Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Механизмы и закономерности развития нарушений морфофункционального состояния плаценты и кислородтранспортной функции периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции

На правах рукописи

АНДРИЕВСКАЯ Ирина Анатольевна

МЕХАНИЗМЫ И ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗВИТИЯ НАРУШЕНИЙ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПЛАЦЕНТЫ И КИСЛОРОДТРАНСПОРТНОЙ ФУНКЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ РОЖЕНИЦ И КРОВИ ПУПОВИНЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 6 ИЮН 2011

Иркутск-2011

4850129

Работа выполнена в «Учреждение Российской академии медицинских наук Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН».

Луценко Михаил Тимофеевич

Власов Борис Яковлевич Изатулин Владимир Григорьевич

Научный консультант:

академик РАМН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Дубровина Валентина Ивановна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН

Защита состоится « 01 » июля 2011г. в 9 часов на заседании диссертационного Совета Д 001.038.02 «Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН» (664003, Иркутск, ул. Тимирязева, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «Учреждение РАМН Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН» по адресу: 664003, Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

Автореферат разослан мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук,

профессор Шолохов Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К числу важнейших патологических проявлений герпес-вирусной инфекции во время беременности можно отнести формирование ранних форм внутриутробной гипоксии плода, патогенез которой, несмотря на нарастающий интерес исследователей к данной проблеме, до настоящего времени остается не ясным.

Так, по данным авторов, внутриутробная гипоксия плода, вызванная тяжелыми инфекционными патологиями у матери в период беременности, сопровождается увеличением частоты летальных исходов в антенатальном периоде по отношению к общему числу перинатальной смертности в среднем до 40% (Шабалов Н.П. и соавт., 2003; Бычков И.В. и соавт, 2009; Зимина H.H. и соавт., 2010). Значимость проблемы определяется и тем, что генерализация герпесной инфекции во время беременности приводит к нейроэндокринным и иммунным сдвигам в организме женщины (Луценко М.Т., 2007; Луценко М.Т., Соловьева A.C., 2010), которые сопровождаются формированием новых порочных кругов в цепи причинно-следственных отношений, усугубляющих течение, как основного заболевания, так и предопределяющих скрытое неблагополучие развивающегося плода в виде гипоксического поражения центральной нервной системы (Антонов П.В. и соавт., 2003; Шабалов Н.П., 2004; Kimberlin D.W., 2005; Иванова В.В. и соавт., 2008; Боковой А.Г., 2010). В связи с этим, решение вопросов, связанных с изучением механизмов и закономерностей развития внутриутробной гипоксии плода, особенно при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности, актуально и имеет важное социальное значение.

Гипоксия плода - состояние, обусловленное морфофункциональными изменениями и представляющее собой результат сложной реакции эритрона и тканей плаценты на различные патологические изменения со стороны материнского организма. В его основе лежит дизадаптация компенсаторно-приспособительных механизмов фетоплацентарного комплекса, которая проявляется на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях, и способствует нарушению газотранспортной, эндокринной, метаболической и антиокислительной функций плаценты (Качалина Т.С. и соавт., 2001; Ванько Л.В. и соавт., 2010). Вполне очевидно, что определяющее значение в механизмах вовлечения плаценты в процесс формирования внутриутробной гипоксии плода при вирусных инфекциях у матери в период беременности, имеет морфофункциональное изменение

мембранного и, как следствие, ядерного аппарата фетоплацентарного барьера. Нарушения метаболизма ядер, вызванные патогенными факторами (вирусы, цитокины, биогенные амины, глюкокортикоиды), экспонирующихся на поверхности синцитиотрофобласта, либо проникающих в его толщу при обострении инфекционного процесса во время беременности, изменяют характер течения биосинтетических и обменных процессов, способствуя нарушению перфузии ворсин, проницаемости фетоплацентарного барьера и метаболической его дисфункции. Формирующийся при этом недостаток кислородного метаболизма в зоне маточно-плацентарных контактов усиливает выраженность апоптотических изменений ядер синцитиотрофобласта (ЪЫЬага N. е1 а1., 2002; Ни Я. е1 а1., 2006), вызывая дезорганизацию его основных функций с развитием необратимых деструктивных процессов в плацентарной ткани, после чего возникают микроциркуляторные расстройства.

