и торможения, формирующей в условиях их динамического баланса равновероятные возможности реализации цитотоксичеекого и регуляторного потенциала эффекторов ЕЦТ, направленной в конкретной физиологической, клинической или экспериментальной ситуации на ингибирование (в том числе - прямым цитотоксическим воздействием) или активацию потенциальных КМ. При этом практически каждый механизм внутреннего усиления или торможения располагает столь же естественным, как и он сам, комплексом ограничения, блокирующим переход импульсной индукции в состояние пролонгированного воздействия.

Действительно, ПК, вносящие определенный вклад в суммарную ЕЦТ и обеспечивающие продукцию ИФН в системе взаимодействия ЕК:КМ, способны блокировать в конкретных условиях избыточную активацию цитотоксических эффекторов. Инициирующий созревание пре-ЕК в зрелые формы клеток, повышающий литичсский потенциал единичного киллера на стадии летального удара, облегчающий функциональную селекцию активных эффекторов в литическом цикле и ускоряющий рециклинг ЕК ИФН, в то же время протектирует КМ от цитотоксичеекого действия ЕК. Дефицит продукции ИРДИ ассоциируется (как при РС) с повышением в плазме крови уровня циркулирующих Р-белков, способных связать и таким образом нейтрализовать избыток свободного ИФН. Компенсирующий на стадии

распознавания и связывания КМ недостаточность цитотоксической функции ЕК ФН расщепляется тропными к нему ферментативно активными Р-бслками, содержание которых возрастает в условиях ИФН-зависимого иммунодефицита по ЕК.

Завершая анализ документального материала, позволяющего в основном представить принципы формирования динамического равновесия в обеспечивающей ЭБР в организме сисгемс ЕЦТ, можно сформулировать следующие положения, значимые в понимании организации эндогенных транслирующих систем, в том числе - ЕЦТ, функционирование которой, в широком смысле, выходит за рамки первой линии антипролиферации, противовирусной защиты и даже иммунорегуляции (Дсдснков А.Н. и др., 1986; Корнеев А.Я., Ершов Ф.И., 1987; Balmasova I.P, 1991; Blalock J.E., Smith Е.М., 1985).

1. Несмотря на детерминированность системы ЕЦТ к реализации цитотоксической активности против активированных аутологичных клеток, распознавание их ЕК в качестве KM in vivo не происходит, либо не инициирует литического воздействия. Во всяком случае, аутоагрессия ЕК не зарегистрирована в современных источниках научной информации.

2. Не описана также индукция генерации ЕК на уровне костного мозга. Она либо вообще отсутствует, а системы обеспечения лимфопоэза реа7 лизуют генетическую программу производства не более чем лимитированного, гарантирующего от накопления потенциала аутоагрсссии количества предшественников ЕК, либо, что менее вероятно, блокируется на более поздних стадиях созревания эффекторов ЕЦТ.

3. Комплекс стимулирующих влияний не обеспечивает не только формирование активированного статуса системы ЕЦТ, не зависящего от присутствия индуктора, но даже состояния пролонгированной активации ЕК, будь то эксперименты in vitro, опыты на лабораторных животных или использование иммуностимуляторов в клинической практике.

4. Как иммунопатология, так и общая патология организма человека, наряду со спонтанным или контролируемым мутагенезом у лабораторных животных, в абсолютном большинстве ассоциированы со снижением цитотоксической активности ЕК. Даже в условиях измененной иммунорегуляции, с необходимостью ослабляющей и супрессорныс звенья иммунитета, активация эффекторов ЕЦТ не регистрируется, оставаясь, с высокой вероятностью, блокированной не связанными напрямую с обеспечением иммунного ответа регуляторными механизмами. :

Остается принципиальный вопрос о происхождении и природе универсального механизма, ограничивающего проявления и существующие тенденции к активации эволюционно древнейшей системы ЭБР посредством ЕЦТ. Полученные данные свидетельствуют, что, в силу модулирующего характера клеточной и гуморальной регуляции активности цитотоксических эффекторов, рассмотренные выше медиаторы, как изолированно, так и в своей совокупности, не обеспечивают супрессирующего влияния, достаточного для лимитирования аутоагрессии ЕК в организме человека и животных.

Обоснованно предположить, что подобное влияние генерируется факторами среды обитания, обладающими рядом постулированных свойств. Они должны быть:

- естественными, ибо любая индукция предполагает формирование зависимости от действия индуктора;

- неспсцифическими, как сама система ЕЦТ и внутренние механизмы ее регуляции;

- древнейшими по происхождению, как все нсспсцифические эффек-торные и регулирующие системы и механизмы;

- производимыми постоянно,

- распространенными повсеместно,

- попадающими в организм естественным путем, т.к. в противном случае не могло бы быть обеспечено наведение и поддержание негативного контроля;

-биологически стойкими;

- наконец (или, в первую очередь), угнетающими активность эффекторов ЕЦТ.

Возможность влияния искомых регуляторов функциональной активности ЕК на осуществление реакций ЕЦТ в организме через эндогенные молекулярные механизмы обеспечения собственно цитолиза предполагает, что воздействие генерируемых в экосистеме регуляторных молекул обоснованно рассматривать в контексте биохимических процессов, замкнутых на транспорт и обмен в микроокружении клетки катионов металлов. Такой вывод следует из определенной связи с мсталлотранспортными процессами как минимум трех механизмов внутренней регуляции системы ЕЦТ: обеспечения независимого от продукции ИФН-у в системе взаимодействия ЕК:КМ цитолиза и функциональной селекции активных эффекторов ЕЦТ на стадии распознавания и связывания КМ, индуцируемых гексапсптидом Суз-(Рго)3-С1и-Ьси, характеризуемым как 7п2'-зависимый пссвдоэнзим (Кульберг А.Я. и др., 1992), а также действия на активность ЕК агрегатов у-глобулина, образование которых, очевидно, происходит с участием бивалентных катионов металла, формирующих межмолекулярные связи. Следовательно, искомые факторы экосистемы должны характеризоваться также сродством к катионам металла или переменным окислительно-восстановительным потенциалом, который мог бы изменять вектор транспорта металла в микроокружении клетки.

Псптидогликаны циапобактсрий как факторы экосистемы, участвующие в негативном контроле эндогенной биологической ретрансляции

Поскольку основными критериями отбора факторов экосистемы, участвующих в негативном контроле ЭБР, становятся эволюционная древность, повсеместная распространенность и постоянство генерации в среде обитания, антропогенные влияния не могут рассматриваться в качестве универсального биологического сигнала, в силу их не биологического и не эволюционного происхождения. Патогенные вирусы не поступают в организм

постоянно, а их повсеместная распространенность относительна. То же относится к патогенным и условно патогенным бактериям, которые при попадании в организм животных и человека способны даже вызывать активацию ЕК и системы выработки ИФН (Саидов М.З., Ковальчук JI.B., 1986; Scharton Т.М., Scott P., 1993; Scott P., Scharton T, 1994). Комменсалы и симбионты слизистых оболочек, прежде всего - желудочно-кишечного тракта, подвержены резким изменениям условий обитания, вследствие конкурентных взаимодействий с микроорганизмами, постоянно поступающими из внешней срсды с водой и пищей. Кроме того, М.С.Ломакин и Г.М.Бочко (1989), S.E.Grossbcrg (1977), T.C.Mcrigan (1974) указывают на активацию под влиянием этих микроорганизмов систем ЕЦТ и ИФН.

