Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы иммунотропного действия противотуберкулёзных препаратов основного ряда

| 003486515

На правах рукописи

Васильева Ольга Александровна

МЕХАНИЗМЫ ИММУНОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЁЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ ОСНОВНОГО РЯДА

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- з ДЕК 2009

Томск-2009

003486515

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении выси профессионального образования «Сибирский государственный медицине университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Новицкий

Вячеслав Викторович Уразова

Ольга Ивановна

Скурихин

Евгений Германович Ваизова

Ольга Евгеньевна

Ведущая организация: Новосибирский научно-исследовательский институт туберку) Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Защита состоится « »^¿^¿<<$£¿£2009 г. в № часов на заседании диссертацион* совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Н фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской акаде медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан ноября 2009 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

—» Амосова Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время туберкулёз занимает ведущее место среди распространённых инфекционных заболеваний. Несмотря на то, что показатель заболеваемости населения в России в 2008 г. в среднем снизился на 9,2%, а показатель смертности по сравнению с 2000 г. - в 1,5 раза, в целом заболеваемость туберкулёзом продолжает удерживаться на высоком уровне [Перельмап М.И., 2007; Мишин В.Ю., 2008]. В Томской области она составляет, по данным 2008 г., 101,3 случаев на 100 000 населения. При этом большая ее доля приходится па туберкулёз органов дыхания.

Основное место в лечении больных туберкулёзом заняла химиотерапия, требующая длительного применения противотуберкулёзных препаратов, которые Moiyr вызывать напряжение ферментативных систем, нарушение обменных процессов и расстройство функционального состояния некоторых органов, что обусловливает развитие побочных реакций [Мишин В.Ю. и соавт., 2004]. Такие побочные эффекты как гепатит, диспепсия, экзантема и артральгия отмечаются у 23% туберкулёзных больных в течение интенсивной фазы лечения [Awofesoa N., 2008]. При этом иммунная система не является исключением, поскольку, выполняя основную функцию защита, она является мишенью для действия повреждающих экзогешплх и эндогенных факторов [Визель A.A., 2000; Фисенко В.А., 2006; Мишин В.Ю., 2007]. Развитие негативных лекарственно-индуцированных реакций повышает риск прекращения лечения, возникновения рецидива туберкулёзной инфекции и определяет увеличение продолжительности антимикобактериалышй терапии [Schaberg Т. et al., 1996; Yee D. et al., 2003; Лысов A.B. и соавт., 2006; Филинюк О.В. и соавт., 2008].

В последние годы становится очевидным, что антибиотики в дополнение к антибактериальной активности способны модулировать продукцию цитокинов и воспалительных медиаторов, в связи с чем MOiyr оказывать значительное влияние на реакции иммунитета и развитие воспаления [Pasquale Т. R., Tan J. S., 2005; Yuhas Y. el al., 2006].

Состояние факторов иммунологической защиты во многом определяет возможность заражения, а при развитии туберкулёзной инфекции - течение и исход заболевания. Важную роль в борьбе с болезнетворными бактериями играют альвеолярные макрофаги и различные субпопуляции Т-лимфоцитов, которые, как известно, осуществляют регуляцию фагоцитоза и лизиса микобактерий макрофагами, формирование специфического противотуберкулёзного иммунитета [Хонина H.A. и соавт., 2000; Urdahl К.В. et al., 2003; Новицкий B.B. и соавт., 2006].

Однако, предполагая иммуносупрессорное действие химиопрепаратов в условиях характерного для туберкулезного процесса вторичного иммунодефицита, без наличия соответствующих экспериментальных исследований нельзя с уверенностью судить об их вкладе в развитие данного состояния, так как практически нет работ, посвященных изучению иммунотропной активности препаратов химиотерапии туберкулёза лёгких. Необходимость использования для лечения одновременно нескольких противотуберкулёзных препаратов приводит к ситуации, в которой трудно определить, какой из используемых препаратов индуцирует нежелательный эффект. В то же время эксперименты in vitro позволяют оценить влияние конкретного препарата на отдельные параметры жизнедеятельности клеток.

В связи с вышеизложенным, важным аспектом современных исследований является изучение особенностей и механизмов влияния противотуберкулёзных препаратов на клетки иммунной системы, поскольку именно от их структурно-функционального состояния зависит иммунологическая реактивность организма, направленная на распознавание возбудителя, формирование иммунного ответа и элиминацию инфекгогена.

Цель исследования: выявить особенности и механизмы иммупотроппого действия противотуберкулёзных препаратов основного (первого) ряда у больных туберкулёзом лёгких in vitro.

Задачи исследования:

1. Определить уровень сскреции про- и противовоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами in vitro при действии противотуберкулёзных препаратов первого ряда (изониазида, рифампицина, этамбутола) у здоровых доноров и больных с лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным туберкулёзом лёгких.

2. Изучить прямое действие основных противотуберкулёзных препаратов на пролиферативнуто активность и апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких с лекарстветюй чувствительностью и устойчивостью возбудителя.

3. Оценить воздействие основных противотуберкулёзных препаратов на активность ферментов энергетического обмена (сукцинатдсгидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лакгатдегидрогепазы) в лимфоцитах периферической крови у здоровых доноров и больных с лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным туберкулёзом лёгких.

4. Провести сравнительную оценку влияния изониазида, рифампицина и этамбутола на мононуклеарные лейкоциты периферической крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких в зависимости от лекарственной чувствительности/резистентности возбудителя.

Научная повита. Проведено комплексное изучение иммунотропных свойств препаратов базовой противотуберкулёзной терапии у больных с впервые выявленным инфильтративным туберкулёзом лёгких (до начала проведения им специфической ерапии) и у здоровых доноров. Впервые показано, что противотуберкулёзные препараты способны in vitro оказывать стимулирующее и, напротив, подавляющее действие на функцию иммунокомпетентных клеток крови, выражающееся как активацией продукции мопонуклеарными лейкоцитами про- и противовоспалительных цитокинов (IL-2 при действии рифампицина, IL-12 и IL-10 при действии изониазида), так и угнетением их секреции (IL-2 при действии изониазида, IL-12, IL-10, TGF-p под действием рифампицина и IFN-y под влиянием рифампицина и этамбутола) в сочетании с подавлением пролиферативной активности лимфоцитов (под влиянием этамбутола). Продемонстрировано, что у больных с лекарственно-резистентным туберкулёзом лёгких интенсивность базальной продукции IL-2 и IFN-y ниже, а уровень спонтанной секреции ÍL-I2, а также индуцированное белковым микобактериальным антигеном образование IL-12, IL-10 (в присутствии изониазида) и TGF-p (в присутствии изониазида и рифампицина) выше, чем при лекарственно-чувствительной форме заболевания. Установлено, что противотуберкулёзные препараты основного ряда у здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких in vitro индуцируют апоптоз лимфоцитов крови и вызывают дисбаланс в активности внутриклеточных ферментов энергетического обмена В частности обнаружено, что антимикобактериальные препараты первого ряда подавляют активность сукцинатдегидрогеназы на фоне компепсаторной активации а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в лимфоцитарных клетках. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что у больных туберкулёзом лёгких рифампицин оказывает более выраженное иммунодепрессивное действие по сравнению с изониазидом и этамбутолом, что проявляется более высокой степенью угнетения им продукции провоспалительпых моно- и лимфокинов (IL-12, IFN-y) и активации апоптотической гибели лимфоцитарных клеток крови in vitro.

Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые данные фундаментального характера о механизмах прямого супрессорного действия противотуберкулёзных препаратов основного ряда на мононуклеарные лейкоциты (лимфоциты и моноциты) крови у больных лекарственно-чувствительным и

лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких. Результаты исследования теоретическ обосновывают необходимость включения в стандартную программу лечения больны туберкулёзом лёгких иммуномодулирующих препаратов для профилактики и коррекци иммунодефицитных состояний, обусловленных влиянием не только возбудителя, по противотуберкулёзной химиотерапии. Основные положения и выводы диссертацн используются в учебном процессе в Сибирском государственном медицинско университете на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиолога клетки», «Патофизиология иммунитета» и кафедре фармакологии в лекционных практических разделах по теме «Побочное действие антимикробных средств».

Положения, выносимые на защиту:

1. Противотуберкулёзные препараты основного ряда (изопиазид, рифампищи этамбутол) in vitro оказывают сходное влияние на фермептативную, пролиферативну] активность и апоптоз лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больнь инфильтративным туберкулёзом лёгких. При этом их иммуносупрессорный эффе! проявляется в большей степени на фоне туберкулёзной инфекции.

2. Иммунотроппое действие препаратов базовой противотуберкулёзной терапии больных туберкулёзом лёгких реализуется за счет индукции апоптоза лимфоцито подавления лимфопролиферации и секреции моионуклеарными лейкоцитами крови vitro провоспалительных (IL-2, IL-12, IFN-y) и противовоспалительных (IL-10, TGF-| цитокинов.

3. Цитохимический дисбаланс в лимфоцитах периферической крови при действ» основных противотуберкулёзных препаратов у больных туберкулёзом лёгю характеризуется дефицитом активности фермента цикла трикарбоновых кисл< (сукцинатдегидрогеназы) в сочетании с компенсаторной активацией ферменте глицсрофосфатного шунта (митохондриальной а-глицерофосфатдегидрогеназы) гликолиза (лактатдегидрогеназы).

