Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Влияние микрогравитации на межклеточное взаимодействие иммунокомпетентных клеток человека с клетками-мишенями (К-562) in vitro

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ВЛИЯНИЕ МИКРОГРАВИТАЦИИ НА МЕЖКЛЕТОЧНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С КЛЕТКАМИ-МИШЕНЯМИ (К-562) IN VITRO

14 00 32 - авиационная, космическая и морская медицина

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003162057

Москва, 2007

003162057

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Ларина Ирина Михайловна, заслуженный деягель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Воложин Александр Ильич

Ведущая организация

Российский государственный научно-исследовательский центр подготовки космонавтов им Ю А Гагарина

Защита диссертации состоится «3_» ноября 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета К 002 111 01 в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) по адресу 123007, г Москва, Хорошевское шоссе, д 76-а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН Автореферат разослан « 8 » октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ИП Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В результате проведенных исследований было установлено, что космические полеты оказывают существенное влияние на функциональное состояние всех систем организма человека [Григорьев А И, 2001, Moore D, Bie Р et al, 1996] В том числе и система иммунитета подвергается воздействию различных факторов, оказывающих влияние на резистентность организма человека к различным инфекционным агентам [Мешков Д 0 , 2001, Konstantmova IV, Fuchs В В , 1991, Sonnenfeld G, Shearer W Т, 2002]

Исследование иммунной системы космонавтов после завершения полетов различной продолжительности выявило ряд изменений функциональных свойств и количества иммунокомпетентных клеток Воздействие микрогравитации проявлялось качественными и количественными сдвигами в популяциях клеток белой крови, включая нейтрофилию, эозинопению и лимфоцитопению [Taylor G R, Dardano J R, 1983, Cogoli A, Tschopp P, 1985, Kaur I, Simons E R et al, 2004, Stowe R P, Sams С F et al, 1999]

Наиболее существенным изменениям в условиях космического полета подвергается клеточный иммунитет человека, ответственность за который несут Т-лимфоциты Исследования, проведенные после длительных космических полетов, позволили выявить ряд закономерностей в изменениях Т-системы иммунитета [Константинова ИВ, 1988, Kimzey S L, 1977, Konstantmova IV, Sonnenfeld G et al, 1991] Воздействие факторов космического полета приводит к снижению функциональной активности (ФГА-реакгивносш) Т-лимфоцигов У части космонавтов отмечали также снижение количества этих клеток в периферической крови [Константинова И В, 1972, Leach С L, Rambaut Р С, 1974, Kimzey S L, 1977, Taylor С R, 1993] Эксперименты ш vitro подтвердили, что микрогравитация может сама по себе изменять функциональный статус Т-клеток, нарушая проведение сигнала и ремоделируя цитоскелет [Lewis М L, Reynolds J L et al, 1991, Cogoli A,BechlerB, 1993]

Снижение цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров было показано многими исследователями как после длительных космических полетов, так и после кратковременных экспедиций [Vorobyov Ye I, Gazenko О G et al, 1983, Konstantmova IV, Sonnenfeld G et al, 1991, Konstantmova IV, RykovaMP et al, 1993, Mehta S К, Kaur I et al, 2001] Была отмечена высокая степень вариабельности данного показателя у различных космонавтов (астронавтов), однако тенденция к снижению была явно выражена после завершения космического полета. Анализ системы естественных киллеров позволил установить, что в результате воздействия факторов космического полета угнетаются такие показатели, как способность распознавать и образовывать конъюгаты с клетками-

мишенями, способность к повторным взаимодействиям с чужеродными клетками, а также интегральная функциональная активность популяции естественных киллеров (Константинова ИВ, 1988, Мешков ДО, 1989, Лесняк AT, Рыкова МП и др, 1998] Такие изменения могут явиться пусковым фактором не только для развития злокачественных новообразований, но и заболеваний инфекционной, в первую очередь, вирусной, природы у космонавтов, как во время космического полета, так и после его завершения, поскольку лимфоциты - естественные киллеры (ЕК) являются первой линией обороны против инфекщкшных агентов и трансформированных клеток [Herberman R В , Ortaldo JR., 1981]

Основу механизма взаимодействия лимфоцитов естественных киллеров с клетками-мишенями, согласно современным представлениям, составляет распознавание "потерявших себя клеток", под которыми подразумеваются клеточные мишени с нарушениями структуры или экспрессии классических и неклассических молекул главного комплекса гистосовмесгамосга I класса (МНС-1) [Ljunggren Н G, Karre К, 1990, Tnnchien G, 1994, Yokoyama W М, 2002] Было установлено, что названные молекулы вступают во взаимодействие с особыми рецепторами, присутствующими на мембране ЕК и определяющими как подавление, так и активацию эффекгорных функций этих клеток [Warren Н S , Campbell A J et al, 2001, Ymg H Y, Shen X et al, 2000] В результате возникает баланс активирующих и ингибирующих сигналов, следствием которого является функциональное состояние ЕК в каждый конкретный момент

Однако, несмотря на интенсивно проводимые исследования системы естественной цитотоксичноста, многие механизмы их иммунорягуляторных и цитотоксических эффектов остаются во многом неясными Исследование влияния микрогравитации на лимфоцшы-естественные киллеры in vitro, позволяет приблизиться к более глубокому пониманию процессов взаимодействия этих иммунокомпетентных клеток с клетками-мишенями и выяснению механизмов изменений в системе иммунитета, регистрируемых после космического полета

Цель работы1 исследование влияния микрогравитации и ее моделирования на межклеточное взаимодействие лимфоцитов человека и клеток-мишеней m vitro Основные задачи исследования:

1 Разработать метод и бортовую укладку для определения цитотоксической активности лимфоцитов-естественных- киллеров периферической крови человека применительно к условиям космического полета на борту Международной космической станции

2 Определить влияние микрогравитации на цитотоксичносгь лимфоцитов-есгественных киллеров in vitro при совместном культивировании с клетками К-562

3 Исследовать влияние клиностатирования на взаимодействие лимфоцитов-есгественных киллеров с клетками-мишенями

4 Изучить продукцию цитокинов суспензией иммунокомпетенгных клеток при взаимодействии с клетками линии К-562 в условиях измененной гравитации

5 Разработать бортовую укладку для оценки влияния биологически активных веществ (в частности IL-2) на межклеточные взаимодействия культуры лимфоцитов человека и культуры клеток линии К-562 в условиях космического полета

6 Провести эксперименты в условиях микрогравитации с применением lg контроля на борту МКС в рамках программы KUBIK (ESA) по изучению цитотоксической активности лимфоцитов-есгественных киллеров in vitro

Научная новизна работы.

Впервые проведено изучение цитотоксической активности изолированных лимфоцитов-естественных киллеров периферической крови человека in vitro в условиях космического полета на борту Международной космической станции Показано, что микрогравитация не подавляет межклеточные взаимодействия лимфоцитов и клеток-мишеней, в качестве которых использовалась суспензионная линия человеческих эритролейкемических лимфобластоидных клеток К-562

Полученные результаты анализа синтеза цитокинов изолированными иммунокомпетентными клетками, экспонированными в условиях микрогравигации, при совместном культивировании с клетками-мишенями показали, что условия микрогравитации оказывают разнонаправленное действие на изменение уровня цитокинов (TNF-a, IL-la, IL-2, IL-4, IL-6) у различных доноров

Практическая и научная значимость работы.

Проведенные исследования позволили разработать новый подход к исследованию роли регуляторных стимулов в функционировании иммунокомпетенгных клеток in vitro в условиях микрогравитации Результаты работы расширяют теоретические представления о влиянии условий микрогравитации на межклеточные взаимодействия лимфоцитов-есгественных киллеров и клеток мишеней линии К-562 Полученные данные могут иметь и определенное практическое значение, так как позволят обосновать методологические подходы к исследованию состояния противовирусного иммунитета космонавтов непосредственно во время космического полета, что значительно расширит возможности медицинского контроля на различных этапах длительных экспедиций

Основные положения, выносимые на защиту:

1 В результате лабораторных испытаний и проведенных полетных экспериментов показана возможность использования и эффективность модифицированного метода изучения цитотоксической активности лимфоцитов -естественных киллеров ш vitro и разработанной укладки («Фибробласт-1») для проведения исследований межклеточного взаимодействия в условиях реального космического полета

2 В условиях микрогравитации функциональная активность лимфоцитов -естественных киллеров, выражающаяся в способности к цитолизу кяеток-мишеней в суспензии и продукции ряда цитокинов не угнетается, более того, наблюдается тенденция к увеличению цитотоксической активности в условиях реального космического полета.

3 Выявлены широкие индивидуальные различия в профиле продукции цитокинов суспензией лимфоцитов ш vitro различных доноров, а также в степени активации цитотоксической активности при юшносгатировании и в условиях микрогравитации (от 2,5% до 171,7%)

Апробация работы и публикации.

