Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы кроветворения у бестимусных мышей

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ОД

ЛУКЬЯНОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА 2 В Ф[В ¡002

МЕХАНИЗМЫ КРОВЕТВОРЕНИЯ У БЕСТИМУСНЫХ МЫШЕЙ

14 00.16 - Патологическая физиология 03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 2002

Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете и Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН доктор медицинских наук

Гольдберг Е.Д. Жданов В.В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доктор биологических наук

Шерстобоев Е.Ю. Чердынцева Н.В.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физиологии СО РАМН (г. Новосибирск)

Защита состоится « »

2002 г. в

часов на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

Я

Автореферат разослан « / » 2002 г

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук

Амосова Е.Н.

г $г, у/2 о

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ БОЕ-Э - бурстобразукмцая единица эритроидиая БПЛ - бурстпромоторная активность ГО - гемопоэтический островок Г ИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагалышй колониестимулирующий фаетор ИЛ-3 (9) - интерлейкин 3 (9)

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-Ф - колониеобразующая единица фибробластоидная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидиая

КСА - колониестимулирующая активность

ЭПА - эритропоэтическая активность

Актуальность проблемы. Несмотря на значительное количество работ, доказавших наличие в гемопоэтической ткани разнообразных, отличающихся по степени коммитированности и пролиферативному потенциалу клеток-предшественников, специфические механизмы регуляции процессов их пролиферации и дифференцировки остаются во многом неясными [Чертков И.Л., Гу-ревич O.A., 1984].

Интересно, что сама по себе разработка методов клонирования гемопоэти-ческих клеток-предшественников привела к открытию нового типа регуляции в системе гемопоэза. Было отмечено, что на эффективность роста колоний из ге-мопоэтических клеток могут оказывать существенное влияние другие клеточные элементы, которые сами не производят клеток клона [Лурия Е.А., Фриден-штейн А.Я., 198); Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984; Metealf D., 1978]. Из этих наблюдений родилось целое направление в современной гематологии, изучающее роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза. В настоящее время можно считать доказанным, что во многом решающая роль в регуляции кроветворения на уровне стволовых кроветворных клеток принадлежит стро-малыюму микроокружению [Лурия Е.А., Фридениггейн А.Я., 1981; Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984; Chertkov J.L., Gurevitch O.A., Udalov G.A., 1980],

В то же время в последние годы в литературе накапливается все больше данных, указывающих на важную роль лимфоцитов тимического происхождения в контроле пролиферации, дифференцировки и миграции различных гемо-поэтических клеток-предшественников, в том числе стволовых кроветворных клеток [Головистаков И.Н., Петров Р.В., Хаитов P.M., 1970; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В., 1983; Гольдберг Е.Д., Карпова Г.В., Дыгай A.M., 1979; Козлов В.А., Колесникова С.М., 1979; Мелик-Гайказян Е.В., 1979; Петров Р.В., Хаитов P.M., Алейникова Н.В. и др., 1976; Петров Р.В., Хаитов P.M., Манько В.М. и др., 1981; Anfalova T.V., Khromykh L.M., et all, 1999; Cernv I, 1974; Cerny J Wagner E.B., Rubin A.S., 1975; Goodman J.W., Chervenak R.P., Shinpock S.G., 1978; Zinkemagel R.M., Althage A„ 1999].

К настоящему времени показана способность Т-лимфоцитов в определенных экспериментальных ситуациях (иммобилизационный стресс, цитостатиче-ские, лучевые воздействия) реализовывать свои регуляторные влияния на уровне коммитированных клеток-предшественников как непосредственно, так и путем взаимодействия с другими элементами ге.чопоэзиндуцируюшего микроокружения (ГИМ) [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1998, Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В., 1983]. Убедительные доказательства важной роли тимуса и лимфоцитов химического происхождения в регуляции костномозгового миелопоэза получены в опытах на животных, тимоктомированных в неонатальный период жизни и у взрослых животных. Удаление вилочковой железы у новорожденных животных сопровождается развитием так называемого wasting-синдромэ, характеризующегося тяжелыми трофическими и иммунными нарушениями. Обнаруживаются деструкция лимфоидных органов и лимфоцитов селезенки, атрофия лимфоузлов, развитие анемии и лимфопении [Миллер Д.Ж., Дукор П., 1967; Кемилева 3., 1984; Sharkis et all., 1980; Zipori D., Trainin N., 1975]. Удаление вилочковой железы у взрослых животных, как правило, не сопровождается развитием столь выраженных изменений со стороны миелопоэза, какие имеют место после операции, произведенной у животных в неонатальный период их жизни [Дыгай A.M., 1984; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В., 1983; Петров Р.В., Хаитов P.M., Алейников И.В., 1977]. Литературные же данные о механизмах влияния тимуса на кроветворение крайне немногочисленны и противоречивы.

В связи с этим прогресс в изучении указанной проблемы, по-видимому, невозможен без использования экспериментальных подходов, которые позволили бы по-новому оценить роль лимфоцитов в регуляции гемопоэза. В частности, целесообразно проведение сравнительного исследования особенностей кроветворения у мышей Nude, характеризующихся врожденным отсутствием вилочковой железы, и у мышей с удаленной вилочковой железой.

Цель исследования: сравнительное изучение особенностей кроветворения на моделях врожденного и приобретенного отсутствия вилочковой железы и вскрытие механизмов, лежащих в их основе.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние системы крови у мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы.

2. Вскрыть механизмы регуляции кроветворения у бестимусных мышей Nude.

3. Исследовать влияние тимэктомии на процессы кроветворения и их регуляцию.

4. Сравнить особенности гемопоэза у мышей с врожденным и приобретенным отсутствием вилочковой железы.