4. У больных инфильтративным лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёпа секреторная дисфункция монопуклеарных лейкоцитов, ипдуцированга противотуберкулёзными препаратами, более выражена, чем у больных с лекарствен» резистентным вариантом инфекции. При этом из противотуберкулёзных препарате первого ряда наибольший отрицательный иммунотропный эффект оказыва рифампицип.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертащ докладывались и обсуждались на межвузовской конференции молодых учень «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007), VIII, IX,

нгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2008, 09), Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова «Туберкулёз, ШД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в равоохранении» (Томск, 2007), XV Российско-японском Симпозиуме медицинского мена «Москва-2007» «Медицинская наука и здравоохранение России и Янонии в чале XXI века. Пути развития и перспективы» (Благовещенск, 2007), XI «российском научном форуме с международным участием имени академика В.И. зффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), XVI 1ссийск0м национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2009), ;ероссийской научно-практической конференции с международным участием вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (г. Новосибирск, 2009), юсийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной оологии» (Томск, 2009), VIII международной Российско-германской конференции 1озокомиалы1ые инфекции. Управление здравоохранением» (Новосибирск, 2009), а 1кже на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и кШунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И. И. [ечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009).

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по риоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 307-2012 годы» (ПС №02.412.11.2040; ПС №02.512.11.2112; ПС №02.512.11.0013) и овета по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-153.2006.7; НШ-2334.2008.7).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, 7 из которых (5 гатей и 2 тезисов) в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 16 таблицами. Библиографический указатель включает 275 источников, из которых 141 отечественных и 134 зарубежных авторов.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу исследования положены результаты обследования 60 впервые выявленных больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких (ТЛ) в возрасте от 18 до 55 лет (47 мужчин и 13 женщин). Все обследованные пациенты находились на стационарном

лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач - к.м.н. Г Янова) во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. - О.И. Новосельцева).

Клинический осмотр пациентов, сбор анамнеза, физикальные методы обследован больных и постановку диагноза осуществляли врачи-фтизиатры Томской области туберкулёзной клинической больницы: чл.-корр. PAMII, профессор Стрелис А.К., к.м Янова Г.В., к.м.н. Филинюк О.В., к.м.н. Лещев A.C., к.м.н. Петрова Л.Е., Мельнике Т.Н., Янов A.A., Щегерцов Д.А.

Диагноз заболевания устанавливали па основании клинической карта заболевания, данных рентгенологического исследования лёгких, результат микроскопического и бактериологического исследования мокроты.

В зависимости от чувствительности возбудителя к основным противотуберкулёзш препаратам (ЛТП) все больные были распределены на две группы. Первую груп составили 35 пациентов, выделяющих микобактсрии туберкулёза (МБТ), чувствитсльн к основным 1ШI, во вторую группу было включено 25 пациентов, выделяющих ME устойчивые как минимум к трем препаратам - изониазиду, рифампищп стрептомицину. Лекарственную чувствительность МБТ определяли традиционш методом абсолютных концентраций па среде Левенштейна-Йенсена. Исследован проводились в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулёзн клинической больницы и Томского областного противотуберкулёзного диспансера.

В исследование не включались пациенты моложе 18 и старше 55 л инфицированные вирусами гепатита и с ВИЧ-инфекцией, страдающие аллергическщ, иммунологическими и иными инфекционными заболеваниями в стадии обострения.

Контрольную группу (группу сравнения) составили 25 практически здоров! доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту.

Материалом для иммунологического исследования служила периферическая Kpoi взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл.

Исследование иммунологических показателей у пациентов контрольной груш проводили однократно, у больных туберкулёзом лёгких - до начала проведен специфической противотуберкулёзной химиотерапии.

Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови осуществля методом градиентного центрифугирования [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Для ипдукц секреторной функции мононуклеарных лейкоцитов и пролиферативной активное лимфоцитов в пробы вносили 20 мкг/мл белкового микобактериального антиге1 выделенного из МБТ семейства «Beijing» (Институт им. Макса Планка, Берл1 Германия). Изучение влияния ПТП (изониазида, рифампицина, этамбутола)

одукцию цитокинов мононуклсарными лейкоцитами проводили на моделях онтанной и индуцированной секреции. Для этого получали три вида супернатшггов: от еток, культивируемых в питательной среде (базальная); от клеток, культивируемых в ггательной среде при добавлении белкового антигена МВТ (антигениндуцированная); клеток, культивируемых в питательной среде в присутствии одновременно белкового тигена МВТ и препарата (антигениндуцированная в присутствии ПТП). Конечная «центрация исследуемых ПТП в культуральной среде составила 10 мкг/мл - для ониазида и рифампицина и 25 мкг/мл — для этамбутола. В контрольные пробы.вносили шную среду RPMI-1640. Для количественного определения цитокинов клетки 'льтивировали при 37°С и 5% С02 в течение 24 ч, а для оценки апоптоза - в течение 20 После инкубации пробирки встряхивали, центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, 'пернатант собирали и использовали для определения концентрации цитокинов, а :адок клеток использовали в аннексиновом и лимфоцитотоксическом тестах.

Дозы химиопрепаратов рассчитывали, исходя из приемов перерасчета, принятых в жсикологии, принимая суточную дозу препарата на 1 кг массы тела за концентрацию в л инкубационной среды. Так при стандартных режимах дозирования изониазид цначается в средней дозе 5-10 мг/кг, рифампицин - 8-10 мг/кг, этамбутол -15-25 мг/кг &рейдович А.И., 1999; Мишин В.Ю., 2007]. Мы использовали дня тестирования энцентрации по верхнему их пределу, поскольку распределение препаратов в идкосгных компартментах организма неодинаково. Субстанции химиопрепаратов cSigma», США) были предоставлены бактериологической лабораторией Томского мастного противотуберкулёзного диспансера. Определение уровня продукции нтерлейкина (IL) 2, IL-12, интерферона (IFN) у, IL-10 и трансформирующего фактора эста (TGF) р в культуральных супернатантах осуществляли методом твердофазного ммуноферментного анализа типа «сэндвич» согласно инструкциям, предлагаемым отечественными (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург; ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; ООО «Цигокин», Санкт-Петербург) и зарубежными («BioSource Europe S.A.», Бельгия; «Bender Medsystems», Австрия) производителями тест-систем.

Пролиферативную способность лимфоцитов оценивали с помощью МТТ-теста [Carmichael J., 1987]. Результаты теста выражали в единицах оптической плотности.

Подсчет CD95+ клеток производили с помощью моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Москва, Россия) в лимфоцитотоксическом тесте [Петров Р.В. и соавт., 1992]. Детекцию апоптотических лимфоцитов периферической крови осуществляли с помощью набора ANNEXIN V FITC [«Beckman Coulter», Франция].

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), митохондриалыюй а-

глицерофосфатдегидрогеиазы (а-ГФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцит! (количество гранул на клетку) определяли цитохимическим методом Нахласа модификации Р.П. Нарциссова [1969], основанным на подсчете образованных в клел видимых гранул диформазана при использовании п-нитротетразолия фиолетового в 30-! лимфоцитах. Мазки периферической крови готовили после инкубации цельной крови изониазидом (10 мкг/мл), рифампицином (10 мкг/мл) и этамбутолом (25мкг/мл) в течет 1 ч или 2 ч. Средний цитохимический коэффициент (СЦК) рассчитывали как отношен! суммарного количества гранул к количеству исследованных клеток. Более детальнь анализ популяции лимфоцитов производили путем изучения гистограммы распределен! лимфоцитов с различной активностью дегидрогсназ у каждого обследованпого. Бьи выделено 3 популяции лимфоцитов и зависимости от активности фермента: клетки высокой активностью (20 и более гранул диформазана на клетку), средней (10-19) низкой (до 9 грапул).

Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью стандартно пакета программ «Statistica for Windows» (Version 6.0) фирмы «StatSoft Inc.» и паке программ «Microsoft Excel» (2003) корпорации «Microsoft». Результаты представляли виде выборочных средних (М) и ошибки среднего (т), а также в виде медианы, верхне (75%-го) и нижнего (25%-го) квартилей (Me (Q1-Q2)). Проверку нормальное распределения количественных показателей проводили с использованием критер] Колмогорова-Смирнова. При соответствии распределения признака в исследуем! выборках нормальному закону проверку гипотезы о равенстве генеральных среда проводили с использованием t-критерия Стыодента. Для оценки достоверности различ! выборок, распределение которых не соответствовало нормальному закону, использова! непараметрический Mann Whitney U test для независимых выборок и Wilcoxon match pairs test для зависимых выборок. Зависимость параметров п группах оценивали помощью ранговой корреляции Спирмена (Spearman rank correlation). Различие дв; сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как известно, в борьбе с микобакгериями туберкулеза при туберкулёзной инфекщ участвует широкий спектр иммунокомпетентных клеток и продуцируемых ю цитокинов, которые играют главную роль в поддержании тканевого гомеосгаза обеспечивают системный ответ на повреждение [Новицкий В.В. и соавт., 2005]. результате проведенного исследования цитокинпродуцирующей функщ мононуклеарных лейкоцитов спонтанный уровень секреции IL-2 у больных 1

и

сохранялся в пределах нормы, хотя большинство исследователей указывают на снижение продукции 1L-2 при ТЛ [Заболотиых Н.В., 1996; Ellner J.J., 1997; Talreja J. et al., 2003; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Новицкий B.B. и соавт., 2005]. Поскольку в данную работу были включены пациенты с впервые выявленным инфильтративным ТЛ, который представляет собой начальный этап развития патологического процесса, то функциональные возможности клеток (в определенной степени) еще сохранны. Последнее подтверждает тот факт, что средняя фоновая активность дегидрогеназ в лимфоцитах (сукцинатдегирогеназы - СДГ, а-глицерофосфатдегидрогеназы - а-ГФДГ и лактатдегидрогеназы - ЛДГ) у больных ТЛ не отличалась от таковой у здоровых доноров. Это можно объяснить компеисаторно-приспособителыюй мобилизацией резерва клеток, направленной на поддержание на должном уровне их ферментативной активности и реализацию иммунных функций, а именно, опосредованное лимфоцитами подавление размножения и уничтожение МВТ.