Основные результаты и положения работы были доложены и опубликованы в материалах III и IV Конференции молодых ученых, специалистов, аспирантов и студентов, посвященных дню космонавтики (Москва, 2004, 2005), 13-ой конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» (Москва, 2006), International Society of Gravitational Physiology (ISGP) Joint Life Science Conference (Кельн, 2005)

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол №9 от 7 сентября 2007 г )

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 140 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, главы собственных исследований с обсуждением полученных результатов и выводов Прилагаемая библиография содержит ссылки на 138 литературных источников, в том числе 89 иностранных Диссертация иллюстрирована 8 рисунками, 5 фотографиями и 38 таблицами

Связь работы с научными программами.

Исследования выполнены в рамах Российской федеральной космической программы, при финансовой поддержке Роскосмоса, Российской академии наук и гранта НШ-2225 2003 4

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалом для исследований служили культура лимфоцитов человека, выделенных из периферической крови, и суспензионная культура опухолевых миелобластов человека (К-562) Клетки-мишени К-562 были получены из коллекции Института вирусологии РАМН им Д И Ивановского В качестве культуральной среды использовали среду RPMI-1640 (Gibco, США) с 5% или 10 % инакгивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США) с добавлением 2мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES буфера и 1% антибиотика Антимикотика (Sigma, США)

Для проведения исследований на борту МКС была разработана и испытана специальная укладка «Фибробласт-1», в состав которой входят шесть комплектов, в которых размещены шприцы с лимфоцитами и клетками-мишенями линии К-562, а также специальные мембранные фильтры Эксперимент «Межклеточное взаимодействие» был выполнен российскими космонавтами в период смены экипажей на МКС-7 - МКС-12 в течение первых и вторых суток после стыковки Снаряжение укладки «Фибробласт-1» производилось в лаборатории Байконура за 19 часов до старта транспортного корабля «Союз»

Для выделения лимфоцитов в асептических условиях был проведен забор 50 мл крови из кубитальной вены у здорового донора, прошедшего предварительно обследование на отсутствие в крови специфических антител против HIV1, HIV2, HTLV1, HTLV2, вируса гепатита А, В и С, Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma homenis, Chlamidia trachomatis, Chlamidia pneumoniae, Chlamidia psittaci и HbsAg Мононуклеары выделяли на градиенте плотности фиколл-пак (Amersham Biosciences) Гепаринизированную венозную кровь разводили в 2 раза средой RPMI-1640 и наслаивали пастеровской пипеткой (Sigma, США) на поверхность градиента плотности фиколл-пака (Sigma, США) в соотношении 1 2 Затем проводили центрифугирование в течение 15 минут при 1820 об/мин при комнатной температуре на центрифуге с горизонтальным ротором (Eppendorf; Германия) Слой клеток из интерфазы собирали пастеровской пипеткой в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл Далее клетки трижды отмывали от градиента плотности в 10 мл культуральной среды RPMI-1640 путем центрифугирования в течение 10 минут при 1000 об/мин при температуре +4°С Взвесь мононуклеаров помещали в культуральную среду с 5% содержанием эмбриональной телячьей сыворотки, подсчитывали количество выделенных лимфоцитов в 3% растворе уксусной кислоты (ДиаэМ, Россия) в камере Горяева под световым микроскопом с помощью объектива х20 и доводили концентрацию клеток до 1х106 кл/мл

В день заправки шприцов укладки «Фибробласт-1» предварительно меченные 3Н-уридином и зафиксированные в 0,1% растворе формалина клетки К-562 трижды отмывали в 10 мл культуральной среды путем центрифугирования в течение 10 минут при 1000 об/мин при комнатной температуре После отмывки клетки помещали в культуральную среду, подсчитывали количество клеток в растворе 0,5% трипанового синего в камере Горяева под световым микроскопом с помощью объектива х20 и разводили клетки К-562 питательной средой до конечной концентрации 1х105 клеток в 1 мл клеточной суспензии В данной концентрации суспензия клеток К-562 была использована в эксперименте и помещалась в шприцы Шприцы с биологическим материалом размещались на панелях комплектов «Фибробласт-1» Каждый комплект «Фибробласт-1» был помещен в пакет ZIPLOCK Полностью снаряженная укладка передавалась представителям РКК «Энергия» за 10 часов до старта для доставки на транспортный корабль «СОЮЗ ТМА»

В течение 1-2 суток после стыковки российские космонавты выполняли ряд последовательных манипуляций в перчаточном боксе Инкубация шприцов производилась в течение 24 часов в термостате КРИОГЕМ-ОЗ, работающем в режиме 37°С После инкубации клеточную суспензию пропускали из шприцов через фильтры (Mdlipore) в

вакутейнеры (Vacuette) Вакутейнеры с культуральной жидкостью замораживали в морозильнике КРИОГЕМ-ОЗ (-20°С) После завершения полета вкладьпп «Фильтры» и замороженные пробы с места приземления доставлялись в лабораторию Института,

Для оценки цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров периферической крови человека фильтры, извлеченные из фильтрующих насадок, помещались в сцикцилляционные флаконы с 5 мл толуолового сцинтиллягора (для приготовления толуолового сцинтиллягора использовались следующие реактивы ППО (5,0 г), ПОПОП (0,1 г) и 1000 мл толуола (Россия)) Измерение радиоактивности клеток-мишеней, осажденных на фильтры, проводилось в жидкостном сцинтилляционном ß-счетчике (Hidex, Финляндия)

Индекс цшотоксичности (ИЦ) рассчитывался по следующей формуле

| _ имп/мин Фипьтоа с клетками К-5И и лимфошггами ^ имп/мин фильтра с клетками К-562

Оценка жизнеспособности и изучение экспрессии главных поверхностных маркеров лимфоцитов - CD3, CD4, CD8, CD14, CD16 и CD56 (Immunotech, Франция), производились на цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter) Для определения жизнеспособности использовались Аннексии V и пропидий йодид (bnmunotech, Франция) Содержание интерлекинов TNF-a, IL-la, IL-2, IL-4 и IL-6 в среде культивации после взаимодействия суспензии лимфоцитов и клеток-мишеней измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием наборов "Human TNF-a", "Human IL-la", "Human IL-2", "Human IL-4" и "Human IL-6" (Biosource, Бельгия) с использованием иммуноферментного анализатора Вю-Rad PR2100

Клиностатирование осуществляли в СОг инкубаторе при температуре 37°С на горизонтальном клиностате со скоростью вращения 6 об/мин Контрольные пробы находились в стационарных условиях, однако применялся дополнительный динамический контроль на шейкере Время совместной инкубации суспензии лимфоцитов и клеток-мишеней также составляло 24 часа, как и ддя полетных экспериментов

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью программ «Exel» и «Statistica 5 0» Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали, используя непараметрические критерии Фридмана и Манна-Уитни Различия считались достоверными при р<0,05 Данные представлены в виде средних значений + стандартное отклонение среднего

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Модификация метода изучения цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров применительно к условиям космического полета.

Поддержание в жизнеспособном состоянии суспензионной культуры опухолевых миелобластов К-562 требует замены культуральной среды каждые 48 - 72 часа, в противном случае происходит гибель клеток, сопровождающаяся разрушением ее рецепторного аппарата. Это резко ограничивает возможности использования стандартной методологии для проведения исследований в условиях космического полета Одной из возможностей постановки цитотоксического теста при необходимости длительного хранения клеток-мишеней является их префиксация Модификация технологии исследований (с использованием в качестве клеток-мишеней для ЕК предварительно зафиксированных в 0,1% растворе формалина клеток К-562) позволяет сохранить

рецепторный аппарат мембраны и использовать эти клетки в эксперименте на борту Международной космической станции

Результаты изучения возможности использования такого способа фиксации клеток-мишеней показали, что количество недеградированной 3Н-РНК, оставшейся в клетках-мишенях через 24 часа после их фиксации, было ниже в свежих мишеневых клетках Содержание недеградированной 3Н-РНК в фиксированных клетках линии К-562 после 7 суточного хранения в холодильнике (+4°С) и при комнатной температуре не претерпевало существенных изменений (Рис 1), и этот показатель сохранялся в дальнейшем на протяжении 4-5 месяцев

Было показано, что хотя способность включения радиоактивной метки изначально гораздо выше у свежих мишеневых клеток линии К-562, но вследствие интенсивного деления клеток этот показатель резко снижался и на четвертые сутки составлял менее 10% от исходного уровня при хранении клеток, как при комнатной температуре (Рис 1), так и при +4°С, что существенно снижало возможности детектирования

Рис 1 Влияние времени хранения на содержание недеградированной 3Н-РНК в клетках линии К-562 (имп/мин) при комнатной температуре

Таким образом, использование клеточной культуры с изначально высокой способностью к включению радиоактивной метки и предварительно зафиксированных клеток является оптимальным для проведения эксперимента независимо от времени внесения радиоактивной метки (по крайней мере, в течение 1 недели)