Научная новизна: В работе впервые проведено комплексное исследование системы крови у мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы (мыши Nude). Показано, что для мышей Nude характерно, с одной стороны, угнетение эритроидного и лимфоидного ростков гемопоэза, с другой активация грануло-моноцитопоэза. Выполненные эксперименты позволили вскрыть ряд механизмов регуляции гемопоэза у бестимусных мышей. В основе угнетения эритропо-эза в костном мозге у бестимусных мышей лежит снижение числа эритроидных гемопоэтических островков, а также снижение выработки эритропоэтической активности элементами ГИМ. В то же время в селезенке компенсаторно активируется эритропоэз, в результате чего развития анемии в периферической крови не наблюдается. Активация грануломоноцитопоэза является следствием повышения числа гранулоцитарных гемопоэтических островков в костном мозге. В работе также впервые проведено сравнительное исследование влияния вилочковой железы на кроветворение на моделях врожденного (мыши Nude) и приобретенного (тимэктомия) отсутствия тимуса. Установлено, что изменения гемопоэза в условиях врожденного отсутствия вилочковой железы охватывают больше отделов кроветворной ткани по сравнению с приобретенным, в последнем случае в большей степени задействованы механизмы «срочной» адаптации.

Практическая значимость. В результате проведенных экспериментов получены новые фундаментальные данные об особенностях механизмов гемопоэза у бестимусных мышей Nude. Выполненные исследования дополняют имеющиеся сведения о важной роли вилочковой железы и лимфоцитов тимического происхождения в регуляции функциональной активности элементов гемопоэзинду-цирующего микроокружения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 7 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает 221 источника, в том числе 129 отечественных и 92 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования выполнены на 105 мышах линии Balb/c 3-х месячного возраста, полученных из питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Из них 15 животных были гомозиготами по мутации пи (пи/пи) (Nude), 20 - гетерозиготами (+/пи) и 70 мышей линии Balb/c, не несущими му-тантный ген.

До начала экспериментальных животных выдерживали в течение недели на обычном пищевом рационе по 8-10 особей в пластиковых клетках. Операция по удалению вилочковой железы 25-ти немутантным мышам линии Balb/c была проведена в возрасте 2 мес. Забор материала для исследований осуществляли через 2 месяца после операции. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации позвоночника под эфирным наркозом.

Таблица 1

Распределение животных по сериям экспериментов

№ Серия эксперимента Количество животных

1 Изучение показателей периферической крови, селезенки, костного мозга, содержания кроветворных прекурсоров, структурно - функциональной организации костного мозга и уровней секреции гуморальных факторов клетками костного мозга у гомозиготных мышей Nude 15

2 Изучение показателей периферической крови, селезенки, костного мозга, содержания кроветворных прекурсоров, структурно-функциональной организации костного мозга и уровней секреции гуморальных факторов клетками костного мозга у гетерозиготных мышей Nude 20

3 Изучение показателей периферической крови, селезенки, костного мозга, содержания кроветворных прекурсоров, структурно-функциональной организации костного мозга и уровней секреции гуморальных факторов клетками костного мозга у немутантных мышей линии Balb/c 15

4 Изучение показателей периферической крови, селезенки, костного мозга, содержания кроветворных прекурсоров, структурно-функциональной организации костного мозга и уровней секреции гуморальных факторов клетками костного мозга у тимэкгомированных мышей линии Balb/c 25

5 Изучение показателей периферической крови, селезенки, костномого мозга, содержания кроветворных прекурсоров, структурно-функциональной организации ко-

стного мозга и уровней секреции гуморальных факторов клетками костного мозга у ложнотимэктомированных мышей линии Ва1Ь/с 10

6 Отработка операции тимэктомии на мышах линии Ва1Ь/с 20

Изучение показателей периферической крови и костного мозга осуществляли стандартными гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987].

Жизнеспособность кариоцитов определяли с помощью трипанового синего [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992].

Суспензию костномозговых нуклеаров из бедренной кости разделяли на прилипающую и неприлипающую фракции путем 40-минутной инкубации в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Количество гранулоцитомакрофагапьных (КОЕ-ГМ) и эритроидных (КОЕ-Э) коло-ниеобразующих единиц определяли методом клонирования неадгезирующих миелокариоцитов в метилцеллюлозе in vitro [Годьдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992]. Под колониями подразумевали образующиеся в полутвердой культуре клеточные агрегаты, содержащие более 50 кроветворных элементов.

Кондиционную среду клеток костного мозга получали инкубированием прилипающих, либо неприлипающих миелокариоцитов в жидкой культураль-ной среде при 37СС в течение 24 часов в атмосфере 5% С02 и 100% влажности. Тестирование колониестимулирующей (КСА) и эритропоэтической (ЭПА) активностей в супернатантах от клеток костного мозга осуществляли в условиях метилцеллюлозной культуры [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992].

Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем определения количественного и качественного состава гемопоэтических островков (ГО) [Crocker P.R., Gordon S„ 1985, Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992].

Весь полученный цифровой материал обрабатывали с помощью методов вариационной статистики [Лакин Г.Ф., 1973] с использованием пакета программ Statistica for Windows.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Проведенные исследования позволили обнаружить в первую очередь нарушения со стороны эритроидного ростка кроветворения у бестимусных мышей Nude. При этом в периферической крови животных данной линии количество эритроцитов и ретикулоцитов не отличалось от уровня аналогичного показателя у гетерозиготных мышей. Однако в костном мозге гомозиготных му-тантных мышей Balb/c было существенно снижено число эритроидных клеток. При этом резко падало содержание эритробластов (на 590 % в сравнении с их гетерозиготными сибсами и на 866 % - с немутантными животными), а также полихроматофильных нормобластов (на 143 и 224 % по сравнению с соответствующими контрольными группами). Но в то же время, количество эритроидных предшественников (КОЕ-Э) в костном мозге бедренной кости у бестимусных мышей значительно превышало аналогичные показатели у гетерозиготных мышей по мутантному гену пи, а количество эритроидных гемопоэтических островков было существенно снижено. Кроме этого, наблюдалось снижение обшей эритропоэтической активности (ЭПА) прилипающих миелокариоцитов костного мозга у бестимусных мышей Nude. Необходимо отметить также выраженное увеличение содержания эритроидных клеток в спленограмме бестимусных животных. У мутантных мышей этот показатель составлял 30,58±4,26, что на 70 % выше, чем у гетерозиготных и на 66 % - чем у немутантных мышей.