Кроме того, известно, что продукция IL-2 и контролируемая им пролиферация лимфоцитов «сдерживаются» трансформирующим ростовым фактором (TGF) ß [Moustakas А., Heldin С.Н., 2005; Li М.О. et а!., 2006]. Согласно полученным данным, спонтанный уровень продукции TGF-ß! у больных ТЛ был сопоставим с таковым у здоровых доноров. Вероятно, это и определяло тот факт, что средняя концентрация IL-2 в культуре мононуклеарных клеток и уровень лимфопролиферации в данной группе исследования были на уровне нормы.

Показано, что степень угнетения секреции IL-2 зависит от тяжести туберкулёза лёгких [Flynn J.L., 2001]. Обнаруженный нами более низкий уровень продукции IL-2 у больных ТЛ с множественной лекарственной устойчивостью (ЛУТЛ) по сравнению с пациентами с лекарственно-чувствительным ТЛ (ЛЧТЛ) свидетельствует об избирательном влиянии возбудителя на секреторную способность Т-лимфоцитов.

IFN-y и IL-12 являются ключевыми цитокинами в защите организма от инфекций, вызванных внутриклеточными микроорганизмами, в том числе МВТ [Кетлинский С.А., 2005]. В частности, основным эффектом IL-12 является индукция синтеза IFN-y естественными киллерами и активированными CD4+, CD8+ Th]-лимфоцитами [Пинегин Б.В., Ильинская А.Н., 2004; Кетлинский С.А., 2005]. Это взаимодействие цитокинов подтвердилось и в нашей работе, о чём свидетельствует тесная корреляционная взаимосвязь между спонтанной продукцией IFN-y и IL-12 (г=1, р=0,002) у здоровых доноров. Исходя из этого, возможными причинами установленной у больных ЛУТЛ низкой продукции IFN-y (на фоне высокой секреции IL-12) могли быть нарушения экспрессии рецепторов для IL-12 (IL-12Rß2, CD212) на клетках-мишенях,

костимулирующих молекул на антигенпредставляющих клетках (В7) или же нарушения на этапе каскада внутриклеточной передачи сигнала (например, на уровне транскрипционного фактора STAT4, который индуцирует в Т-клетках синтез IFN-y). С другой стороны, дефицит IFN-y может быть обусловлен повышенным уровнем спонтанной продукции у больных с ЛУТЛ IL-10 - ингибитора активности макрофагов, а, следовательно, Т-лимфоцитарных реакций, в том числе продукции Т-клетками IFN-y [Curfs J.H.AJ. et al., 1997; Фрейдлин И.С., 2001]. У больных с ЛЧТЛ, напротив, было зафиксировано повышение продукции IFN-y in vitro, что согласуется с дапными других авторов [Новицкий В.В. и соавт., 2005; Fortes A. et al., 2005].

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов с белковым антигеном МБТ пс сопровождалось усилением образования IL-2 у больных ТЛ по сравнению с пормой, что свидетельствует о снижении реактивности МБТ-специфичных клонов Т-клеток или истощении резерва их IL-2-секреторной активности. Не исключено, что отсутствие индуцирующего эффекта белкового антигена МБТ на интенсивность секреции IL-2 может быть опосредовало связыванием данного цитокина а-цепью рецептора для IL-2 (CD25), экспрессия которой у больных ТЛ возрастает [Новицкий В.В. и соавт., 2005, 2007]. Вероятно, формирующийся вследствие этого дефицит свободной формы цитокина (IL-2) обусловливает низкий уровень лимфопролиферации при добавлении в культуру клеток белкового антигена МБТ. Не исключено, что подавление пролиферативпой активности лимфоцитов определяется также иммунотропными особенностями белкового антигена МБТ семейства Beijing.

Из трёх исследуемых противотуберкулёзных препаратов основного ряда оценку влияния на пролиферативную активность лимфоцитов в МТТ-тесте удалось провести только с этамбутолом. Рифампиции и изониазид специфически реагировали с МТТ-реактивом, усиливая степень окраски и искажая результаты. Добавление в питательную среду для культивирования клеток этамбутола приводило к статистически значимому снижению лимфопролиферации относительно спонтанных её показателей как у больных ТЛ, так и у здоровых доноров. Учитывая данные литературы, можно предположить, чт возможным механизмом подавления пролиферативпой активности лимфоцитов этамбутолом могло быть как прямое, так и опосредованное (через дефекты экспрессии отдельных цепей рецептора для IL-2, активации JAK-киназ) нарушение процесса фосфорилирования факторов транскрипции (STAT3, STAT5a и STAT5P) [Симбирце А.С., 1998; Галицкий В.А., 2005; Rickert M et al., 2005; Wang X. et al., 2005; Карицкая И.А. и соавт., 2006].

Интересно, что у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ в условиях специфической провокации понуклеарных лейкоцитов in vitro путем добавления в культуру клеток белкового гигена МБТ мы отмечали увеличение секреции лишь IFN-y и IL-10. Обращал на себя имапие тот факт, что мононуклеарные лейкоциты здоровых людей и больных ТЛ в де случаев по-разному реагировали на действие специфического стимулятора (рис. 1), шенно, при действии микобактериального протеина у здоровых доноров они отвечали еличением секреции IL-I2, а у больных ЛУТЛ - значительным снижением образования иного цитокина. В случае с IL-10 устанавливалась обратная ситуация.

1С. 1. Концентрации интерлейкина 12 (11.-12) и интерлейкина 10 (1Ь-10) в культуре энонуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных туберкулёзом лёгких и здоровых доноров, римечание:

0 - спонтанная продукция

О - при инкубации с белковым антигеном микобактерий * - достоверность различий по сравнению со спонтанной продукцией цитокина

При этом ангигениндуцированная продукция ГГСР-Р1 у больных ТЛ и в контрольной >уппе была понижешюй, а пролиферативная активность лимфоцитов при действии икобактериального белка снижалась только при туберкулёзной инфекции и не ¡менялась у здоровых доноров. Допустимо, что снижение антигенипдуцированной амфопролиферации и секреции 1Ь-12 и ТОР-р! по сравнению со спонтанным их эовием у больных ТЛ, как уже указывалось выше, отражает отсутствие реакции МБТ-зактивных клеток па специфический индуктор или истощение их функционального гзерва. Такого рода изменения в продукции ключевых цитокинов мононуклеарными гйкоцитами при туберкулезной инфекции могут предрасполагать к беспрепятственному размножению МБТ и служить фактором клинической манифестации инфекции.

Согласно данным литературы, нарушение антигенспецифического ответа щ туберкулёзе может быть обусловлено апоптозом аптигенреактивных клеток, а такя перераспределением и сосредоточением (компарггментализацией) их в очаге ипфекщ [Хонина H.A. и соавт., 2001]. Однако при оценке спонтанного апоптоза лимфоцитов м отмечали лишь повышение количества CD95+ клеток у больных JI4TJI без увеличен! числа апоптотических annexin V-презептирующих лимфоцитов, что не противореч! данным, полученным другими исследователями [Бойчук C.B. и соавт., 2003]. Кроме тог известно, что TGF-ß является проапоптотическим фактором [Edlund S. et al., 200 Moustakas A., Heldin C.H., 2005], оказывает апоптозипдуцирующее действие на поздш стадии активации Т-лимфоцитов [Потапнев М.Г1., 2002]. Базальная секрещ мононуклеарными лейкоцитами TGF-ßi у больных ТЛ обеих групп наблюдения была i уровне нормы, вероятно, поэтому и количество фосфатидилсерин-положительнь лимфоцитов, связывающих annexin V, не отличалось от такового у здоровых допоров.

Анализ влияния 11T1I на цитокинпродуцирующую способность мононуклеарнь лейкоцитов исследовали при совместном культивировании клеток с белковым антигене МБТ, в связи с чем достоверность различий полученных результатов оцепипш относительно аптигениндуцировапного уровня продукции цитокнна. Так, добавление купьтуральную среду изониазида оказывало разнонаправленные эффекты, а именн опосредовало снижение концентрации IL-2 в культуральных супернатантах у больнь ЛУТЛ, двукратное увеличение уровня продукции IL-12 у больных ТЛ обеих rpyi наблюдения, тенденцию к снижению секреции IFN-y во всех группах обследованных больных ТЛ и у здоровых доноров) и повышение образования IL-10 у здоровых донор! (табл. 1). Следует отметить, что у больных с ЛЧТЛ уровень продукции IL-12, IL-10 TGF-ßi при совместном культивировании клеток с белковьм антигеном МБТ изониазидом были достоверно ниже аналогичных результатов у больных с ЛУТЛ, хо средние значения антигениндуцированной секреции данных цитокинов у пациентов эп групп статистически не различались. Таким образом, мононуклеарпые лейкоцит больных с лекарственно-устойчивым вариантом ТЛ оказываются менее восприимчивы» к воздействию изониазида.