Изучение функциональной активности лимфоцитов-естественных киллеров венозной крови здоровых доноров при совместной инкубации культуры лимфоцитов с клетками-мишенями, в качестве которых были использованы как клетки линии К-562, меченные 3Н-уридином через 24 часа после внесения свежей культуральной среды в

культуральные флаконы, так и предварительно зафиксированные меченные 3Н-уридином мишеневые клетки не выявило достоверных отличий цитотоксического индекса. Таким образом, показана возможность использования меченных 3Н-уридином клеток-мишеней линии К-562, предварительно зафиксированных в 0,1 % растворе формалина, при проведении исследований в условиях, когда существуют препятствия для постоянной смены питательной культуральной среды, а также отсутствуют условия для выполнения процедуры обработки клеток радиоактивными материалами

Результаты экспериментов, направленных на изучение влияния длительности и температурных условий хранения на культуры лимфоцитов человека, показали, что жизнеспособность изолированных лимфоцитов, находившихся после выделения из крови донора в течение 5 суток при температуре +4°С и +18 - 20°С, оставалась высокой При увеличении сроков хранения клеточных культур до 6-7 суток, как при комнатной температуре, так и при +4°С отмечено резкое снижение содержания жизнеспособных лимфоцитов (табл 1)

Таблица 1

Влияние времени и условий хранения на жизнеспособность клеток (в %) в

.............— .......--,--------- /О,, 1 гф..............1

% жизнеспособных клеток

Условия Время хранения выделенных ли мфоадг гов человека (сутки)

хранения 0 1 2 3 4 5 6 7

+18 -20°С 99 99 95 82 80 25 21

+4°С 99,5 99 99 100 90 82 25 23

Необходимо отметить, что снижение концентрации лимфоцитов в суспензии до 1х106 кл./мл положительно повлияло на жизнеспособность клеток при хранении при комнатной температуре, сохраняя число жизнеспособных клеток на уровне более 90%

Таким образом, разработанная модификация метода исследования цитотоксической активности ЕК с использованием культуры лимфоцитов человека и зафиксированных в 0,1% растворе формалина опухолевых миелобласгов линии К-562, меченных 3Н-уридином, может быть использована для детального изучения эффектов микрогравитации на контактное взаимодействие ЕК с клетками-мишенями в суспензионных клеточных культурах При этом цитотоксическая активность лимфоцитов-есгесгвенных киллеров сохраняется в суспензионной культуре лимфоцитов человека, содержавшихся при температуре +18 - 20°С в течение 3-4 суток (период

транспортировки до места старта, выведения на орбиту и космического полета до момента стыковки с орбитальной космической станцией) после выделения из крови донора

Анализ субпопуляционного состава используемых культур лимфоцитов человека

Для анализа и корректной оценки влияния внешних факторов на цитотоксическую активность необходимо знать соотношение популяций и субпопуляций лимфоцитов в суспензии При сравнении субпопуляционного состава лимфоцитов цельной крови различных доноров и суспензии изолированных лимфоцитов было отмечено, что в целом количественное соотношение субпопуляций лимфоцитов остается неизменным (Таб 2) Естественно, что при процедуре выделения лимфоцитов из венозной крови доноров часть клеток теряется в процессе отмывки, что выражается в снижении абсолютного количества клеток некоторых субпопуляций, но в процентном отношении у большинства доноров чаще незначительно снижается количество В-лимфоцитов и Т-хелперов, а также теряется небольшая часть МК-клеток

Таблица 2

Субпопуляционный состав лимфоцитов цельной крови и суспензии изолированных лимфоцитов на примере трех различных доноров

Субпопуляции лимфоцитов Норма (% клеток) Донор 1 Донор 2 Донор 3

кровь сусп лимф кровь сусп лимф кровь сусп лимф

Т-лимфоциты (СОЗ+/СБ19-) 55 0 - 88 0 84 7 791 70 5 67 1 78 9 79 9

В-лимфоциты (СОЗ-/СШ9+) 5 0-190 67 49 И 5 78 8 1 50

Т-хелперы (СБЗ+/С04+) 31 0-510 46 6 46 4 40 3 37 9 56 0 48 7

Т-супрессоры/цитотокс (С03+/С08+) 120-300 28 3 30 2 27 4 25 9 23 9 23 3

КК-клегки (СБЗ-/СБ16+/С056+) 60-200 65 46 14 3 122 73 67

Т-ЫК (СБЗ+/С016+/С05б+) 00-50 7 1 95 30 34 6 1 27

Т-лимфоциты актив (СОЗ+/НЬА-№+) 00-120 1 9 1 9 66 40 1 4 1 1

Исследования влияния условий доставки на МКС биологических проб на субпопуляционный состав лимфоцитов показали (Таб 3), что на четвертые сутки после выделения лимфоцитов, то есть на момент проведения эксперимента на борту МКС наблюдается выраженное снижение процента В-клеток и заметно падает содержание ТЫК-клеток в суспензии лимфоцитов (как правило, сразу после выделения лимфоцитов из периферической крови) Необходимо отметить, что процентное содержание лимфопитов-естественных киллеров (ЫК-клеток) при этом не изменяется

Таблица 3.

Сравнение субпопупяционногб состава суспензии лимфоцитов человека на вторые и четвертые сутки после выделения из периферической крови донора.

Субпопуляции лимфоцита в Норма (% клеток) Кровь Лимф. Лимф. Вторые сутки Лимф. Четвертые сутки

Т-лммфоцЩы (CD3+/CD1с)-) 55.0 - 88 0 78.9 799 72.2 84.4

В-лнмфацты (CD3-/CD19+) 5.0-19.0 8.1 5.0 5.1 3.5

Т-хелперы (СШ+/СП4+) 31.0-51.0 56.0 48.7 46.9 55.1

Т-еу пргсеоры/иитото ке. (CD3+/CD8-H 12.0-30 0 23.9 23.3 22.8 25.7

N К-КЛСТКИ (CD3-'CD16+/CD56+1 6.0 - 20 0 7.3 6 7 7.5 82

T-NK (CD3+/COI6+/CD56+) 0.0-5.0 6.1 2.7 2 7 2.4

Т-лимфоцитът актив. (CD3+/HL A-D R+) 0.0-12.0 1.4 1.1 1.2 0.9

Аналогичные результаты были покачаны при хранении культуры клеток при температуре +4"С.Поскольку длительна* инкубация культуры лимфоцитов а измененных условиях может приводить к изменению рецепториого аппарата клеток, проводилось изучение влияния кииностатирования на изолированные лимфоциты человека. Длительное изменение направления вектора гравитации (в течение 24 часов) не вызвало существенных изменений в субпопуляииоином составе суспензии лимфоцитов человека. Таким образом, отсутствие значимых изменений субполуляциеянгаго состава в течение 34 суток пееле выделения лимфоцитов из периферической крови донора позволяет использовать разработанные методические подходы к исследованию цитоток си ческой активности лимфоцитов в условиях микротравитзции.

Используя модифицированную методику, для проведения полетных экспериментов была создана укладка «фибробласт-1» (Рис 2),

Рис .2. Полетная укладка «ФИЕГОБЛАСТ-1».

Результаты полетных экспериментов «Межклеточное взаимодействие», проведенных на борту Международной космической станции (МКС-7-МКС-12).

Летные испытания укладки "ФИБРОБЛАСТ-1" (Рис 2) в апреле 2003 г, осуществленные российским космонавтом командиром экипажа МКС-7 в условиях реального космического полета показали, что разработанная укладка пригодна дня проведения исследований с суспензионными клеточными культурами В последующем был проведен полетный эксперимент «Межклеточное взаимодействие» во время экспедиций на борту Международной космической станции Результаты исследования полученного биологического материала показали, что лимфоциты человека в условиях микрогравитации сохраняли способность оказывать цитотоксическое действие на клетки миелолейкоза человека линии К-562

С нашей точки зрения, представляется интересным сравнить данные по влиянию микрогравитации на цитолитическую функцию лимфоцитов человека, полученные в различных экспедициях на МКС Обобщенные данные исследования цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров, выделенных из периферической крови 10 здоровых доноров, которое проводилось в течение пяти экспедиций на МКС, представлены в таблице 4

Таблица 4

Данные исследования цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров, выделенных из периферической крови 10 здоровых доноров, которое проводилось во время пяти экспедиций на МКС

Донор % КК-клеток Индекс цитотоксичности Активация (%)