Объектом исследования стали цианобактсрии - древнейшие обитатели Земли, распространившиеся значительно шире других фототрофных прокариот за счет реализации эффективных механизмов генетической диверсификации (Кондратьева E.H. и др., 1989; Кульберг А.Я., 1994). Сотрудникам лаборатории иммунохимии НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН под руководством профессора А.Я.Кульберга удалось выделить из культу-ралыюй жидкости цианобактсрий A.variabilis содержащую пептидогликаны фракцию, по-видимому, ответственную за передачу сигнала на включение механизма мутагенеза микроорганизмов, и доказать се способность деколонизировать цианобактсрии, вызывать мутагенез у сальмонелл и личинок Drosophila mclanogaster, изменять продукцию фибробластами кожи человека in vitro белков периклеточного матрикса, обусловливая, таким образом, деколонизацию и клеток человека (Кульберг А.Я., 1994). По совокупности свойств экзомстаболиты цианобактсрий отвечали веем сформулированным критериям, характеризующим потенциального носителя регулятор-ного сигнала экосистемы, ограничивающего потенциал цитотоксических эффекторов (Кульберг А.Я., 1994; Carmichacl WAV., 1989, 1994; Kulbcrg A J. ctal., 1993, 1994).

Действие ПГЦБ на ннтотоксическую активность ЕК и БТЛ человека

in vitro.

Как видно из данных, представленных на рис.4, ПГЦБ, полученные из культуральной жидкости A.variabilis, угнетают цитотоксичность ЕК человека в условиях 1 час обработки суспензии МНК. В разведениях концентрата фракции ПГЦБ 1/20 и 1/200, содержащих 5-ти и 50-кратно меньшую дозу активного компонента, чем в исходном материале бактерий, зарегистрировано снижение ЕК-активности МНК на 19% (р<0,01) и на 23% (р<0,01), соответственно.

ПГЦБ, полученные из проб водопроводной воды, в некоторой степени утрачивают потенциал регуляции ЕК-активности МНК. Результаты свидетельствуют, однако, о выраженном ннгибирующем действии ПГЦБ на цитотоксичность МНК. Зарегистрировано снижение активности клеток in vitro на 8-35%. Полученные данные проявляют отсутствие у фракции ПГЦБ модулирующих свойств в отношении популяции эффекторов ЕЦТ. Снижение ЕК-активности МНК отмечено как у доноров с исходно высоким, так и -

Усл. ед. 6.0

- «

4.0

1

2.0

Рис.4

Действие фракции ПГЦБ, полученной из культу-ральной жидкости A.varia-bilis, на цитотоксическую активность ЕК здоровых доноров in vitro (M±m,

низким уровнем ЕЦТ. Несмотря на кажущееся противоречие традиционным подходам к оценке иммуномодуляции, именно в этом видится физиологич-ность влияния факторов цианобактерий на функциональную активность ЕК человека. Рассмотрение микробных факторов среды обитания в качестве рациональных ограничителей цитотоксического потенциала ЕК, следуя всей логике исследования, с необходимостью определяет их вовлечение в контроль функционирования эффекторов ЕЦТ тогда, когда система способна к обеспечению активации за счет внутренних компенсаторных механизмов, т.е. в условиях формирования расширенного диапазона реагирования, следовательно, - при низком уровне функциональной активности клеток.

Фракция ПГЦБ, выделенных из проб водопроводной воды и при-

мененных в концентрациях, снижающих цитотоксичность ЕК, усиливала пролиферативную активность МНК человека в реакции спонтанной БТЛ. Даже в группе доноров с исходно высоким уровнем пролиферации отмечали дополнительную индукцию митогенеза под влиянием 1 час экспозиции МНК с фракцией ПГЦБ. У лиц с промежуточными показателями спонтанной БТЛ ПГЦБ в разведениях препарата 1/20, 1/200 и 1/2000 стимулировали пролиферацию лимфоцитов на 44%, 84% (р<0,02), и 71 % (р<0,01), соответственно.

п=4).

*р<0,01 по сравнению с контролем (К).

0

К

1/20 1/200 1/2000 Разведение препарата

На фоне низких показателей спонтанной БТЛ исследуемая фракция в тех же разведениях стимулировала пролиферацию лимфоцитов, повышая уровень включения метки на 28%, 42% (р<0,1) и 39%, соответственно.

Краткосрочной экспозиции клеток с ПГЦБ оказалось достаточно для выявления способности фракции, выделенной из проб водопроводной воды, блокировать митогенное действие ФГА (р<0,01 -0,1), сохраняя при этом уровень индукции пролиферации, свойственный самой фракции ПГЦБ. Результаты исследования свидетельствуют о наличии у фракции ПГЦБ способности блокировать и митогенную активность Кон А, проявляющейся тенденцией к последовательному снижению эффекта фитомитогена в отношении МНК, обработанных 10-кратно уменьшающимися дозами пептидогликанов. Тем самым исключается возможность двойного усиления митогенеза в биологической системе.

Влияние содержащихся в водопроводной воде ПГЦБ на иммуно-реактивность лабораторных животных в модельных опытах in vivo.

Представленные в табл.2 результаты свидетельствуют о снижении к 10-м суткам наблюдения ЕК-активности спленоцитов мышей, получавших для питья концентрированную по фракции ПГЦБ водопроводную

Таблица 2.

Показатели активности ЕК, спонтанной БТЛ и ИФН-статуса у мышей, получавших для питья концентрат фракции ПГЦБ из проб водопроводной воды (М±т).

Сутки Активность ЕК, усл.ед. Включение Н3-тими- дина сплено-цитами, имп/мин (хЮ3) Продукция ИФН-а индуцированными сплено-цитами, 1од2(титр) Продукция ИФН-у индуцированными сплено-цитами, 1од2(титр) Содержание ИФН в сыворотке крови, log2 (титр)

0 2,73±0,12 4,66±0,42 5,5+0,29 2,5±0,87 0,0±0,0

(п=7) (п=7) (п=7) (п=7) (п=7)

1 контроль 2,43±0,16 5,71±0,55 5,8±0,17 2,8+0,60 0,0±0,0

(п=6) (п=6) (п=6) (п=6) (п=6)

опыт 2,54±0,18 3,86±0,63 6,51±0,53 3,5±0,43 2,3+1,49

(п=6) (п=6) (п=7) (п=7) (п=7)

10 контроль 2,97±0,20 5,10±0,33 5,0±0,87 2,5±0,84 0,0+0,0

(п=6) (п=7) (п=6) (п=6) (п=6)

опыт 2,50±0,19 7,92±0,78* 4,5±1,43 2,44+0,71 0,0±0,0

(п=5) (п=6) (п=5) . (п=5) (п=5)

Примечание: *р<0,05 по сравнению с контролем.