Эффект рифампицина на клетки в большинстве случаев был ингибирующим, п] этом подавление секреции цитокинов было более выраженным по сравнению воздействием изониазида и этамбутола Исключением стало повышение продукции IL мононуклеарами периферической крови при действии рифампицина как у больных Т так и у здоровых доноров (табл. 1).

При исследовании влияния этамбутола па продукцию цитокинов in vitro было установлено лишь достоверное снижеиие уровня секреции IFN-y у больных TJI впе зависимости от чувствительности возбудителя к основным ПТП.

Выявленные изменения в продукции цитокинов под действием препаратов имеют как положительное, так и отрицательное значение. Так, снижение уровня IL-10 и TGF-Pi при действии рифампицина можно рассматривать как положительную реакцию, поскольку эти цитокины обладают мощным противовоспалительным действием и подавляют развитие иммунного ответа на МБТ. Напротив же, выявленное снижение продукции мопонуклеарами IL-12 (при инкубации клеток с рифампицином) и IFN-y (при действии рифампицина и этамбутола) имеет отрицательное значение, учитывая, что эти цитокины, как упоминалось ранее, являются ключевыми в развитии иммунного ответа на внутриклеточные патогены и угнетение их секреции является фактором вторичного иммунодефицита, обусловливающим формирование тяжелых форм микобактериалыюй инфекции у человека.

Таблица 1

Направленность действия изониазида и рифампицина на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови in vitro у больных туберкулёзом лёгких и •здоровых доноров

Цитокины Здоровые доноры Больные лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких Больные лекарственно- устойчивым туберкулёзом лёгких

Изониазид +белковый АгМБ'Г Рифампицин + белковый Аг.МБТ Изониазид +белковыи Аг МБТ Рифампицин + белковый Аг МБТ Изониазид +белковый Аг МБТ Рифампицин + белковый АгМБТ

IL-2 - Т - т 1 Т

IL-12 - i NT 1 т 1

IFN^y N1 1 N1 1 N| 1

IL-10 t 1 - 1 - 4

TGF-P, - - - 1 - 1

Примечание: Аг - антиген, N 4 - тенденция к снижению, N | - тенденция к повышению, | - подавление продукции, | - стимулирование продукции,«-» - отсутствие эффекта

Каким же образом противотуберкулёзные препараты обусловливают снижение синтеза изучаемых цитокинов?

Очевидно, что цитокинпродуцирующая способность лимфоцитов определяется интенсивностью процессов метаболизма, а, следовательно, активностью внутриклеточных ферментов. При изучении влияния ПТП на цитохимический статус лимфоцитов было обнаружено значительное снижение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) — центрального фермента цикла Кребса. В контрольной группе после 2-х часового воздействия ПТП большая часть популяции клеток была представлена лимфоцитами с высокой и умеренной активностью СДГ, тогда как для больных с туберкулёзной инфекцией было характерным преобладание клеток, проявляющих низкую активность СДГ (рис. 2, 3). Так, при 2-часовой инкубации лимфоцитов с исследуемыми ПТП у больных ТЛ доля клеток с низкой активностью СДГ | составляла около 70%.

г25

ш 20

I 10

---< --

5=4 Т.,, I * I

I I

Здоровые доноры

^^^ Вольные

туберкулёзом легких

До 1 час 2 часа

инкубации Время инкубации с этамбутолом

Рис. 2. Активность сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови у здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких при действии этамбутола

Здоровые доноры

Больные туберкулёзом легких

12,73

64,07

23,28

67,68

д - низкоактивные клетки (3 - высокоактивные клетки Щ - умеренноактивные клетки

Рис. 3. Структура популяции лимфоцитов (%) в зависимости от активности сукцинатдегидрогеназы при 2-часовом воздействии этамбутола у здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких

Разнонаправленные изменения активности а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ВДГ) у больных с инфильтративным ТЛ (рис. 4) и у здоровых доноров (увеличение тивности фермента у больных вне зависимости от вида ПТП и снижение активности грмента у здоровых доноров при действии рифампицина, а также увеличение числа гакоактивных клеток при действии этамбутола в контрольной группе), по-видимому, эжно объяснить следующим образом. а-ГФДГ - компонент глицерофосфатного шунта, ишощийся ипдикатором состояния энергетического метаболизма. Он обеспечивает гнхронизацию процессов биологического окисления и гликолиза. Снижение активности ЦГ и активация а-ГФДГ у больных инфильтративным ТЛ, возможно, отражает «¡баланс аэробных и анаэробных процессов энергообразования в направлении гтивации последних, что подтверждается увеличением активности ДДГ в клетках. В штрольной группе активности СДГ и а-ГФДГ снижались параллельно, то есть препарат ¡менял энзиматическую активность, но не вызывал сдвига равновесия в активности шных ферментов.

До 1 час 2 часа

инкубации

Время инкубации с рифаклицином

—Здоровые доноры

-¿г- Бальные

туберкулёзом легких

ис. 4. Активность а-глицерофосфатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких при действии рифампицина

Подтверждением функциональной взаимосвязи между СДГ и а-ГФДГ служит трицателыш корреляция, полученная при анализе величип ферментативной активности имфоцитов после 2-х часов инкубации их с этамбутолом (1=-0,9637, р=0,002), которая показывает, что чем ниже активность СДГ при действии этамбутола, тем более выраженным является компенсаторное повышение активности а-ГФДГ. Помимо этого, согласованные изменения наблюдались при анализе фоновой активности СДГ и а-ГФДГ у больных ТЛ (г=0,9999, р=0,010). В целом, характеризуя изменения в активности егидрогеназ в лимфоцитах, следует отметить, что у больных ТЛ нарушения в

цитохимическом статусе более выражены, чем у здоровых доноров, что свидетельству об истощении систем защиты от неблагоприятных факторов на фоне туберкулёз™ инфекции.

Поскольку характер изменений в работе ферментов под влиянием изониазщ рифампиципа и этамбутола является сходным, это позволяет предположи универсальный повреждающий механизм их действия. Как и любые химиопрепарат противотуберкулёзные средства способны усиливать перекисное окисление липид (ПОЛ) посредством стимуляции свободнорадикальных реакций, что мож непосредственно привести к повреждению структуры фермента и снижению е активности. Кроме того, снижение энергообразования и накопление свободш радикалов являются важными факторами, приводящими к запуску программировали гибели клетки. Таким образом, одним из механизмов угнетения продукции изучаем! цитокинов могло быть уменьшение числа функционально активных клеток вследств препарат-индуцированного апоягоза, поскольку инкубация лимфоцитов с ГП приводила к значительному повышению количества клеток, предуготовленных апоптозу (СБ95+) и вступивших в раннюю фазу клеточной гибели (аппехт V4) (р<0,0: Подтверждением этого служит выявленная отрицательная корреляция меж количеством СБ95+ лимфоцитов и концентрацией в культуре при ипхубац

клеток с рифампицином у здоровых доноров (г=-0,9738, р=0,001), а также меж, уровнем секреции ШМ-у и числом СБ95' клеток у больных с ЛЧТЛ при добавлении культуральную среду изониазида (г=-0,7953, р=0,033). Более существенное повышен числа апоптотических лимфоцитов устанавливалось у больных ТЛ при действ! рифампицина, что, вероятно, и приводило к более глубокому снижению секрец цитокинов при культивировании клеток с данным препаратом.

Учитывая данные литературы и основываясь на собственных результатах, следу отметить, что повышенный уровень апоптоза лимфоцитов при действии изониази; рифампиципа и этамбутола, вероятнее всего, обусловлен запуском программировали клеточной гибели по митохондриальному пути (за счет нарушений в энергетичесю статусе клеток, активации ПОЛ, повреждений структуры ДНК), что отчас подтверждается отсутствием корреляции между количеством С1Э95+ и аппехт презентирукнцих лимфоцитов.

Значительное увеличение количества СГ)95+ клеток у больных с ЛЧТЛ и аппехт лимфоцитов при действии рифампицина у больных ТЛ обеих групп наблюдения (с ЛЧ' и ЛУТЛ) по сравнению со здоровыми донорами свидетельствует о болын чувствительности клеток больных к экзогенным воздействиям, что, возможно, являеп

цним из механизмов формирования вторичной иммунной недостаточности, посредованной лекарственным воздействием на фоне противотуберкулезной терапии.

Наряду с подавлением под влиянием 11111 секреции указшшых выше цитокинов, ри инкубации клеток с изониазидом отмечалось увеличение образования ононуклеарными лейкоцитами IL-12 (у больных TJI), IL-10 (у здоровых доноров), а акже повышение секреции IL-2 (у больных TJI и здоровых доноров) при добавлении в леточную культуру рифампицина, что подтверждает способность данных препаратов казывать не только иммунодепрессивный, но и (учитывая активацию ими секреции IL-2, IL-12) провоспалительный эффекты.

Недавно показано, что рифампицип способен влиять па транскрипционные факторы, регулирующие синтез м-РНК iNOS (индуцибелыюй NO-синтазы). Кроме того, рифампицин усиливает и подавляет экспрессию ряда генов, продукты которых ответственны за развитие воспалительных процессов [Yuhas Y. et al., 2009]. Таким образом, пе исключено, что эффекты ПТП могут реализоваться на уровне транскрипции генов цитокинов посредством усиления или ингибирования этого процесса.

Анализируя данные литературы и результаты собственных исследований о влиянии ПТП на реактивность мононуклеарных лейкоцитов крови, можно заключить, что противотуберкулёзные препараты оказывают модулирующее влияние на клетки иммунной системы, но с преобладанием всё же негативных его эффектов (рис. 5).

