Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Иммуномодулирующие свойства основных и резервных препаратов стандартной химиотерапии туберкулёза лёгких

V?

!

На правах рукописи

Серебрякова Валентина Александровна

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ И РЕЗЕРВНЫХ ПРЕПАРАТОВ СТАНДАРТНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЁЗА ЛЁГКИХ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

2 0 КНВ2011

ТОМСК-2010

004619637

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор

Новицкий Вячеслав Викторович

Уразова Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Венгеровский Александр Исаакович Удут Елена Владимировна Жукова Оксана Борисовна

Ведущая организация:

Государственное учреждение «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН» (г. Москва)

Защита состоится 25 февраля 2011 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, у;

доктор биологических наук E.H. Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По существующим оценкам, в структуре заболеваемости туберкулёзом органов дыхания ведущей формой является инфильтративный туберкулёз, что позволяет рассматривать данное заболевание как одну из наиболее значимых медико-социальных проблем отечественного здравоохранения [Григорьева Е.А., 2006; Мишин В.Ю. и соавт., 2006; Волчегорский И.А. и соавт., 2008].

На протяжении последних десятилетий в комплексе методов современной терапии туберкулёза ведущее положение занимает комбинированная этиотропная химиотерапия с использованием препаратов первого ряда - изониазид, рифампицин, этамбутол, пира-зинамид, стрептомицин, и (при лекарственно-устойчивом туберкулёзе лёгких) препаратов второго ряда - аминогликозиды, тионамиды, капреомицн, циклосерин, параамино-салициловая кислота и препараты группы фторхинолонов [Мишин В.Ю., Степанян И.Э., 2000; Мишин В.Ю., 2001; Chan E.D., Iseman M.D., 2002; Harries A. et al., 2002; Sterling T.R. et al., 2003; Мишин В.Ю., Чуканов В.И., 2004; Лазарева Н.Б. и соавт., 2008]. Однако с внедрением её стандартных режимов, рекомендованных ВОЗ, количество случаев терапевтических неудач все еще остается высоким [Мишин В.Ю. и соавт., 2003,2006, 2007; Перельман М.И. и соавт., 2004; Al-Attiyah R., Mustafa A.S., 2008; Gon-zalez-Juarrero M. et al., 2009]. В качестве одной из причин недостаточной эффективности химиотерапии туберкулёза лёгких рассматривается токсическое действие противотуберкулёзных препаратов (ПТП) на клетки макроорганизма [Мишин В.Ю. и соавт., 2003; Чуканов В.И. и соавт., 2004; Новицкий В.В. и соавт., 2009], в том числе и негативное влияние ПТП на клетки иммунной системы [Арцимович Н.Г., Настоящая Н.Н., 1994; Jimenez-Valera М. et al., 1995; Инсанов А.Б. и соавт., 1998; Calleja С. et al., 1998; Гольсв С .С., 2000; Гельберг И.С. и соавт., 2002; Pahlevan А.А. et al., 2002; Gil D. et al., 2003; Jun Y.T. et al., 2003; Васильева O.A., 2009; Ерохина M.B. и соавт., 2009; Новицкий В.В. и соавт., 2009; Селицкая Р.П., 2009], что неблагоприятно отражается на течении воспалительного процесса.

Общеизвестно, что ключевое значение в реализации иммунного ответа играет межклеточная кооперация иммунокомпетентных клеток крови [Lasco Т.М. et al., 2003; Коненков В.И. и соавт., 2005; Guyot-Revol V., 2006; Savvant K.V., McMurray D.N., 2007; Aktas E. et al., 2009]. Причиной дизрегуляции реакций противоинфекционной защиты при туберкулёзе являются нарушения структурно-метаболического и функционального

статуса лимфоцитов и моноцитов, которые регистрируются не только в период активного развития инфекции, но и в период ремиссии. Так, ранее проведёнными исследованиями было показано, что у больных лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких после завершения курса интенсивной и поддерживающей терапии имеют место изменения морфологии, дисбаланс процессов пролиферации и апоптоза лимфоцитов, продукции иммунорегуляторных цитокинов мононукле-арными лейкоцитами крови in vitro, нарушения адгезии, поглотительной и переваривающей функции клеток системы мононуклеарных фагоцитов [Серебрякова В.А. и со-авт., 2006; Новицкий В.В. и соавт., 2006, 2007, 2009; Воронкова О.В., 2007; Филинюк О.В. и соавт., 2007].

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что в настоящее время имеется сравнительно немного работ, посвященных оценке прямого (in vitro) влияния ПТП на показатели неспецифической резистентности и специфического иммунитета. Практически все научно-исследовательские работы аналогичного направления выполнены в экспериментах на животных, либо на периферической крови здоровых доноров. Вместе с тем, в доступной литераторе сведения о прямом влиянии ПТП на иммунокомпетент-ные клетки у больных туберкулёзом лёгких практически отсутствуют. Следует подчеркнуть, что, несмотря на универсальный характер механизмов, лежащих в основе ан-тиген-индудированных изменений функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определяющим фактором их ответной реакции на действие родственных повреждающих факторов (в том числе при медикаментозном воздействии) является фоновое состояние клеток и их адаптационная реактивность, резерв которой в условиях развивающегося инфекционного процесса претерпевает выраженное истощение.

Функционирование иммунной системы обеспечивается постоянной рециркуляцией иммунокомпетентных клеток и их взаимодействием, а сбалансированность иммунного ответа на антигенную агрессию непосредственно зависит от основных физиологических процессов, происходящих в самой иммунной системе, определяемых клональной пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом клеток, интенсивностью внутриклеточного метаболизма, секрецией биомолекул, обеспечивающих кооперацию регулятор-ных и эффекторных клеток в процессе реализации иммунного ответа.

Учитывая глубокую дисфункцию иммунной системы, сопровождающую развитие туберкулёза лёгких, и высокую фармакологическую активность применяемых ПТП, ис-

следование механизмов их прямого влияния на иммунокомпетентные клетки крови в условиях патологии представляет значительный интерес, поскольку именно уровень иммунологической реактивности организма при туберкулёзе оказывает существенное влияние на течение и исход заболевания.

В заключение следует отметить, что актуальность изучения особенностей влияния основных и резервных препаратов химиотерапии туберкулёза на метаболическую, функциональную активность и апоптоз лимфоцитов крови не вызывает сомнений, поскольку определяет возможность более глубокого понимания сути патогенеза иммунопатологических осложнений в условиях применения ПТП и может быть основой разработки способов эффективной направленной иммунокорригирующей терапии.

Цель исследования: выявить механизмы и особенности прямого (in vilro) действия основных и резервных препаратов противотуберкулёзной химиотерапии на иммунокомпетентные клетки периферической крови при туберкулёзе лёгких.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать прямое (in vitro) влияние препаратов химиотерапии туберкулёза лёгких основного (изониазид, рифампицин, этамбутол) и резервного (офлоксацин, парааминосалициловая кислота, капреомицин) ряда на реактивность мононуклеар-ных лейкоцитов, ферментативные свойства и апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и при инфильтративном туберкулёзе лёгких.

2. Провести сравнительную оценку цитопатических эффектов противотуберкулёзных препаратов in vitro у здоровых доноров и больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких.

3. Установить общие закономерности и особенности прямого (in vitro) иммунотропно-го действия основных и резервных противотуберкулёзных препаратов при лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом инфильтративном туберкулёзе лёгких.

4. Оценить in vitro прспарат-индуцированные нарушения цитокинопродукции, ферментативной, пролиферативной и апоптотической активности лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких в зависимости от вида применяемых противотуберкулёзных препаратов.

Научная новизна. Проведено комплексное изучение прямого (in vitro) влияния ПТП основного (первого) и резервного (второго) ряда на реактивность мононуклеар-

ных лейкоцитов, метаболизм и апоптоз лимфоцитов крови у больных с впервые выявленным инфильтративным туберкулёзом лёгких (до начала проведения им специфической терапии). Впервые показано, что основные и резервные ПТП способны in vitro оказывать модулирующее действие на антиген-индуцированную секрецию мононукле-арными лейкоцитами про- и противовоспалительных цитокинов, что проявляется как её активацией (IL-2 при действии рифампицина, IL-12 под влиянием изониазида, IL-10 в присутствии парааминосалициловой кислоты и TGF|3 при действии офлоксацина, пара-аминосалициловой кислоты и капреомицина), так и угнетением (IL-2 под влиянием изониазида, IL-12 в присутствии рифампицина и офлоксацина, IL-10 и TGF-J5 при действии рифампицина, IFN-7 под влиянием рифампицина, этамбутола, офлоксацина и тара в присутствии офлоксацина). Впервые установлено, что этамбутол, офлоксацин, парааминосалициловая кислота и капрсомицин in vitro подавляют пролиферацию анти-генспецифических лимфоцитов у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких. Впервые показано, что основные и резервные ПТП in vitro индуцируют угнетение активности сукцинатдегидрогсназы в лимфоцитарных клетках (в условиях перераспределения популяции лимфоцитов периферической крови с повышением доли низкоактивных клеток), стимулируют активность кислой фосфатазы и апоптоз лимфоцитов. Продемонстрировано, что у больных лекарственно-резистентным туберкулёзом лёгких in vitro интенсивность антиген-индуцированной секреции IFNy (при действии рифампицина, этамбутола и капреомицина), IL-4 (под влиянием изониазида, этамбутола, офлоксацина и парааминосалициловой ксилоты), 'FNFa (в присутствии офлоксацина) и количество С095+-лимфоцитов (при действии офлоксацина) ниже, а секреция IL-12 (под влиянием изониазида, офлоксацина, парааминосалициловой кислоты и капреомицина), IL-10 (в присутствии изониазида и парааминосалициловой кислоты) и TGF-J3 (при действии изониазида и рифампицина), напротив, выше, чем при лекарственно-чувствительном варианте заболевания. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких лимфоциты более чувствительны к экзогенному лекарственному воздействию in vitro, чем у здоровых доноров. Так, у пациентов с туберкулёзом лёгких отмечается более выраженное угнетение пролиферации антигенспецифических лимфоцитов (при действии офлоксацина), активности сукцинатдегидрогеназы и изменение структуры популяции лимфоцитов (после 2-часового воздействия основных и резервных ПТП), увеличение среднего цитохимиче-