40

воду. Уровень цитотоксичности ЕК in vitro уменьшился на 15%. Динамика спонтанной БТЛ выявляет прямое митогенное действие фракции ПГЦБ, содержащейся в воде для питья, на сплсноцитьг животных. К 10-м суткам наблюдения включение Н'-тимидина спленоцитами мышей, получавших с водой концентрированные ПГЦБ, превысило интенсивность спонтанной БТЛ в контроле на 55% (р<0,05). К 10-му дню наблюдения снизилась выработка спленоцитами индуцированного ИФН-а. Указанные изменения сопровождались повышением гетерогенности группы опытных животных по всем исследованным показателям.

Представленные в табл.3 результаты свидетельствуют о повышении к 40-м суткам наблюдения ЕК-активности сплсноцитов животных, получавших для питья воду, освобожденную от фракции ПГЦБ. Цитотокеич-ность ЕК в селезенке мышей опытной группы на 22% превысила показатели контрольной. Динамика спонтанной БТЛ позволяет установить, что к 40-му дню эксперимента интенсивность включения изотопа спленоцитами мышей, изолированных от потребления с водой фракции ПГЦБ, значимо возросла, на 69% превысив уровень БТЛ в селезенке контрольных животных. Полученные данные говорят о том, что содержащая ПГЦБ фракция, обладающая собственным прямым митогенным действием in vivo, блокирует пролиферацию, форсируемую поступающими в организм высокоэффективными индукторами. Адаптированные к получению жидкости, содержащей фактор физиологической регуляции, лабораторные животные, изолированные от потребления с водой фракции ПГЦБ, лишаются естественного ограничителя

Таблица 3.

Показатели активности ЕК, спонтанной БТЛ и ИФН-статуса у мышей, получавших для питья водопроводную воду, не содержащую фракции ПГЦБ (М±т). ♦

Сутки Активность ЕК, усл.ед. Включение Н3-тими- дина спленоцитами, имп/мин (х103) Продукция ИФН-и индуцированными спленоцитами, !од2(титр) Продукция ИФН-у индуцированными спленоцитами, 1од2(титр) Содержание ИФН в сыворотке крови, log2 (титр)

20 контроль (п=5) 2,52±0,16 7,43±1,18 4,0±1,05 1,6±0,75 0,0±0,0

опыт (п=5) 2,47±0,24 6,52+1,0 4,8±1,2 1,2±0,58 1,8±0,74*

40 контроль (п=4) 3,18±0,37 7,89±1,54 5,0+0,91 2,5±0,29 1,0±0,41

опыт (п=4) 3,88±0,21 13,35+1,74 4,5±0,87 2,0±0,41 2,3±0,88

Примечание: *р<0,05 по сравнению с контролем.

форсированного митогснсза. Выявленные изменения сопровождались синхронизацией группы опытных животных по всем исследованным показателям.

Совокупность полученных данных позволяет обоснованно предполагать, что являющаяся естественной компонентой водопроводной и, безусловно, природной воды фракция ПГЦБ опосредует мягкое ингибирующее влияние на функционирование системы ЕЦТ человека и высших животных, индуцирует митогенез лимфоцитов, блокируя стимуляцию пролиферации клеток высокоэффективными индукторами, и поддерживает определенный уровень вариабельности, по-видимому, отвечающий потребностям обеспечения физиологического регуляторного баланса.

Изучение механизмов регулирующего влияния ПГЦБ в системе ЭБР.

В расшифровке механизмов действия ПГЦБ на клетки эукарнот существуют 2 ключевых момента, структурно определяющие особенности функционирования этих соединений как биорегуляторов. С одной стороны, будучи, собственно, пептидогликанами, формирующими в результате замещения сахарных остатков заряженными химическими группировками структуру последовательности, связывающую воду и привносящую связанные молекулы воды в структуру взаимодействующего биополимера, за счет изменения степени гидратации и, следовательно, конформационной устойчивости последнего ПГЦБ способны существенно изменить его функциональную активность. С другой стороны, высокий общий отрицательный заряд пепти-до(протсо)гликанов (ППрГ) обеспечивает им в качестве полиэлсктролитов возможность формировать хелатные комплексы с катионами металлов, прежде всего - меди, цинка и железа, консервирующие ПГЦБ и повышающие устойчивость биополимера в жидкой среде.

Удаление из фракции ПГЦБ переходных металлов, адсорбируемых хелатирующей смолой, приводит к полной отмене митогенного эффекта препарата в отношении лимфоцитов человека in vitro. Применение для обработки клеток исходной фракции ПГЦБ вызывало повышение уровня спонтанной БТЛ в 10 случаях из 11; в результате пропускания препарата через колонку с хелатирующей смолой выявить стимуляцию бластогснсза удалось лишь в 1 случае из 10.

Предметом исследования стал извлеченный из молекулы у-глобу-лина пептидогликан, представляющий собой отрицательно заряженный продукт, содержание углеводов в котором значительно превосходит таковое в исходном у-глобулинс (Кульбсрг А.Я. и др., 1994), во многом сходный с изучаемыми ПГЦБ, что дает возможность рассматривать его в качестве модельного препарата, механизм реализации биологической активности которого, в основном, соответствует механизмам действия ПГЦБ. Как по общему плану строения, устойчивости в растворах, достигаемой посредством кластерообразования, способности регулировать электронно-транспортные процессы (Кульбсрг А.Я., 1994), так и по специфической антикоагулянтной активности (Кульбсрг А.Я. и др., 1994), сравниваемые пептидогликаны в высокой степени сопоставимы.

Обработка МНК здоровых доноров пептидоглнканом, выделенным из препарата у-глобулина человека, приводит к последовательному нарастанию митогенного эффекта при снижении дозы активного компонента с 1200 до 60,0 нг/мл. В дозе 60 нг/мл ППрГ достоверно (р<0,02) увеличивал включение Н3-тимидина лимфоцитами. Препарат у-глобул и на повышал включение НМтшидина в МНК в дозе 70,0 нг/мл (р<0,05). С учетом концентрационных зависимостей, вскрытых в процессе выделения пеп-тидогликана из нативного у-глобулина, дозы 60,0 нг/мл активного компонента и 70,0 нг/мл у-глобулина, вызывающие равновеликие сдвиги уровня спонтанной БТЛ in vitro, можно считать варьирующими в пределах, определяемых перераспределением пептидных и углеводных компонентов при пропускании у-глобулина через колонку с хелатирующей смолой. С другой стороны, поскольку стимуляция бластогснеза агрегированным у-глобулином зарегистрирована именно в присутствии в реакционной смеси 5,Ох102 мкг/мл белка (см. выше), митогенный эффект у-глобулнна сыворотки человека in vitro обоснованно связать с влиянием содержащей углеводный компонент фракции, освобождаемой в среду культивирования лимфоцитов при агрегировании белка. В использованном диапазоне концентраций выделенный из препарата у-глобулина ППрГ ослаблял эффект последующей индукции бластогснеза ФГА и Кон А. Сонаправленнос влияние отмечено при использовании у-глобулнна.