Анализируя вышеперечисленные результаты, следует отметить, что снижение секреции эритропоэтической активности клетками микроокружения костного мозга приводит к уменьшению количества эритроидных гемопоэтических островков и снижению выхода из них созревающих эритробластов и полихроматофильных нормобластов. Рассматривая факт увеличения числа эритроидных предшественников в костном мозге при одновременном снижении количества созревающих клеток эритроидного ряда можно сделать предположение о нарушении дифференцировки клеток в эритроне. Отсутствие достоверных изменений в содержании зрелых эритроцитов в периферической крови у мышей Nude на фоне подавления костномозгового эритропоэза может быть

связанно со стимуляцией процессов их образования в ткани селезенки, что мы и наблюдаем.

Таким образом, у мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы наблюдается картина угнетения эритропоэза в костном мозге и компенсаторная активация его в селезенке.

Известно, что лимфоциты тимического происхождения и тимоциты способны вырабатывать БПА (бурстпромоторную активность), стимулирующую процессы пролиферации и дифференцировки БОЕ-Э (эритроидная бурстобра-зуюшая единица) и другие цитокины, активирующие эритропоэз (ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-9) [Mangan K.F., Chikkappa G„ Scharfman W.B., Desforges J.F., 1981; Mangan K.F., Desforges J.F., 1980; Nathan D.G., Chess L., Hillman D.C. et all., 1978]. Кроме того, Т-лимфоциты посредством продукции целого ряда гуморальных факторов, а также за счет непосредственных межклеточных взаимодействий со стромальными клетками и макрофагами поддерживают способность последних активировать эритропоэз. Соответственно, выпадение у мышей Nude данного механизма контроля функций мононуклеарных фагоцитов, и приводило к снижению секреции последними эритропоэзстимулирующих факторов вследствие сокращения популяции клеток-продуцентов, а также к уменьшению образования эритроидных гемопоэтических островков. Таким образом, снижение числа Т-лимфоцитов в костном мозге мышей и обуславливает угнетение эритропоэза у бестимусных мышей линии Nude.

Еще одной характерной особенностью мышей Nude явились закономерные нарушения со стороны лимфоидного ростка. Так, обнаруженное снижение общего количества лейкоцитов в периферической крови бестимусных мышей было обусловлено значительным уменьшением содержания лимфоидных клеток. В костном мозге отмечалось резкое снижение содержания лимфоидных элементов как в сравнении с группой гетерозиготных животных, так и с животными без мутации. При подсчете спленограмм также было обнаружено падение доли лимфоидных клеток (больших и средних лимфоцитов) у мышей с врож-

денным отсутствием вилочковой железы по сравнению с величинами аналогичных показателей в контрольных группах.

Таким образом, гемопоэз у мышей с генотипом nu/nu характеризуется угнетением лимфоидного ростка во всех исследуемых кроветворных органах (костный мозг и селезенка). При этом снижение содержания в селезенке больших и средних лимфоцитов, без изменения содержания малых лимфоцитов, говорит о компенсаторном ускорении их созревания.

С другой стороны, обращало на себя внимание развитие у бестимусных животных гиперплазии гранулоцитарного и моноцитарного ростков гемопоэза, обусловленной увеличением числа как зрелых, так и незрелых форм клеток. Так, в костном мозге и селезенке повышалось содержание созревающих элементов моноцитарного ряда у атомических мышей по сравнению с гетерозиготными и немутантными животными. Следует заметить, что активации данного ростка костномозгового и селезеночного кроветворения соответствовало повышение содержания зрелых элементов в периферической крови.

В костном мозге бестимусных мышей Nude также было значительно увеличено количество сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов (на 270 % по сравнению с гетерозиготными и на 76 % - с немутантными животными), но достоверно снижено число миелобластов. Статистически значимой разницы с контрольными животными по содержанию клоногенных клеток- предшественников грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) выявлено не было, однако число клеток-предшественников фибробластов (КОЕ-Ф) у атимических мышей Nude было увеличено. Из особенностей селезеночного кроветворения обращало на себя внимание резкое повышение числа незрелых и зрелых нейтрофильных грану-лоцитов, а также количества плазматических клеток у бестимусных мышей по сравнению с контрольными группами. Однако в периферической крови не смотря на активацию гранулоцитопоэза в костном мозге и селезенке статистически значимой разницы в содержании нейтрофильных гранулоцитов обнаружено не было.

Изучение цитологических препаратов гемотоэтических островков показало, что формирование гранулоцитарных клеточных ассоциаций в костном мозге бестимусных мышей превышает таковое в группе гетерозиготных и не-мутантных животных. В то же время как общая, так и удельная колониестиму-лирующая активность (КСА) неприлипающих миелокариоцитов костного мозга снижалась у бестимусных мышей по сравнению с немутантными животными и с гетерозиготными мышами.

Таким образом, рассматривая состояние гранулоцитарного ростка костного мозга у бестимусных мышей в целом, можно отметить сниженную секрецию КСА неприлипающими миелокариоцитами и уменьшенное количество миелобластов, при неизменном содержании КОЕ-ГМ. Привлекает внимание тот факт, что количество созревающих элементов нейтрофильного ряда, начиная с промиелоцитов и заканчивая палочкоядерными лейкоцитами, не отличается от аналогичных показателей немутантных мышей, а содержание сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов резко увеличено.