Между тем, несмотря на освещенность проблемы патогенеза внутриутробной гипоксии плода при осложненном течении беременности, остаются не выясненными вопросы воздействия персистирующих вирусных инфекций, в том числе, герпес-вирусной, на состояние кислородтранспортной функции, как периферической крови, так и тканей плаценты. Не установлена роль ВПГ-1 в механизмах вовлечения эритроцитов периферической крови матери и плода в патологический процесс. Остаются не изученными аспекты патогенетического влияния дестабилизирующих и деструктивных процессов, индуцируемых ВПГ-1, на конформационную устойчивость цитоскелета и липидного матрикса мембран эритроцитов матери и плода. Не определены причинно-следственные связи между активностью герпес-вирусной инфекции и состоянием метаболических и энергетических процессов на уровне эритроцитов периферической крови матери и плода. Недостаточно изучены вопросы влияния ВПГ-1 на характер апоптоза ядер синцитиотрофобласта и обменных процессов в плаценте. Недостаточно исследований и в области изучения закономерностей функционирования плаценты, как органа, обеспечивающего поддержание кислородобменной функции у плода на период беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией. Поэтому оценка характера взаимоотношений активности ВПГ-1 во время беременности, морфофункционального состояния плаценты и кислородтранспортной функции крови матери в патогенезе

внутриутробной гипоксии плода представляет одну из актуальных проблем патологической физиологии.

Цель исследования

Установить механизмы и закономерности развития нарушений морфофункционального состояния плаценты и кислородтранспортной функции периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции.

Задачи исследования

1. Выявить механизмы и закономерности формирования нарушений эритропоэтической функции периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции.

2. Определить особенности морфофункционального состояния эритроцитов периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции: строение эритроцитов; состояние липидно-белкового комплекса мембран; активность ферментов, определяющих оксигенацию гемоглобина и антиокислительные свойства мембран.

3. Оценить морфофункциональное состояние фетоплацентарного барьера при обострении герпес-вирусной инфекции: строение поверхности и цитозоля фетоплацентарного барьера, апоптотическую активность ядер синцитиотрофобласта плаценты.

4. Раскрыть закономерности развития нарушений кислородного обмена между кровью матери и плода и участие в нем фетоплацентарного барьера при обострении герпес-вирусной инфекции.

Новизна исследования

Впервые установлены наиболее значимые причины, лимитирующие эритропоэз и кислородтранспортную функцию эритроцитов при обострении герпес-вирусной инфекции, как в периферической крови рожениц, так и в крови пуповины.

Доказано, что повышение концентрации ЮТа при обострении герпес-вирусной инфекции приводит к снижению эритропоэтической функции периферической крови рожениц и крови пуповины.

Определены механизмы патогенного действия ВПГ-1 на морфофункциональное состояние эритроцитов (структура белкового цитоскелета мембран, вязкостные свойства и деформируемость мембран, активность ферментов пентозофосфатного (глюкозо-6-

фосфатдегидрогеназа) и глутатионредуктазного (глутатионредуктаза) циклов, антиокислительных ферментов (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза)), как в периферической крови рожениц, так и в крови пуповины.

Выявлены причинно-следственные связи между формой эритроидных клеток и содержанием основных белков цитоскелета (спектрина, анкирина, белка полосы 4.1, белка полосы 3, гликофорина); между структурой гемоглобина, уровнем 2,3-ДФГ и скоростью кислородного обмена в эритроцитах периферической крови рожениц и в крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции.

Новыми являются данные об особенностях морфофункционального состояния фетоплацентарного барьера, механизмы повреждений его наружной поверхности, структуры цитозоля и ядерного аппарата, приводящие к нарушению трансплацентарного кислородного обмена при обострении герпес-вирусной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в том, что получены теоретические знания о закономерностях развития эритропоэтической дисфункции периферической крови рожениц и крови пуповины, нарушений эритропоэза, морфофункционального состояния эритроцитов и их кислородтранспортных свойств при обострении герпес-вирусной инфекции. Разработаны оригинальные способы диагностики эритропоэтической функции периферической крови рожениц, крови пуповины, а также морфофункционального состояния эритроцитов (структура белкового цитоскелета, вязкостно-эластические свойства мембран, состав и конформационная стабильность гемоглобина), состояние ферментов (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа,

глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза), участвующих в сохранении нативных свойств гемоглобина, его оксигенации и фетоплацентарного барьера (структура и свойства наружной поверхности синцитиотрофобласта, цитозоля, мембранного аппарата митохондрий, активность проапоптотических и апоптотических факторов) при обострении герпес-вирусной инфекции.