Таким образом, результаты провсдешгого исследования позволяют заключить, что иммунотропное действие противотуберкулёзных препаратов основного ряда in vitro реализуется посредством модуляции продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами, усиления апоптоза лимфоцитарпых клеток в сочетании с угнетением лимфоиролиферации и индукцией в лимфоцитах дисбаланса в активности ключевых ферментов (СДГ, а-ГФДГ, ЛДГ), участвующих в реакциях энергообразования. Знание эффектов противотуберкулёзных химиопрспаратов на параметры, характеризующие функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов, на наш взгляд, позволит в значительной мере оценить перспективность использования иммунокорригирующей терапии у больных ТЛ, откроет новые возможности для целенаправленного регулирования процессов синтеза, секреции цитокинов при ТЛ и профилактики осложнений, опосредованных их дизрегуляцией.

Рис. 5. Предполагаемые механизмы влияния противотуберкулёзных препаратов на реактивность лимфо- и моноцитарных клеток крови на основании данных литературы и результатов собственного исследования (в серых рамках).

21

ВЫВОДЫ

1. Влияние противотуберкулёзных химиопрепаратов основного ряда (изониазида, рифампицина, этамбутола) на ферментативную, пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких является сходным, но в большей степени выраженным на фоне туберкулёзной инфекции.

2. Механизм иммуносупрессорного действия основных препаратов противотуберкулёзной 'химиотерапии in vitro связан с подавлением у больных туберкулёзом лёгких секреции мононуклеарными лейкоцитами IL-2 при действии изониазида (в случае лекарственной резистентности возбудителя), IFN-y под влиянием этамбутола и (как и у здоровых доноров) IL-12, IFN-y под действием рифампицина в сочетании со способностью изониазида индуцировать у здоровых доноров синтез IL-10.

3. Наряду с иммунодепрессивным действием in vitro рифампицин активирует продукцию мононуклеарными лейкоцитами крови IL-2 при одновременном угнетении секреции противовоспалительных цитокинов - IL-10 и TGF-ß (у больных туберкулёзом лёгких вне связи с лекарственной чувствительностью возбудителя), а изониазид стимулирует секрецию IL-12 (у больных с лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких).

4. При лекарственно-устойчивом туберкулёзе лёгких интенсивность базалыюй продукции мононуклеарными лейкоцитами крови IL-2 и IFN-y ниже, а уровень спонтанной секреции IL-12, а также антигениндуцированного образования IL-12, ILIO (в присутствии изониазида) и TGF-ß (в присутствии изониазида и рифампицина) выше, чем при лекарственно-чувствительном варианте заболевания.

5. Цитопатическое действие базовых препаратов противотуберкулёзной химиотерапии реализуется путём индукции апогггоза и подавления (под влиянием этамбутола) пролиферации лимфоцитарных клеток у здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких вне зависимости от варианта течения инфекции (лекарственно-чувствительный, лекарственно-устойчивый).

6. Ферментативный дисбаланс в лимфоцитах крови при действии противотуберкулёзных препаратов у больных туберкулёзом лёгких характеризуется подавлением активности сукцинатдегидрогеназы и активацией а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в условиях перераспределения популяции лимфоцитов периферической крови в направлении увеличения доли клеток с низкой или высокой ферментативной активностью.

7. Рифампицин обладает наиболее выраженным иммунодепреесивным действием, что у больных туберкулёзом лёгких проявляется более высокой степенью угнетения продукции IL-12, IFN-y мононуклеарными лейкоцитами и активации апоптотической гибели лимфоцитов крови in vitro, чем под влиянием изониазида и зтамбутола.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1; Особенности иммунотоксического действия противотуберкулёзны химиопрепаратов // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2/3. - С. 217-218 (соав' Уразова О.И., Воропкова О.В., Хасанова P.P.).

2. Оценка цитотоксической активности зтамбутола с использованием МТТ-теста Материалы XIII межвузовской конференции молодых ученых Актуальные проблем патофизиологии. - СПб., 2007. - С. 24-25 (соавт. Уразова О.И., Воронкова О.В., Хасанос P.P. и др.).

3. Влияние противотуберкулёзных химиопрепаратов на продукцию ИЛ-1 лимфоцитами периферической крови (The influence of antituberculous drugs on IL-I production by peripheral blood lymphocytes) / Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатит! проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российсю Германской конференции Форума Коха-Мечникова. - Томск, 2007. - С. 68-69 (соав Уразова О.И., Воронкова О.В., Хасанова P.P. и др.).

4. Дизрсгуляция иммунитета при туберкулёзе лёгких (Immunity disregulation durir pulmonary tuberculosis) / Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасное! крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российско-Германской конференщ Форума Коха-Мечникова. - Томск, 2007. - С. 82-83 (соавт. Уразова О.И., Новицкий В.Е Воронкова О.В. и др.).

5. Влияние противотуберкулёзных химиопрепаратов на дегидрогеназную активное лимфоцитов периферической крови / Науки о человеке: материалы VIII конгрео молодых и ученых и специалистов. - Томск, 2007. - С. 170-171 (соавт. Уразова 01 Воронкова О.В., Хасанова P.P. и др.).

6. Influence of antituberculous drugs on functional activity of lymphocytes / «Book abstract, Commemorating 15 years of Russia-Japan Medical Exchange under the guidance Japan-Russia Medical Exchange Foundation (1992-2007)». - Blagoveshchensk, 2007. - С. V (со authors Urazova O.I., Voronkova O.V., Hasanova R.R., Melnik M.I.).

7. Features of production TNF-a and 1L-2 at tuberculosis of lungs of chemotherapy / «Boi of abstract, Commemorating 15 years of Russia-Japan Medical Exchange under the guidance

pan-Russia Medical Exchange Foundation (1992-2007)». - Blagoveshchensk, 2007. - C. 58-(co authors Hasanova R.R., Urazova O.I., Voronkova O.V. et al.).

Цитокиппродуцирующая активность мононуклеарных лейкоцитов периферической ови при туберкулёзе лёгких / Науки о человеке: материалы VHI конгресса молодых и еных и специалистов. - Томск, 2007. - С. 61-62 (соавт. Хасанова P.P., Уразова О.И., >ронкова О.В. и др.).

Оценка влияния противотуберкулёзных препаратов на цитохимический статус [мфоцитов in vitro // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2008. - № 3 . - С. 27-I (соавт. Уразова О.И., Серебрякова В.А., Новицкий В.В. и др.).

>. Оценка влияния противотуберкулёзных препаратов на продукцию IL-2 и IFN^y [мфоцитами периферической крови in vitro / Науки о человеке: материалы IX конгресса злодых и учепых и специалистов. - Томск, 2008. - С. 36-36 (соавт. Серебрякова В.Л., разова О.И., Будкина Т.Е., Воронкова О.В.).

Роль цитокинов в модуляции субпопуляционного состава лимфоцитов крови у шьных туберкулёзом лёгких // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2008. - № 3. С. 31-35 (соавт. Хасанова P.P., Воронкова О.В., Уразова О.И. и др.). !. Сравнительная оценка показателей адаптивного иммунитета при лекарствснно-гаствитслыгом и лекарстпешю-устойчивом туберкулёзе лёгких / Физиология и геология иммунной системы: IV международная конференция по иммунотерапии Лосква, 2008) // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 288-289 (соавт. оронкова О.В., Уразова О.И., Хасанова P.P. и др.).

!. Пролиферативный и секреторный ответ мононуклеарных лейкоцитов на шбинированное воздействие этамбутола и микобактериального антигена // [едицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 2-3. - С. 153-160 (соавт. Серебрякова В.А., разова О.И., Новицкий В.В. и др.).

1. Модулирующее влияние изониазида и рифампицина на секрецию цитокинов in ¡tro при туберкулёзе лёгких // Туберкулёз и болезни лёгких. - 2009. - № 7. - С. 58-64 о авт. Серебрякова В.А., Уразова О.И., Новицкий В.В. и др.)

15. Оценка влияния рифампицина на апоптоз лимфоцитов периферической крови у эльных туберкулёзом лёгких / Науки о человеке: материалы X конгресса молодых и ченых и специалистов. - Томск, 2009. - С. 72-73 (соавт. Уразова О.И., Серебрякова В.А., ононова Т.Е., Колосова А.Е.).

16. Особенности секреции цитокинов при действии противотуберкулёзных препаратов in vitro / Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды Всероссийской

научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2009. С. 60-64 (соавт. Серебрякова В. А., Уразова О.И., Новицкий В.В., Кононова Т.Е.). 17. Аллельный полиморфизм генов цитокинов при туберкулёзе лёгких // Бюллете экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148, № 8. - С. 137-142 (соа Наследникова И.О., Уразова О.И., Воронкова О.В. и др.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а-ГФДГ - а-глицерофосфатдегидрогеназа ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛУТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулёз лёгких

ЛЧТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулёз лёгких

МБТ - микобактсрии туберкулёза

ИОЛ-перекисное окисление липидов

ПТП - противотуберкулёзные препараты

СДГ - сукципатдегидрогеназа

СЦК- средний цитохимический коэффициент

ТЛ - туберкулёз лёгких

CD - cell differentiation antigens - антигены дифференцировки клеток IFN - interferon - интерферон 1L - interleukin - иптерлейкин

TGF - transforming grows factor-трансформирующий фактор роста Thl, Th2 - T-helper-1,2 - субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов/хелперов

Отпечатано в ООО «НИП» ул. Советская, 47, «Штемпельная мастерская» тел.: 53-14-70,52-83-10 Заказ 6569-89, Тираж 100 экз.