По современным представлениям, развитие кроветворных клеток от ком-митировашшх до зрелых форм происходит в составе гемопоэтических островков [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 19994; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Захаров Ю.М. и др., 1990; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. и др., 1987; Захаров Ю.И., Мельников И.Ю., 1984; Лурия Е.А., Фриденштейн А.Я., 1981; Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Огава М., 1990; Трентин Д.Д., 1982; Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984]. Центральной клеткой гранулоцитарного гемопоэти-ческого островка является, как правило, фибробласг. Содержание фибробла-стоидных предшественников в костном мозге бестимусных мышей Nude возрастает, что и приводит к увеличению формирования гранулоцитарных гемопоэтических островков. Данное обстоятельство и лежит в основе феномена ускоренной дифференцировки гранулоцитарных предшественников, обеспечивающей накопление зрелых гранулоцитарных элементов в костном мозге.

По данным Bamberger E.G. с соавт. (1977) трансплантация тимоцитов бестимусным мышам Nude приводила к нормализации содержания лимфоцитов

в костном мозге и периферической крови. У получавших тимоциты мышей Nude отменялись нейтрофилия, эозинофилия и моноцитоз. При этом число гра-нулоцитарных колоний, образованных клетками костного мозга в агаре не отличалось от аналогичного показателя у атимических мышей. На этом основании авторы сделали предположение о том, что зрелые тимоциты могут производить факторы, которые влияют на процессы пролиферации и дифференци-ровки гранулоцитарных и моноцитарных клеток в кроветворных органах. По мнению других авторов, Т-лимфоциты также могут оказывать свое регулятор-ное влияние на гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы in vitro: как непосредственно, так и через продуцируемые гемопоэтины [Цыр-лова И.Г., Гайдуль К.В., Козлов В.А., 1984; Savary Ch., Lotzova Е., 1990]. Необходимо отметить, что такой контроль может быть не только положительным, но и отрицательным в зависимости от субпопуляции Т-клеток и от их функционального состояния.

В наших исследованиях также не наблюдается увеличение содержания гранулоцитарно-макрофагальных колоний (КОЕ-ГМ), но при этом происходит активация гранулоцитопоэза и моноцитопоэза в костном мозге и селезенке. Вероятно, в организме бестимусных мышей Nude присутствует фракция Т-лимфоцитов, которая может оказывать стимулирующее влияние в отношении отмеченных ростков кроветворения, но отсутствуют лимфоциты стимулирующие эритро- и лимфопоэз. Это подтверждается данными, полученными Jordan R.K. с соавторами (1977), которые обнаружили у мышей линии Nude небольшое содержание тета-положительных Т-клеток и доказали их внетимическое происхождение.

Быковская С.Н., Грунтенко Е.В. (1982) показали, что если поместить мышей Nude в безмикробные условия, то можно добиться существенного увеличения продолжительности их жизни. Следовательно, основной причиной гибели бестимусных мышей чаще всего являются инфекционные заболевания и их последствия. Это происходит из-за пониженного количества Т-лимфоцитов, обеспечивающих реакции клеточного иммунитета. В этой ситуации моноциты

и «ейтрофилы могут частично компенсировать недостаточность иммунной защиты организма.

Итак, выявляемые у мышей с наследственно обусловленным отсутствием вилочковой железы сдвиги со стороны миелопоэза подтверждают важную роль тимусного контроля пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток. Однако необходимо отметить, что вышеперечисленных данных явно недостаточно, чтобы сделать вывод о характере причинно-следственных отношений между выпадением функции тимуса и состоянием миелопоэза. Это обусловлено тем, что у мышей Nude имеет место развитие патологического синдрома, характеризующегося целым комплексом изменений со стороны различных органов и систем. В связи с этим для получения более определенного ответа на вопрос о роли выпадения функции тимуса в выявляемых сдвигах со стороны костномозгового и селезеночного гемопоэза, мы решили провести эксперименты на модели удаления вилочковой железы у взрослых животных.

Выполненные исследования позволили обнаружить, что удаление вилочковой железы у взрослых животных не сопровождается развитием столь выраженных нарушений со стороны миелопоэза, какие имеют место у мышей с врожденным отсутствием тимуса.

В костном мозге тимэктомированных животных уменьшалось содержание полихроматофильных нормобластов (на 66 % по сравнению с неопериро-ванными и на 115 % - с ложнотимэктомированными животными), остальные показатели не отличались от аналогичных показателей ложнотимэктомирован-ных и неоперированных мышей. В селезенке мышей с удаленным тимусом увеличивалось содержание эритроидных клеток по сравнению с неоперированными (на 77 %) и с ложнотимэктомированными животными (63 %).

У животных, подвергнутых тимэктомии, возрастало удельное и общее число КОЕ-Э в сравнении с неоперированными животными. Следует отметить и увеличение числа эритроидных гемопоэтических островков в костном мозге тимэктомированных мышей в сравнении с неоперированными животными. Кроме этого, общая ЭПА неприлипающих миелокариоцитов оказалась снижен-

ной в сравнении с неоперированными мышами, а общий уровень ЭПА прилипающих элементов костного мозга у тимэктомированных животных был уменьшен по сравнению с обеими группами контроля. Данный факт свидетельствует о выпадении Т-лимфоцитарных механизмов контроля функции макрофагов вследствие тимэктомии.

Отсутствие достоверных изменений в содержании зрелых эритроцитов в периферической крови у тимэктомированных мышей на фоне подавления костномозгового эритропоэза может быть обусловлено стимуляцией процессов их образования в кроветворной ткани селезенки.