Внедрение в практику

Разработанные способы диагностики нарушений

морфофункционального состояния эритроцитов периферической крови рожениц и фетоплацентарного барьера, а также оксигенации крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции внедрены в

научно-исследовательскую и клиническую практику акушерского отделения патологии беременности при клинике «Учреждение Российской академии медицинских наук Дальневосточный центр физиологии и патологии Сибирского отделения РАМН» (г. Благовещенск).

Материалы исследования рекомендуется внедрять в практическую работу научно-исследовательских лабораторий, использовать в учебно-методических материалах для обучения студентов медицинских институтов профильных кафедр.

Положения, выносимые на защиту

1. При обострении герпес-вирусной инфекции нарушаются механизмы цитокинопосредованной регуляции эритропоэтической функции периферической крови рожениц и пуповинной крови.

2. Обострение герпес-вирусной инфекции усиливает морфофункциональную перестройку эритроцитов, нарушает состояние липидно-белкового комплекса мембран, изменяет ферментативную активность, определяющую оксигенацию гемоглобина и антиокислительные свойства мембран, как в периферической крови рожениц, так и в крови пуповины.

3. Повреждение плаценты ВПГ-1 приводит к нарушению морфофункционального состояния фетоплацентарного барьера: строения поверхности и цитозоля фетоплацентарного барьера, апоптотической активности ядер синцитиотрофобласта плаценты.

4. При обострении герпес-вирусной инфекции нарушаются механизмы регуляции трансплацентарного кислородного обмена между кровью матери и плода.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета «Учреждение Российской Академии медицинских наук Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН» (2007, 2010); на научно-практической конференции с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном федеральном округе» (Хабаровск, 26-27 сентября 2007 г.); II съезд врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего востока (Благовещенск, 24-25 октября 2007 г.); III Всероссийской научно-практической конференции с

международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 7-9 ноября 2007 г.); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 25-27 июня 2008 г.); научно-практической конференции с международным участием «Современные факторы формирования, методы оценки и прогнозирования общественного здоровья на территории Дальневосточного региона» (Хабаровск, 10-11 июня 2008 г.); международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд (Паттайа), 18-28 февраля 2009 г.); IV международной научной конференции «Системный анализ в медицине» (Благовещенск, 25-26 мая-2010 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 73 научные работы, из них 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, 24 патента на изобретения РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и имеет 35 таблиц, 6 схем и 35 рисунков. Собственно текст - 190 страниц. Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, раздела «Внедрение в практику» и списка литературы, содержащего 195 отечественных и 103 зарубежных источников.

Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследование рожениц и новорожденных осуществлялось на базе научной лаборатории «Механизмы этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при неспецифических заболеваниях легких» совместно с акушерским отделением патологии беременности клиники «Учреждение Российской академии медицинских наук Дальневосточный центр физиологии и патологии Сибирского отделения РАМН» (г. Благовещенск) и акушерским отделением Областного роддома (г. Благовещенск). Работа основана на результатах комплексного обследования с применением общеклинических, биохимических, морфологических и статистических методов исследования. Все

исследования были проведены с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и нормативных документов «Правила клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом № 266 от 19.06.03 Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Работа была одобрена комитетом по биомедицинской этике при «Учреждение Российской академии медицинских наук Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН» в соответствии с принципами конвенции о биомедицине и правах человека, а также общепризнанными нормами международного права. От всех здоровых и больных лиц было получено информированное согласие.

С целью изучения влияния обострения герпес-вирусной инфекции на состояние кислородтранспортной функции периферической крови матери и крови пуповины было обследовано 90 рожениц в возрасте от 18 до 35 лет и 90 новорожденных от этих же женщин. Результаты обследования рожениц и их новорожденных анализировали с позиции активности герпес-вирусной инфекции в организме женщины в третьем триместре беременности по величине четырехкратного и более нарастания титра антител к ВПГ-1, выявляемого в динамике через 10 дней в парных сыворотках. Роженицы основной группы с низким титром антител к ВПГ-1 1:3200 и высоким титром антител ^О к ВПГ-1 1:12800 в третьем триместре беременности распределялись одинаково, по 30 случаев. Роженицы без осложнений во время беременности составили контрольную группу (30 случаев). Исследования у новорожденных проводили в группах, распределенных в зависимости от титра антител к ВПГ-1 в крови матери (по 30 случаев, соответственно).