контроль полет

Донор 1 (МКС-8) 163 9,7 12,2 125 8

Донор 2 (МКС-9) 261 16,2 32,0 197 5

Донор 3 (МКС-9) 12 8 25,0 44,2 176 8

Донор 4 (МКС-10) 100 26,5 31,5 1189

Донор 5 (МКС-10) 204 11,4 18,7 164 0

Донор 6 (МКС-10) 15 1 11,6 31,5 271 7

Донор 7 (МКС-11) 155 26,8 29,3 109 3

Донор 8 (МКС-И) 180 15,7 16,1 102 5

Донор 9 (МКС-12) 16 5 18,4 28,2 153 3

Донор 10 (МКС-12) 67 12,7 15,1 1189

М+т 15 7+3 7 17 4+5 4 25 9+8 3 153 9+38 9

При изучении лимфоцитов - естественных киллеров было показано, что процентное содержание этих клеток находилось в пределах физиологической нормы и составляло в среднем 15,7% от общего числа лимфоцитов При этом индекс циготоксичности в наземном контроле, выраженный в условных единицах, составлял в среднем 17,4 услед В условиях микрогравитации цитотоксическая активность лимфоцитов увеличивалась в среднем на 53,9%, и средний индекс цитотоксичносш составлял 25,9 уел ед

Достоверность уровня различия оценивали, используя непараметрические критерии Фридмана и Манна-Уитни Различия считались достоверными при р<0,05 Однако не было показано достоверных различий при данном уровне значимости, поэтому данные представлены в виде средних значений + стандартное отклонение среднего

Необходимо отметить разную степень выраженности эффекта активации цитотоксической активности в условиях микрогравитации у различных доноров В ряде случаев отмечалось лишь незначительное повышение данного показателя от 2,5 до 25,8% у четырех обследуемых доноров В то же время в остальных шести случаях наблюдалось довольно существенное повышение циготоксического индекса в условиях космического полета по сравнению с наземным контролем (от 53,3% до 171,7%), что может свидетельствовать о весьма широких индивидуальных особенностях клеток -естественных киллеров различных доноров

Полученные данные подтверждаются данными литературы о высокой вариабельности показателей цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров, за счет которой осуществляются высокоэффективные механизмы внутренней адаптации и компенсации системы естественной цитотоксичносш [Чекнев С Б, 1997, Whiteside TL, Herberman RB, 1994, Smkovics JG, Horvath JC, 2005] Более того, вариабельность активности ЕК (индекс вариабельности, рассчитывающийся как отношение максимального отклонения к среднему значению циготоксического индекса) может служить высокочувствительной характеристикой состояния этой популяции лимфоцитов, так как в условиях развития патологических процессов, связанных с недостаточностью системы естественной цитотоксичносш, этот показатель существенно изменяется [Чекнев С Б, 2004]

Наземное моделирование условий микрогравитации методом клиностатировапия

Многочисленные исследования российских и зарубежных ученых подтверждают тот факт, что при моделировании условий микрогравитации различными методами при проведении экспериментов in vitro в клетках возникают изменения, сходные с теми,

которые обнаруживаются в условиях реального космического полета [Maccarrone М, Batosta N et al, 2003, Risso A, Tell G et al, 2005, Degan P, Sancandi M et al, 2005] Эксперименты с использованием клиностата были проведены на различных типах клеток, в том числе иммунокомпетентных При этом было показано снижение пролиферации клеток, изменение характера движения и перестройка цитоскелета [Буравкова Л Б, Романов Ю А и др, 2005, Cogoli А, Valluchi-Morf М, 1980, Cogoli А, 1993]

Нами было проведено исследование межклеточного взаимодействия при клиностатировании суспензии лимфоцитов и клеток К-562 на горизонтальном клиностате со скоростью вращения б об/мин в течение 24 часов В экспериментах использовались лимфоциты, выделенные из периферической крови 14 здоровых доноров

Было показано, что длительное изменение направления вектора гравитации ведет к увеличению цитотоксической активности ЕК (табл 5), но эффект был менее выражен по сравнению с изменениями, обнаруженными в условиях космического полета

Таблица 5

Сравнительный анализ цитотоксической активности лимфоцитов, выделенных из периферической крови 14 доноров

Донор Контроль Клиностат Шейкер % активации при клиностатировании

1 29,4 29,3 16,2 99,7

2 20,4 21 21,5 102,9

3 34,7 39,3 20,4 113,3

4 12,1 23 31,2 190,1

5 16,6 26,9 40,6 162,0

б 8,6 18,2 26,5 211,6

7 14,3 26,6 16,5 186,0

8 18 25,3 33 140,6

9 11,6 17,1 - 147,4

10 11,6 14,4 - 124,1

11 12,7 19,3 - 152,0

12 18,3 32,2 - 176,0

13 17,1 18 - 105,3

14 18,6 37,3 - 200,5

М+ш 17,4+7,1 24,9+7,6 25,7+8,7 150,8+38,2

Необходимо отметить, что у половины обследуемых доноров эффект активации цитотоксической активности после 24 часов клиностатирования составлял менее 25% от контрольного уровня У другой половины доноров повышение цитотоксической

активности лимфоцитов - естественных киллеров человека было весьма существенно и составляло от 52% до 111% При этом как контрольный исходный уровень цитотоксической активности широко варьировал (от 8,6 уел ед до 34,7 уел ед ), так и циготоксический индекс лимфоцитов, подвергнутых клиностатированию (от 18 уел ед до 39,3 уел ед) Также как и в условиях микрогравитации не было выявлено корреляции между контрольным уровнем цитотоксической активности лимфоцитов обследуемых доноров и степенью активации лимфоцитов при длительном клиностатировании (г =-0,57)

Важной особенностью проведенных исследований являлось наличие дополнительного динамического контроля для учета возможного воздействия перемешивания среды инкубации Для этих целей был использован шейкер, который также помещался вместе с пробами в СОг инкубатор В результате было показано, что такой дополнительный фактор в период взаимодействия с клетками-мишенями также ведет к повышению цитотоксической активности этих клеток, причем выраженность этого эффекта сопоставима с изменениями, происходящими на клиностате Эти данные получены для 8 различных доноров, у которых обнаруживается широкая вариабельность данного показателя (от 16,2 уел ед до 40,6 уел ед ) Хотя в ряде случаев было отмечено, что при относительно высоком индексе цитотоксичности при длительном клиностатировании, данный показатель не изменялся на шейкере по сравнению со статическим контролем

Изучение продукции интерлейкинов суспензией лимфоцитов в условиях измененной гравитации.

Хорошо известно, что при взаимодействии лимфоцитов с чужеродными клетками активируется синтез широкого спектра интерлейкинов [Ярилин А А, 1997, 1999, Фрейдлин И С, 2001, Рязанцева Н В, Новицкий В В , 2006] При исследовании синтеза интерлейкинов суспензией лимфоцитов была отмечена широкая вариабельность этого показателя у различных доноров Причиной этого можно считать индивидуальные особенности и различное функциональное состояние лимфоцитов различных доноров, однако данные особенности продукции интерлейкинов можно отнести также к различным условиям хранения проб после проведения полетных экспериментов Далее представлены результаты исследования синтеза цитокинов (ЮТ-а, 1Ь-1а и !Ь-6) суспензией лимфоцитов здоровых доноров после экспозиции в условиях микрогравитации (табл 6), а также при длительном (24 часа) клиностатировании

Таблица 6

Содержание ТЫБ-а, 1Ь-1а и 1Ь-6 в среде инкубации после взаимодействия ЕК с

Интерлейкин контроль полет клиностат

ЮТ-а 90,9+58,2 84,8+46,2 155,5+98,2

1Ь-1а 28,1+29,2 9,4+4,5 30,6+34,8

1Ы5 1453,9+505,8 1421,9+489,5 1104,7+127,2

Из данных таблицы 6 следует, что микрогравитация в полетных экспериментах, а также длительное изменение вектора гравитации в наземных исследованиях разнонаправлено влияют на продукцию цитокинов суспензией лимфоцитов Приведенные данные не позволяют сделать однозначное заключение о влиянии микрогравитащи на продукцию цитокинов суспензией лимфоцитов Эта функция очень индивидуальна для лимфоцитов различных доноров, причем абсолютное значение содержания ЮТ-а, 1Ь-1а и 1Ь-6 в среде культивирования после взаимодействия также колеблется в широких пределах

Индивидуальные особенности цитотоксической активности лимфоцитов одного донора в различных экспериментах

В полетных экспериментах, проводившихся на борту МКС-9 - МКС-13 были использованы лимфоциты, выделенные из периферической крови одного и того же донора Поскольку эксперимент проводился с четкой периодичностью весна-осень, представляется интересным проанализировать индивидуальные особенности лимфоцитов-естественных киллеров в зависимости от сезона, а также оценить изменение субпопуляционного состава суспензии лимфоцитов, их цитотоксической активности и продукции интерлейкинов в течение длительного периода (2,5 года) при проведении пяти независимых экспериментов

С помощью проточной цитофлуориметрии было показано, что жизнеспособность изолированных лимфоцитов данного донора на 4-5 сутки после выделения, т е на момент проведения эксперимента на борту МКС, всегда оставалась высокой и составляла не менее 90% жизнеспособных клеток от общего числа лимфоцитов в суспензии Данный показатель не претерпевая изменений во всех проведенных экспериментах

Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов на протяжении двух с половиной лет, дважды в год показал стабильность в соотношении популяций лимфоцитов у здорового донора (табл 7)