В настоящее время туберкулёз занимает ведущее место среди распространенных инфекционных заболеваний. Несмотря на то, что показатель заболеваемости населения в России в 2008 г. в среднем снизился на 9,2%, а показатель смертности по сравнению с 2000 г. - в 1,5 раза, в целом заболеваемость туберкулёзом продолжает удерживаться на высоком уровне [Перельман М.И., 2007; Мишин В.Ю., 2008]. В Томской области она составляет, по данным 2008 г., 101,3 случаев на 100 000 населения. При этом большая ее доля приходится на туберкулёз органов дыхания.

Основное место в лечении больных туберкулёзом заняла химиотерапия, требующая длительного применения противотуберкулёзных препаратов, которые могут вызывать напряжение ферментативных систем, нарушения обменных процессов и расстройства функционального состояния некоторых органов, что обусловливает развитие побочных реакций [Мишин В.Ю. и соавт., 2004]. Такие побочные эффекты как гепатит, диспепсия, экзантема и артральгия отмечаются у 23% туберкулёзных больных в течение интенсивной фазы лечения [Awofesoa N., 2008]. При этом иммунная система не является исключением, поскольку, выполняя основную функцию защиты, она является мишенью для действия повреждающих экзогенных и эндогенных факторов [Визель А.А., 2000; Фисенко В.А., 2006; Мишин В.Ю., 2007]. Развитие негативных лекарственно-индуцированных реакций повышает риск прекращения лечения, возникновения рецидива туберкулёзной инфекции и определяет увеличение продолжительности антимикобактериальной терапии [Schaberg Т. et al., 1996; Yee D. et al., 2003; Лысов A.B. и соавт., 2006; Филинюк O.B. и соавт., 2008].

В последние годы становится очевидным, что антибиотики в дополнение к антибактериальной активности способны модулировать продукцию цитокинов и воспалительных медиаторов, в связи с чем могут оказывать значительное влияние на реакции иммунитета и развитие воспаления [Pasquale Т. R., Tan J. S., 2005; Yuhas Y. et al., 2006].

Состояние факторов иммунологической защиты во многом определяет возможность заражения, а при развитии туберкулёзной инфекции - течение и исход заболевания. Важную роль в борьбе с болезнетворными бактериями играют альвеолярные макрофаги и различные субпопуляции Т-лимфоцитов, которые, как известно, осуществляют регуляцию фагоцитоза и лизиса микобактерий макрофагами, формирование специфического противотуберкулёзного иммунитета [Хонина Н.А. и соавт., 2000; Urdahl К.В. et al., 2003; Новицкий В.В. и соавт., 2006].

Однако, предполагая иммуносупрессорное действие химиопрепаратов в условиях характерного для туберкулёзного процесса вторичного иммунодефицита, без наличия соответствующих экспериментальных исследований нельзя с уверенностью судить об их вкладе в развитие данного состояния, так как работы, посвящённые изучению иммунотропной активности препаратов химиотерапии туберкулёза лёгких, практически отсутствуют. Необходимость использования для лечения одновременно нескольких противотуберкулёзных препаратов приводит к ситуации, в которой трудно определить, какой из используемых препаратов индуцирует нежелательный эффект. В то же время эксперименты in vitro позволяют, оценить влияние конкретного препарата на отдельные параметры жизнедеятельности клеток.

В связи с вышеизложенным, важным аспектом современных исследований представляется изучение особенностей и механизмов влияния противотуберкулёзных препаратов на клетки иммунной системы, поскольку именно от их структурно-функционального состояния зависит иммунологическая реактивность организма, направленная на распознавание возбудителя, формирование иммунного ответа и элиминацию инфектогена.

Цель исследования: выявить особенности и механизмы иммунотропного действия противотуберкулёзных препаратов основного (первого) ряда у больных туберкулёзом лёгких in vitro.

Задачи исследования:

1. Определить уровень секреции про- и противовоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами in vitro при действии противотуберкулёзных препаратов первого ряда (изониазида, рифампицина, этамбутола) у здоровых доноров и больных с лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным туберкулёзом лёгких.

2. Изучить прямое действие основных противотуберкулёзных препаратов на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких с лекарственной чувствительностью и устойчивостью возбудителя.

3. Оценить воздействие основных противотуберкулёзных препаратов на активность ферментов энергетического обмена (сукцинатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы) в лимфоцитах периферической крови у здоровых доноров и больных с лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным туберкулёзом лёгких.

4. Провести сравнительную оценку влияния изониазида, рифампицина и этамбутола на мононуклеарные лейкоциты периферической крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких в зависимости от лекарственной чувствительности/резистентности возбудителя.

Научная новизна. Проведено комплексное изучение иммунотропных свойств препаратов базовой противотуберкулёзной терапии у больных с впервые выявленным инфильтративным туберкулёзом лёгких (до начала проведения им специфической терапии) и у здоровых доноров. Впервые показано, что противотуберкулёзные препараты способны in vitro оказывать стимулирующее и, напротив, подавляющее действие на функцию иммунокомпетентных клеток крови, выражающееся как активацией продукции мононуклеарными лейкоцитами про- и противовоспалительных цитокинов (IL-2 при действии рифампицина, IL-12 и IL-10 при действии изониазида), так и угнетением их секреции (IL-2 при действии изониазида, IL-12, IL-10, TGF-P под действием рифампицина и IFN-y под влиянием рифампицина и этамбутола) в сочетании с подавлением пролиферативной активности лимфоцитов (под влиянием этамбутола). Продемонстрировано, что у больных с лекарственно-резистентным туберкулёзом лёгких интенсивность базальной продукции IL-2 и IFN-y ниже, а уровень спонтанной секреции IL-12, а также индуцированное белковым микобактериальным антигеном образование IL-12, IL-10 (в присутствии изониазида) и TGF-(3 (в присутствии изониазида и рифампицина) выше, чем при лекарственно-чувствительной форме заболевания. Установлено, что противотуберкулёзные препараты основного ряда у здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких in vitro индуцируют апоптоз лимфоцитов крови и вызывают дисбаланс в активности внутриклеточных ферментов энергетического обмена. В частности обнаружено, что антимикобактериальные препараты первого ряда подавляют активность сукцинатдегидрогеназы на фоне компенсаторной активации а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в лимфоцитарных клетках. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что у больных туберкулёзом лёгких рифампицин оказывает более выраженное иммунодепрессивное действие по сравнению с изониазидом и этамбутолом, что проявляется более высокой степенью угнетения им продукции провоспалительных моно- и лимфокинов (IL-12, IFN-y) и активации апоптотической гибели лимфоцитарных клеток крови in vitro.

Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые данные фундаментального характера о механизмах прямого супрессорного действия противотуберкулёзных препаратов основного ряда на мононуклеарные лейкоциты (лимфоциты и моноциты) крови у больных лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких. Результаты исследования теоретически обосновывают необходимость включения в стандартную программу лечения больных туберкулёзом лёгких иммуномодулирующих препаратов для профилактики и коррекции иммунодефицитных состояний, обусловленных влиянием не только возбудителя, но и противотуберкулёзной химиотерапии. Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в Сибирском государственном медицинском университете на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета» и кафедре фармакологии в лекционных и практических разделах по теме «Побочное действие антимикробных средств».

Положения, выносимые на защиту:

1. Противотуберкулёзные препараты основного ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол) in vitro оказывают сходное влияние на ферментативную, пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких. При этом их иммуносупрессорный эффект проявляется в большей степени на фоне туберкулёзной инфекции.

2. Иммунотропное действие препаратов базовой противотуберкулёзной терапии у больных туберкулёзом лёгких реализуется за счет индукции апоптоза лимфоцитов, подавления лимфопролиферации и секреции мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro провоспалительных (IL-2, IL-12, IFN-y) и противовоспалительных (IL-10, TGF-P) цитокинов.

3. Цитохимический дисбаланс в лимфоцитах периферической крови при действии основных противотуберкулёзных препаратов у больных туберкулёзом лёгких характеризуется дефицитом активности фермента цикла трикарбоновых кислот (сукцинатдегидрогеназы) в сочетании с компенсаторной активацией ферментов глицерофосфатного шунта (митохондриальной а-глицерофосфатдегидрогеназы) и гликолиза (лактатдегидр огеназы).

4. У больных инфильтративным лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких секреторная дисфункция мононуклеарных лейкоцитов, индуцированная противотуберкулёзными препаратами, более выражена, чем у больных с лекарственно-резистентным вариантом инфекции. При этом из противотуберкулёзных препаратов первого ряда наибольший отрицательный иммунотропный эффект оказывает рифампицин.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007), VIII, IX, X конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2008, 2009), Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова «Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), XV Российско-японском Симпозиуме медицинского обмена «Москва-2007» «Медицинская наука и здравоохранение России и Японии в начале XXI века. Пути развития и перспективы» (Благовещенск, 2007), XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), VIII международной Российско-германской конференции «Нозокомиальные инфекции. Управление здравоохранением» (Новосибирск, 2009), а также на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009).

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК №02.412.11.2040; ГК №02.512.11.2112; ГК №02.512.11.0013) и Совета по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-4153.2006.7; НШ-2334.2008.7).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, 7 из которых (5 статей и 2 тезисов) в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 16 таблицами. Библиографический указатель включает 275 источников, из которых 141 отечественных и 134 зарубежных авторов.