Одновременно проводилось морфологическое, гистохимическое и биохимическое исследование тканей зрелых плацент при родах в срок, полученных от тех же женщин с низким титром антител 1§С к ВПГ-1 1:3200 и высоким титром антител к ВПГ-1 1:12800 в третьем триместре беременности (по 30 случаев, соответственно). В контрольную группу вошли плаценты от практически здоровых беременных (30 случаев).

Биохимические методы исследования. У обследуемых групп забор крови проводился из локтевой вены, вены пуповины в сухую стерильную посуду в количестве 5-7 мл с добавлением гепарина с целью получения образцов эритроцитарных мембран. Периферическую кровь для исследований кислотно-щелочного состояния и газов крови забирали

из локтевой вены, вены пуповины непосредственно перед определением в стандартные шприцы по 0,25 мл. Для определения эритропоэтической активности использовали кровь, не содержащую антикоагулянты. Сыворотку получали центрифугированием при 1000 g в течение 15 минут.

Мембраны эритроцитов получали путем моделирования гипоосмотического шока по принципу G.Dodge с последующим осаждением при центрифугировании со скоростью 4000 g при температуре +4 С в течение 10 минут.

Для получения гомогената плодовая часть плаценты (ворсинчатый хорион) срезалась скальпелем небольшими пластинками площадью до 23 см и толщиной 1 мм. Кусочки ткани помещали в химические стаканы, содержащие 200 мл физиологического раствора, отмывали от клеток крови, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 мин. и подсушивали на фильтровальной бумаге. Затем, ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли физиологический раствор в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл физиологического раствора). Гомогенат замораживали при -20°С в течение суток. Затем, его размораживали и центрифугировали при 1500 g при температуре +4°С в течение 15 минут. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения иммуноферментного анализа.

Для оценки структурно-метаболического статуса эритроцитов периферической крови рожениц и пуповинной крови новорожденных, а также плаценты использовали следующие биохимические методы, а) флюорометрический метод: уровень серотонина в периферической крови оценивали по Прошиной Л.Я.; содержание а-токоферола определяли по прописи Hansen L.G. и Warwich W.I.; изучение микровязкости липидного бислоя и зоны белок-липидных контактов мембран эритроцитов проводили путем измерения флюоресценции пирена; б) спектрофотометрический метод: содержание глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы выявляли с помощью наборов «SENTINEL DIAGNOSTICS», Италия; оценку активности супероксиддисмутазы проводили с использованием наборов «RANDOX Laboratories Ltd.», Англия; концентрацию МДА определяли общепринятым методом с применением тиобарбитуровой кислоты по методу Гаврилова В.Б. и соавт.; содержание 2,3-ДФГ и АТФ определяли по прописи Луганова И.С. и Блинова М.Н.; расчет