Результаты исследования свидетельствуют о проявлении извлеченными из молекулы сывороточного у-глобулина пептидогликанами способности ингибировать популяцию эффекторов ЕЦТ. При этом, как выделенные из предварительно агрегированного, так и полученные из освобожденного от агрегатов белка препаратов у-глобулина активные фракции с преимущественным содержанием углеводного компонента, использованные в дозе 0,1 мкг/мл, снижали цитотоксическую активность ЕК здоровых доноров in vitro на 57% и 42%), соответственно. В свете представленных результатов, события, описанные при изучении закономерностей протекания реакций спонтанной БТЛ и ЕЦТ в присутствии у-глобулина человека in vitro, обоснованно рассматривать как следствие освобождения в среду ингибирующнх ЕКи стимулирующих спонтанную БТЛ МС-псптидогликанов, обусловленное замыканием внутримолекулярных связей у-глобулина на себя, повышающим конформационную устойчивость белка в разбавленном водном растворе.

К ответу на вопрос о роли катионов металлов в обеспечении функциональной активности ПГЦБ и сходных с ними по биологическим свойствам богатых углеводами компонентов, ассоциированных с у-глобулином сыворотки человека, приближает изучение гепарина, антикоагулянтнос действие которого соответствует таковому, обнаруженному как во фракции ПГЦБ (Кульбсрг А.Я., 1994), так и в углевод-содержащей составляющей у-глобулина (Кульбсрг А.Я. и др., 1994). Описанное у мышей подавление гепарином ЕК-активности спленоцитов (Yamamoto Н. et al., 1985) выявляется на клетках человека (р<0,1) лишь после пропускания препарата через колонку с гидроокисью алюминия.

Поскольку хслатирование катионов с необходимостью обусловливает изменение электронной плотности в микроокружении биополимера и

предполагает возможность перехвата свободных электронов с взаимодействующих со связывающим металл ППрГ макромолекул, а цитотоксичсское воздействие ЕК на КМ происходит за счет потребления активных метаболитов кислорода (El-Hag A., Clark R.A., 1984; Suthanthiran M. et al., 1984; Van Kessel K.P.M. et al., 1987), обоснованно полагать, что регулирующие функции ПГЦБ и им подобных амфипатичсских МС-соединсний в отношении ЕК осуществляются на основе окислительно-восстановительных процессов, протекающих через стадию короткоживущих свободных радикалов кислорода. Способность ПГЦБ и содержащей их фракции водопроводной воды, поступающей в организм человека и животных, перехватывать свободные электроны с супсроксиданион-радикалов доказана конкурентным ингибированием в присутствии указанных пепгидогликанов восстановления тстразолия нитросинсго; на свойство этих биополимеров донорствовагь свободные электроны указывает катализируемый ПГЦБ и их концентратом, полученным из проб водопроводной воды, процесс окислительного гидролиза модифицированного анилидом пептидного субстрата (Кульберг А.Я., 1994).

Элсктронно-транспортныс характеристики подобных соединений могут обоснованно рассматриваться в качестве универсального механизма негативного контроля системы ЕЦТ, функционирующей за счет утилизации в цитотоксической реакции свободных радикалов кислорода. Если в процессе организации компактной структуры ППрГ происходит перехват свободных электронов, потребных для генерации гидроксиланион-радикалов, вовлекаемых ЕК в реализацию летального удара, а в ходе деструктурирования биополимера формирующиеся метаболи ты кислорода способны повредить, как сильные окислители, рецепторы мембраны самого эффектора, то, независимо от переменной конформации и направленности транспорта электронов, подобным регулятором цитотоксичсская клетка будет постоянно ограничена в возможности осуществить генетически детерминированную программу цитолиза.

Популяционная динамика показателей ЕЦТ лимфоцитов человека в условиях глобальной экспансии цианобактсрий.

Результаты анализа поиуляционного уровня ЕЦТ в условиях генерируемого цианобактсриями действующего вектора негативной регуляции выявляют важные свидетельства существенного влияния ПГЦБ, распространяемых через воду, на функционирование системы ЕЦТ. Зарегистрированное в 1992 г. в г.Москве, в 1985 г. в России, в 1983 г. в США и в 1983 г., а также в 1986 г. в мире, в целом (рис.5), снижение уровня ЕЦТ через стадию повышения вариабельности активности ЕК in vitro в предшествующие годы наблюдения, соответствует обнаружению in vivo повышенной степени гетерогенности лабораторных животных, получавших для питья воду, концентрированную по фракции ПГЦБ, по исследованным показателям. Наоборот, синхронизация группы мышей, потреблявших воду, освобожденную от ПГЦБ, по параметрам естественной резистентности совпадает с ощутимым снижением вариабельности цитотоксичности ЕК in vitro в мире, в целом, отмеченным в 1984 г. в условиях повышения ЕК-активности МНК человека (рис.5). Характерной особенностью описанной динамики является прослс-

а 6

5.0 100

(285*) (129*) (85*) (205) (115*) (567*) (198*) (92*) (51) Годы наблюдения

Рис.5

Динамика цитотоксической активности ЕК in vitro (M±m) в популяции здоровых доноров планеты в 1979-1987 гг.

На столбиках указано число публикаций, отобранных для анализа; в скобках - число обследованных доноров; (*) - число наблюдений не менее указанного; открытые столбики - нефракционированная суспензия МНК; штриховка - фракция БГЛ; *р<0,1; **р<0,05 по сравнению с уровнем 1980 г.

жпвасмое как во фракции МНК периферической крови доноров, так и в суспензиях БГЛ, в 1981 г. в США и менее достоверное - в 1983 г. в России увеличение активности ЕК, предшествующее последующему двухлетнему стабильному снижению цитотоксичности. Аналогично, у мышей, получавших для питья концентрат фракции ПГЦБ в воде, уменьшение ЕК-активности сплсноцитов и индукция бластогенсза закреплялись, минуя стадию реверсирующего воздействия препарата. Выявленная нелинейность изменения активности ЕК in vitro, отмеченная во всех проанализированных регионах, а также в мире, в целом (рис.5), с преходящими тенденциями к восстановлению исходного уровня цитотоксичности согласуется с данными, говорящими о физиологическом характере воздействия ПГЦБ на функции клеток иммунной системы, свидетельство чему основывается на мягком, адаптирующем влиянии ПГЦБ в условиях опытов in vivo. Фиксирование цитотоксичности в 1994-1995 гг. в г.Москве и 1986-1987 гг. в мире, в целом (рис.5), на определенном уровне указывает на эффективность эндогенных систем, отвстствующих за регуляцию электронно-транспортных процессов, поддерживающих цитотоксичсскую активность ЕК в популяции в диапазоне, обеспечивающем выполнение комплексом ЕЦТ функций иммунобиологического надзора даже на фоне форсированного негативного воздействия.

Следовательно, наряду с другими факторами локального действия и глобального масштаба, оказывающими влияние на естественную резистентность организма человека, генерируемые цианобактсриями биоио-лимерные индукторы генетической диверсификации во многом определяют в последние десятилетия уровень функционирования системы ЕЦТ в пределах популяции, что позволяет сделать заключение о реальном достижении ими организма человека и высших животных, выступающих в данном случае в качестве вторичных объектов биологической трансляции прокариот.