При изучении лимфоидного ростка в кроветворных органах тимэктомированных животных не было выявлено существенных изменений в содержании лимфоцитов в сравнении с неоперированными и ложнотимэктомированными животными. Таким образом, тимэктомия у взрослых мышей не приводит к угнетению лимфопоэза в костном мозге и селезенке.

Нарушения миелопоэза при тимэктомии затрагивали и грануломоноци-тарный росток. Так, в периферической крови тимэктомированных животных повышалось содержание моноцитов по сравнению с ложнотимэктомированными и неоперированными мышами. Однако в костном мозге и селезенке признаки активации моноцитопоэза зафиксированы не были.

Так как активации моноцитопоэза в кроветворных органах при тимэктомии не происходит, но в то же время в периферической крови увеличивается количество клеток моноцитарного ряда, можно сделать предположение об увеличении продолжительности пребывания моноцитов в крови. Miller J. (1962) установил, что удаление тимуса у взрослых мышей приводит к снижению иммунологической реактивности. Следовательно, длительное пребывание моноцитов в периферической крови может быть связано с их недостаточным использованием в иммунных реакциях.

В костном мозге тимэктомированных мышей было обнаружено увеличение числа палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов по сравнению с аналогичными показателями в контрольных группах. Следует от-

метить, что отклонений величин показателей гранулоцитарного ростка в спле-нограмме от исходного уровня после проведения операции тимэктомии не обнаружено. Кроме этого, у мышей данной группы оказалось сниженным содержание костномозговых КОЕ-ГМ по сравнению с неоперированными животными. Однако величина данного показателя на 52 % превышала число гранулони-томакрофагалъных прекурсоров у ложнотимэктомированных мышей.

Изучение цитологических препаратов гемопоэтических островков показало, что основную долю структурно-функциональных единиц костного мозга тимэктомированных мышей составляют гранулоцитарные. Их количество резко превышало данный показатель при сравнении с соответствуюшими величинами у неоперированных и ложнотимэктомированных животных. Кроме этого, по сравнению с ложнотимэетомированными достоверно снижалось (на 125 %) число смешанных гемопоэтических островков.

Изучение секреторной активности клеток гемопоэзиндуцирующего микроокружения у тимэктомированных животных показало снижеЕше продукции миелокариоцитами костного мозга гемостимулирующих факторов. Так, общая КСА неприлипающих миелокариоцитов снижалась на 53 % по сравнению с неоперированными и на 45 % - с ложнотимэетомированными животными, а удельная КСА отличалась только от неоперированных животных, что в первую очередь свидетельствует об уменьшении содержания в костном мозге секре-торно активных Т-лимфоцитов.

Рассматривая картину гранулоцитопоэза в целом, нетрудно заметить, что снижение выработки колониестимулирующих факторов (КСА) непршшпаю-щими клетками костного мозга может быть причиной снижения содержания КОЕ-ГМ. В то же время не исключено, что изменение пула клеток-предшественников грануломоноцитопоэза связано с ускорением их созревания в условиях угнетения стимулирующих пролиферацию импульсов со стороны Т-лимфоцитов [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В., 1983; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999; Лурия Е.А., Фриденштейн А.Я., 1981; Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984]. В этом случае активная дифференцировка клоноген-

пых клеток за счет усиленного формирования гранулоцитарных гемолоэтиче-ских островков и является причиной накопления в костном мозге зрелых ней-трофилов (палочкоядерных и сегментоядерных).

Таким образом, вышеперечисленные данные свидетельствуют о том, что удаление вилочковой железы у экспериментальных животных изменяет активность продукции клеток практически всех ростков кроветворения.

Для того, чтобы оценить роль вилочковой железы в формировании системы кроветворения в процессе онтогенеза, мы сочли нужным сравнить группы . мышей с врожденным и приобретенным отсутствием тимуса.

Мыши, как с врожденным отсутствием тимуса, так и после тимэктомии, характеризуются одинаковой динамикой нарушений в системе эритрона. В обоих случаях наблюдается развитие депрессии эритропоэза в костном мозге (рис. 2), снижение секреции эритропоэтической активности (ЭПА) прилипающими клетками костного мозга (рис. 5) и компенсаторная активация образования эритроидных клеток в селезенке (рис. 6), благодаря чему анемия в периферической крови не развивается. Однако следует заметить, что угнетение эрит-роидного ростка в костном мозге мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы является более глубоким и не сопровождается повышением содержания эритроидных колониебразующих клеток, как в группе сравнения.

Таким образом, наличие изменений со стороны эритроидного ростка в кроветворной ткани мышей, как с врожденным, так и приобретенным отсутствием тимуса подтверждает важнейшую роль вилочковой железы в регуляции эритропоэза [Дыгай A.M., 1984]. Отсутствие тимического контроля при данных патологических состояниях и приводит к изменению функциональной активности костномозгового микроокружения в отношении эритропоэза. Но в то же время в организме существуют компенсаторные механизмы, которые направлены на устранение дефицита эритроидных клеток и распространяются на кроветворную ткань селезенки. Вероятнее всего, эти механизмы не подчиняются влиянию вилочковой железы, или наоборот, отсутствие тимуса растормаживает механизмы, повышающие эритропоэтическую активность стромы селезенки.

Еще одной характерной особенностью бестимусных мышей явилось развитие лимфопении (рис. 1) в периферической крови. По литературным данным у мышей обеих групп снижается иммунологическая толерантность [Быковская С.Н., Грутенко Е.В., 1982; Петров Р.В., Хаитов P.M., Алейникова Н.В. и др., 1976]. Однако, у мышей Nude дефицит лимфоцитов обусловлен более глубокими нарушениями в кроветворной ткани и затрагивает как костный мозг (рис. 2), так и селезенку (рис. 6). При тимэктомии этого не наблюдается. Поэтому можно сделать предположение, о том, что при тимэктомии изменяется только лим-фопоэз, а у мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы нарушается как лимфопоэз, так и иммуногенез.