«эффективной фракции» 2,3-ДФГ проводили по методу Алатарцева В.В. и соавт.; определение общего гемоглобина проводилось с использованием наборов ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; уровень оксигемоглобина и метгемоглобина оценивали по прописи Эвелина и Мэллой; содержание термостабильного и термолабильного гемоглобинов проводили по Дидковскому H.A. и соавт.; в) иммуноферментный анализ: содержание сывороточного эритропоэтина и интерлейкина 2, INPy оценивали с помощью наборов реактивов ООО «Протеиновый контур», С.-Петербург; уровень TNFa в сыворотке крови и в гомогенатах плацент оценивали, используя наборы реактивов ООО «Цитокин», С.-Петербург; уровень интерлейкинов 1, 4, 8 в сыворотке крови определяли с использованием наборов реактивов ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; количественное определение гранзима В, антител к фосфатидилсерину классов IgG и IgM, аннексинаУ, каспазы-3, протеина р53, цитохрома С, протеина Вс1-2, перексида водорода в гомогенатах плацент проводили с помощью набора реактивов «Bender MedSystems», Австрия; содержание Hsp70 в гомогенатах плацент определяли с помощью набора реактивов «ELISA Kit», США; содержание NO2* в гомогенатах плацент выявляли с помощью набора реактивов «Bender MedSystems», Австрия; выявление типоспецифических антител к ВПГ-1 классов IgG и IgM и их титрование в парных сыворотках проводили с помощью наборов ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; г) субпопуляцию NK- лимфоцитов CD 16+ и HLADR-антигены определяли на проточном цитофлюориметре «Вескшап Coulter Epics XL-MCL», США; д) определение кислотно-щелочного состояния и газов крови осуществлялось на портативном биохимическом анализаторе «IRMA TruPoint», США; е) исследование белкового спектра мембран эритроцитов проводили с помощью вертикального одномерного диск-электрофореза в градиентном (7,5-10%) полиакриламидном геле в присутствии 0,1% раствора додецилсульфата натрия по модифицированной методике Laemmli U.. Полипептидные зоны окрашивали в 0,1% растворе Кумасси R-250, 25% растворе изопропилового спирта и 7% растворе уксусной кислоты. Ориентировку белковых фрагментов оценивали в соответствие с рекомендациями Steck Т.; разделение гемоглобиновых фракций осуществляли с помощью вертикального диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле. В качестве исследуемого материала использовали 10% гемолизат, полученный из гепаринизированной крови, по технике, описанной Мауером Г.. Идентификацию электорофореграмм проводили при длине волны 590-600 нм с помощью установки «BioDocAnalize», Германия; з)

липиды экстрагировали по методу Фолча. Готовые экстракты разделяли на индивидуальные фракции фосфолипидов на пластинках с тонким слоем силикагеля «Woelm» (Германия). Двухмерную тонкослойную хроматографию и идентификацию индивидуальных фракций фосфолипидов осуществляли по методу Кирхнера Ю..

Морфо-гистохимические методы. Результаты морфологических исследований образцов периферической крови и плацент были проанализированы с помощью световой и электронной микроскопии. Для электронно-микроскопических исследований плацентарный материал фиксировали на холоде в 2,5% глютаральдегиде на 0,1 М кокадилатном буфере при рН 7,4 в течение часа. Далее его отмывали в соответствующем буфере с добавлением сахарозы. Последующую фиксацию проводили в 2% растворе четырех окиси осмия в течение 20-30 минут. После дегидратации в серии спиртов и ацетона образцы заливали в смесь смол аралдит и эпон-812. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм готовили на ультрамикротоме «LKB-8800» (Швеция) и окрашивали толуидиновым синим. Гистохимические методы проводили на парафиновых и криостатных срезах, после фиксации 4% раствором параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4). Готовые препараты подвергались цитофотометрическому анализу на цитофотометрической компьютерной установке «Mekos» (Москва). Для анализа были применены следующие морфо-гистохимические методы: а) общегистологические: окраска срезов гематоксилином Бемера-эозином для изучения общего плана строения плаценты; б) иммуногистохимические: коллаген III, IV, V типов выявляли с использованием моноспецифических поликлональных антисывороток НПКО «Динго» (Москва), с последующим мечением пероксидазой хрена; в) гистологические: гликозаминогликаны выявляли альциановым синим по Стидмену; перекиси жирных кислот выявляли по методу Винклера-Шульца, с использованием в качестве субстрата п-амино-N, N-диметилфенилендиамина; активность NO-синтазы определяли по Коржевскому Д.Э.; выявление АТФ-азы по методу Падикула-Херману; морфологическая детекция апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке концов фрагментов ДНК по ISEL-методу (in situ end-labeling); окраска гемоглобина по Лепена; общий мазок крови по Романовскому-Гимзе; подсчет общего числа эритроцитов проводился в камере Горяева; ретикулоциты и их морфофункциональные формы выявляли суправитальным окрашиванием бриллиант-крезил блау по

методу Гелыиейера. Для каждого гистохимического метода были поставлены соответствующие контроли.