ского коэффициента кислой фосфатазы (под влиянием изошшида, этамбутола и капре-омицина) и числа апоптотических лимфоцитов (в присутствии рифампинина и офлок-сацииа). При этом у здоровых доноров регистрируется более значительное подавление антиген-индуцированной секреции мононуклеарными лейкоцитами IFNy (при действии рифампицина) и IL-10 (под влиянием рифампицина). Впервые показано, что у больных туберкулёзом лёгких in vitro рифампицин обладает более выраженным иммуносупер-ссорным эффектом, чем изониазид и этамбутол, что проявляется более высокой степенью угнетения антиген-индуцированной секреции IFNy и более низким уровнем анти-ген-стимулированной продукции мононуклеарными лейкоцитами IL-12 при его действии. Впервые продемонстрировано, что у больных туберкулёзом лёгких иммуномоду-лирующий эффект офлоксацина in vitro более выражен, чем у парааминосалициловой кислоты и капреомицина. Так, при действии офлоксацина регистрируется увеличение числа аноптотаческих лимфоцитов (что не было отмечено в присутствии капреомицина), а также более значительное повышение доли клеток с низкой активностью сукци-натдегидрогеназы. Впервые установлено, что иммунотропный эффект основных препаратов химиотерапии туберкулёза проявляется более значимым, чем у ПТП резервного ряда, апоптоз-индуцирующим действием, повышением активности кислой фосфатазы в лимфоцитах и увеличением антиген-стимулированной секреции IL-4 in vitro. Иммуно-модулирующее действие препаратов второй линии in vitro характеризуется более высокой степенью подаачения активности сукцинатдегидрогеназы и угнетением антиген-индуцированной TNFa-секреторной активности мононуклеарных лейкоцитов.

Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые данные фундаментального характера о механизмах прямого (in vitro) иммупомодулирующего действия ПТП первого и второго ряда на антиген-индуцировапную секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами, пролиферацию, апоптоз и метаболизм лимфоцитов крови у больных с инфильтративным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких. Результаты исследования теоретически обосновывают необходимость включения в стандартную схему лечения больных туберкулёзом лёгких иммуномодулирующих препаратов для профилактики и коррекции иммуноде-фицитных состояний, обусловленных влиянием не только возбудителя, но и ПТП. Полученные данные могут быть положены в основу разработки методологического под-

хода к коррекции лекарственно-индуцированных нарушений реактивности мононукле-арных лейкоцитов, сопровождающих течение туберкулёзной инфекции на этапе специфического лечения. Знание механизмов прямого иммунотропного действия ПТП на мононуклеарные лейкоциты больных туберкулезом лёгких представляет значительный интерес для фтизиатрической практики и иммунологии не только с точки зрения получения новых фундаментальных знашй, но и дальнейшей разработки на основе уже известных и широко применяемых лекарственных средств с известной структурой новых их производных с выраженным иммуномодулирующим эффектом. Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе ГОУ ВПО СибГМУ Росз-драва на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета» и кафедре фармакологии в лекционных и практических разделах по теме «Побочное действие антимикробных средств».

Положения, выносимые на защиту:

1. В основе иммунотропного действия основных (изониазид, рифампицин, этамбу-тол) и резервных (офлоксацин, парааминосалициловая кислота, капреомицин) противотуберкулёзных препаратов in vitro у здоровых доноров и больных с ин-фильтративным туберкулёзом лёгких лежит модулирующее их влияние на анти-ген-индуцированную секрецию мононуклеарными лейкоцитами крови провоспа-лительных (IL-2, IL-12, IFNy, TNFa) и противовоспалительных (IL-4, IL-10, TGFp) цитокинов, подавление пролиферации и активация апоптоза лимфоцитов с угнетением в них активности сукцинатдегидрогеназы и повышением активности кислой фосфатазы.

2. Ответная реакция мононуклеарных лейкоцитов крови на прямое действие противотуберкулёзных препаратов основного и резервного ряда (в условиях дополнительной антигенной нагрузки и без неё) определяется исходным состоянием клеток. При этом у больных туберкулёзом лёгких in vitro апоптоз, угнетение проли-феративного ответа антигенспецифических клеток, дисбаланс ферментативной активности лимфоцитов, индуцированные противотуберкулёзными препаратами, носят более выраженный характер, чем у здоровых доноров.

3. У больных лекарственно-резистентным инфильтративным туберкулёзом лёгких in vitro при действии противотуберкулёзных препаратов первого и второго ряда

степень секреторной дисфункции мононуклеарных лейкоцитов является более выраженной, чем при лекарственно-чувствительном варианте инфекции. Наибольший суммарный негативный эффект на иммунокомпетентные клетки крови из числа противотуберкулёзных препаратов основного ряда оказывает рифам ии-цин, а из препаратов второй линии - офлоксацин.

4. Противотуберкулёзные препараты основного ряда in vitro способны не только подавлять, но и активировать секрецию ThI-ассоциированных цитокинов: IL-2 (рифампицин) и IL-12 (изониазид) в ответ на антигенное воздействие. При этом они оказывают более выраженное стимулирующее влияние на секрецию IL-4, апоптоз и активность кислой фосфатазы в лимфоцитах крови, чем резервные противотуберкулёзные препараты, наиболее значимыми цитопатическими эффектами которых являются угнетение активности фермента цикла трикарбоновых кислот (сукцинатдегидрогеназы) в лимфоцитах и секреции TNFa мононуклеарными лейкоцитами крови.

Реализация н апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на IX, X конгрессах молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008, 2009), межгородских конференциях молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), II Архангельской международной медицинской конференции молодых учёных и студентов (Архангельск, 2009), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), VII международной Российско-германской конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции» (Новосибирск, 2009), а также на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009).

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК №02.412.11.2040; ГК №02.512.11.2112; ГК №02.512.11.0013) и Совета по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-4153.2006.7; НШ-2334.2008.7).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из них 10 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает 422 источника, из них 231 отечественных и 191 зарубежных авторов.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работы положены результаты обследования 143 впервые выявленных больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких (TJI) в возрасте от 18 до 55 лет (104 мужчины и 39 женщин). Все обследованные пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач - к.м.н. Г.В. Янова) во фтизиотерапевтическом отделении №1 (и.о. зав. отд. -Е.П. Степанова).

Клинический осмотр пациентов, сбор анамнеза, физикальные методы обследования больных и постановку диагноза осуществляли врачи-фтизиатры Томской областной туберкулёзной клинической больницы: к.м.н. Некрасов Е.В., к.м.н. Филигаок О.В., к.м.н. Петрова Л.Е., Степанова Е.П., Мельникова Т.И., Янов А.А., Щегерцов Д.А.

Диагноз устанавливался на основании клинической картины заболевания, данных рентгенологического исследования лёгких, результатов микроскопического и бактериологического исследования мокроты.

В зависимости от чувствительности возбудителя к противотуберкулёзным препаратам (ПТП) основного ряда все больные были распределены на две группы: первую группу составил 91 пациент, выделяющий Mycobacterium tuberculosis (М. tuberculosis), чувствительные к основным ПТП, во вторую группу были включены 52 больных, выделяющих М. tuberculosis, устойчивые к одному и более ПТП основного ряда - изониа-зиду, рифампицину, стрептомицину. Лекарственную чувствительность М. tuberculosis определяли традиционным методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. Исследования проводились в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулёзной клинической больницы и Томского областного противотуберкулёзного диспансера.

В исследование не включались пациенты моложе 18 и старше 55 лет, инфицированные вирусами гепатита и ВИЧ, страдающие иными инфекциями в стадии обострения, аллергическими и аутоиммунными заболеваниями.

Контрольную группу составили 49 здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу (35 мужчин и 14 женщин) и возрасту.

Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл.

Исследование иммунологических показателей у больных TJ1 проводили до начала противотуберкулёзной терапии. Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови осуществляли методом градиентного центрифугирования [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Для индукции секреторной функции мононуклеарных лейкоцитов и пролиферации лимфоцитов в пробы вносили комплексный белковый антиген, выделенный из М. tuberculosis семейства Beijing1, в дозе 20 мкг/мл и вакцинный штамм BCG (Bacillus Calmette-Guerrin) (ФГУП «НПО «Микроген», Россия) - в дозе 50 мкг/мл. Изучение влияния ПТП основного (изониазид, рнфампицин, этамбутол) и резервного (офлокса-цин, капреомицин, парааминосалициловая кислота) ряда на секрецию цитокинов моно-нуклеарными лейкоцитами и пролиферацию лимфоцитов проводили на модели индуцированной секреции. Для этого получали три вида супернатантов: от клеток, культивируемых в питательной среде (базальная); от клеток, культивируемых в питательной среде в присутствии белкового антигена М. tuberculosis или вакцинного штамма BCG (антиген-ивдуцированная); от клеток, культивируемых в питательной среде в условиях индукции белковым антигеном М. tuberculosis или вакцинным штаммом BCG в присутствии ПТП (антиген-ивдуцированная в присутствии ПТП). Конечная концентрация исследуемых ПТП в культуральной среде составила 10 мкг/мл - для изониазида, рифам-пицина и офлоксацина, 20 мкг/мл - для капреомицина, 25 мкг/мл - для этамбутола и 150 мкг/мл - для парааминосапициловой кислоты (Г1АСК). В контрольные пробы вносили полную среду RPMI-I640. Для количественного определения цитокинов клеточные суспензии инкубировали при 37°С и 5% С02 в течение 24 ч. После инкубации пробирки встряхивали, центрифугировали 10 мин при 500 g, сунернатант собирали и использовали для количественного определения концентраций цитокинов.

1 Антиген предоставлен иммунологической лабораторией института инфекционной биологии им. Макса Планка (г. Берлин)

Определение концентрации интерлейкинов (IL) -2, -4, -10, -12, интерферона (1FN) у, фактора некроза опухолей (TNF) а и трансформирующего фактора роста (TGF) ß в культуральных супернатантах осуществляли методом твердофазного иммунофермент-ного анализа, согласно инструкциям, предлагаемым отечественными (ЗАО «Вектор-Бест», ООО «Протеиновый контур», ООО «Цитокин», Россия) и зарубежными («Bender Medsystems», Австрия; «BioSource Europe S.A.», Бельгия) производителями тест-систем.