Таблица 7

Субпопуляционный состав лимфоцитов донора, измеряемый на протяжении 2 5 лет, _дважды в год_

Субпопуляции лимфоцитов Нормальные значения МКС-9 апрель 2004 г МКС-10 октябрь 2004 г МКС-11 апрель 2005 г МКС-12 октябрь 2005 г МК-13 март 2006 г

Т- лимфоциты (СОЗ+/СШ9-) 550 - 880 73 2 74 6 69 1 67 2 77 9

В-лимфоциты (С03-/С019+) 5 0-190 53 80 67 57 60

Т-хелперы (СБЗ+/С04+) 31 0-51 0 47 2 48 3 44 6 42 5 52 5

Т-супрессоры/цитотокс (СОЗ+/СШ+) 120-300 22 6 20 6 21 8 22 3 240

"ЫК-клетки (СВЗ-/СВ16+/С056+) 6 0 - 20 0 12 8 10 0 180 165 10 2

Т-МК клетки (СИЗ+ЛХ) 16+/С056+) 00-50 17 23 38 33 49

Т- лимфоциты актив (СОЗ+/НЬАЛЖ+) 00-120 07 1 0 24 14 2 1

Количество Т- и В-клеток изменялось на 10,7% (от 67,2% до 77,9%) и 2,7% (от 5,3% до 8,0%) соответственно, но оставалось в пределах клинической нормы Можно отметить также некоторое колебание количества Т-КК субпопуляции клеток (от 1,7% до 4,9%), а также изменение количества ШС-клеток в суспензии лимфоцитов (от 10,0% до 18%) Изменения в содержании популяций иммунокомпетентных клеток не коррелировали между собой Не было обнаружено также и значимых сезонных колебаний При изучении цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров учитывался их процент от общего числа клеток в суспензии, а также анализировалась степень изменения цитотоксического индекса в условиях микрогравитации (Таблица 8)

Таблица 8

Цитотоксическая активность лимфоцитов-естественных киллеров донора,

Период NK-клеток, % Индекс цитотоксичности Активация, %

контроль полет

Март 2004 г 12 8 25 0 442 176 8

Октябрь 2004 г 10 0 26 5 315 1189

Март 2005 г 18 0 157 16 1 102 5

Октябрь 2005 г 16 5 184 28 2 153 3

Март 2006 г 10 2 261 27 7 1061

М+т 13 5+3 0 22 3+4 2 29 5+6 6 131 5+26 8

Можно отметить, что у данного донора подтвердилась выявленная в результате проведенных полетных экспериментов тенденция к увеличению цитотоксического индекса в условиях космического полета в среднем на 30% по сравнению с наземными контрольными пробами, однако степень выраженности этого эффекта широко варьировала (от 102,5% до 176,8%)

Статистический анализ показал наличие обратной корреляции между числом МС-клеток в суспензии лимфоцитов и уровнем циготоксической активности в наземных условиях у данного донора (коэффициент корреляции составлял -0,97) Данную зависимость можно объяснить компенсаторным увеличением функциональной активности лимфоцигов-естественных киллеров при сокращении их количества в суспензии лимфоцитов, позволяющим сохранять цитотоксические способности этих клеток на высоком постоянном уровне При этом не наблюдалось зависимости между количеством КК-клетох и циготоксической активностью этих клеток в условиях микрогравитации (г=-0,52), а также процентом активации (1=0,07) Степень активации не зависела от контрольного наземного уровня цитотоксической активности (г=0,12)

При анализе синтеза ингерлейкинов суспензией лимфоцитов учитывалось содержание Т-лимфоцитов и В-клеток в суспензии, так как исследуемые цитокины могли синтезироваться данными субпопуляциями лимфоцитов Данные, представленные в таблице 9, отражают проведенные в течение трех полетных экспериментов исследования содержания ингерлейкинов в среде культивации после взаимодействия лимфоцитов и клеток-мишеней

Таблица 9

Изменение содержания ингерлейкинов в среде культивации в условиях

микрогравитации и при клиностагировании__

% NK-cells %Т-cell %В-cell TNF-o IL-la IL-6

полет клин полет клин полет клин

мке- 9 12,8 73,2 5,3 +56,4% - +28,3% - +20,6% -

мкс-10 10,0 74 6 8,0 +2,9% +91,1% +22,6% +29,0% -20,7% -18,4%

мкс-п 18,0 69,1 6,7 +5,8% +71,8% -84,4% +16,0% -6,3% -9,8%

М±ш 13,6+ 2,9 71,2+ 2,1 6,7+ 0,9 +21,7% +81,5% -11,2% +22,5% -2,1% -14,1%

Лимфоциты одного донора проявляли различную функциональную активность, выражающуюся в продукции ряда цигокинов Была выявлена широкая вариабельность изменения уровня ингерлейкинов (TNF-a, IL-la, IL-6) в полетных условиях и при клиностатировании по сравнению с наземным контролем Показано также неоднозначное влияние микрогравигации на синтез IL-4 и IL-2

Стимуляция цитотоксической активности интерпейшном-2 в наземных модельных экспериментах.

Исследование влияния IL-2 на цитотоксическую активность лимфоцигов-естественных киллеров проводилось в рамках программы лабораторно-отработочных испытаний полетного эксперимента по изучению влияния биологически активных веществ на межклеточные взаимодействия культуры лимфоцитов человека и

перевиваемой суспензионной культуры клеток линии К-5 62 и условиях мiispoгравитации с использованием составных частей укладки «ФИБРОБЛЛСТ- IM». Результаты исследования цитотоксической активности лимфоцитов 5 различных донор™ в наземных модельных экспериментах с использованием клнпостата показали, что под влиянием IL-2 происходит увеличение иитотоксического индекса в клипостатируемых культурах в средней lia 40% от контрольного уровня, при этом в контрольных культурах цитотоксическая активность повышалась в среднем на 33%. То есть, по усредненным данным не выявлено существенного усиления цитотоксической активности лимфоцитов -естественных киллеров при культивировании в присутствии данного нитокнна Следует отметить, что лимфоциты, выделенные из периферической крови различных доноров чрезвычайно разнообразно отвечали на стимуляцию IL-2

Эксперимент SKA по программе A U8IK (ESA)

Полетный эксперимент NKA (Natural Killer cell Activity), включенный в программу KUBIK Европейского космического агентства, был разработан на основании ранее проведенной на борту Международной космической станции серии экспериментов «Межклеточное взаимодействие». Схема эксперимента была практически аналогична, однако основное отличие состояло в том. что с использованием бортовой аппаратуры KUBIK (Рис. 3), в состав которой входила центрифуга, появлялась возможность дополнительного 1« контроля на борту МКС.

Рис. 3 Вортовая аппаратура K.UBIK и схема размещения кассет внутри.

Эксперимент NKA проводился в кассетах «Cytokmc» (фирмы Comal), состоящих из 6 ячеек для суспензии лимфоцитов н 6 - для клеток-мишеней линии К-562 каждая После объединения суспензий клеток И совместной инкубации в течение 24 часов клетки осаждались па специальные фильтры, а супсрнатант собирался в отдельную камеру для последующего анализа содержания шггокинов.

Начальный этап полетного эксперимента NKA в аппаратуре KUBIK (сборка и заполнение кассет «Cytokine» биологическим материалом) был проведен в лаборатории Байконура в период с 27 марта 2006 г по 29 марта 2006 г В эксперименте использовали 6 кассет «Cytokine» Кассеты были заправлены лимфоцитами, выделенными из периферической крови двух здоровых доноров, в соответствии со стандартной схемой 1-ая и 2-ая ячейки - донор 1, 3-я и 4-я - донор 2, 5-я и 6-я - клетки К-562 + среда Аналогично были заправлены еще 4 кассеты «Cytokine», использовавшиеся впоследствии в качестве дополнительного наземного контроля и для исследования влияния клиностатирования на циготоксическую активность лимфоцитов — естественных киллеров Все полетные кассеты после заправки и герметизации успешно прошли тест на утечку биологического материала при понижении давления до 289 mbar, т е приблизительно до 220 ммртст (время экспозиции составляло 10 минут)

Полетный эксперимент «NKA» был выполнен на Международаой космической станции российским космонавтом командиром экипажа МКС-13 1 и 2 апреля 2006г В первый день проведения эксперимента на борту все процедуры были выполнены в соответствии с циклограммой, согласно штатному расписанию При выполнении процедур второго дня, т е при завершении совместного культивирования лимфоцитов и клеток-мишеней и осаждения клеток на фильтры, космонавтом было отмечено затруднение процесса фильтрации, что сопровождалось появлением капель жидкости на поверхности кассет В связи с этим фактом после возвращения кассет было дополнительно произведено измерение объемов жидкостей, находящихся в ячейках после прохождения суспензии клеток через фильтры, для оценки произошедшей утечки Индекс ципготоксичносш рассчитывался с учетом измеренных объемов ^

При исследовании жизнеспособности суспензии лимфоцитов было показано, что жизнеспособность лимфоцитов на момент проведения эксперимента сохранялась на высоком уровне и составляла 87,2% и 93,1% для первого и второго донора соответственно Изучение субпопуляционного состава суспензии лимфоцитов проводилось в контрольных пробах, как до объединения клеточных суспензий, так и после совместного культивирования лимфоцитов и клеток-мишеней

Из данных таблицы 11 следует, что после взаимодействия лимфоцигов-естественных киллеров и клеток-мишеней происходит значительное снижение процента NK-клеток в суспензии Однако наиболее вероятным объяснением этого факта представляется то, что часть этих клеток находится на разных этапах взаимодействия с клетками-мишенями, образуя коньюгаты Данные образования, очевидно, больше по

размеру единичных клеток, а также, возможно, изменяют свою антигенную структуру, вследствие чего затруднено их детектирование с помощью проточной шлофлуориметрии.