Статистическая обработка и анализ данных проводились с использованием пакета прикладных программ «Statistica». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (т), коэффициент вариации, 95% доверительный интервал для средних значений M±tm, где t определялся по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=ni+n2-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структурно-метаболический статус эритроцитов периферической

крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции

Герпес-вирусная инфекция является одной из важнейших медико-социальных проблем современного акушерства и перинатологии (Тютюнник В.Л. и соавт., 2003; Иванова В.В. и соавт., 2008). Особое ее значение обусловлено высоким уровнем заболеваемости беременных, рожениц и родильниц, с поражением плодов и новорожденных и значительной долей герпес-вирусных инфекций в структуре осложнений беременности и неблагоприятных перинатальных исходов (Белозеров Е.С., Буланьков Ю.И., 2005; Исаков В.А., Архипова Е.И., Исаков Д.В., 2006). По нашим данным, среди беременных женщин, ранее редко болевших, титр антител IgG к ВПГ-1 1:12800 регистрируется в 30% случаев, в 50% фиксируется титр антител 1:6400 и, только, у 20% беременных обострение протекает с титром антител 1:3200. Генерализации инфекции способствует снижение иммунного статуса и изменение характера нейроэндокринных и обменных процессов у матери, свойственное периоду беременности и достигающее максимального развития во второй ее половине (Луценко М.Т., 2007). Высокий риск осложнений беременности и развития патологии плода определяется особенностью биологической аффинности ВПГ к нервным и иммунокомпетентным клеткам. Диссеминация возбудителя в сенсорные

ганглии, при инфицировании беременных, приводит к стимуляции моноаминергической системы, способствующей увеличению циркуляции в периферической крови серотонина, оказывающего тормозное действие на иммунные реакции (Вальков А.Ю., Ходасевич Л.С., 2000). Необходимо отметить, и о непосредственном влиянии ВПГ-1 на лимфоциты и макрофаги, в строме и цитоплазме которых наблюдается экспрессия вируса в виде элементарных телец, что неизбежно ведет к продукции ими провоспалительных цитокинов (TNFa, INFy), обладающих цитолитическим и цитотоксическим действием на клеточные структуры (Луценко М.Т., Соловьева A.C., 2010). Другим фактом, патологического влияния ВПГ-1, является его непосредственная локализация в строме эритроцитов, что нарушает конформационную устойчивость мембраны, изменяя, тем самым, газообмен (Орджоникидзе Н.В., Тютюнник В.Л., Марченко Л.А., 2001).

Следовательно, взаимообусловленное влияние ВПГ-1 и серотонина на иммунные реакции организма женщин в период беременности является патогенетически обусловленным фактором, способным изменять характер внутри- и межклеточных обменных процессов в системе «мать-плацента-плод».

Как показано в таблице 1, содержание серотонина прогрессивно увеличивалось в периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции, с максимальным проявлением при титре антител IgG к ВПГ-1 1:12800 в третьем триместре беременности. Возможно, повышение секреции моноамина усиливало действие антигена ВПГ-1 на лимфоидные органы, что изменяло иммунный ответ рожениц и приводило к повышению продукции макрофагальными клетками TNFa. Кроме того, в периферической крови рожениц наблюдалось увеличение уровня IL-1 и IL-8, участвующих, совместно с TNFa, в дифференцировке лимфоцитов в сторону формирования плазматических клеток. Параллельно отмечалось и увеличение INFy. Наряду с повышенным уровнем цитокинов макрофагальной природы, наблюдалось усиление продукции Thl-цитокинов, которое сопровождалось достоверным увеличением в периферической крови рожениц средних показателей IL-2. Свидетельством изменения баланса между Thl/Th2 явилось и увеличение внутриклеточной экспрессии IL-4. Также нельзя исключить, что повышенная продукция TNFa способствовала усилению основных функций цитотоксических NK(CD16)-лимфoцитoв, экспрессирующих на своей поверхности HLADR-антигены, уровень которых прогрессивно

увеличивался, соответственно степени агрессивности герпес-вирусной инфекции.