С учетом полученных в работе данных о механизмах регулирующего действия амфипатичсских МС-сосдинсний на функциональную активность эффекторов ЕЦТ можно полагать, что многочисленные взаимодействия эндогенных регуляторов активности ЕК человека, определенная составляющая которых реализуется через процессы электронного обмена, формируют в организме физиологический уровень окислитсльно-восстановитсльных

Гемар гспараисульфаты; пептидогликаны, ассоциированные с молекулой у-глобулина

тип

Фибронсктии

11111

-6 \

ИФН-у, ИЛ-6

ИЛ-1, И Л-2, ИЛ-3 Г-КСФ, ГМ-КСФ

Короткие, богатые иролшюм полипептидные последовательности - продукты частичной катаболитной деградации

у-глобулина \\\\\\

Агрегированный у-глобулип как СОД

Р-бслки как СОД

ПГЦБ и подобные им по строению и свойствам МСППрГ

Рис.6

Функциональные взаимосвязи, формирующие динамический баланс в системе электронно-транспортных процессов, значимых в обеспечении реакций ЕК-опосредованного цитолиза.

реакций, связанных с генерацией и перехватом свободных радикалов кислорода, потребляемых в реакции ЕК-опосрсдованного цитолиза (см. схему на рис.6). ПГЦБ, вызывая определенные сдвиги окислительно-восстановительного равновесия в системе цитокиновой регуляции иммунного ответа, способны существенно влиять на эндогенные механизмы генерации и перехвата активных форм кислорода, тем самым естественно, нсспецифи-чески ограничивая специализированные функции эффекторов ЕЦТ.

Заключая изложение и обсуждение результатов собственных исследований, необходимо подчеркнуть следующее. Первично описанная, по существу, как прайминг продукции ИФН (Stewart W.E., II, 1983; Stewart W.E., II et al., 1971), рассматриваемая в настоящем комплексе исследований с позиций ее обеспечения системой ЕЦТ, ЭБР позволяет установить важнейшие особенности функциональной организации системы и описать механизмы аутокринной регуляции ЕК, реализующих специализированную активность в относительно автономном режиме. Методологически эндогенная воспроизводящая трансляция биологического сигнала, контролируемая через изменение активности ЕК регулирующими направленность процессов электронного транспорта и обмена МСППрГ, ПГЦБ и им подобными соединениями, формирует принципиально новый подход к фундаментальным исследованиям по проблеме ЕЦТ. Он не основан концептуально на индуктивном влиянии микробных факторов среды обитания, критически значимом в становлении иммунорсактивностн и поддержании определенной напряженности иммунитета в фило- и онтогенезе. Он полагает эволюциоино детерминированное вовлечение продуктов микроорганизмов в осуществление рационального ограничения цитотоксичности ЕК, препятствующего ауто-агрессии и срыву иммунологической толерантности в условиях гиперактивации цитотоксических эффекторов.

ВЫВОДЫ

1. Функционирование системы ЕЦТ в организме человека и высших животных обеспечивается на основе высокой вариабельности цитотоксичес-кой активности ЕК, широкого диапазона чувствительности клеток к действию иммуноактивных соединений различного происхождения, способности эффекторов ЕЦТ к ответу на ИФН, выработке ИФН и независимой от продукции ИФН реализации цитотоксичсского потенциала. Активность ЕК регулируется в относительно автономном режиме эффективными механизмами внутреннего усиления и торможения системы ЕЦТ.

2. Вариабельность цитотоксичсской активности ЕК выявляется на клеточном, половом, возрастном и популяционном уровне. Установлено, что при взаимодействии ЕК:КМ индивидуальные значения ЦИ у здоровых доноров in vitro колеблются в пределах от 2 до 82%, а ИВ - от 0,45 до 1,28 в зависимости от соотношения Э:М. Цитотоксичность ЕК у мужчин на 1025% выше, чем у женщин (р<0,001-0,1). Уменьшение с возрастом ЕЦТ

лимфоцитов сопровождается у мужчин снижением, в то время как у женщин - ростом вариабельности активности ЕК. Результаты статистического популяционного анализа обнаруживают, что разброс индивидуальных показателей цитотоксичности ЕК у здоровых доноров in vitro составляет от 4,1 до 40,5% среднего уровня, установленного для конкретного региона.

3. Способность ЕК человека отвечать на действие in vitro иммуноактив-ных соединений различного происхождения проявляется повышением цитотоксичности клеток под влиянием Т-активина (р<0,05), мислопида (р<0,05), препаратов ИФН-а (р<0,001-0,05), гаммаферона и С-реактивного белка; стимуляцией пролиферации CD16'CD56' лимфоцитов рИЛ-2 (р<0,1), рИЛ-3 (р<0,01-0,02) и рГМ-КСФ (р<0,05-0,1), а также МНК у-глобулнном сыворотки (р<0,05); ингибированисм цитотоксичности в присутствии Р-бслка и сывороточного у-глобулина (р<0,001 -0,02).

4. Ответ ЕК человека на действие in vitro ИФН определяется исходным уровнем ЕЦТ лимфоцитов и возрастом донора, зависит от наличия в препарате связанных с адекватной индукцией ИФН-гснсза цитокинов. Он полностью блокируется в аутологичной системе впервые описанным ингибитором регулирующего действия ИФН-а и ИФН-у на активность ЕК, вырабатываемым одновременно с ИФН в условиях индукции последнего.

5. Способность эффекторов ЕЦТ к продукции ИФН при взаимодействии ЕК:КМ у здоровых доноров in vitro характеризуется существенным вкладом прилипающих клеток и сильно положительно коррелирует с ци-тотоксичностыо (f)=0,87). В то же время, доказана возможность независимого от продукции ИФН осуществления цитотоксичсской функции ЕК - в условиях воздействия in vitro синтетического гексапснтида Cys-(Pro)3-Glu-Lcu, проявляющего в культуре ЛПК человека свойства индуктора ИФН-у, а в реакции ЕЦТ отменяющего выработку ИФН и повышающего цитотоксичность ЕК.

6. Характер влияния ИФН на устойчивость КМ в реакции ЕЦТ и реализация эффектов ингибиторов ИФН in vitro определяются чувствительностью КМ к антивирусному действию ИФН. Обнаружено, что реаферон протестирует чувствительные к ИФН человеческие КМ линии J-96 в реакции ЕЦТ (р<0,05) и снижает устойчивость ИФН-резистснтных КМ линии J-41 (р<0,()5). Мышиный сывороточный ИФН снижает лизис ЕК человека КМ мышиных линий L-929 и МСВ (р<0,05), чувствительных и резистентных к антивирусному действию ИФН, соответственно. ИДИ отменяет протекцию мышиным сывороточным ИФН КМ линии L-929 при взаимодействии с лимфоцитами человека и не изменяет эффект ИФН в отношении КМ линии МСВ, а его изолированное применение защищает последние от цитотоксического воздействия ЕК человека (р<0,05).

7. Реализация цитотоксического потенциала ЕК в определенной степени обеспечивается динамикой распознавания и связывания КМ эффектором ЕЦТ. Установлено, что присутствие в реакционной смсси гаммаферона и препаратов С-реакгивного белка, а также обработка лимфоцитов человека синтетическим гсксапсптидом Cys-(Pro)3-Glu-Leu приводят к снижению числа конъюгатов Э:М, образующихся в первые 10 мин контакта МНК с

KM (p<0,05-0,1), которое сопровождается выраженным повышением эффективности последующего цитолиза КМ. Показатель корреляции цито-токсичности ЕК и интенсивности конъюгатообразования увеличивается при этом до 0,5-1,0 в сравнении с 0,16 в контроле.