Пролиферацию лимфоцитов оценивали с помощью МТТ-теста [Carmichael J., 1987]. Результаты теста выражали в едииицах оптической плотности.

Для исследования апоптоза лимфоцитов периферической крови проводили отделение моноцитов путем инкубации суспензии отмытых мононуклеарных лейкоцитов в пластиковых чашках Петри при 37°С в течение 1 ч. Затем содержимое чашки переносили в пробирку, центрифугировали 10 мин при 500 g, к осадку добавляли 1 мл полной питательной среды. Для оценки препарат-индуцированного апоптоза лимфоцитов клетки культивировали в питательной среде в присутствии ПТГ1: изониазида (10 мкг/мл), рифамлицина (10 мкг/мл), этамбутола (25 мкг/мл), офлоксацина (10 мкг/мл), канреоми-цина (20 мкг/мл) и ПАСК (150 мкг/мл) в течение 20 ч. В контрольные пробы вносили полную среду RPMI-1640.

Определение С095+-лимфоцитов проводили лимфоцитотоксическим методом [Петров Р.В. и соавт., 1992] с использованием моноклонального антитела (ООО «Сорбент», Россия) к антигену CD95.

Детекцию апоптотических лимфоцитов периферической крови осуществляли с помощью набора ANNEX SN V F1TC методом люминесцентной микроскопии [«Beck-man Coulter», Франция].

Дозы химиопрепаратов рассчитывали, исходя из приемов перерасчета, используемых в токсикологии, принимая суточную дозу препарата на 1 кг массы тела за концентрацию в 1 л инкубационной среды, с учетом их фармакокинетических параметров. Так, при лечении туберкулёза, согласно стандартным схемам химиотерапии и режимам дозирования, изониазид назначается в дозе 5-10 мг/кг, рифампицин - 8-10 мг/кг, этам-бутол - 15-25 мг/кг, офлоксацин - 7,5-15 мг/кг, ПАСК - 140-180 мг/кг, капреомицин -не более 20 мг/кг [Фрейдович А.И., 1999; Машковский М.Д., 2002; Перельман М.И. и соавт., 2003; Краснов В.А., Урсов В.Г., 2004; Мишин В.Ю. и соавт., 2007]. При выборе

концентраций ПТП мы исходили из учёта терапевтической дозы лекарственных препаратов (ближе к верхнему пределу) в связи с неодинаковым распределением препаратов в жидкостных компартментах организма. Субстанции химиопрепаратов («Sigma», США) были предоставлены бактериологической лабораторией Томского областного противотуберкулёзного диспансера.

Активность кислой фосфатазы (КФ) в лимфоцитах определяли цитохимическим методом Ф.Г. Дж. Хэйхоу, Д. Кваглино [1983]. Активность сукцинатдегидрогеиазы (СДГ) в лимфоцитах (количество гранул на клетку) оценивали цитохимическим методом Нахласа в модификации Р.П. Нарциссова [1969]. Мазки периферической крови готовили после инкубации цельной крови с изониазидом (10 мкг/мл), рифампицином (10 мкг/мл), этамбутолом (25 мкг/мл), офлоксацином (10 мкг/мл), капреомицином (20 мкг/мл) и ПАСК (150 мкг/мл) в течение 1 ч и 2 ч. Результаты выражали в условных единицах с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Наряду с вычислением СЦК проводили анализ гистограммы распределения лимфоцитов по активности СДГ. Было выделено 3 популяции лимфоцитов: клетки с высокой активностью СДГ (20 и более гранул диформазана на клетку), средней (10-19 гранул) и низкой (до 9 гранул).

Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью стандартного пакета программ «Statistica for Windows» (Version 6.0) фирмы «StatSoft Inc.» и «Microsoft Exel» (2003) корпорации «Microsoft». Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Шапиро-Уилка. Поскольку все количественные показатели в группах сравнения не имели нормального распределения, результаты представляли в виде медианы (Me), нижнего (25%-го) и верхнего (75%-го) квартилей (Q1-Q3)). Для оценки достоверности различий зависимых выборок использовали нспараметрический Wilcoxon matched pairs test, для независимых выборок применяли непараметрический Mann Whitney U test. Зависимость параметров в группах оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена (Spearman rank correlation). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Значительные успехи, достигнутые в области изучения патофизиологии клетки, свидетельствуют о том, что ключевые процессы, обеспечивающие развитие иммунных реакций, могут быть мишенью различных неблагоприятных воздействий, в том числе

отрицательного влияния антибиотиков. При этом известно, что любые физиологически значимые нарушения внутриклеточного метаболизма, секреции, процессов пролиферации, созревания и апоптоза иммунокомпетентных клеток (ИКК) способны привести к дисбалансу иммунных реакций и, как следствие, снижению противоинфекционной резистентности организма.

Согласно современным представлениям, патогенетическую основу туберкулёза представляет классическая реакция гиперчувствительности замедленного типа, связанная с формированием моноиуклеарньгх инфильтратов с высокоактивными макрофагами и преимущественно Т-лимфоцитами-хелперами типа 1 (Thl) [Feng C.G. et al., 2005; Olleros ML. et al., 2005; Темчура O.B. и соавт., 2007]. Ключевое значение в регуляции иммунологического гомеостаза при развитии реакций иммунной защиты играет кооперативное межклеточное взаимодействие, осуществляемое с помощью универсальных эффекторных молекул, объединенных в систему цитокинов [Томова А.С. и соавт., 2005; Ершов Ф.И., 2006; Sawant K.V., McMurray D.N., 2007; Тюлькова Т.Е. и соавт., 2008].

Анализ влияния противотуберкулёзных препаратов (ПТП) основного ряда на ци-токинсекреторную активность мононуклеарных лейкоцитов показал, что добавление в культуры клеток изониазида сопровождалось угнетением продукции IL-2 и увеличением секреции IL-12 при действии белкового микобактериального антигена только у пациентов с лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких (ЛУТЛ) (табл. 1).

Обращало на себя внимание, что наибольшее количество изменений резерва цито-кинсекреторной активности мононуклеарных клеток регистрировалось при действии рифампицина. Так, во всех группах исследования отмечалось увеличение продукции IL-2 и угнетение секреции IFN7, IL-12 и IL-10 in vitro (табл. 1). Кроме того, у больных лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких (ЛЧТЛ) и ЛУТЛ фиксировалось снижение белок-индуцированной секреции клетками TGF0 (табл. 1).

Установленные нами изменения белок-индуцированной секреции цитокинов мо-нонуклеарными лейкоцитами при действии рифампицина, на наш взгляд, могут быть интерпретированы как в пользу позитивного (за счет опосредованной IL-2 индукции процессов клеточного деления и супрессии продукции IL-10 и TGFp), так и негативного (подавление секреции IFNy и IL-12) модулирующего эффекта данного препарата.

Действие этамбутола характеризовалось подавлением белок-индуцированной секреции мононуклеарами IFNy как у здоровых лиц, так и у пациентов с ТЛ (табл. 1).

Таблица 1

Направленность действия противотуберкулёзных препаратов основного ряда на белок-индуцированную секрецию цитокинов момонуклеарными лейкоцитами периферической крови in vitro у здоровых доноров и больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких

Цитокины Здоровые доноры Больные лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких Больные лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких

Изопиазид Рифампицин Этамбутол Изопиазид Рифампшцш Этамбугол Изопиазид Рифамшшин Этамбутол

IL-2 I t _ * _ т — 1 Г —

JL-4 т т — — — — —

IL-10 т 1 1 — — 1 -

1L-12 — 1 * — i 1 т I *

tFNy — 1 1 i - 1 i — 1 1

TOFP — - • 1 - I * — 1 *

TNFa — - i - — —

Примечание. Здесь и в таблице 2: «Т» - повышение секреции цитокши, «1» - угнетение секреции цитошна, «-» - отсутствие эффекта препарата, «*» - эффект препарата не был исследован.

Интересно, что только у здоровых доноров рифампицин и этамбутол индуцировали увеличение стимулированной белковым антигеном М. tuberculosis продукции IL-4 (табл. 1). Данный факт, возможно, обусловливался как особенностями исходного функционального состояния ТЪ2-лимфоцитов, так и их большей устойчивостью к апоптоти-ческой гибели, опосредованной конститутивной экспрессией большого количества Fas-ассоциированной фосфатазы, участвующей в дефосфорилировании цитоплазмати-ческой части CD95 и защищающей тем самым клетку от Fas-опосредованного апоптоза [Sato T. et al., 1995; Потапнев М.П., 2002]. Действительно, при добавлении в культуры клеток рифампицина число апототических лимфоцитов у здоровых лиц было ниже, а продукция IL-4 (при действии рифампицина и этамбутола), напротив, выше, чем у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ.

Анализ влияния ПТП резервного ряда на цитокинсекреторную активность моно-нуклеарных клеток у пациентов с ЛЧТЛ показал, что только офлоксацин индуцировал снижение BCG-стимулированной секреции IFNy (как и у здоровых лиц), IL-12 и увеличение продукции клетками IL-4 (табл. 2).

Рассматривая цитокины в рамках единой регуляторной системы и принимая во внимание механизм положительной паракринной регуляции с обратной связью, можно предположить, что подавление BCG-индуцировашюй секреции IFNy при действии оф-локсацина у больных ЛЧТЛ опосредовалось низкой продукцией IL-12 при действии BCG.

Неоднократно обосновано, что определение ключевых медиаторов клеточного и гуморального иммунитета - IFNy и IL-4 - дает возможность ориентировочной оценки баланса ТЫЛЪ2-ответов, а также функциональной активности лимфоцитов указанных субпопуляций [Torres M. et al., 1998; Фрейдлин И.С., 2001; Кетлинский С.А., 2002; Williams А.С. et al., 2005; Железникова Г.Ф., 2008]. В этой связи установленное нами у больных ЛЧТЛ при действии офлоксацина смещение резерва ТЫЛЪ2-цитокинового баланса в сторону IL-4 может быть рассмотрено как проявление негативного модулирующего эффекта данного препарата, способствующего пролиферации В-лимфоцитов и преобладанию гуморальных иммунных реакций, малоэффективных в отношении элиминации M. tuberculosis.

У больных ЛУТЛ добавление в культуры клеток офлоксацина, как и у здоровых доноров, сопровождалось снижением BCG-индуцированной секреции TNFa (табл. 2).