Таблица 1

Показатели нейрогуморалыю-гормонального статуса у рожениц при _обострении герпес-вирусной инфекции_

Показатели

Титр антител к ВПГ-1 в третьем

триместре беременности группа

1:12800 1:3200

Серотонин, 1,65±0,02 1,01 ±0,04 0,86±0,07

мкмоль/мл р<0,001 р<0,001

ТОТа, пг/мл 90,40±0,81 34,21±0,61 12,00±0,70

р<0,001 р<0,001

1Ь-1, пг/мл 74,95±1,4 42,69±0,42 20,70±0,53

р<0,001 р<0,001

ЮТу, пг/мл 408,50±2,01 242,69± 1,00 138,90±0,53

р<0,001 р<0,001

1Ь-2, пг/мл 101,00±2,00 52,41±0,54 38,40±0,90

р<0,001 р<0,001

1Ь-4, пг/мл 33,00±1,80 20,76±0,51 16,20±0,85

р<0,001 р<0,001

1Ь-8, пг/мл 44,00±0,90 24,05±0,22 18,00±0,60

р<0,001 р<0,001

№С(С016), % 16,80±0,70 11,50±0,50 10,00±0,10

р<0,001 р<0,01

НЬАОИ, % 8,40±0,40 6,00±0,08 4,50±0,60

р<0,001 р<0,01

Контрольная

Примечание: группой.

достоверность по сравнению с контрольной

Следовательно, развивающаяся при обострении герпес-вирусной инфекции дисфункция иммунных реакций способствовала накоплению в периферической крови рожениц патогенных токсических (антигены ВПГ-1), нейрогенных (серотонин) и иммунных (ЮТа) факторов, изменяющих поверхностные свойства мембран эритроцитов и обладающих эритропоэзингибирующим действием. Доказательством явилось уменьшение выработки эритропоэтина, при сниженном рОг венозной крови рожениц, при обострении герпес-вирусной инфекции, что приводило к снижению общего числа эритроцитов и количества ретикулоцитов, среди которых увеличивалась доля морфофункционально

незрелых полносетчатых форм над зрелыми пылевидными (табл. 2). Содержание неполносетчатых форм статистически значимо не изменялось. Одновременно в периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции определялось повышение гетерогенности популяции эритроцитов. Доля дискоцитов среди общего числа эритроцитов заметно уменьшалась, а количество эхиноцитов, каплевидных, мишеневидных и дегенеративных форм, наоборот, увеличивалось.

Таблица 2

Показатели эритропоэтической функции периферической крови

рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции

Показатели Титр антител к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контрольная группа

1:12800 1:3200

р02, мм рт.ст. 27,60±0,70; р<0,001 35,70±0,40; р<0,001 41,60±0,90

Эритропоэтин, МЕ/мл 8,95±0,47; р<0,001 13,99±0,24; р<0,001 28,09±0,36

Эритроциты, 1012/л 3,20±0,15; р<0,05 3,40±0,09; р<0,05 3,60±0,12

Ретикулоциты, % 0,90±0,07; р<0,001 1,20±0,09; р<0,001 1,50±0,07

Полносетчатые ретикулоциты, % 16,67±0,47; р<0,001 8,02±0,15; р<0,001 3,42±0,16

Неполносетчатые ретикулоциты, % 41,67±0,58;р>0,05 50,31 ±0,94; р<0,01 41,56±0,71

Пылевидные ретикулоциты, % 33,34±0,72; р<0,001 41,67±0,94; р<0,001 55,02±0,73

Дискоциты,% 68,20±1,70; р<0,001 74,90±0,70; р<0,001 87,00±1,10

Эхиноциты,% 6,60±0,08; р<0,001 3,49±0,30; р<0,001 2,75±0,06

Каплевидные эритроциты, % 2,27±0,04; р<0,05 2,48±0,10; р<0,05 1,20±0,09

Мишеневидные эритроциты, % 9,33±0,70; р<0,001 9,29±0,40; р<0,001 4,30±0,60

Дегенеративные формы, % 13,60±0,90;р<0,001 9,85±0,60; р<0,001 4,75±0,40

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Такие изменения со стороны трансформации эритроцитов в периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной

инфекции явились следствием уменьшения вязкостно-эластических свойств мембраны, что обусловлено, вероятным, нарушением взаимосвязи между ее компонентами - белками и фосфолипидами (табл.

3).