8. Развитие функциональной недостаточности эффекторов ЕЦТ проявляется изменением ответа ЕК на действие in vitro Т-активина и мислопида (опухоль мозга, ишемический инсульт, хронический алкоголизм, р<0,1); обнаруживаются супрессирующие влияния прилипающих клеток (системная склеродермия, р<(),02-0,05), диссоциация цитотокснческой и ИФН-продуцирующей активности ЕК (очаговая склеродермия, р=0,56; отдельные заболевания ЦНС, р=0,15, р<0,001). В условиях сохранения лимфоцитами нормального уровня реагирования на действие нммуно-корригирующих препаратов положительный клинический эффект ИФН-сх в терапии заболеваний печени, вызванных вирусом гепатита В, и - индуктора ИФН ридостипа у больных рецидивирующим герпесом гениталий сопровождается восстановлением in vitro исходно сниженного цитоток-сичсского потенциала ЕК (р<0,001-0,05).

9. Клинико-иммунологическис сопоставления у больных рассеянным склерозом, рассматриваемым как заболевание, патогенетически ассоциированное с недостаточностью эффекторов ЕЦТ, свидетельствуют о связи дефицита активности ЕК in vitro (р<0,02-0,05), развивающегося на фоне выраженного снижения продукции индуцированных ИФН-сх и ИФН-у (р<0,001), а также - ИРДИ (р<0,05), с типом течения процесса, степенью инвалидизации больных и давностью заболевания. В реакции ЕЦТ выявляются: изменение динамики образования конъюгатов Э:М (р<0,05) и чувствительности ЕК к действию in vitro Т-активина, гаммаферона, С-рсактивного белка и фибронектина; повышение вклада прилипающих клеток в суммарную цитотоксичность (р<0,05-0,1); снижение продукции ИФН-сх и доли ИФН-а, вырабатываемого при участии прилипающих клеток; возникновение диссоциации цитотоксичности ЕК и продукции ИФН ((>=0,57). В условиях сохранения лимфоцитами нормального уровня реагирования на миелопид положительный клинический эффект препарата сопровождается восстановлением in vitro цитотоксического потенциала ЕК у больных с нарастанием и стабилизацией активности PC.

10. Рассмотрение механизмов эндогенной регуляции активности ЕК факторами, участвующими в транспорте и обмене катионов металлов, обнаруживает, что ассоциированная с у-глобулином сыворотки крови человека фракция, содержащая углеводный компонент, соответствующая по составу ППрГ и выделяемая в условиях воздействия на молекулу у-глобулина хелатирующего агента, стимулирует БТЛ человека in vitro (р<0,02), ослабляет эффект индукции БТЛ фитомитогенами и снижает цитотоксичность ЕК. Аналогично, активность ЕК человека снижается in vitro в результате обработки МНК модифицированным гидроокисью алюминия гепарином (р<0,1).

11. Вовлечение в регуляцию активности ЕК соединений, обеспечивающих установление определенного уровня транспорта и обмена катионов

металлов, подтверждается при изучении действия на функционирование лимфоцитов человека и экспериментальных животных экзомстаболитов цианобактсрий, относимых к классу пептидогликанов и обладающих ме-таллосвязывающими свойствами. Обнаружено, что фракция ПГЦБ, выделенная из культуральной жидкости A.variabilis, снижает in vitro цито-токсичность ЕК человека (р<0,01). Полученная из проб водопроводной воды и соответствующая по ряду характеристик фракции ПГЦБ составляющая, аналогично эндогенным МСППрГ, ингибируст функционирование эффекторов ЕЦТ, повышает уровень спонтанной БТЛ (р<0,01-0,1) и ослабляет эффект индукции БТЛ под действием ФГА (р<0,01 -0,1). В ходе хронических опытов на лабораторных животных in vivo показано, что у получавших для питья концентрат фракции ПГЦБ белых беспородных мышей снижались ЕК-активность сплсноцитов и продукция индуцированного ИФН-а, тогда как уровень спонтанной БТЛ возрастал (р<0,05). У животных, получавших для питья освобожденную от фракции ПГЦБ водопроводную воду, повышались ЕК-активность сплсноцитов, уровень спонтанной БТЛ и продукция индуцированного ИФН-а клетками селезенки.

12. Результаты статистического динамического анализа выявляют выраженную в условиях глобальной экспансии цианобактсрий тенденцию к снижению популяционного уровня функционирования эффекторов ЕЦТ человека (р<0,02-0,1). При детальном рассмотрении они свидетельствуют в пользу предположения об общности эндогенных и экзогенных механизмов, устанавливающих регуляторный баланс в комплексе естественных цитотоксичееких реакций посредством реализации переменного вектора транспорта металла в микроокружении клетки, а возможно - и управления, тем самым, окислитсльно-восстановитсльными процессами, протекающими через стадию короткоживущих радикалов кислорода, потребляемых в реакциях ЕК-опосрсдованного цитолиза.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чскнсв С.Б., Саидов М.З., КоваЛьчук Л.В., Павлюк A.C., Арион В.Я. Действие Т-активина на активность естественных киллеров человека in vitro // Бюлл. экспсрим. биол. и медицины. - 1986. - Т.101, №4. - С.455-457.

2. Сучкова Т.Н., Чскиёв С.Б. Активность естественных клеток-киллеров у больных очаговой склеродермисй//Весш. дерматол. и венерологии. -1986. -№10. -С.13-17.

3. Сорокин A.M., Ковальчук Л.В., Тункель О.И., Чскнсв С.Б. Интсрфероннро-дуцирующая и цитогоксическая активность естественных клеток-киллеров у больных рассеянным склерозом //Журн. иевроиатол. и психиагрии им.С.С.Корсакова. - 1987. - Т.87, №2. - С.211-215.

4. Чскнсв С.Б., Саидов М.З., Ковальчук Л.В., Сорокин A.M., Степанепко Р.Н., Арион В.Я. Принцип серийных клеточных разведений в оценке действия имму-нокорригирующих препаратов in vitro // Лабор. дело. - 1987. -№¡3. -С.231-234.

5. Ковальчук JI.В., Ганковская Л.В., Чекнёв С.Б., Гизс Т., Соколова Е.В., Гвоздева H.A., Извекова В.А., Сорокин A.M. Рсгуляторное действие пептидов иммунной системы на функциональную активность моноцитов и естественных киллеров человека in vitro // Иммунология. - 1987. - №4. - С.57-61.

6. Чекнёв С.Б., Ковальчук Л.В. Возрастные особенности активности естественных киллеров у здоровых доноров // Геронтология и гериатрия - 87 / Иммунитет и старение. - Киев, 1987. - С.79-83.

7. Бакунц Г.О., Ковальчук Л.В., Чекнёв С.Б., Ульянова Т.Ю., Павлюк A.C., Дёмина Т.Л. Функциональная активность естественных киллеров и антителозависнмая цитотоксичность лимфоцитов у больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения // Жури, невронатол. и психиатрии им.С.С.Корсакова. - 1988. -Т.88, №1. - С.31-34.