Таблица 2

Направленность действия противотуберкулёзных препаратов резервного ряда на BCG-индуцированную секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови in vitro у здоровых доноров и больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких

Цитокины Здоровые доноры Больные лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких Больные лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких

Офлоксацик ПАСК Капреомицин Офлаксашт ПАСК Капреомицин Офлоксацин ПАСК Капреомицин

IL-2 — - — — — - 1_1_

1L-4 — — Т — — — -

IL-I0 — — - — — т -

IL-12 - 1 — — — — - ! ' - и

IFNy 1 ^ - - 1 — — — _ -

TGFp 1 1 1 — — Т т Г

TNFa 1 1 1 — " 1 " 1 _ —

Примечание: ПАСК - параашшосалициловая кислота.

При действии ПАСК и капреомицина изменения резерва цитокинсекреторной активности мононуклеарных лейкоцитов регистрировались только у пациентов с ЛУТЛ и здоровых доноров. Так, у пациентов с ЛУТЛ ПАСК усиливал BCG-стимулированную секрецию IL-10 (табл. 2). Учитывая общеизвестный спектр биологических эффектов данного цитокина, факт увеличения его продукции можно интерпретировать как результат негативного модулирующего действия ПАСК, способствующего подавлению реакций клеточного иммунитета.

У здоровых лиц воздействие ПАСК сопровождалось угнетением BCG-инду-цированной продукции IL-12, а также (как и при действии капреомицина) снижением секреции TNFa (табл. 2).

Обращало на себя внимание, что все изученные ПТП резервного ряда вызывали разнонаправленные изменения BCG-стимулированной продукции TGFp у пациентов с ЛУТЛ и здоровых доноров. Так, у пациентов с ЛУТЛ регистрировалось увеличение, а у здоровых лиц, напротив, угнетение BCG-индуцированной секреции данного цитокина (табл. 2).

В последнее время снижение интенсивности протективного иммунного Thl-ответа при ТЛ ряд авторов [Сахно Л.В. и соавт., 2004; Фрейдлин И.С., 2005; Guyot-Revol V. et al., 2006; Burl S. et al., 2007; Chen X. et al., 2007; Лядова И.В., Гергерт В.Я., 2009] связывают с высоким содержанием в крови T-reg-клеток (CD4*CD25+Foxp3+ и CD4+CD25"Foxp3+), принимающих участие в развитие анергии. При этом одним из механизмов реализации супрессорного действия данных популяций 'Г-лимфоцитов является секреция Thl-ингибирующих цитокинов - IL-I0 и TGFfi [Murakami М. et al., 2002; Shevach E.M., 2002; Thornton A.M. et al., 2004; Фрейдлин И.С., 2005; Воробьев A.A. и соавт., 2006; Burl S. et al., 2007]. Учитывая гипотезу о том, что нарушение клеточно-опосредованных иммунных реакций при ЛУТЛ в большей степени обусловлено анергией Т-лимфоцитов (нежели их функциональным истощением), можно предположить, что установленное нами только у пациентов с ЛУТЛ при действии ПТП резервного ряда увеличение BCG-стимулированной секреции TGFJ3 (и IL-10 под влиянием ПАСК) опосредовано препарат-индуцированной стимуляцией функциональной активности T-reg-клеток, возможно, их высокой восприимчивостью к лекарственному воздействию, а также более высоким, чем у пациентов с ЛЧТЛ, содержанием этих клеток в крови.

Интересно, что изменения антиген-индуцированной секреции TGF(3 при действии ПТГ1 основного и резервного ряда были разнонаправленными. Так, рифампицин вызы-

вал её подавление у больных TJ1 обеих групп, а офлоксацин, ПАСК и капрсомицин, напротив, повышение величины этого показателя (до уровня контрольных значений) у пациентов с ЛУТЛ.

Известно, что избыточная продукция TGF-ß сопровождается угнетением антиген-специфического иммунного ответа (в том числе и при туберкулёзной инфекции). Данный механизм реализуется за счет подавления экспрессии на Т-клетках рецепторов к IL-1, секреции 1L-12, пролиферации клеток, смещения баланса Т-лимфоцитов в сторону Th2, а также за счет прямого супрессорного действия на Т-лимфоциты [Зубова С.Г., Окулов В.Б., 2001; Фрейдлин И.С., 2001; Пронина H.A. и соавт., 2004; Allen S.S. et al, 2004; Тюлькова Т.Е. и соавт., 2008]. Учитывая преобладающий характер противовоспалительных эффектов TGFß, факт угнетения белок-шщуцированной секреции TGFß, установленный нами у больных TJI обеих групп при действии рифампицина (табл. 1) в период активного развития патологического процесса, по-видимому, является позитивным модулирующим эффектом данного препарата.

Известно, что процесс экспрессии генов цитокинов включает в себя ряд этапов: транскрипцию, процессинг мРНК, трансляцию и секрецию белка [Сенников C.B., Силков А.Н., 2005]. В этой связи изменения антигсн-индуцированной секреции изученных цитокинов при действии ПТП основного и резервного ряда, вероятно, обусловливались различными нарушениями на указанных этапах экспрессии генов медиаторов (активация или подавление определенных факторов транскрипции, дестабилизирующее действие на мРНК определенных цитокинов и т.д.), а также экспозиции цитокиновых рецепторов.

Завершая анализ изменений антиген-индуцированной секреции цитокинов при действии ПТГ1 основного и резервного ряда, следует обозначить два наиболее общих модулирующих эффекта препаратов у больных ТЛ: подавление секреции IFNy (при действии рифампицина, этамбутола и офлоксацина) и IL-12 (при действии рифампицина и офлоксацина). Поскольку IFNy и IL-12, стимулируя дифференцировку Thl и эф-фекторные функции макрофагов [Nolt D., Flynn J.L., 2004; Cho H. et al., 2005; Cho Ii., McMurray D.N., 2005; Feng C.G. et al., 2005; Ершов Ф.И., 2006; Jeevan A. et al, 2006; Лядова И.В., Гергерт В.Я., 2009], играют ключевую роль в формировании клеточно-опосредованных иммунных реакций, то подавление их секреции свидетельствует в пользу негативного модулирующего эффекта рифампицина, этамбутола и офлоксацина

Вместе с тем, установленный факт стимуляции антиген-индуцированной секреции ряда цитокинов (IL-2 (при действии рифампицина во всех группах обследуемых), IL-4 (при действии рифампицина, этамбутола у здоровых доноров и офлоксацина у больных ЛЧТЛ) и IL-12 (при действии изониазида у пациентов с ЛУТЛ)) (табл. 1, 2) позволяет думать о том, что итогом модулирующего влияния ГГГП основного и резервного ряда на процессы регуляции транскрипции генов цитокинов может быть не только подавление, но и увеличение образования конечного продукта

Одним из важнейших этапов ответа иммунной системы на активацию клетки является пролиферация антигенспецифических лимфоцитов. Проведенное исследование позволило установить снижение активности антиген-индуцированной пролиферации лимфоцитов при действии этамбутола (во всех группах исследования), офлоксацина (у здоровых доноров и пациентов с ЛЧТЛ), ПАСК (у больных ТЛ обеих групп) и капрео-мицина (у пациентов с ЛЧТЛ).

Согласно современным представлениям, запуск процесса пролиферации лимфоцитов включает в себя ряд последовательно активирующихся элементов, такие как синтез IL-2, экспрессию рецептора для 1L-2 и lL-2-зависимый сигнальный каскад, включающий активацию нерецепторных тирозиновых киназ семейства JAK (JAK1 и JAK3), Src-киназ (Lck, Lyn, Fyn), Syk-киназ (Syk, Zap-70) и др., фосфорилирование транскрипционных факторов (STAT3 и STAT5a/ß) [Марахова И.И. и соавт., 2003, 2004; Карицкая И.А. и соавт., 2005,2006,2008].

Поскольку действие этамбутола, офлоксацина, IIACK и капреомицина не сопровождалось изменением антиген-индуцированной секреции IL-2, то в основе угнетения пролиферативного ответа антигенспецифических лимфоцитов в условиях их инкубации с данными ПТП следует предполагать нарушения на последующих этапах реализации процесса пролиферации лимфоцитов. Поскольку для высокоаффинного взаимодействия IL-2 со своим рецептором требуется участие всех его субъединиц - IL-2Ra (CD25), IL-2Rß (CD122) и ус (CD132) (общей у-цепи цитокиновых рецепторов)) [Симбирцев A.C., 1998; Карицкая И.А. и соавт., 2006; Зенин В.В. и соавт., 2009], то одним из механизмов установленных изменений могли быть обусловленные препаратами нарушения на этапах синтеза (субъединицы IL-2Ra), гетеродимеризации цитоплазматических доменов, сборки и экспозиции на мембране рецептора для IL-2, взаимодействие с которым определяет последующий каскад реакций, обеспечивающих пролиферацию клеток.

Кроме того, учитывая представленные выше данные, можно предположить, что

возможным механизмом препарат-индуцированиого угнетения пролиферативного ответа антигенспецифических лимфоцитов могло быть как прямое, так и опосредованное (через дефекты экспрессии отдельных цепей рецептора для IL-2, активации JAK-киназ) нарушение процесса фосфорилирования указанных факторов транскрипции (STAT3, STAT5a и STAT5ß).

Хорошо известно, что ключевая роль в определении функциональной активности лимфоцитов принадлежит интенсивности метаболических процессов, обеспечивающих клетку энергией и пластическим материалом [Соколов В.В. и соавт., 1975; Савченко A.A., 1996; Труфакин В.А., Робинсон М.В., 1996; Булыгин Г.В. и соавт., 1999]. При этом внутриклеточные ферменты являются наиболее уязвимой и быстро реагирующей системой клетки для различных фармакологических воздействий [Сергеев П.В. и соавт., 1996; Куценко С.А., 2002; Мишин В.Ю. и соавт., 2003].

Согласно исследованию A.A. Савченко [1999], одним из основных показателей дисфункции лимфоцитов служит снижение активности метаболических реакций в митохондриях. Цитохимическим маркером этих органелл является фермент цикла Кребса - сукцинатдегидрогеназа (СДГ) [Ленинджер А.Л., 1985; Чернышев В.Н., 2005; Козинсц Г.И. и соавт., 2006].