Таблица 11.

Субпопуляцнонный состав суспензии лимфоцитов до и после совместного _культивирования лимфоцитов и клеток-мишеней. ______

Сублопуляцни лимфоцитов Нормальные значения Донор 1 Динор 2

Лимф. Лимф. +К-562 Лимф. Лимф. +К-562

Т-лимфоцяты (С03+/С019-) 55.0-88.0 77,9 72.3 80. й 52.5

В- лимфоциты (С 03-/СО 19+) 5.0— 19.0 6.0 5.9 6.4 8.8

Т-хелперы (СОЗ+/СЦ4+) 31.0-51 0 52.5 52.7 553 29 8

Т- суп рессо ры/н итого ке. (СШ+/С08+) 12.0-30 0 24.0 227 21.7 13.1

МК-клетки (С03-/С016+/С056+) 6.0-20 0 10.2 6.8 5,4 0,9

Т-МК клетки (СО 3+/СО1 6+/СЦ5 6+) 0 0-5.0 4.9 ¡.0 3,0 0.7

Т- лимфоциты актив. (СЩ+/НЬА-ЭК+) 0.0- 12.0 2.1 2.0 0.6 2.8

Изучение цитотоксической активности лимфоцитов двух доноров проводилось наряду с оценкой содержания фактора некроза опухолей в культур алы! ой среде и

представлено на рис. 4

Рис.4. Цитогоксическая акл-ивнослъ лимфоцитов и содержание фактора некроза опухолей в культуралыюй среде

Таким образом, в проведенном эксперименте «ККА» были подтверждены полученные ранее в серии экспериментов «Межклеточное взаимодействие» данные о том. что фактор микрогравитации не оказывает ингнбирующето воздействия на функциональную активность лимфоцитов - естественных киллеров. Возможно, даже

увеличение цитотоксического индекса в условиях космического полета Следовательно, снижение функций системы естественной цитотоксичности, обнаруженное при длительных и кратковременных полетах у космонавтов и астронавтов [Лесняк АТ, Рыкова М П и др, 1998, КопвгапПпоуа IV, РисИв В В , 1991, МеэЬкоу И О, Яукоуа М Р, 1995], скорее всего, вызвано влиянием других многочисленных факторов космического полета или опосредовано влиянием системных факторов Более того, в наших исследованиях была выявлена тенденция к повышению цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров, выделенных из периферической крови здоровых доноров, против клеток-мишеней линии К-562 К сожалению, механизм данного явления остается невыясненным Очевидно, что продукция цитокинов в условиях микрогравитации не влияет на данный процесс, так как не было выявлено корреляции между содержанием цитокинов в среде культивации после взаимодействия и эффектом активации цитотоксической активности в условиях космического полета Вероятно, что в условиях космического полета, а также при постоянном изменении вектора гравитации (клиностатировании) клетки не оседают под влиянием гравитации, а постоянно находятся во взвешенном состоянии, за счет чего облегчается процесс контакта лимфоцита -естественного киллера с клеткой-мишенью Косвенным подтверждением данного предположения является тот факт, что в проведенных нами исследованиях с использованием динамического контроля (шейкера), было обнаружено повышение цитотоксической активности сопоставимое с увеличением данного показателя при клиностатировании В обоих случаях имело место постоянное перемешивание среды, что, вероятно, облегчает процесс распознавания клеток-мишеней лимфоцитами и установление межклеточных контактов при данном соотношении эффектор мишень (10 1)

Созданная на базе укладки «Фибробласг-1» модифицированная укладка «Фибробласг-1М», предназначенная для изучения влияния биологически активных веществ, в частности, интерлейкина-2, на межклеточные взаимодействия культуры лимфоцитов человека и перевиваемой суспензионной культуры клеток линии К-562 в условиях микрогравигацш позволит более детально изучить воздействие микрогравигации на контактное взаимодействие ЕК с клетками-мишенями в суспензионных клеточных культурах

выводы

1 Разработана методика и специальная укладка («Фибробласт-1») дня изучения цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров in vitro в условиях реального космического полета с использованием культуры лимфоцитов человека и опухолевых миапобластов линии К-562

2 Лимфоциты ЕК, выделенные из периферической крови человека, сохраняли способность распознавать и контактировать с клетками-мишенями (миелобласгы линии К-562) в суспензии во время инкубации в условиях микрогравитации и реализовать свой цитотоксический эффект при взаимодействии с высокоспецифическими клетками-мишенями

3 В условиях микрогравитации показана тенденция к повышению цитотоксичносга ЕК клеток человека при их инкубации ш vitro с клетками К-562 Выявленные отличия в степени активации лимфоцитов доноров могут зависеть от исходных потешщальных возможностей клеток - естественных киллеров и индивидуальных особенностей донора

4 При моделировании условий микрогравитации методом клиностатирования показана сходная тенденция к увеличению цитотоксического индекса лимфоцитов по сравнению с контрольными пробами, но менее выраженная, чем в условиях микрогравитации

5 Изучение продукции цитокинов суспензией лимфоцитов показало, что условия микрогравитации оказывают неоднозначное влияние на изменение уровня цитокинов (TNF-a, IL-la, IL-2, IL-4, IL-6) у различных доноров

6 Эксперименты, проведенные в условиях микрогравитации с применением lg контроля на борту МКС в рамках программы KUBK (ESA), по изучению цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров ш vitro подтвердили полученные ранее данные о том, что микрогравитация не ингибирует функциональную активность ЕК лимфоцитов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Cell interactions m microgravity cytotoxic effects of natural killer cells in vitro // Journal of Gravitational Physiology, 2004, Volume 11 №2, P-177-180 (co-autors L Buravkova, M Rykova, E Andropova)

2 Использование проточной цитофлуориметрии для выявления изменений популяций лимфоцитов II Тезисы докладов Конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященной Дню космонавтики Москва, 2004, сгр 10-11

3 Модификация метода изучения дитотоксической активности лимфоцитов-есгеетвенных киллеров для полетных экспериментов в космосе // Авиакосмическая и экологическая медицина, 2005, №1, стр 55-59 (соавт Л Б Буравкова, М П Рыкова, Е Н Антропова)

4 Cytotoxic activity of NK lymphocytes in vitro under microgravity // Journal of Gravitational Physiology, 2005, Volume 12 №1, P-173-174 (co-autors L Buravkova, M Rykova)

5 Cell-to-cell interactions in changed gravity ground-based and flight experiments // Acta Astronáutica, 2005, Volume 12, P-67-74 (co-autors L Buravkova, Yu. Romanov, M Rykova, N Merzbkina)

6 Результаты полетного эксперимента «Межклеточное взаимодействие» (МКС-7 -МКС-11) // Тезисы докладов 6-ой международной научно-практической конференции «Пилотируемые полеты в космос» Звездный городок, 2005, сгр 117-118 (соавт Л Б Буравкова, М П Рыкова)

7 Изучение цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров в условиях измененной гравитации // Тезисы докладов Конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов Москва, 2005, стр 15-1

8 Межклеточное взаимодействие иммунных клеток и клеток-мишеней in vitro в условиях микрогравитации (МКС-7 - МКС-12) // Тезисы докладов 13-ой конференции ((Космическая биология и авиакосмическая медицина» Москва, 2006, стр 84-86 (соавт МП Рыкова,Л Б Буравкова)

9 The effects of microgravity on interaction between human immune cells and target cells in vitro (flight experiments during ISS-7 - ISS-12 missions // Abstract book Science on European Soyuz Mission to the International Space Station (2001-2005), Toledo (Spam), 2006, P-20 (co-autors L Buravkova, M Rykova)

Подписано в печать 05 10 2007 г Исполнено 05 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ №831 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 \vw\v аиюге!ега1 ги

В результате проведенных многолетних исследований на космических кораблях и орбитальных станциях было установлено, что космические полеты оказывают существенное влияние на функциональное состояние всех систем организма человека [Газенко О.Г., 1984; Григорьев А.И., 2001; Moore D., Bie Р. et al., 1996]. В том числе, в этих условиях и система иммунитета подвергается воздействию факторов, негативно сказывающихся на резистентности организма человека к различным инфекционным агентам [Константинова И.В., 1988; Мешков Д.О., 2001; Konstantinova I.V., Fuchs В.В., 1991; Sonnenfeld G., Shearer W.T., 2002]. Исследование иммунной системы космонавтов после завершения полетов различной продолжительности выявило ряд изменений функциональных свойств и количества иммунокомпетентных клеток. Так, воздействие микрогравитации проявлялось качественными и количественными сдвигами в популяциях клеток белой крови, включая нейтрофилию, эозинопению и лимфоцитопению [Taylor G.R., Dardano J.R., 1983; Cogoli A., Tschopp P., 1985; Kaur I., Simons E.R. et al., 2004; Stowe R.P., Sams C.F. et al., 1999].