8. Черменёва Л.М., Довгий A.B., Чекнёв С.Б. Естественные клетки-киллеры у больных хроническим алкоголизмом // Жури, микробиол., энидемиол. и иммунобиологии. - 1988. - №5. - С.69-72.

9. Черменёва Л.М., Довгий A.B., Чекнёв С.Б., Бозисва Ж.Ч. Выявление дефекта в системе естественных клеток-киллеров при хроническом алкоголизме // Вопр. наркологии. - 1988. - №2. - С. 13-17.

10. Cheknev S.B., Kovalchuk L.V., Sorokin A.M. Conception of natural killers (NK) immunodeficiency//Abstracts. Ninth European Immunology Meet., Roma, Sept. 14-17,

1988.-Rome, 1988.-P.122.

11. Чекнёв С.Б., Ковальчук Л.В., Тупкель О.И., Дёмина Т.Л., Яковлев В.В., Павлюк A.C. Расстройства нервной регуляции и изменение активности несненнфических киллеров при заболеваниях центральной нервной системы // Пробл. нейрогормональпой метаболической регуляции иммунной сист емы в клинике. -Горький, 1988. -С.27-38.

12. Чекнёв С.Б., Сорокин A.M., Ковальчук Л.В. Диссоциация иитотоксичсской и интерфероц-продуцирующей активности естественных киллеров в патогенезе иммуиорс1уляторного дисбаланса // Иммунология. - 19S9. - №3. - С.48-52.

13. Чекнёв С.Б., Латышева О.Л., Демина Т.Л., Сорокин A.M., Гусев Е.И. О системе естественной цитотоксичности у больных рассеянным склерозом: клинико-иммунологические параллели // Жури, невронатол. и исихиатрии им.С.С.Корсакова. - 1989. - Т. 89, №7. - С.16-19.

14. Чекнёв С.Б., Сорокин A.M., Ковальчук Л.В. Возрастные аспекты взаи-мосвязи активности естественных киллеров с системой интерферона // Иммунология. -

1989. - №4. - С.70-72.

15. Чекнёв С.Б., Ковальчук Л.В. Регуляция активности естественных киллеров человека // Механизмы иммунорегуляции и иммунная биотехнология. - М., 2 МОЛГМИ нм.Н.И.Пирогова, 1989. - С.12-16.

16. Сорокин A.M., Чекнёв С.Б., Ковальчук Л.В. Роль прилипающих клеток в обеспечении реакций естественной цитотоксичности // Бюлл. экснерим. биол. и медицины. - 1989. - Т. 108, №9. - С.322-325.

17. Чекнёв С.Б. Патогенетические аспекты иммунодефицита по естественным киллерам // Молекулярные и клеточные аспекты клинической иммунологии. - М., 2 МОЛГМИ нм.Н.И.Пирогова, 1989. - С.6-12.

18. Чскнсв С.Б., Латышева О.Л., Фролова И.С., Прицкср А.Д., Дёмина TJL, Сорокин A.M. Отсутствие эндогенных блокаторов активности ЕК-клсток Подтверждает интерферон-зависимый характер дефицита но ЕК при рассеянном склерозе // Интсрфсрон-89. - М., НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалси, 1989. - С.42-47.

19. Чскнсв С.Б., Латышева О.Л., Прицкср А.Д., Фролова И.С., Дёмина Т.Л., Сорокин A.M., Гусев Е.И. Иммунокорригирующсе действие мислопида у больных рассеянным склерозом с нарастанием и стабилизацией активности процесса // Иммунолошя. - 1990. - №1. - С.55-57.

20. Чскнсв С.Б., Наровлянский А.Н., Амчснкова A.M., Сорокин A.M., Хссин Я.Е., Ершов Ф.И. Активность естественных киллеров человека против клеток-мншеней, обладающих различной чувствительностью к шперферону// Бюлл. экснсрим. биол. и медицины. - 1990. - Т.110, №10. - С.406-409.

21. Чскнсв С.Б., Сорокин A.M., Тунксль О.И. Индивидуальная чувствительность естественных киллеров человека к регулирующему действию иитерферонов // Иммунология. - 1990. - №6. - С.47-50.

22. Чскнсв С.Б., Латышева О.Л., Тункель О.И., Прицкср А.Д., Фролова И.С., Сорокин A.M., Ершов Ф.И. Интерфероновый статус при рассеянном склерозе // Там же. - С.57-60.

23. Чекнёв С.Б., Наровлянский А.11., Амчснкова A.M., Сорокин A.M. Варианты ци-тотоксичсской активности естественных киллеров против модифицированных интерфероном клеток-мишеней//Доклады Академии наук СССР. •• 1990.-Т.315, №5. -С. 1270-1274..

24. Чекнёв С.Б., Латышева О.Л., Тунксль О.И. Возрастные особенности системы естественной цитотоксичиости у. больных рассеянным склерозом и их возможная Связь с патогенезом заболевания // Журн. невронатол. и психиатрии им.С.С.Корсакова. - 1991. - Т.91, №2. - С.13-16.

25. Сорокин A.M., Чекнёв С.Б., Кузнецов В.П. Иммуномодулнрующая активность отечественных медицинских природных препаратов интерферона-а // Иммунология. - 1991. - №1. - С.17-20.

26. Чскнсв С.Б., Саидов М.З., Цветков В.В., Моисеева Н.Б., Ульянова Т.Ю., Латышева О.Л., Лозесва Я.Г., Ковальчук Л.В. Возрастная и половая вариабельность активности естественных киллеров у здоровых допоров //Там же,- С.39-43.

27. Chekncv S.B., Barlova L.M., Tarkhanova I.A., Margulis G.U., Kulberg A.J. New test ifor measuring human natural killer cell activity // Abstracts. 11th European Immunology Meet., Espoo, 1991. June 10-12. - Helsinki, 1991. - №19-14.

28. Чскнсв С.Б., Наровлянский А.Н., Амчснкова A.M., Ершов Ф.И. Ингибитор действия интерферона в регуляции активности естественных киллеров человека // Бюлл. экспсрим. биол. и медицины. - 1991. - Т.112, №10. - С.395-397.

29. Чекнёв С.Б., Латышева О.Л., Денисов Л.А., Ершов Ф.И. Взаимодействие интерферона с другими иммуномодуляторами в регуляции активности естественных киллеров человека // Там же. - 1992. - Т.113, №2. - С.179-182.

30. Наровлянский А.Н., Амчснкова A.M., Алимов Э.Г., Покидышсва Л.Н., Чекнёв С.Б., Хссин Я.Е., Ершов Ф.И. Резистентность клеток к интерферону и путь се преодоления //Интсрфсрон-92. -М., НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, 1992. -С.59-69.

31. Cheknev S.B. Pathogcnctical basis for combined using of interferon and its inhibitor in the therapy of multiple sclcrosis patients // Adv. Modern Biotechnology / Short rc-

ports of the Congr. "Biotccnologia Habana'92", June 8 to 12, 1992, La Habana. -Habana, 1992. - V.l. - P.20.7.

32. Чскнсв С.Б. Активность естественных киллеров человека в различных экспериментальных условиях // Бюлл. экснсрим. биол. и медицины. - 1992. -Т.114, №8. - С.187-189.