115 ВЫВОДЫ

1. Влияние противотуберкулёзных химиопрепаратов основного ряда (изониазида, рифампицина, этамбутола) на ферментативную, пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом легких является сходным, но в большей степени выраженным на фоне туберкулёзной инфекции.

2. Механизм иммуносупрессорного действия основных препаратов противотуберкулёзной химиотерапии in vitro связан с подавлением у больных туберкулёзом легких секреции мононуклеарными лейкоцитами IL-2 при действии изониазида (в случае лекарственной резистентности возбудителя), IFN-y под влиянием этамбутола и (как и у здоровых доноров) IL-12, IFN-y под действием рифампицина в сочетании со способностью изониазида индуцировать у здоровых доноров синтез IL-10.

3. Наряду с иммунодепрессивным действием in vitro рифампицин активирует продукцию мононуклеарными лейкоцитами крови IL-2 при одновременном угнетении секреции противовоспалительных цитокинов — IL-10 и TGF-P (у больных туберкулёзом легких вне связи с лекарственной чувствительностью возбудителя), а изониазид стимулирует секрецию IL-12 (у больных с лекарственно-устойчивым туберкулёзом легких).

4. При лекарственно-устойчивом туберкулёзе легких интенсивность базальной продукции мононуклеарными лейкоцитами крови IL-2 и IFN-y ниже, а уровень спонтанной секреции IL-12, а также антигениндуцированного образования IL-12, IL-10 (в присутствии изониазида) и TGF-P (в присутствии изониазида и рифампицина) выше, чем при лекарственно-чувствительном варианте заболевания.

5. Цитопатическое действие базовых препаратов противотуберкулёзной химиотерапии реализуется путём индукции апоптоза и подавления (под влиянием этамбутола) пролиферации лимфоцитарных клеток у здоровых доноров и больных туберкулёзом легких вне зависимости от варианта течения инфекции (лекарственно-чувствительный, лекарственно-устойчивый).

6. Ферментативный дисбаланс в лимфоцитах крови при действии противотуберкулёзных препаратов у больных туберкулёзом легких характеризуется подавлением активности сукцинатдегидрогеназы и активацией а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в условиях перераспределения популяции лимфоцитов периферической крови в направлении увеличения доли клеток с низкой или высокой ферментативной активностью.

7. Рифампицин обладает наиболее выраженным иммунодепрессивным действием, что у больных туберкулёзом легких проявляется более высокой степенью угнетения продукции IL-12, IFN-y мононуклеарными лейкоцитами и активации апоптотической гибели лимфоцитов крови in vitro, чем под влиянием изониазида и этамбутола.

117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ данных литературы показал, что противотуберкулёзные химиопрепараты обладают достаточно широким спектром побочных и токсических реакций на организменном уровне. Однако данные о непосредственном влиянии противотуберкулёзных препаратов на иммунокомпетентные клетки немногочисленны, разрозненны и противоречивы.

Согласно исследованиям ряда авторов, первичные изменения, вызванные эндо- и экзогенными повреждающими (болезнетворными) факторами, чаще обнаруживаются в рециркулирующих лимфоцитах крови, функциональная активность которых в значительной степени зависит от интенсивности энергетических процессов [Труфакин В.А., Робинсон М.В., 1996; Саранчина Э.Б. и соавт., 2003; Чернышов В.Н., 2005]. Характер метаболизма иммунокомпетентных клеток, состояние их рецепторного аппарата и продукция цитокинов формируют основу иммунной реакции, изменяясь в ходе последней и обеспечивая её динамику в пространстве и во времени [Труфакин В.А. и соавт., 2005].

Таким образом, актуальность изучения молекулярных механизмов иммунотропного действия базовых препаратов химиотерапии туберкулёза, их влияния на секрецию биологически активных веществ мононуклеарными лейкоцитами, ферментативную, пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов не вызывает сомнений, поскольку исход туберкулёзной инфекции во многом определяется состоянием реактивности иммунокомпетентных клеток и тем, насколько четко организованно межклеточное взаимодействие в процессе развития иммунного ответа, основными медиаторами которого являются иммунорегуляторные биомолекулы — цитокины.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

В ходе работы было обследовано 60 впервые выявленных больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких (ТЛ) в возрасте от 18 до 55 лет (47 мужчин и 13 женщин). Все обследованные пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач - к.м.н. Г.В. Янова) во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. - О.И. Новосельцева).

Клинический осмотр пациентов, сбор анамнеза, физикальные методы обследования больных и постановку диагноза осуществляли врачи-фтизиатры Томской областной туберкулёзной клинической больницы: чл.-корр. РАМН, профессор Стрелис А.К., к.м.н. Янова Г.В., к.м.н. Филинюк О.В., к.м.н. Лещев A.C., к.м.н. Петрова Л.Е., Мельникова Т.И., Янов A.A., Щегерцов Д. А.

Диагноз заболевания устанавливали на основании клинической картины заболевания, данных рентгенологического исследования лёгких, результатов микроскопического и бактериологического исследования мокроты.

Клиническая картина туберкулёза лёгких характеризовалась наличием синдрома воспалительной интоксикации (повышение температуры тела, ночные поты, озноб, повышенная утомляемость, слабость, снижение или отсутствие аппетита, потеря массы тела, тахикардия) и бронхолегочных симптомов (кашель более двух-трех недель, выделение мокроты, кровохарканье, одышка, боль в грудной клетке, связанная с дыханием). Бактериовыделение регистрировалось у 100% обследованных пациентов.

В зависимости от чувствительности возбудителя к основным противотуберкулёзным препаратам (ПТП) все больные были распределены на две группы. Первую группу составили 35 пациентов, выделяющих микобактерии туберкулёза (МБТ), чувствительные к основным ПТП, во вторую группу было включено 25 пациентов, выделяющих МБТ, устойчивые как минимум к трем препаратам - изониазиду, рифампицину, стрептомицину. Лекарственную чувствительность МБТ определяли традиционным методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Иенсена. Исследования проводились в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулёзной клинической больницы и Томского областного противотуберкулёзного диспансера.

В исследование не включались пациенты моложе 18 и старше 55 лет, инфицированные вирусами гепатита и с ВИЧ-инфекцией, страдающие аллергическими, иммунологическими и иными инфекционными заболеваниями в стадии обострения.

Контрольную группу (группу сравнения) составили 25 практически здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту.

2.2. Материал исследования

Материалом для иммунологического исследования служила периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл.

Исследование иммунологических показателей у пациентов контрольной группы проводили однократно, у больных туберкулёзом лёгких - до начала проведения специфической противотуберкулёзной химиотерапии.

2.3. Методы исследования

2.3.1. Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов проводили по методу Е.Д. Гольдберга и соавт. [1992].

Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови. Венозную гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) выдерживали при 37°С в течение 40-60 мин для отделения плазмы от эритроцитов. Полученную плазму наслаивали на среду для выделения лимфоцитов (Lymphocyte Séparation Médium) (р=1077 кг/м ) в соотношении 1:1 и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Образовавшееся интерфазное кольцо из клеток осторожно, через верхний слой плазмы собирали пипеткой, трижды отмывали средой RPMI-1640 (ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск) дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот», Санкт-Петербург), последовательно ресуспендируя и центрифугируя каждый раз в течение 10 мин при 1500 об/мин.

Приготовление супернатантов. Для получения супернатантов выделенные лимфоциты ресуспендировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 (ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот», Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 2 мМ/мл HEPES («Flow», Великобритания). Определение концентрации клеток в суспензии и их жизнеспособности проводили в счетной камере Горяева. Для этого 0,1 мл клеточной суспензии смешивали с равным объемом 0,5% раствора трипанового синего («Serva», США) и переносили в камеру. Жизнеспособность клеток оценивали по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет (%). Количество клеток в суспензии стандартизировали до 2,5х106/мл.

Для индукции секреторной функции мононуклерных лейкоцитов и пролиферативной активности лимфоцитов в пробы вносили 20 мкг/мл белкового микобактериального антигена, выделенного из МБТ семейства «Beijing» (Институт им. Макса Планка, Берлин, Германия).

Изучение влияния ПТП (изониазида, рифампицина, этамбутола) на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами проводили на моделях спонтанной и индуцированной секреции. Для этого получали три вида супернатантов: от клеток, культивируемых в питательной среде (базальная); от клеток, культивируемых в питательной среде при добавлении белкового антигена МБТ (антигениндуцированная); от клеток, культивируемых в питательной среде в присутствии одновременно белкового антигена МБТ и препарата (антигениндуцированная в присутствии ПТП). Конечная концентрация исследуемых ПТП в культуральной среде составила 10 мкг/мл - для изониазида и рифампицина и 25 мкг/мл - для этамбутола. В контрольные пробы вносили полную среду RPMI-1640. Для количественного определения цитокинов клетки культивировали при 37°С и 5% С02 в течение 24 ч, а для оценки апоптоза - в течение 20 ч. После инкубации пробирки встряхивали, центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, супернатант собирали и использовали для определения концентрации цитокинов, а осадок клеток использовали в аннексиновом и лимфоцитотоксическом тестах.