Наиболее существенным изменениям в условиях космического полета подвергается клеточный иммунитет человека, ответственность за который несут Т-лимфоциты, осуществляющие прямой контакт с чужеродными антигенами и разрушающие их. Исследования, проведенные после длительных космических полетов, позволили выявить ряд закономерностей в изменениях Т-системы иммунитета [Константинова И.В., 1988; Kimzey S.L., 1977; Konstantinova I.V., Sonnenfeld G. et al., 1991]. Было, в частности, показано, что воздействие факторов космического полета приводит к снижению митоген-индуцированной пролиферативной активности лимфоцитов (ФГА-реактивности) - одного из основных показателей функционального состояния Т-клеток. У части космонавтов отмечали также снижение количества этих клеток в периферической крови

Константинова И.В., 1972; Leach C.L., Rambaut P.C., 1974; Kimzey S.L., 1977; Taylor G.R., 1993]. Эксперименты in vitro подтвердили, что микрогравитация может сама по себе изменять функциональный статус Т-клеток, нарушая проведение сигнала и ремоделируя цитоскелет [Lewis M.L., Reynolds J.L. et al., 1991; Cogoli A., Bechler В., 1993].

B-клеточная система иммунитета, играющая ключевую роль в развитии гуморального иммунного ответа и вырабатывающая антитела -специфические белки (иммуноглобулины), способные обезвреживать возбудителей инфекционных заболеваний и их токсины, после длительных полетов претерпевала наименьшие изменения под воздействием условий микрогравитации. Об этом свидетельствовало отсутствие почти во всех случаях изменений суммарного содержания в крови популяции В-лимфоцитов [Konstantinova I.A., Fuchs В.В., 1991].

Снижение цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров было показано многими исследователями как после длительных космических полетов, так и после кратковременных экспедиций [Vorobyov Ye.I., Gazenko O.G. et al., 1983; Konstantinova I.V., Sonnenfeld G. et al., 1991; Konstantinova I.V., Rykova M.P. et al., 1993; Mehta S. K., Kaur I. et al., 2001]. Отмечена высокая степень вариабельности данного показателя у различных космонавтов (астронавтов), однако тенденция к снижению была явно выражена после завершения космического полета. Анализ системы естественных киллеров позволил установить, что в результате воздействия факторов космического полета угнетаются такие функции, как способность распознавать и образовывать конъюгаты с клетками-мишенями, способность к повторным взаимодействиям с чужеродными клетками, а также интегральная цитотоксическая активность популяции естественных киллеров [Константинова И.В., 1988; Мешков Д.О., 1989; Лесняк А.Т., Рыкова М.П. и др., 1998]. Такие изменения могут явиться пусковым фактором не только для развития злокачественных новообразований, но и заболеваний инфекционной, в первую очередь, вирусной природы у космонавтов, как во время космического полета, так и после его завершения, поскольку лимфоциты - естественные киллеры (ЕК) являются первой линией обороны против инфекционных агентов и трансформированных клеток [Herberman R.B., Ortaldo J.R., 1981]. Лимфоциты данной субпопуляции распознают и убивают некоторые опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусом, а также соматические клетки при нарушении их цитодифференцировки без предварительной сенсибилизации.

Основу механизма взаимодействия лимфоцитов - естественных киллеров с клетками-мишенями, согласно современным представлениям, составляет распознавание "потерявших себя клеток", под которыми подразумеваются клеточные мишени с нарушениями структуры или экспрессии классических и неклассических молекул главного комплекса гистосовместимости I класса (МНС-1) [Ljunggren H.G., Karre К., 1990; Trinchieri G., 1994; Yokoyama W.M., 2002]. Было установлено, что названные молекулы вступают во взаимодействие с особыми рецепторами, присутствующими на мембране ЕК и определяющими как подавление, так и активацию эффекторных функций этих клеток [Warren H.S., Campbell A.J. et al., 2001; Ying H.Y., Shen X. et al., 2000]. В результате возникает баланс активирующих и ингибирующих сигналов, следствием которого является функциональное состояние ЕК в каждый конкретный момент.

Однако, несмотря на интенсивно проводимые исследования системы естественной цитотоксичности, многие механизмы ее иммунорягуляторных и цитотоксических эффектов остаются во многом неясными. Исследование влияния микрогравитации на лимфоциты - естественные киллеры in vitro позволяет приблизиться к более глубокому пониманию процессов взаимодействия этих иммунокомпетентных клеток с клетками-мишенями и выяснению механизмов изменений в системе иммунитета, регистрируемых после космического полета.

Цель работы:

Исследование влияния микрогравитации на межклеточное взаимодействие лимфоцитов человека и клеток-мишеней in vitro.

Основные задачи исследования:

1. Разработать метод и бортовую укладку для определения цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров периферической крови человека применительно к условиям космического полета на борту Международной космической станции.

2. Определить влияние микрогравитации на цитотоксичность лимфоцитов - естественных киллеров in vitro при совместном культивировании с клетками К-562.

3. Исследовать влияние клиностатирования на взаимодействие лимфоцитов - естественных киллеров с клетками-мишенями.

4. Изучить продукцию цитокинов суспензией иммунокомпетентных клеток при взаимодействии с клетками линии К-562 в условиях измененной гравитации.

5. Разработать бортовую укладку для оценки влияния биологически активных веществ (в частности, IL-2) на межклеточные взаимодействия культуры лимфоцитов человека и культуры клеток линии К-562 в условиях космического полета.

Научная новизна работы.

Впервые проведено изучение цитотоксической активности изолированных лимфоцитов - естественных киллеров периферической крови человека in vitro в условиях космического полета на борту Международной космической станции. Показано, что микрогравитация не подавляет межклеточные взаимодействия лимфоцитов и клеток-мишеней, в качестве которых использовалась суспензионная линия человеческих эритролейкемических лимфобластоидных клеток К-562.

Полученные результаты анализа синтеза цитокинов изолированными иммунокомпетентными клетками, экспонированными в условиях микрогравитации, при совместном культивировании с клетками-мишенями показали, что условия микрогравитации оказывают разнонаправленное действие на изменение уровня цитокинов (TNF-a, IL-la, IL-2, IL-4, IL-6) у различных доноров.

Практическая и научная значимость работы.

Проведенные исследования позволили разработать новый подход к исследованию роли регуляторных стимулов в функционировании иммунокомпетентных клеток in vitro в условиях микрогравитации. Результаты работы дополняют теоретические представления о влиянии условий микрогравитации на межклеточные взаимодействия лимфоцитов-естественных киллеров и клеток мишеней линии К-562. Полученные данные позволяют обосновать методологические подходы к исследованию состояния противовирусного иммунитета космонавтов непосредственно во время космического полета, что является основанием для разработки средств медицинского контроля на различных этапах длительных экспедиций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В результате лабораторных испытаний и проведенных полетных экспериментов показана возможность использования и эффективность применения модифицированного метода изучения цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров in vitro и разработанной укладки («Фибробласт-1») для проведения исследований межклеточного взаимодействия в условиях космического полета.

2. В условиях микрогравитации функциональная активность лимфоцитов - естественных киллеров, выражающаяся в способности к цитолизу клеток-мишеней при совместном культивировании в течение 24 часов и продукции ряда цитокинов, не угнетается, более того, наблюдается тенденция к увеличению цитотоксической активности in vitro в условиях реального космического полета.

3. Выявлены широкие индивидуальные различия в профиле продукции цитокинов суспензией лимфоцитов in vitro различных доноров, а также в степени активации цитотоксической активности при клиностатировании и в условиях микрогравитации (от 2,5% до 171,7%).

Апробация работы и публикации.

Основные результаты и положения работы были доложены и опубликованы в материалах III и IV Конференции молодых ученых, специалистов, аспирантов и студентов, посвященных дню космонавтики (Москва, 2004, 2005); 6-ой международной научно-практической конференции «Пилотируемые полеты в космос» (Звездный городок, 2005); 13-ой конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» (Москва, 2006); 55th International Astronautical Congress (Канада, Ванкувер, 2004); International Society of Gravitational Physiology (ISGP) Joint Life Science Conference (Германия, Кельн, 2005); Science on European Soyuz Mission to the International Space Station (2001-2005) ESA Conference (Испания, Толедо, 2006).