Цитохимическое исследование активности СДГ' показало, что после 1 -часовой инкубации крови с ПТП основного ряда у больных ТЛ регистрировалось перераспределение структуры популяции лимфоцитов в направлении увеличения доли клеток с низкой активностью фермента по сравнению с таковым у здоровых доноров. При 1-часовой инкубации с ПТП резервного ряда во всех группах обследуемых также отмечачись изменения структуры распределения клеток за счет увеличения числа низкоактивных и снижения количества высокоактивных лимфоцитов относительно исходных значений: у здоровых лиц при действии ПАСК и капреомицина, у пациентов с ТЛ - при действии офлоксацина, ПАСК и капреомицина.

Сравнительный анализ изменений активности СДГ в лимфоцитах при 1-часовой инкубации крови с ПТП в зависимости от групповой принадлежности препаратов показал, что в целом (как у здоровых доноров, так и у пациентов с ТЛ) при действии ПТП основного ряда изменения структуры популяции лимфоцитов были менее выраженными, чем при инкубации с резервными ПТП.

Увеличение времени воздействия ПТП первой и второй линии до 2 ч у здоровых

доноров и больных ТЛ сопровождалось значительным снижением СЦК СДГ. Перераспределение структуры популяции лимфоцитов после 2-часовой инкубации с ПТП основного и резервного ряда у здоровых доноров характеризовалось снижением числа высокоактивных и увеличением доли низкоактивных лимфоцитов; у больных ТЛ повышение количества клеток с низкой активностью СДГ отмечалось на фоне снижения числа умеренно- и высокоактивных лимфоцитов.

Обращало на себя внимание, что у здоровых доноров большая часть популяции клеток была представлена лимфоцитами с высокой и умеренной активностью СДГ, а у пациентов с ТЛ преобладали низкоактивные клетки.

Поскольку лимфоцит является клеткой с преимущественно аэробным механизмом получения энергии, то установленное нами под действием ПТП угнетение активности СДГ - центрального фермента цикла Кребса, свидетельствующее об истощении резерва данного фермента, могло сопровождаться нарушением реализации эффекторных функций лимфоцитов, в том числе синтеза и секреции цитокинов, а также угнетением про-лиферагивной активности лимфоцитов.

Сопоставление эффектов ПТП резервного ряда показало, что наиболее значительное увеличение числа низкоактивных клеток и снижение количества лимфоцитов с высокой (у больных ТЛ) и умеренной (у здоровых доноров) активностью СДГ отмечалось при действии офлоксацина.

Представителем большой группы гидролитических ферментов, катализирующих разрушение метаболитов и биологических полимеров, является кислая фосфатаза (КФ) [Нарциссов Р.П., 1969; Труфакин В.А. и соавт., 2005; Козинец Г.И. и соавт., 2006]. Исследование активности КФ позволило установить увеличение её СЦК после 1-часового воздействия на клетки капреомицина (у здоровых доноров и больных ТЛ), а также изо-ниазида и офлоксацина (у пациентов с ТЛ).

Капреомицин - противотуберкулёзный антибиотик полипептидной структуры, продуцируемый Бкерготусеэ саргео!из и представляющий собой комплекс из 4-х микробиологически активных компонентов [Кукес В.Г., Стародубцев А.К., 2003]. По-видимому, природное происхождение и особенности структуры данного препарата обусловливали его высокие антигенные свойства, что определило его стимулирующее влияние на активность КФ как в клетках здоровых доноров, так и у больных ТЛ.

Анализ активности КФ после 2-часового воздействия ПТП показал, что у пациен-

тов с TJI при действии всех использованных в работе ПТП СЦК КФ превышал её исходные значения.

Известно, что уменьшение активности энергетических ферментов в лимфоцитах сопровождается нарушением проницаемости и целостности как клеточной мембраны, так и мембран органелл, в том числе и лизосом. При этом лизосомальные ферменты теряют изоляцию и становятся потенциальными химическими агрессорами [Соколов В.В. и соавт., 1975]. Действительно, нами было показано н&чичие отрицательных взаимосвязей исходного СЦК КФ со средней активностью СДГ (г=Ч),776; р=0,0138) и фоновым количеством лимфоцитов с высокой активностью СДГ (г^-0,971; р=0,0012) у здоровых доноров. После 2-часового воздействия этамбутола у здоровых индивидуумов также обнаруживалась отрицательная зависимость (г=—0,710; р=0,032) между СЦК КФ и СЦК СДГ. У больных ТЛ количество лимфоцитов с низкой активностью СДГ после 2-часовой инкубации крови с офлоксацином положительно кореллировало (г=0,775; р=0,041) с СЦК КФ.

Данные литературы указывают, что маркерные энзимы лизосом способны не только катализировать разрушение различных субстратов, но и принимать участие в образовании метаболитов с цитотоксическими свойствами [Нарциссов Р.П., 1969; Труфакин В.А. и соавт., 2005; Козинец Г.И. и соавт., 2006]. Следовательно, препарат-индуцированное повышение активности КФ может быть рассмотрено не только в свете повышения защитного потенциала ИКК, но и с точки зрения способности фермента инициировать гидролиз белков, полипептидов, ДНК, РНК и апоптоз лимфоцитов. В пользу этого предположения свидетельствует наличие положительной зависимости (г=0,815, р=0,025) между исходным СЦК КФ и фоновым количеством апоптотических лимфоцитов у здоровых доноров.

Исследование прямого (in vitro) влияния ПТП на апоптоз лимфоцитов периферической крови позволило установить, что изониазид, рифампицин и этамбутол индуцировали увеличение числа CD95+- и апоптотических клеток как у здоровых доноров, так и у пациентов с ТЛ. Действие ПТП резервного ряда на процесс апоптотической гибели было не столь однозначным. Так, при добавлении в культуры клеток офлоксацина изменения показателей, отражающих апоптотическую активность лимфоцитов, соответствовали таковым при действии ПТП основного ряда После инкубации культур клеток с ПАСК повышение количества СТ)95+-лимфоцитов регистрировалось только у здоровых доноров, а увеличение числа armexin У+-клеток - у больных ЛЧТЛ. Обращало на себя внимание, что во всех группах исследования капреомицин не оказывал влияния на

количество апоптотических лимфоцитов. Однако у больных ЛУТЛ его действие характеризовалось увеличением числа клеток, презентирующих антиген CD95.

Учитывая существование двух фундаментальных механизмов запуска тонатоген-ной программы клеток [Григорьев М.Ю. и соавт., 2003; Мойбенко A.A. и соавт., 2005; Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2006; Рычков И.А., Москалева Е.Ю., 2007; O'Sullivan М-Р. et ai., 2007], а также результаты представленных исследований можно заключить, что изониазид, рифампицин, этамбутол и офлоксацин способны инициировать апоптоз как по рецепторному (внешнему), так и митохондриальному (внутреннему) пути. В пользу последнего свидетельствует отсутствие корреляции между количеством CD95+-и числом annexin У+-лимфоцитов.

Кроме того, исследованиями O.A. Васильевой [2009] было показано, что при инкубации цельной крови больных ТЛ с ПТП основного ряда угнетение активности СДГ в лимфоцитах сопровождается активацией а-глицерофосфатдегидрогеназы - компонента глицерофосфатного шунта, обеспечивающего синхронизацию процессов биологического окисления и гликолиза. Увеличение акгивности лактатдегидрогеназы при действии ПТП основного ряда подтверждало предположение автора о препарат-индуцированном дисбалансе аэробных и анаэробных процессов энергообразования в лимфоцитах в направлении активации последних.

Известно, что нарушения окислительного фосфорилирования и энергетического обмена клетки в целом сопровождаются смещением трансмембранного митохондри-алыюго электрохимического потенциала, дезинтеграцией мембран митохондрий и выходом в цитоплазму белков (цитохром С, Smac/DIABLO и др.), обычно находящихся в межмембранном пространстве этих органелл. Конечным итогом этого процесса является активация ключевых регуляторов апоптоза - каспаз, осуществляющих деградацию жизненно важных белков и опосредующих фрагментацию ДНК [Chang H.Y.; Yang X., 2000; Григорьев М.Ю. и соавт., 2003; Гордеева A.B. и соавт., 2004; Souvannavong V. et al., 2004; Бра M. и соавт., 2005; Мойбенко A.A. и соавт., 2005; Fink S.L., Cookson B.N., 2005; Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2006; Мураков C.B., Воспельникова Н.Д., 2006; Рычков И.А., Москалева Е.Ю., 2007; Oikawa Y. et а!., 2008].

С.Е. Schwab и H. Tuschl [2003], оценивая цитотоксический эффект изониазида на 3-х клеточных линиях (человеческая гепатома Hep-G2, лимфобластома АНН-1, лимфо-ма мышей YAC-1), отмечали значительное увеличение количества апоптотических (annexin V+) клеток после 24 ч инкубации клеточных линий с изониазидом в концентрации >26 мМ. При этом индукция апоптоза сопровождалась снижением трансмембранного

митохондриалыюго потенциала и появлением разрывов ДНК.

S. Bhadauria и соавт. [2007], изучая токсичность изониазида на клетках гепатомы Hep-G2, пришел к заключению, что данный препарат способен индуцировать апоптоз посредством инициации оксидативного стресса через снижение концентрации восстановленного глутатиона и увеличение содержания в клетках активных форм кислорода. Представленные данные доказывают рассмотренное выше предположение о реализации изониазид-индуцированного апоптоза лимфоцитов по внутреннему пути.

В работе Y. Yuhas и соавт. [2009] было показано, что рифампицин способен усиливать экспрессию индуцибельной NO-синтазы, повышая тем самым продукцию оксида азота в эпителиальных клетках лёгких человека. Известно, что в определенной концентрации N0 может выступать в качестве аноптоз-индуцирующего фактора [Albina J.E. et al., 1993; Fehsel К. ct al., 1995; Dimmeler S., Zeiher A.M., 1997; Залесский B.H., Великая H.B., 2003; Каминская Г.О., 2004]. Не исключено, что усиление апоптотической гибели лимфоцитов, установленное нами при действии рифампицина, могло быть обусловлено возможным повышением концентрации окиси азота в клетках.