У мышей Nude наблюдается активация моноцитопоэза в селезенке (рис. 6) и костном мозге (рис. 2), с последующим развитием моноцитоза в периферической крови (рис. 1), а у животных, подвергнутых операции тимэктомии, мо-ноцитоз развивается без активации моноцитопоэза в кроветворных органах, скорее всего за счет увеличения продолжительности жизни моноцитов крови в.

Активация гранулоцитарного ростка кроветворной ткани характерна как для мышей с врожденным, так и приобретенным отсутствием вилочковой железы. Однако, если у бестимусных мышей Nude усиление гранулоцитопоэза наблюдается в костном мозге (рис. 2) и селезенке (рис. 6), то у животных после операции тимэктомии - только в костном мозге (рис. 2), и значения соответствующих показателей изменяются в меньшей степени. Кроме этого, у тимэкто-мированиых мышей наблюдается снижение содержание клеток - предшественников типа КОЕ-ГМ и увеличение КОЕ-Ф в костном мозге (рис. 3) по сравнению с бестимусными мышами Nude. Еще одной особенностью животных, подвергнутых операции тимэктомии, можио назвать повышение содержания всех видов гемопоэтических островков (рис. 4) по сравнению с мутантными животными, что лежит в основе ускоренной дифференцировки кроветворных прекурсоров.

Адаптивные изменения гранулоцитопоэза у мышей с врожденным отсутствием тимуса, видимо вследствие их развития с самых ранних этапов онтоге-

Рис. 1. Показатели периферической крови у мышей Ва1Ь/с с врожденным (столбики с диагональной штриховкой), приобретенным (столбики с точечной штриховкой) отсутствием ви-лочковой железы и интакгных животных (незаиггриховакные столбики) По оси абсцисс - лейкоциты (1), сегментоядерные нейтрофилы (2), моноциты (3) и лимфоциты (4). По оси ординат - содержание клеток (х Ю'/л) Доверительные интервалы при Р=0,05

Рис. 2. Показатели миелограим у мышей Ва1Ь/с с врожденным (столбики с диагональной штриховкой), приобретенным (столбики с точечной штриховкой) отсутствием вилочковой железы и интактных животных (незаштрихованные столбики)

По оси абсцисс - миелобласты (1), сегментоядерные нейтрофилы (2), лимфоциты (3), моноциты (4), эритробласты (5) и полихроматофнльные нормобласты (6). По оси ординат - содержание клеток (х Ш9/бедро) Доверительные интервалы при Р=0,05

неза, распространяются на внекостномозговые кроветворные территории, в частности, на селезенку. По этой причине у них в меньшей степени задействован «срочный» механизм активации данного ростка - ускоренная дифференцировка - по сравнению с таковой у животных, перенесших операцию тимэктомии.

Возможно, именно поэтому удаление вилочковой железы у взрослых животных не сопровождается развитием столь выраженных нарушений со стороны миелопоэза, какие имеют место у мышей с врожденным отсутствием тимуса.

Поданным A.M. Дыгая (1984) существуютТ- регуляторы эритропоэза, относящиеся к короткоживущей субпопуляции Т- лимфоцитов, которые в первую очередь элиминируются из организма при удалении вилочковой железы. Следовательно, выпадение функции данной субпопуляции Т- клеток у мышей как с врожденным, так и приобретенным отсутствием тимуса и приводит угнетению эритропоэза в костном мозге.

Таким образом, анализируя все вышеперечисленные факты, не трудно заметить, что у бестимусных мышей обнаруживается одинаковая тенденция нарушений в системе крови. Изменения касаются эритроидного, лимфоидного, моноцитарного и гранулоцитарного ростков миелопоэза. Отсюда следует сделать вывод, что в регуляции всех перечисленных звеньев играют важную роль Т- лимфоцитарные механизмы. При этом существуют субпопуляции Т- клеток, отвечающие за регуляцию процессов пролиферации и дифференцировки элементов разных ростков гемопоэза.

Рис. 3. Колониеобразующая активность костного мозга мышей Ва1Ь/с с врожденным (столбики с диагональной штриховкой), приобретенным (столбики с точечной штриховкой) отсутствием вилочковой железы и интактных животных (незаштрихованные столбики) По оси абсцисс - содержание КОЕ-Э (1), КОЕ-ГМ-(2) и КОЕ-Ф (3). По оси ординат - содержание КОЕ/бедро Доверительные интервалы при Р=0,05

41

-ЕЁВ-

Рис. 4. Содержание гемопоэтических островков в костном мозге мышей Ва1Ь/с с врожденным (столбики с диагональной штриховкой), приобретенным (столбики с точечной штриховкой) отсутствием вилочковой железы и интактных животных (незаштрихованные столбики)

По оси абсцисс - общее содержание гемопоэтических островков (ГО) (1), гранулоцитарные ГО (2), эритроидные (3), смешанные ГО (4), макрофагположительные ГО (5) и макрофакот-рицательные ГО (6)

По оси ординат - содержание островков (Ю'/бедро) Доверительные интервалы при Р=0,05

Рис. 5. Эритропоэтическая активность (ЭПА) супернатантов костного мозга мышей Ва1Ь/с с врожденным (столбики с диагональной штриховкой), приобретенным (столбики с точечной штриховкой) отсутствием вилочковой железы и интактных животных (незаштрихованные столбики)

По оси абсцисс - общая ЭПА неприлипающих клеток (I), удельная ЭПА неприлипаюших клеток (2), общая ЭПА прилипающих клеток (3), общая ЭПА прилипающих клеток (4) По оси ординат- уровень ЭПА (КОЕ-Э/Ю5 интактных неадгезирующих миелокариоцитов) Доверительные интервалы при Р=0,05