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол №9 от 7 сентября 2007 г.)

выводы

1. Разработана методика и специальная укладка («Фибробласт-1») для изучения цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров in vitro в условиях реального космического полета с использованием культуры лимфоцитов человека и опухолевых миелобластов линии К-562.

2. Лимфоциты ЕК, выделенные из периферической крови человека, сохраняли способность распознавать и контактировать с клетками-мишенями (миелобласты линии К-562) в суспензии во время инкубации в условиях микрогравитации и реализовать свой цитотоксический эффект при взаимодействии с высокоспецифическими клетками-мишенями.

3. В условиях микрогравитации показана четкая тенденция к повышению цитотоксичности ЕК клеток человека при их инкубации in vitro с клетками К-562. Выявленные отличия в степени активации лимфоцитов доноров могут зависеть от исходных потенциальных возможностей клеток - естественных киллеров и индивидуальных особенностей донора.

4. При моделировании условий микрогравитации методом клиностатирования показано сходное увеличение цитотоксического индекса лимфоцитов по сравнению с контрольными пробами, которое было менее выражено по сравнению с результатами, полученными в космическом полете.

5. Изучение продукции цитокинов суспензией лимфоцитов человека показало, что условия микрогравитации оказывают неоднозначное влияние на изменение уровня цитокинов (TNF-a, IL-la, IL-2, IL-4, IL-6) у различных доноров.

6. Эксперименты, проведенные в условиях микрогравитации с применением lg-контроля на борту МКС в рамках программы KUBIK (ESA), по изучению цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров in vitro подтвердили полученные ранее данные о том, что микрогравитация не ингибирует функциональную активность ЕК лимфоцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В экспериментах проведенных в условиях космического полета, а также при обследовании космонавтов и астронавтов до и после экспедиций различной продолжительности, было показано угнетение функций иммунной системы человека, в том числе изменение количества и функции нейтрофилов, снижение цитотоксической активности NK-клеток, изменение продукции цитокинов (снижение синтеза интерлейкина-2 и интерферона-у), изменение фенотипа мононуклеаров периферической крови, изменение (снижение) пролиферации лимфоцитов, снижение реакции лимфоцитов в ответ на митогенный стимул, уменьшение количества лимфоцитов, уменьшение количества эозинофилов, изменение субпопуляционного состава суспензии лимфоцитов [Константинова И.В., 1988; Мешков Д.О., 1989; Лесняк А.Т., Рыкова М.П. и др., 1998; Taylor G.R., Dardano J.R., 1983; Cogoli A., Tschopp P., 1985; Kaur I., Simons E.R. et al., 2004; Stowe R.P., Sams C.F. et al., 1999]. Однако в условиях целостного организма трудно выявить влияние непосредственно фактора микрогравитации на функционирование иммунной системы, так как все наблюдаемые изменения могут быть опосредованы многоуровневой регуляцией, как нервной, так и гуморальной. Так стресс во время взлета и посадки, изоляция и другие стресс-индуцирующие факторы во время космического полета могут вызывать некоторые из этих эффектов. Стресс-гормоны, например, такие как кортизол, который повышается во время полета [Ларина И.М., 2001], как известно, влияют на продукцию гуморальных иммунных факторов и популяцию иммунных клеток, включая моноциты и лимфоциты.

Таким образом, для анализа механизмов клеточных эффектов исследования in vitro представляются перспективным направлением, так как позволяют выявить непосредственные эффекты воздействия микрогравитации на иммунные клетки, в частности, на лимфоциты человека. На иммунокомпетентных клетках in vitro также было показано негативное влияние микрогравитации на жизнеспособность клеток: увеличивалось количество апоптотических клеток по сравнению с наземным контролем [Lewis M.L., Reynolds J.L. et al., 1998], а также на проведение сигнала и организацию цитоскелета [Cogoli-Greuter М. et al., 1994; Schmitt D. A., Hatton J. P., 1996; Lewis M.L., Cubano L.A., 2001]. В результате проведенных нами исследований было показано, что сам по себе фактор микрогравитации не оказывал угнетающего влияния на функцию лимфоцитов - естественных киллеров и на продукцию цитокинов суспензией лимфоцитов in vitro. Кроме того, в эксперименте NKA, проведенном в рамках программы KUBIK (ESA) с использованием lg-контроля на борту МКС были подтверждены полученные ранее в серии экспериментов «Межклеточное взаимодействие» данные о том, что микрогравитации не снижает функциональной активности одной из важных субпопуляций лимфоцитов, являющихся важными факторами противовирусной и противоопухолевой защиты, особенно на ранних этапах иммунных процессов.

Более того, в наших исследованиях была выявлена тенденция к повышению цитотоксической активности лимфоцитов - естественных киллеров, выделенных из периферической крови здоровых доноров, против клеток-мишеней линии К-562. Величина этой активности не зависела от базальной цитотоксической активности и от количества ЕК лимфоцитов в популяции иммунокомпетентных клеток. Можно предположить, что продукция цитокинов в условиях микрогравитации не влияет на данный процесс, так как не было выявлено корреляции между содержанием цитокинов в среде культивации после взаимодействия и эффектом активации цитотоксической активности в условиях космического полета.

Исследование цитотоксической активности изолированных лимфоцитов крови человека при совместном культивировании с культурой клеток линии К-562 в присутствии биологически активных веществ с использованием укладки «Фибробласт-1М», вероятно, позволит перейти к более глубокому пониманию некоторых процессов, лежащих в основе межклеточных контактов в условиях невесомости. Также целесообразно было бы использование методов молекулярной биологии для уточнения механизмов данного процесса на молекулярном уровне, например, изучение в условиях микрогравитации тирозинкиназной активности.

Так как известно, что линия К-562 с ее чрезвычайно выраженной чувствительностью к литическому действию ЕК является МНС-1-негативной и, следовательно, не может быть источником ингибиторных сигналов [Ье ВоШеШег Р., Вагакопу1 А. & а!., 2002], соответственно единственным вариантом для увеличения цитотоксической активности является усиление активирующих сигналов, которые запускаются с участием тирозинкиназы 8ук. Механизм реализации этого эффекта непрямой, он связан со структурой иммунорецепторного тирозинсодержащего активирующего участка, включенного в состав гликолипидобогащенного мембранного комплекса, что приводит, в конечном счете, к росту тирозинкиназной активности на внутренней стороне мембраны и, как следствие, к мобилизации кальция, продукции эйкозаноидов и транскрипции генов, ведающих синтезом цитокинов [ТотасеНо Е., 01сезе Ь. е1 а!., 1998; СИепутзИ Н. е1 а1.,

2000].

Еще одна возможность, по которой цитотоксический индекс может увеличиваться в условиях микрогравитации, - это чисто «механическая» теория. Вероятно, что в условиях космического полета, а также при постоянном изменении вектора гравитации (клиностатировании) клетки не оседают под влиянием гравитации, а постоянно находятся во взвешенном состоянии, за счет чего облегчается процесс контакта лимфоцита -естественного киллера с клеткой-мишенью. Косвенным подтверждением этого является тот факт, что в проведенных нами исследованиях с использованием динамического контроля (шейкера), было обнаружено повышение цитотоксической активности сопоставимое с увеличением данного показателя при клиностатировании. В обоих случаях имело место постоянное перемешивание среды, что, вероятно, облегчает процесс распознавания клеток-мишеней лимфоцитами и установление межклеточных контактов при данном соотношении эффектор : мишень (10:1).

Представляет безусловный интерес возможность сопоставления результатов, полученных при исследовании лимфоцитов здорового человека в различных экспериментах, проведенных в течение трех лет. Было обнаружено, что высокая вариабельность функциональной организации системы естественной цитотоксичности человека проявляется не только на половом, возрастном и популяционных уровнях [Чекнев С.Б., 1998; 2004], но также показана на уровне отдельного индивидуума. При этом анализ субпопуляционного состава лимфоцитов на протяжении трех лет, дважды в год показал стабильность в соотношении популяций лимфоцитов у данного донора. Однако выявленная высокая изменчивость активности естественных киллеров служит проявлением действия механизмов, поддерживающих выраженную пластичность популяции ЕК, связанную с филогенетически закрепленным полиморфизмом рецепторных структур этих клеток, и обеспечивающих высокие компенсаторные возможности.

Созданная на базе укладки «Фибробласт-1» модифицированная укладка «Фибробласт-1М», предназначенная для изучения влияния биологически активных веществ, в частности, интерлейкина-2 на межклеточные взаимодействия культуры лимфоцитов человека и перевиваемой суспензионной культуры клеток линии К-562 в условиях микрогравитации, не только сохраняет все преимущества ранее разработанной модели, но и предоставляет дополнительные удобства для использования. Применение данной укладки в экспериментах в условиях реального космического полета позволит более детально изучить воздействие микрогравитации на контактное взаимодействие ЕК с клетками-мишенями в суспензионных клеточных культурах.