Известно, что ПАСК способна ингибировать окислительное фосфорилирование и наработку АТФ з митохондриях гепатоцитов морских свинок [Григорян В.Г., Кирош-ка B.C., 1973]. Поскольку уменьшение образования АТФ является одним из инициирующих факторов митохондриального пути апоптоза, представленные данные литературы и результаты собственных исследований (согласно которым увеличение количества annexin У+-клеток при добавлении ПАСК обнаруживалось в отсутствие повышения числа С095+-лимфоцитов) позволяют заключить, что в присутствии ПАСК у пациентов с JI4TJI апоптоз лимфоцитов также реализовывался но внутреннему механизму.

Исследованиями В.В. Новицкого и соавт. [2006], Т.А. Шилько и соавт. [2008] было показано, что увеличение концентрации в лимфоцитах ионов Са2+. Mg2\ Fe2+ и Al + способно стимулировать, а Си2+, Мп2+ и Zn2+, напротив, подавлять апоптоз. Обращало на себя внимание, что регистрируемые авторами до начала лечения у больных TJI признаки сочетанного нарушения апоптоза и микро- и макроэлементного спектра лимфоцитов периферической крови проявляли наибольшую степень выраженности после интенсивной фазы химиотерапии.

Известно, что лроапоптотическое действие ионов Ca2t и Mg2* опосредовано активацией Ca2+/Mg2+-3aBHCHMoй эндонуклеазы, осуществляющей фрагментацию ядерного хроматина и Са2+ -зависимой трансглутаминазы, формирующей перекрестные сшивки между цитозольными белками. Антиапоптотический эффект Си2+ и Zn2+ обусловлен

тем, что данные микроэлементы входят в состав цитозольной супероксиддисмутазы, прерывающей свободнорадикальные процессы и защищающей клетки от деструктивного воздействия супероксидных анион-радикалов [Идз М., 1995; Новицкий В.В. и со-авт., 2006; Шилько Т.А. и соавт., 2008].

Результаты исследований D. Gil и соавт. [2003], выполненных на макрофагах мышей, свидетельствуют о том, что рифампицин и этамбутол способны вмешиваться в обмен ионов кальция, усиливая их выход из внутриклеточных депо. Известно, что изо-ниазид способен образовывать хелатные комплексы с двухвалентными катионами металлов [Чу ч алии А.Г. и соавт., 2004], что также не исключает возможность его модулирующего влияния на ионный спектр лимфоцитов. Таким образом, возможное изменение микро- и макроэлементного спектра лимфоцитов (в том числе и увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция) при действии изученных ПТП также могло вносить определенный вклад в реализацию апоптоза лимфоцитов.

В работах M.R. Masjedi и соавт. [2000], В.В. Новицкого и соавт. [2005] было показано, что проведение курса противотуберкулёзной терапии сопровождается значительным увеличением числа хромосомных аберраций в лимфоцитах у больных TJI по сравнению с нелечеными пациентами и здоровыми донорами. Результаты представленных исследований позволяют предположить, что одним из путей инициации апоптоза лимфоцитов могло быть препарат-индуцированное повреждение структуры ДНК.

Таким образом, учитывая вышеизложенное, а также результаты цитохимического определения активности СДГ, можно заключить, что в качестве возможных пусковых факторов реализации апоптоза лимфоцитов могли выступать препарат-индуцирован-ные нарушения в энергетическом статусе клеток, ионный дисбаланс, активация сво-боднорадикальных реакций и повреждение структуры ДНК.

Патофизиологическое значение препарат-индуцированного апоптоза как фактора регуляции реакций иммунной защиты подтверждалось наличием отрицательной корреляции между количеством С095т-лимфоцитов и концентрацией IFNy в культуре при инкубации клеток с рифампицином у здоровых доноров (г=-0,9738, р=0,001) и ири культивировании мононуклеаров с изониазидом у больных JI4TJI (г=-0,7953, р=0,033).

Следует отметить, что рассмотренные факторы не исчерпывают всего многообразия возможных механизмов препарат-индуцированных нарушений функциональной активности, метаболизма и апоптоза ИКК. При этом к ряду наиболее общих механизмов,

лежащих в основе модулирующего действия ПТП, можно отнести нарушение энергетического обмена, процессов синтеза белка, клеточного деления, ионного гомеостаза, активацию свободно-радикальных процессов и повреждение клеточных мембран. Учитывая данные литературы и результаты собственных исследований, можно предложить следующую схему, отражающую механизмы влияния ПТП основного и резервного ряда на реактивность мононуклеарных лейкоцитов крови (рис. 1).

Сравнительный анализ полученных результатов позволил установить, что из числа изученных ПТП основного ряда наибольшим спектром модулирующих эффектов обладал рифампицин. Так, при действии рифампицина нами было зарегистрировано угнетение белок-индуцированной секреции IL-10, IL-12, IFNy, TGFß, увеличение белок-стимулированной продукции IL-2, числа CD95+- и annexin У+-лимфоцитов, подаааение активности СДГ и повышение СЦК КФ (табл. 3). При этом иммунотропное действие рифампицина характеризовалось более высокой степенью угнетения белок-индуцированной секреции IFN-y мононуклеарными лейкоцитами (табл. 3), чем под влиянием этамбутола.

Среди включенных в исследование ПТП резервного ряда аналогичным образом можно было охарактеризовать офлоксацин. Модулирующее влияние офлоксацина проявлялось угнетением BCG-индуцированной секреции IFNy, IL-12, TNFa, а также стимуляцией продукции IL-4 и TGFß (табл. 4). Кроме того, при действии офлоксацина регистрировалось увеличение числа CD95+- (у здоровых и больных ЛЧТЛ) и апоптотиче-ских лимфоцитов (во всех группах), а также наибольшее число клеток с низкой активностью СДГ (табл. 4).

Рассмотренные выше результаты позволяют заключить, что, несмотря на общность путей реализации повреждающего действия ПТП, существуют и индивидуальные его особенности, по-видимому, обусловленные молекулярной структурой изученных лекарственных средств. Данные литературы указывают, что антибиотики, содержащие в структуре молекулы ЫН2-группы, связанные с бензольным кольцом, обладают высокой антигенной активностью. Кроме того, известно, что гетероциклические соединения (органические соединения, содержащие в составе углеводородного цикла атомы других элементов, такие как азот, кислород, сера), имея в составе несколько функциональных групп и радикалов способны трансформироваться в различные формы метаболитов и оказывать на клетку комплексное воздействие [Волкова Т.О., Немова H.H., 2008].

Рис. 1. Механизмы модулирующего влияния противотуберкулёзных препаратов основного и резервного ряда на реактивность мононуклеарных лейкоцитов крови согласно данным литературы и результатам собственных исследований (в выделенных рамках).

Примечание: КФ - кислая фосфатаза, СДГ - сукцинагдегидрогеназа, ПОЛ - перекисное окисление липидов, ЦПМ -цитоплачматическая мембрана.

Таблица 3

Спектр иммуномодулирующих свойств противотуберкулёзных препаратов основного ряда у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких

Модулирующий эффект Изониазид Рифампицин Этамбутол

| секреции 11,-2 при индукции антигеном - + -

1 секреции 1Ь-10 при индукции антигеном - + -

| секреции 1Г-12 при индукции антигеном - + -

| секреции И'Ыу при индукции антигеном - ++ +

1 секреции ТвРр при индукции антигеном - + *

| пролиферативной активности антиген-специфичсских лимфоцитов * * +

1 активности СДГ + + +

1 активности КФ + + +

* числа С095+-лимфоцитов + + +

| числа аппех'т У+-лимфоцитов + + +

Примечание. Здесь и в таблице 4: «+» - наличие указанного эффекта у препарата, «-» -отсутствие указанного эффекта у препарата, «* »- эффект препарата не был исследован.

Очевидно, что одним из факторов, обусловливающих выраженность установленных эффектов, является проникающая способность молекул изученных ПТП, определяемая их молекулярной массой и липофильностью [Куценко С.А., 2002; Жандарев В.В. и соавт., 2006]. Известно, что увеличение массы затрудняет прохождение молекул через мембранные структуры. Однако липофильные вещества, несмотря на большие размеры молекулы, относительно легко проходят через биологические барьеры. Для низкомолекулярных веществ их проникающая способность определяется растворимостью. Гидрофильные молекулы (даже с низкой молекулярной массой) обладают ограниченной проникающей способностью. Показано также, что с увеличением молекулярной массы растет число возможных изомерных форм молекулы, её размера и количества атомов, контактирующих с участками связывания [Куценко С.А., 2002]. При этом наличие в структуре метальных групп способствует увеличению липофилыюсти молекул [Жандарев В.В. и соавт., 2006].

Подсчет молекулярных масс изученных ПТП показал, что для изониазида (Св117ЩУ) она составила 137,14 атомных единиц массы (а.е.м.), рифампицина (С4зН58М4012) - 822,94 а.е.м., этамбутола (СюН^'гОг) - 204,31 а.е.м., офлоксацина

(С18Н2оРЫз04) - 361,37 а.е.м., ПАСК (С7Н7Кт03) - 153,14 а.е.м. и капреомицина (С25Н4^|408)-668,71 а.е.м.

Таблица 4

Спектр иммуномодулирующих свойств противотуберкулёзных препаратов резервного ряда у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких

Модулирующий эффект Офлоксацин ПАСК Капреомицин

| секреции 1Ь-4 при индукции антигеном + - -

| секреции [Ь-10 при индукции антигеном - + -

| секреции 11,-12 при индукции антигеном + - -

{ секреции 1 РКу при индукции антигеном + - -

| секреции ТЫРа при индукции антигеном + - -

| секреции ТОРр при индукции антигеном + + +

| пролиферативной активности антигенспеци-фических лимфоцитов + + +

| числа лимфоцитов с низкой активностью СДГ -н- + +

| активности КФ + + +

| числа С095+-лимфоцитов + - +

| числа аппехт лимфоцитов + + -

Сравнение молекулярных масс и анализ структурных химических формул показали, что из числа ПТП основного ряда наибольшим числом указанных характеристик обладал рифампицин. Так, молекула рифампицина обладала наибольшей молекулярной массой и липофильностью (7 метальных групп). Среди ПТП резервного ряда самая высокая молекулярная масса регистрировалась у капреомицина. Две метильные группы обнаруживалось в структуре офлоксацина. При этом в структуре молекул рифампицина и офлоксацина отмечалось наибольшее число углеводородных циклов.