Рис. 6. Показатели спленограмм у мышей Ва1Ь/с с врожденным (столбики с диагональной штриховкой), приобретенным (столбики с точечной штриховкой) отсутствием вилочковой железы и интактных животных (незаштрихованные столбики)

По оси абсцисс - количество больших лимфоцитов (1), средних лимфоцитов (2), моноцитов (3), незрелых нейтрофильных лейкоцитов (4), зрелых нейтрофильных лейкоцитов (5) и эрит-роидных клеток (6)

По оси ординат - содержание клеток (106/селезенку) Доверительные интервалы при Р=0,05

ВЫВОДЫ

1. На моделях врожденного и приобретенного отсутствия тимуса вскрыты закономерности и механизмы участия вилочковой железы в регуляции кроветворения.

2. У животных с врожденным отсутствием тимуса наблюдается угнетение лимфоидного и эритроидного ростков кроветворения, активация костномозгового грануломоноцитопоэза и компенсаторное увеличение количества эритроидных клеток в селезенке.

3. В основе изменений в системе крови у бестимусных животных Nude лежит увеличение количества эритроидных и фибробластоидных предшественников, повышение числа гранулоцитарных и снижение числа эритроидных гемопоэтических островков в костном мозге, а также снижение выработки колониестимулирукяцей и эритропоэтической активностей элементами ГИМ.

4. Тимэктомия у мышей линии Balb/c приводит к активации гранулоцитарно-го ростка, угнетению эритропоэза в костном мозге, и активации его в селезенке.

5. Нарушения костномозгового кроветворения у тимэктомированных мышей обусловлены увеличением количества гранулоцитомакрофагальных и стромальных предшественников, макрофагположительных и макрофагог-рицательных гемопоэтических островков, а также снижением выработки колониестимулирующей и эриропоэтической активностей клетками микроокружения.

6. Особенностью системы крови у мышей с мутантным геном Nude в отличие от тимэктомированных животных является более широкий плацдарм нарушений, включающий кроме костного мозга селезенку (активация грануломоноцитопоэза и угнетение лимфопоэза). Нарушения эритропоэза носят более выраженный характер.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Активность симпатико-адреналовой системы и гибель миелокариоцитов в динамике старения мышей линии AKR/JY// Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2000. - Т. 129. - № 6. - С. 614-616 (соавторы И.А. Хлусов, Л.А. Ставрова, Т.И. Фомина, A.M. Дыгай, Е.Д. Гольдберг).

2. Механизмы кроветворения у мышей Nude II Науки о человеке. Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевич. - Томск, 2000. - С. 13-14.

3. Особенности регуляции эритро- и гранулоцитопоэза у мышей Nude // Проблемы эксперим. и клин, фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2001. - С. 19-21.

4. Эритропоэз у мышей Nude // Проблемы эксперим. и клин, фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2001. - С. 21-23.

5. Механизмы кроветворения у мышей Nude // Актуальные проблемы эксперим. и клин, фармакологии. - Томск, 2001. - С. 93-96.

Актуальность проблемы. Несмотря на значительное количество работ, доказавших наличие в гемопоэтической ткани разнообразных, отличающихся по степени коммитированности и пролиферативному потенциалу клеток-предшественников, специфические механизмы регуляции процессов их пролиферации и дифференцировки остаются во многом неясными [122].

Интересно, что сама по себе разработка методов клонирования гемопоэтических клеток-предшественников привела к открытию нового типа регуляции в системе гемопоэза. Было отмечено, что на эффективность роста колоний из гемопоэтических клеток могут оказывать существенное влияние другие клеточные элементы, которые сами не производят клеток клона [71, 122, 185]. Из этих наблюдений родилось целое направление в современной гематологии, изучающее роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза. В настоящее время можно считать доказанным, что во многом решающая роль в регуляции кроветворения на уровне стволовых кроветворных клеток принадлежит стромальному микроокружению [71, 122, 144].

В то же время в последние годы в литературе появляется все больше данных, указывающих на важную роль лимфоцитов тимического происхождения в контроле пролиферации, дифференцировки и миграции различных гемопоэтических клеток-предшественников, в том числе стволовых кроветворных клеток [23, 29, 37, 64, 73, 77, 122, 133, 142, 143, 212, 220].

К настоящему времени накоплено много данных, указывающих на способность Т-лимфоцитов в определенных экспериментальных ситуациях (иммобилизационный стресс, цитостатические, лучевые воздействия) реализовывать свои регуляторные влияния на уровне коммитированных клеток-предшественников как непосредственно, так и путем взаимодействия с другими элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) [10, 27, 29]. Убедительные доказательства важной роли тимуса и лимфоцитов тимического происхождения в регуляции костно-мозгового миелопоэза получены в опытах на животных, тимэктомированных в неонатальный период жизни и на взрослых животных. Удаление вилочковой железы у новорожденных животных сопровождается развитием так называемого wasting-синдрома, характеризующегося тяжелыми трофическими и иммунными нарушениями. Обнаруживаются деструкция лимфоидных органов и лимфоцитов селезенки, атрофия лимфоузлов, развитие анемии и лимфопении [59, 79, 150, 221]. Удаление вилочковой железы у взрослых животных, как правило, не сопровождается развитием столь выраженных изменений со стороны миелопоэза, какие имеют место после операции, произведенной у животных в неонатальный период их жизни [29, 44, 122]. Литературные же данные о механизмах влияния тимуса на кроветворение крайне немногочисленны и противоречивы.