Дозы химиопрепаратов рассчитывали, исходя из приемов перерасчета, принятых в токсикологии, принимая суточную дозу препарата на 1 кг массы тела за концентрацию в 1 л инкубационной среды. Так при стандартных режимах дозирования изониазид назначается в средней дозе 5-10 мг/кг, рифампицин — 8-10 мг/кг, этамбутол -15-25 мг/кг [Фрейдович А.И., 1999; Мишин В.Ю., 2007]. Мы использовали для тестирования концентрации по верхнему их пределу, поскольку распределение препаратов в жидкостных компартментах организма неодинаково. Субстанции химиопрепаратов («Sigma», США) были предоставлены бактериологической лабораторией Томского областного противотуберкулёзного диспансера.

2.3.2. Иммуноферментный анализ цитокинсекретирующей активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro

Определение уровня продукции интерлейкина (IL) 2, IL-12, интерферона (IFN) у, IL-10 и трансформирующего фактора роста (TGF) ß в культуральных супернатантах осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» согласно инструкциям, предлагаемым отечественными (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург; ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; ООО «Цитокин», Санкт-Петербург) и зарубежными («BioSource Europe S.A.», Бельгия; «Bender Medsystems», Австрия) производителями тест-систем.

Принцип метода заключается в конъюгации одного эпитопа молекулы цитокина с мышиными моноклональными антителами, сорбированными на твердой фазе микропланшета. Другой тип антител - кроличьи поликлональные биотилированные антитела, специфичные против человеческих цитокинов, соединяются с независимым эпитопом цитокина. После удаления избытка вторых антител добавляется стрептавидинпероксидаза, которая связывается с биотилированными антителами с формированием сэндвич-комплекса из 4-х реагентов. После второй инкубации и промывки удаляется несвязавшийся фермент, после чего добавляется субстратный раствор, который взаимодействует с ферментом с образованием цветного комплекса. Оптическая плотность раствора пропорциональна концентрации определяемого вещества и регистрируется колориметрически. Калибровочная кривая строится с использованием стандартных растворов цитокинов с известной концентрацией.

Оптическую плотность плашки регистрировали на микропланшетном фотометре Multiskan EX (Финляндия) при длине волны 450 нм. Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой. Результаты выражали в пг/мл.

2.3.3. МТТ-тест оценки пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови in vitro

Пролиферативную активность лимфоцитов крови оценивали по методу, предложенному J. Carmichael [1987].

Принцип метода. В культуральной среде лимфоциты под влиянием митогенов или антигенов трансформируются в бласты. Результаты пролиферативного ответа можно оценить с помощью МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных ферментов живых клеток восстанавливать тетразолиевую соль - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиума бромида (МТТ, тиазолил синий) до МТТ-формазана. Число жизнеспособных клеток прямо пропорционально количеству восстановленного формазана, которое можно определить спектрофотометрически после растворения в органическом растворителе.

Ход работы. Лимфоциты, выделенные в стерильных условиях (см. 2.3.1), при концентрации клеточной взвеси 2,5x106/мл культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 2 мМ/мл HEPES («Flow», Великобритания), 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной ЭТС («Sigma», США) при 37°С и 5%

С02 в течение 3 суток. Для стимуляции пролиферации лимфоцитов в пробы вносили белковый микобактериальный антиген в дозе 20 мкг/мл. В контрольные пробы добавляли политую среду КРМ1-1640. После инкубации в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ (2 мг/мл) и инкубировали при 37°С в С02-инкубаторе в течение 4 ч. Затем супернатант удаляли, к осадку добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида, ресуспендировали, переносили пробы в плоскодонный планшет для иммунологических исследований и измеряли оптическую плотность на микропланшетном фотометре МиШвкап ЕХ (Финляндия) при длине волны 540 нм. В качестве контроля («нулевой» пробы) использовали физиологический раствор №С1 (0,9%). Результаты выражали в единицах оптической плотности.

По полученным результатам рассчитывали пролиферативный резерв лимфоцитов — отношение показателей пролиферации клеток в присутствии белкового антигена МВТ к значениям базальной лимфопролиферации.

2.3.4. Идентификация СВ95+лимфоцитов периферической крови

Определение СВ95+ клеток производили с помощью моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Москва, Россия) в лимфоцитотоксическом тесте [Петров Р.В. и соавт., 1992].

Принцип метода основан на способности специфических моноклональных антител (1§М и ^в) в присутствии комплемента оказывать цитотоксическое воздействие на СБ95+ лимфоциты.

Ход работы. Полученный образец клеток (см. 2.3.1) дважды отмывали раствором Хенкса, ресуспендируя и центрифугируя каждый раз при 1500 об/мин в течение 5 мин. В пробирку типа «эппендорф» вносили 40 мкл клеточной суспензии, предварительно стандартизировав количество клеток до 2,5x106/мл, добавляли 5 мкл моноклональных антител, ресуспендировали и инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре. После инкубации эппендорфы центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин. Надосадок в количестве 40 мкл аккуратно убирали пипеткой. К осадку добавляли 25 мкл сыворотки кролика, содержащей комплемент, ресуспендировали и инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. Далее вносили 0,2% раствор эозина и подсчитывали 100 лимфоцитов, дифференцируя среди них окрашенные. Результаты выражали в процентах (к 100 подсчитанным клеткам).

2.3.5. Детекция апоптотических лимфоцитов периферической крови Определение количества апоптотических лимфоцитов осуществляли с помощью набора ANNEXIN V FITC [«Beckman Coulter», Франция].

Принцип метода основан на способности аннексина V в присутствии

Л I ионов Ca специфически связываться с фосфатидилсерином (PS) мембран клеток, что позволяет детектировать клетки, находящиеся в раннем апоптозе.

Ход работы. Образец клеток, полученный в п. 2.3.1, отмывали раствором Хенкса, затем промывали охлажденным на льду фосфатно-солевым буфером, центрифугировали 5 мин при 4°С при 500 g. Удаляли супернатант и ресуспендировали остаток клеток в 100 мкл Ca -содержащего охлажденного на льду разбавленного буфера из набора. Пробирки хранили на льду. Добавляли 1 мкл ANNEXIN V FITC раствора, осторожно перемешивали. Инкубировали на льду в темноте в течение 10 мин. Далее добавляли 200 мкл охлажденного на льду разбавленного буфера, осторожно перемешивали. Анализировали образец клеток с „ - . , , г г Рис. 2. Микрофотография апоптотических использованием флуоресцентного ЛИМФОЦИТОВ периферической крови. т г Флуоресцентная микроскопия. Ув. х 1000 микроскопа Axiostar plus («Carl Zeiss»,

Германия). Подсчитывали процент лимфоцитов, находившихся в апоптозе (зеленая флуоресценция клеток) на 200 клеток (рис. 2).

2,3.6. Определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови

2.3.6.1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в лимфоцитах (количество гранул на клетку) определяли цитохимическим методом Нахласа в модификации Р.П. Нарциссова [1969], основанным на подсчете образованных в клетке видимых гранул диформазана при использовании п-нитротетразолия фиолетового в 30-50 лимфоцитах (рис. 3).

Мазки периферической крови после инкубации её в течение 1 ч или 2 ч с изониазидом (10 мкг/мл), рифампицином (10 мкг/мл) и этамбутолом (25мкг/мл) фиксировали в насыщенном трилоном Б 60% ацетоне в течение 30 с, промывали в дистиллированной воде и инкубировали 1 ч при 37°С в среде следующего состава: 25 мл среды без субстрата (6,5 мг трилона Б, 6,5 мг паранитротетразолия фиолетового, 25 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 7,3)), 270 мг янтарнокислого натрия. После инкубации мазки промывали проточной водой, высушивали и докрашивали раствором азура II (30 мин).

Средний цитохимический коэффициент (СЦК) рассчитывали по формуле: количество гранул

СЦК = количество исследуемых клеток

Более детальный анализ популяции лимфоцитов производили путем изучения гистограммы распределения лимфоцитов с различной активностью дегидрогеназ у каждого обследованного. Было выделено 3 рис, з. Микрофотография лимфоцитов периферической крови. Цитохимическая популяции лимфоцитов в зависимости от реакция на сукцинатдегидрогеназу. Световая микроскопия. Ув. *900 активности фермента: клетки с высокой активностью (20 и более гранул диформазана на клетку), средней (10-19) и низкой (до 9 гранул).

2.3.6.2. Определение активности а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ)

Выявление активности митохондриальной а-ГФДГ и оценку результатов реакции проводили аналогичным определению активности СДГ методом (см. 2.3.6.). Инкубационную среду готовили, добавляя к 25 мл среды без субстрата 315 мг а-глицерофосфата натрия (pH 7,3).

2.3.6.3. Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) Выявление активности ЛДГ и оценку результатов реакции проводили аналогичным определению активности СДГ методом (см. 2.3.6.). Инкубационную среду готовили, добавляя к 25 мл среды без субстрата 3 мл 0,2 М лактата лития, 1,5 мг феназинметасульфата и 6 мг НАД1".

2.4. Статистическая обработка результатов Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью стандартного пакета программ «Statistica for Windows» (Version 6.0) фирмы «StatSoft Inc.» и пакета программ «Microsoft Excel» (2003) корпорации «Microsoft». Результаты представляли в виде выборочных средних (М) и ошибки среднего (ш), а также в виде медианы, верхнего (75%-го) и нижнего (25%-го) квартилей (Me (Q1-Q2)). Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии распределения признака в исследуемых выборках нормальному закону проверку гипотезы о равенстве генеральных средних проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки достоверности различий выборок, распределение которых не соответствовало нормальному закону, использовали непараметрический Mann Whitney U test для независимых выборок и Wilcoxon matched pairs test для зависимых выборок. Зависимость параметров в группах оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена (Spearman rank correlation). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05.