Сравнение полученных результатов в зависимости от групповой принадлежности изученных ПТП позволило установить, что ПТП основного ряда обладали более сильным модулирующим эффектом в отношении апоптоза лимфоцитов по сравнению с препаратами второй линии. Так, после инкубации клеток с рифампицином увеличение числа С095+-лимфоцитон было более выраженным, чем при действии ПАСК (у здоровых лиц) и капреомицина (у больных ЛУТЛ). При этом культивирование клеток с изо-ниазидом и рифампицином (у здоровых доноров) сопровождалось более значительным повышением доли апоптотических лимфоцитов, чем при действии офлоксацина.

Сравнение данных цитохимического анализа свидетельствовало о преимуществе негативного модулирующего эффекта ПТП резервного ряда. Так, у здоровых доноров после 2-часовой инкубации крови с офлоксацином, ПАСК и капреомицином доля лимфоцитов с низкой активностью СДГ была выше таковой при действии этамбутола. У пациентов с ТЛ после 1-часовой инкубации крови с резервными ПТП число высокоактивных клеток было ниже, а количество лимфоцитов с умеренной активностью СДГ, напротив, превышало соответствующие показатели при действии этамбутола. Однако различия, выявленные в группе больных ТЛ, полностью нивелировались к окончанию второго часа инкубации.

Межгрупповой сравнительный анализ показателей цитокиновой секреции был проведен нами только для 1Г-4 и ТКТа, поскольку влияние ПТП основного и резервного ряда на продукцию указанных медиаторов было оценено в условиях индукции одним и тем же антигеном - вакцинным штаммом ВСО. В целом было показано, что наиболее низкие значения ВСО-индуцированной секреции Т\'Ра регистрировались под влиянием резервных ПТП: у здоровых доноров при действии офлоксацина, ПАСК и капреомицина, у больных ЛУТЛ только при действии офлоксацина. Напротив, более высокие показатели ВСО-сгимулированной продукции !Ь-4 у здоровых лиц отмечались при культивировании клеток с основными ПТП-рифампицином и зтамбутолом.

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что ПТП основного и резервного ряда обладают иммунотропной активностью, которая реализуется через модуляцию цитокинсекреторной функции мононуклеарных лейкоцитов, угнетение пролиферации антигенспецифических лимфоцитов, индукцию дисбаланса ферментативной активности лимфоцитов и стимуляцию их апоптоза. При этом, несмотря на то, что механизмы, лежащие в основе изменений свойств клеток, наблюдаемых при различных экспериментальных воздействиях, во многом являются универсальными, определяющими факторами ответной реакции ИКК служат их исходное состояние и адаптационная реактивность, резерв которой в условиях развивающегося инфекционного процесса претерпевает выраженное истощение. Основой данного заключения явились полученные нами результаты, согласно которым, определенные модулирующие эффекты ПТП на мононуклеарные клетки больных ТЛ были более выраженными, чем у здоровых лиц. Так, у пациентов с ТЛ регистрировалось более значительное угнетение резерва пролиферации лимфоцитов (при действии офлоксацина), снижение СЦК СДГ и изменение структуры популяции лимфоцитов по активности фермента (после 2-часовой инкубации с ПТП основного и резервного ряда), а также увеличение СЦК КФ

(при действии изониазида, этамбутола, капреомцина) и числа апоптотических лимфоцитов (при действии рифампицина и офлоксацина). У здоровых доноров отмечалось более выраженное подавление антиген-индуцированной секреции мононуклеарными лейкоцитами IFNy (при действии рифампицина) и IL-10 (под влиянием рифампицина и этамбутола). Кроме того, у здоровых лиц в ряде случаев мононухлеарные клетки были нечувствительными к лекарственному воздействию. Так, у здоровых индивидуумов, в отличие от больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ, не отмечалось изменений резерва пролиферации лимфоцитов (при действии ПАСК и капреомицина), количества апоптотических клеток (при действии ПАСК), активности КФ (при действии рифампицина, офлоксацина, ПАСК), а также снижения числа лимфоцитов с умеренной энзиматической активностью (после 2-часовой инкубации с ПТП резервного ряда). Обращало на себя внимание, что ряд изменений антиген-индуцированной секреции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами in vitro регистрировался только у пациентов с ТЛ: при ЛЧТЛ - увеличение секреции IL-4 (при действии офлоксацина), снижение продукции IL-I2 (при действии офлоксацина) и TGFJ3 (при действии рифампицина); при ЛУТЛ - угнетение секреции IL-2 (при действии изониазида) и TGFp (при действии рифампицина), а также повышение продукции IL-10 (при действии ПАСК), IL-12 (при действии изониазида) и TGFp (при действии офлоксацина, ПАСК и капреомицина) (табл. 1,2).

Показано, что воспалительные заболевания лёгких сопровождаются дисбалансом между процессами образования и распада аденозина в иммунных клетках, что приводит к деструкции мембран лимфоцитов и накоплению ряда токсичных продуктов, в том числе перекиси водорода и сунероксидного аниона, способного инициировать перекис-ное окисление липидов [Андрушкевич В.В. и соавт., 2003]. В работе В.В. Новицкого и соавт. [2005] было установлено, что течение ТЛ характеризуется увеличением активности перекисного окисления липидов в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови. Учитывая представленные данные, можно предположить, что более высокая, чем у здоровых лиц, подверженность мононуклеарных клеток больных ТЛ к экзогенному лекарственному воздействию могла определяться исходной повышенной проницаемостью мембран лимфоцитов вследствие её стуктурных изменений.

Сравнительный анализ полученных результатов в зависимости от варианта ТЛ (лекарственно-чувствительный и лекарственно-устойчивый) показал, что у пациентов с ЛУТЛ индуцированный ПТП дисбаланс антиген-стимулированной секреции цитокинов был более значительным, чем у больных ЛЧТЛ. Так, только у пациентов с ЛУТЛ было отмечено угнетение секреции TNFa (при действии офлоксацина), повышение продук-

ции 1L-10 (при действии ПАСК) (табл. 2) и IL-12 (при действии изониазида) (табл. 1), а также более выраженное угнетение секреции IFNy (при действии рифампицина и этам-бутола). Кроме того, при ЛУТЛ регистрировались более низкие значения антиген-индуцированной секреции IL-4 (при действии изониазида, этамбутола, офлоксацина, ПАСК), IFNy (при действии капреомицина), числа С095+-лимфоцитов (при действии офлоксацина) и, напротив, более высокие показатели продукции IL-12 (при действии офлоксацина, ПАСК и капреомицина), IL-10 (при действии изониазида) и TGF-fS (при действии изониазида и рифампицина).

Представленные данные свидетельствуют, на наш взгляд, о большей восприимчивости мононуклеарных лейкоцитов больных ЛУТЛ к экзогенному лекарственному воздействию. Учитывая представление о том, что развитие ЛУТЛ обусловлено не столько наличием в популяции резистентных М. tuberculosis, сколько их активным и беспрепятственным размножением (как за счет вирулентности возбудителя, так и дисфункции иммунной системы макрооганизма) [Чукапов В.И., Кузьмина Н.В., 1996; Воронкова О.В. и соавт., 2007], можно думать, что повышенная чувствительность мононуклеарных клеток у больных ЛУТЛ к действию ПТП обусловливалась исходными (генетическими) особенностями ИКК, определяющими их функциональные свойства.

Наличие в спектре модулирующих эффектов изученных ПТП стимулирующего влияния на антиген-индуцированную секрецию IL-2 (при действии рифампицина во всех группах обследуемых) и IL-12 (при действии изониазида у пациентов с ЛУТЛ) (табл. 1) указывает на способность данных препаратов оказывать провоспалительное действие.

Поскольку уровень иммунологической реактивности организма при ТЛ и на этане специфического лечения оказывает существенное влияние на течение и исход заболевания, знание модулирующих эффектов ПТП основного и резервного ряда на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов, метаболизм и алоптоз лимфоцитов, на наш взгляд, представляет большое значение для практической фтизиатрии и иммунологии. При этом наиболее важными точками приложения полученных данных являются создание на основе известных и широко применяемых высокоактивных ПТП противотуберкулёзных средств с выраженными иммуномодулирующими свойствами, а также направленное (с учетом особенностей иммунного статуса каждого пациента) регулирование дисбаланса иммунных реакций, сопровождающих развитие и терапию ТЛ. Одним из возможных практических выходов явилось бы сокращение сроков противотуберкулёзной химиотерапии, а также повышение её эффективности. Учитывая много-

образие регулирующих механизмов иммунологического гомеостаза в норме и при развитии реакций иммунной защиты, особенности иммунопатогснеза ЛЧТЛ и ЛУТЛ, а также необходимость одновременного применения комбинации ПТП (от 4 до 7), обладающих зачастую различными иммунотропными свойствами, перспективным направлением представляется оценка влияния комбинаций ПТП, наиболее активно используемых в терапии туберкулёза, в том числе и на более широкий спектр показателей иммунного статуса.

ВЫВОДЫ:

1. Иммунотропное действие противотуберкулёзных препаратов основного (изониа-зида, рифампицина, этамбутола) и резервного (офлоксацина, парааминосалици-ловой кислоты, капреомицина) ряда у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких и здоровых доноров in vitro проявляется дисбалансом антиген-индуцированной секреции цитокинов, угнетением пролиферации антигенспеци-фических лимфоцитов и активности сукцинатдегидрогеназы (за счет увеличения доли низкоактивных клеток) в сочетании с активацией апоптоза и кислой фосфа-тазы в лимфоцитарных клетках.

2. В основе иммуносупрессорного действия противотуберкулёзных препаратов лежит угнетение антиген-индуцированной продукции мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro провоспалительных цитокинов IFNy (рифампицин, этамбутол, офлоксацин), IL-12 (рифампицин, офлоксацин) при лекарственно-чувствительном туберкулёзе лёгких и IFNy (рифампицин, этамбутол), IL-2 (изониазид), IL-12 (рифампицин), TNFa (офлоксацин) в условиях гиперсекреции противовоспалительных цитокинов IL-10 (парааминосалициловая кислота) и TGPf} (офлоксацин, парааминосалициловая кислота, капреомицин) при лекарственно-резистентном варианте инфекции.