В связи с этим прогресс в изучении указанной проблемы, по-видимому, невозможен без использования экспериментальных подходов, которые позволили бы по-новому оценить роль лимфоцитов в регуляции гемопоэза. В частности, целесообразно проведение сравнительного исследования особенностей кроветворения у мышей Nude, характеризующихся врожденным отсутствием вилочковой железы, и у мышей с удаленной вилочковой железой.

Цель исследования: сравнительное изучение особенностей кроветворения на моделях врожденного и приобретенного отсутствия вилочковой железы и вскрытие механизмов, лежащих в их основе.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние системы крови у мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы.

2. Вскрыть механизмы регуляции кроветворения у бестимусных мышей Nude.

3. Исследовать влияние тимэктомии на процессы кроветворения и их регуляцию.

4. Сравнить особенности гемопоэза у мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы с животными после операции тимэктомии.

Научная новизна: В работе впервые проведено комплексное исследование системы крови у мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы (мыши с мутацией Nude). Показано, что для мышей Nude характерно, с одной стороны, угнетение эритроидного и лимфоидного ростков гемопоэза, с другой - активация грануломоноцитопоэза. Выполненные эксперименты позволили вскрыть ряд механизмов регуляции гемопоэза у бестимусных мышей. В основе угнетения эритропоэза в костном мозге у бестимусных мышей лежит снижение числа эритроидных гемопоэтических островков, а также снижение выработки эритропоэтической активности элементами ГИМ. В то же время в селезенке компенсаторно активируется эритропоэз, в результате чего развития анемии в периферической крови не наблюдается. Активация грануломоноцитопоэза является следствием повышения числа гранулоцитарных гемопоэтических островков в костном мозге. В работе также впервые проведено сравнительное исследование влияния вилочковой железы на кроветворение на моделях врожденного (мыши Nude) и приобретенного (тимэктомия) отсутствия тимуса. Установлено, что изменения гемопоэза в условиях врожденного отсутствия вилочковой железы охватывают больше отделов кроветворной ткани по сравнению с тимэктомией, в последнем случае в большей степени задействованы механизмы «срочной» адаптации.

Практическая значимость. В результате проведенных экспериментов получены новые фундаментальные данные об особенностях механизмов гемопоэза у бестимусных мышей Nude. Выполненные исследования дополняют имеющиеся сведения о важной роли вилочковой железы и лимфоцитов тимического происхождения в регуляции функциональной активности элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 7 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает 221 источника, в том числе 129 отечественных и 92 иностранных.

ВЫВОДЫ

На моделях врожденного и приобретенного отсутствия тимуса вскрыты закономерности и механизмы участия вилочковой железы в регуляции кроветворения.

У животных с врожденным отсутствием тимуса наблюдаются угнетение лимфоидного и эритроидного ростков кроветворения, активация костномозгового грануломоноцитопоэза и компенсаторное увеличение количества эритроидных клеток в селезенке.

В основе изменений в системе крови у бестимусных животных линии Nude лежит увеличение количества эритроидных и фибробластоидных предшественников, повышение числа гранулоцитарных и снижение числа эритроидных гемопоэтических островков в костном мозге, а также снижение выработки колониестимулирующей и эритропоэтической активностей элементами ГИМ.

Тимэктомия у мышей линии Balb/c приводит к активации гранулоцитарного ростка, угнетению эритропоэза в костном мозге, и активации его в селезенке.

Нарушения костно-мозгового кроветворения у тимэктомированных мышей обусловлены увеличением количества гранулоцитомакрофагальных и стромальных предшественников, макрофагположительных и макрофаготрицательных гемопоэтических островков, а также снижением выработки колониестимулирующей и эриропоэтической активностей клетками микроокружения. Особенностью системы крови у мышей с мутантным геном Nude в отличие от тимэктомированных животных является более широкий плацдарм нарушений, включающий кроме костного мозга селезенку (активация грануломоноцитопоэза и угнетение лимфопоэза). Нарушения эритропоэза носят более выраженный характер.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что для нормального функционирования гемопоэтических органов необходимо адекватное взаимодействие кроветворных клеток с различными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения. Именно кооперативные межклеточные взаимодействия, формирующие сложную систему прямых обратных связей, объединяющих клеточные компартменты в единое целое, обусловливают адаптацию в условиях физиологических сдвигов и патологических состояний.

Представленный в обзоре материал не оставляет сомнений в том, что вилочковая железа может регулировать процессы пролиферации и дифференцировки в кроветворной ткани как прямо, так и опосредованно через лимфоциты тимического происхождения.

В связи с этим прогресс в изучении указанной проблемы, по-видимому, невозможен без использования принципиально новых экспериментальных моделей, которые позволили бы оценить роль тимуса в регуляции гемопоэза. Одной из таких моделей могут служить мыши Nude, характеризующиеся врожденным отсутствием вилочковой железы. В литературе имеются отдельные сведения об изменениях в кроветворной ткани бестимусных животных. Вместе с тем многие закономерности гемопоэза при врожденном отсутствии тимуса, механизмы нарушений кроветворения до настоящего времени остаются во многом неясными. В связи с этим представляет интерес комплексное исследование морфофункционального состояния системы крови и механизмов кроветворения у бестимусных мышей Nude.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1 МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 105 мышах линии Balb/c 3-месячного возраста, полученных из питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Из них 15 животных были гомозиготами по мутации пи (пи/пи) (Nude), 20 - мышами линии Balb/c гетерозиготами (+/пи) и 70 -мышами линии Balb/c, не несущими мутантный ген. Операция по удалению вилочковой железы 25 немутантным мышам линии Balb/c была проведена в возрасте 2 мес.

До начала и после операции экспериментальных животных выдерживали в течение недели на обычном пищевом рационе по 8-10 особей в пластиковых клетках. Забор материала для исследований у тимэктомированных животных осуществляли через 2 месяца после операции. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации позвоночника, под эфирным наркозом.