33. Chekncv S.B., Narovlyansky A.N.. Amchenkova A.M. Diffcrcnce and similarity in actions of interferon and of its inhibitor on the natural killer (NK) cell activity// J. Interferon Research. - 1992. - V.l2, suppl.l. - P.203.

34. Chekncv S.B., Kujavskaya D.V., Kulbcrg A.J. Effcctontargct conjugates as traps for natural killer cells in mechanism of their cytotoxic action // Lymphokinc and Cytokine Research. - 1993. - V.12, №5. - P.347. .

35. Chekncv S.B., Ashmanova Ya.G., Latyshcva O.L., Kujavskaya D.V., Deniina T.L., Kulbcrg A.J. Interferon as a factor ensuring formation of "false" NK: target cell conjugates in multiple sclerosis patients // J. Interferon Research. - 1993. - V.13, suppl.l. - P.108.

36. Kulbcrg A.J., Ycrshov F.I., Tarkhanova I.A., Babaeva E.E., Chekncv S.B., Kitashov A.V.. Narovlyansky A.N., Amchcnkova A.M. Microbial peptidoglycan admixture in tap water inhibits the viral induced interferon production // Ibid. - P. 110.

37. Крель П.Е., Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Апросина З.Г., Игнатова Т.М., Семснкова Е.Н., Косминкова Е.Н., Бабаянц А.А., Чскнсв С.Б. Комплексное лечение <х-интерфероном и цитокинами заболеваний, индуцированных вирусом гепатита В: хронического гепатита и цирроза печени, узелкового исриартсриита, хронического гломерулонсфрита//Росс. жури, гастроэнтерологии, гематологии. - 1993. - Т.1, №2. - С.72-78.

38. Чскнсв С.Б. Недостаточно« ь системы интерферона как механизм развития иммунодефицита но естественным киллерам // Иммунология. - 1993. - №6. - С.8-12.

39. Чскнсв С.Б. Отрицательная поправка к показателям регулирования активности естественных киллеров // Там же. - С-.45-47.

40. Латышева О.Л., Чскнсв С.Б., Демина Т.Л. Определение активности естественных киллеров в прогнозе эффективности применения Т-активина и миелопида у больных рассеянных склерозом // Нсироиммунологня на пороге XXI века. -Санкт-Петербург, 1993. - С.88-93.

41. Чскнёв С.Б. Система естественной цитотоксичности в иммунопатогенезе рассеянного склероза // Там же. - С. 163-173.

42. Чскнсв С.Б., Куявская Д.В., Токсамбаева С.Ж., Мысякин Е.Б., Кульбсрг А.Я. Диссоциация коныогатов эффект ор:мишеиь в механизме активации ест ест венных киллеров человека факторами, действующими на стадии "легально!» удара" // Бюлл. экснсрим. биол. и медицины. - 1994. - Т.117, №3. - С.280-285.

43. Kulbcrg A.J., Babaeva Е.Е., Tarkhanova 1.А., Chekncv S.B., Kulagina N.N. Immunosuppressive peptidoglycan of algae origin as pollutant of water and regular admixture in commercial preparations of recombinant HIV-1 proteins // Biotec. -1994.-V.9, №2.-P.123.

44. Чскнёв С.Б. Патогенез рассеянного склероза: иммуностимуляция или иммунодефицит? // Иммунология. - 1994. - №2. - С.9-17.

45. Chekncv S.B., Tarkhanova I.A., Babaeva Е.Е., Kulbcrg A.J. A peptidoglycan of cyanobactcria as a factor alTccting natural immunity // Natural Immunity. - 1994. -V.13, №4. -P.233.

46. Чскнёв С.Б., Миковская О.И., Мешкова Е.Н., Халдин А.А., Самгии М.А., Малиновская В.В. Активность естественных киллеров и показатели иитерферонового статуса у больных рецидивирующим герпесом гениталий при лечении ридосги-1ЮМ // Воир. вируеолопш. - 1994. - Т.39, №3. - С. 125-128.

47. Чекнсв С.Б., Куявская Д.В., Тарханова И. А., Бабаева Е.Е., Бартова J1.M., Кульбсрг А.Я. Вовлечение фибронектина и взаимодействующих с ним компонентов сыворотки в регуляцию активности естественных киллеров человека // Бюлл. эксисрим. биол. и медицины. - 1994. - Т. 118, №7. - С.54-59.

48. Чекиев С.Б., Ашмаиова Я.Г., Латышева О.Л., Токсамбасва С.Ж., Мысякии Е.Б., Кульбсрг А.Я. Фибропектин как фактор компенсации в системе естественной цитотокснчности при интерферонзависимом иммунодефиците // Там же. - С.67-70.

49. Чекиев С.Б., Ершов Ф.И., Прицкер А.Д., Латышева О.Л. Регуляция активности естественных киллеров человека аутологичным интерфероном // Там же. - №9. -С.281-284.

50. Chckncv S.В., Ashmanova Y.G., Pritskcr A.D., Latysheva O.L., Ycrshov F.I., Kul-berg A.J. Autologous enhancement by interferon of natural killer activity of human peripheral blood lymphocytes // Mediators of Inflammation. - 1994. - V.3, №5. -P.341-346.

51. Чекиев С.Б., Ашмаиова Я.Г., Прицкер А.Д., Лагышева О.Л. Циркулирующий сывороточный интерферон и его влияние на активность естественных киллеров человека// Бюлл. эксисрим. биол. и медицины, - 1994. - Т. 118, №12. - С.619-622.

52. Чекиев С.Б., Ашмаиова Я.Г., Бабаева Е.Е., Тарханова И.А., Кульбсрг А.Я. Бласт-трапсформация лимфоцитов и активность естественных киллеров в присутствии у-глобулина in vitro // Там же. - С.625-630.

53. Chckncv S.В., Latysheva O.L., Démina T.L. Measurement of natural killer cell activity for prediction of immunotherapy efficiency in multiple sclerosis // Adv. Modern Biotechnology / Short reports of the Congr. "Biotccnologia Habana'94", Nov.28 -Dec.3, 1994, La Habana, - Habana, 1994. - V.2. - P.211.

54. Чекиев С.Б., Кульбсрг А.Я. Поиуляцнонная динамика противоопухолевой активности естественных киллеров человека // Иммунология. - 1995. - №2. -С.9-12.

55. Чекиев С.Б. Стимуляция нролиферативной активности естественных киллеров (CD16+CD56+ клеток) человека рскомбипаптным иптсрлейкнном-З in vitro // Бюлл. эксисрим. биол. и медицины. - 1995. - Т.119, №4. - С.409-412.

56. Chcknev S.В. Defects of a fibroncctin in a pathology of endogenous biological rctranslation // Abstract book. The 9th Int. Congr. Immunol., 23-29 July, 1995, San Francisco. - San Francisco, 1995. - P.474.

57. Чекиев С.Б. Выделение обогащенных естественными киллерами (CD 16' CD56'-клегками) мононуклеаров из периферической крови доноров // Иммунология. -1995.-№5.-С.9-14.

58. Chcknev S.В., Kulberg A.J. NK cell activity in population and cancer mortality // J. Lcukocytc Biology. - 1995. - Suppl. - P.27.

a