3. Свойство противотуберкулёзных препаратов основного ряда стимулировать Т-клеточный иммунный ответ у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких in vitro проявляется увеличением секреции IL-12 (под влиянием изониазида в случае лекарственной устойчивости возбудителя) и IL-2 на фоне угнетения продукции цитокинов с иммуносупрессорной активностью - IL-10 и TGFp (в присутствии рифампицина вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя).

4. Определяющим фактором ответной реакции мононуклеарных лейкоцитов на действие противотуберкулёзных препаратов in vitro является исходное состояние клеток. При этом у пациентов с инфильтративным туберкулёзом легких регистрируется более выраженное, чем у здоровых доноров, снижение пролифератив-ного резерва лимфоцитов (при действии офлоксацина), угнетение сукцинатде-гидрогеназы (после 2-часовой инкубации клеток с основными и резервными препаратами), повышение активности кислой фосфатазы (под влиянием изониазида, этамбутола и капрсомицина) и числа аиоптотических лимфоцитов (в присутствии рифампицина и офлоксацина). У здоровых доноров в большей степени подавляется антиген-индуцированная секреция мононуклеарными лейкоцитами IFNy (при действии рифампицина) и IL-I0 (под влиянием рифампицина и этамбутола).

5. При лекарственно-резистентном туберкулёзе лёгких повышенная (по сравнению с лекарственно-чувствительным вариантом инфекции) чувствительность мононуклеарных лейкоцитов к экзогенному лекарственному воздействию in vitro характеризуется более выраженным угнетением антиген-индуцированной секреции IFNy (при действии рифампицина, этамбутола) и более низким уровнем антиген-стимулированной продукции IL-4 (под влиянием изониазида этамбутола офлоксацина и парааминосалициловой кислоты), IFNy (в присутствии капреомицина) и TNFa (при действии офлоксацина).

6. У больных с лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких количество С095^-лимфоцитов в крови (при действии офлоксацина) выше, а антиген-индуцированная секреция in vitro IL-12 (в присутствии изониазида, офлоксацина, парааминосалициловой кислоты и капреомицина) и иммуносупрессорных цито-кинов IL-10 (при действии изониазида и парааминосалициловой кислоты) и TGF-(3 (под влиянием изониазида и рифампицина) - ниже, чем при лекарственно-резистентном варианте заболевания.

7. Из противотуберкулёзных препаратов основного ряда наибольшим иммуносу-прессорным действием in vitro обладает рифампицин, что проявляется более выраженным угнетением антиген-индуцированной секреции IFNy (чем при действии этамбутола) и более низким уровнем антиген-стимулированной продукции IL-12 (чем при действии изониазида) мононуклеарными лейкоцитами у больных туберкулёзом лёгких. Среди противотуберкулёзных препаратов резервного ряда наибольший ингибирующий эффект на сукцинатдегидрогеназу и активирующее влияние на апоптоз лимфоцитов крови in vitro оказывает офлоксацин.

8. В спектре иммуномодулирующих свойств противотуберкулёзных препаратов основного ряда более выраженным, чем у резервных препаратов, является стимулирующее влияние на антиген-индуцированную секрецию IL-4 мононуклеарны-ми лейкоцитами, апоптоз и активность кислой фосфатазы в лимфоцитах in vitro. Противотуберкулёзные препараты второго ряда больше угнетают активность сукцинатдсгидрогеназы в лимфоцитах (за счет увеличения числа низкоактивных клеток) и антиген-индуцированную секрецию TNFa мононуклеарными лейкоцитами крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка влияния противотуберкулёзных препаратов на цитохимический статус лимфоцитов in vitro / O.A. Васильева, О.И. Уразова, В.А. Серебрякова и др. // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2008. - № 3. - С. 27-30.

2. Роль цитокинов в модуляции субпопуляционного состава лимфоцитов крови у больных туберкулёзом лёгких / P.P. Хасанова, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, В.А. Серебрякова // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. -2008.-№3.~ С. 31-35.

3. Оценка влияния противотуберкулёзных препаратов на продукцию 1L-2 и IFN-y лимфоцитами периферической крови in vitro / В.А. Серебрякова, О.И. Уразова, O.A. Васильева и др. // Науки о человеке : материалы IX конгресса молодых учёных и специалистов. - Томск, 2008. - С. 35-36.

4. Реактивность лимфоцитов крови при туберкулёзе лёгких / P.P. Хасанова, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, Ю.В. Стамбула,

A.Е. Колосова, В.А. Серебрякова и др. // Медицинская иммунология. - 2009. -Т. 11, № 1.-С. 35-40.

5. Модулирующее влияние изониазида и рифампицина на секрецию цитокинов in vitro при туберкулёзе лёгких / В.А. Серебрякова, O.A. Васильева, О.И. Уразова и др. // Туберкулёз и болезни лёгких. - 2009. -№ 7. - С. 58-64.

6. Пролиферативный и секреторный ответ мононуклеарных лейкоцитов на комбинированное воздействие этамбутола и микобактериального антигена /

B.А. Серебрякова, O.A. Васильева, О.И. Уразова и др. // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, №2-3.-С. 153-160.

7. Особенности секреции цитокинов при действии противотуберкулёзных препаратов in vitro / O.A. Васильева, В.А. Серебрякова, О.И. Уразова и др. // Вопросы па-

тогенеза типовых патологических процессов : сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2009.-С. 60-63.

8. Оценка влияния офлоксацина, парааминосалициловой кислоты и капреомицина на пролифсративную активность лимфоцитов у больных туберкулёзом лёгких /

B. Л. Серебрякова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. // Науки о человеке : материалы X конгресса молодых учёных и специалистов с международным участием. -Томск, 2009.-С. 103-104.

9. Оценка влияния рифампицина на апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных туберкулёзом лёгких / O.A. Васильева, О.И. Уразова, В.А. Серебрякова и др. И Науки о человеке : материалы X конгресса молодых учёных и специалистов с международным участием. - Томск, 2009. - С. 72-73.

Ю.Влияние офлоксацина на цитокинпродуцирующую способность мононуклеарных лейкоцитов при туберкулёзе лёгких / Т.Е. Кононова, В.А. Серебрякова, O.A. Васильева и др. // Актуальные проблемы патофизиологии : материалы XV межгородской конференции молодых учёных. - СПб., 2009. - С. 57.

11. Влияние противотуберкулёзных химиопреларатов резервного ряда на цитокинпродуцирующую способность мононуклеарных лейкоцитов при туберкулёзе лёгких / Т.Е. Кононова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, В.А. Серебрякова и др. II Бюллетень Северного государственного медицинского университета. - 2009. 1. -

C. 178.

12.Полиморфизм генов IL-2 и 1L-4 при инфильтративном туберкулёзе лёгких / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.В. Воронкова,

A.И. Рубанова, Ю.В. Стамбула, P.P. Хасанова, Т.Е. Будкина, О.В. Колоколова,

B.А. Серебрякова и др. // Иммунология. - 2009. - Т. 30, № 2. - С. 88-92.

13.Молекулярно-генетические аспекты прогнозирования и иммунотерапии туберкулёзной инфекции / В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, И.О. Наследникова, В.А. Серебрякова и др. // Успехи физиологических наук. -2009. - Т. 40, № 2. - С. 40-46.

14.Аллельный полиморфизм генов цитокинов при туберкулёзе лёгких / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, О.В. Воронкова, А.К. Стрелис, В.В. Новицкий, Е.Л. Никулина, P.P. Хасанова, Т.Е. Кононова, В.А. Серебрякова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148, № 8. - С. 137-142.

15. Сравнительное исследование продукции противовоспалительных цитокинов у больных туберкулёзом лёгких под воздействием противотуберкулёзных препаратов резервного ряда / Т.Е. Кононова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий,

B.А. Серебрякова и др. // Инновации в медицине. Социально значимые инфекции : материалы VII Российско-германской научно-практической конференции. - Новосибирск, 2009. - С. 200-202.

16.Препарат-индуцированный апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных туберкулёзом лёгких / В.А. Серебрякова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. // Инновации в медицине. Социально значимые инфекции : материалы VII Российско-германской научно-практической конференции. - Новосибирск, 2009. -

C. 218-219.

17.Иммунотропный эффект рифампицина как базового препарата противотуберкулёзной химиотерапии / O.A. Васильева, О.И. Уразова, В.А. Серебрякова, Т.Е. Кононова // Актуальные проблемы инфекционной патологии : материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета. - Томск, 2009. - С. 21-23.

18. Модулирующий эффект офлоксацина на апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных туберкулёзом лёгких / В.А. Серебрякова, Т.Е. Кононова, O.A. Васильева и др. // Актуальные проблемы патофизиологии : материалы XVI межгородской конференции молодых учёных. - СПб., 2010. - С. 156-158.

19.Аллельный полиморфизм генов IFNy и TGFß как фактор модуляции секреции цитокинов и подверженности туберкулёзу лёгких / E.JI. Никулина, И.О. Наследникова, О.И. Уразова, О.В. Воронкова, Е.Г. Чурина, В.А. Серебрякова // Туберкулёз и болезни лёгких. - 2010. - № 6. - С. 15-19.

20.Влияние противотуберкулёзных препаратов резервного ряда на продукцию противовоспалительных цитокинов у больных туберкулёзом лёгких / Т.Е. Кононова, О.И. Уразова, В.А. Серебрякова и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. -Т. 9,№5.-С. 64-71.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения ИКК - иммунокомлетентные клетки КФ - кислая фосфатаза

ЛУТЛ - лекарствешю-усгойчивый туберкулёз лёгких

ЛЧТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулёз лёгких

ПАСК - парааминосалициловая кислота

П'ГП - противотуберкулезные препараты

СДГ - сукцинатдешдрогеназа

СЦК-средний цитохимический коэффициент

ТЛ - туберкулёз лёгких

BCG - Bacillus Calmette-Guerrin - вакцинный штамм БЦЖ CD - cell differentiation antigens - антигены дифференцировки клеток IFN - interferon - интерферон IL - interleukin - интерлейкин

М. tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis - микобактерии туберкулёза NO - оксид азота

TGF - transforming ;gro\vs factor - трансформирующий фактор роста Tho, Thi, Th2 - T-hdper-0,1,2- субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов/хелперов TNF - tumor necrosis factor - фактор некроза опухолей Treg - субпопуляция регулягорных 'Г-лимфоцитов

Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Позитив-НБ» 634050 г. Томск, пр. Ленина 34а