Таблица 3

Состав и свойства мембран эритроцитов периферической крови _рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции

Г ** ^ 1»уу Г.У * ** у

Титр антител к ВПГ-1 в третьем триместре беременности

Показатели

1:12800

Контроль ная группа

1:3200

а-спектрин

6,93*0,18; р<0,01

7,62*0,43; р>0,05

7,89*0,24

Р-спектрин

7,65±0,12; р<0,01

8,47*0,31;р>0,05

8,74±0,33

Анкирин

2,55*0,15; р<0,001

3,40*0,44; р>0,05

4,02*0,09

Полоса 3

15,78*0,29; р<0,001

17,35*0,18; р<0,05

18,34*0,19

Полоса 4.1

3,47*0,12; р<0,05

4,01*0,23; р>0,05

4,38*0,18

Полоса 4.2

8,15*0,41; р>0,05

7,74*0,54; р>0,05

7,25*0,12

Полоса 4.5

10,60*0,33; р>0,05

10,16*0,32; р>0,05

10,34*0,12

Полоса 4.9

9,60*0,18; р>0,05

9,17*0,27; р>0,05

9,19±0,10

Актин

9,60*0,21; р<0,05

9,00*0,26; р>0,05

8,87*0,24

Полоса 6

8,93*0,16; р>0,05

8,53±0,19; р>0,05

8,34*0,18

Полоса 7

8,44*0,13; р<0,01

7,64*0,11;р>0,05

7,02*0,14

Гликофорин

7,62*0,38; р<0,01

6,91*0,21 ;р<0,01

5,64*0,10

Фосфатидилэтаноламин

21,13*0,18; р<0,001

24,84*0,24; р<0,01

26,56*0,16

Фосфатидилхолин

23,31*0,18; р<0,001

28,46*0,21; р<0,01

31,46*0,42

Сфингомиелин

24,97*0,36; р<0,001

20,93*0,25; р<0,01

18,04*0,21

Фосфатидилинозитол

6,19*0,15; р<0,01

7,90*0,20; р<0,01

8,94*0,13

Фосфатидилсерин

11,90*0,25; р<0,01

9,50*0,11;р>0,05

8,71*0,20

Лизофосфатидилхолин

12,50*0,41; р<0,001

8,20*0,54; р<0,001

6,20*0,12

Рэ/Рм липидного бислоя

0,61*0,01; р<0,001

0,74*0,01; р<0,001

0,82*0,01

РЭ/Тм зоны липид-белковых контактов

0,86*0,02; р<0,001

0,91*0,02; р<0,001

1,21*0,03

Примечание: группой.

р - достоверность по сравнению с контрольной

При изучении относительного содержания белков цитоскелета мембран эритроцитов периферической крови рожениц отмечено снижение содержания а-спектрина, (3-спектрина, анкирина, а также белка полосы 4.1 при одновременном увеличении доли актина, соответствующее степени агрессивности герпес-вирусной инфекции в третьем триместре беременности. При этом достоверно низкими

оказались значения белка полосы 3. В отношении фракций белков полос 4.2, 4.5, 4.9 и 6 статистически достоверных изменений выявлено не было. Значения белка полосы 7 и гликофорина были повышенными.

При анализе фосфолипидного спектра мембран эритроцитов периферической крови рожениц, при обострении герпес-вирусной инфекции, обнаружено снижение уровня фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина. Очевидно, что определяемое уменьшение доли фосфатидилэтаноламина в мембранах эритроцитов в периферической крови рожениц связано с увеличением синтеза фосфатидилсерина, показатели которого увеличивались. Результатом гидролиза фосфатидилхолина можно назвать выявляемое повышение фракции лизофосфатидилхолина, что усиливало разрыхление липидного бислоя мембран эритроцитов. Наряду с этим, обнаруживалось снижение фракции фосфатидилинозитола. При этом, уровень сфингомиелина повышался. Нарушение соотношения фосфолипидов явилось причиной снижения текучести и увеличения относительной микровязкости мембран эритроцитов периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции, что подтверждалось низкими значениями флюоресценции липотропного зонда пирен, а также уменьшением параметров флюоресценции липид-белоковой фазы (табл. 3).

Анализ эффективности процессов образования гемоглобина показал, что формируемое при обострении герпес-вирусной инфекции состояние неэффективности эритропоэза явилось одной из возможных причин изменения соотношения основных изомолекулярных форм гемоглобина в эритроцитах периферической крови рожениц (табл. 4). В ходе исследования определялось снижение уровня гемоглобина А при одновременном росте показателей фетального гемоглобина, что соответствовало высокому титру антител к ВПГ-1 1:12800 в третьем триместре беременности. При этом уровень гемоглобина А2 статистически значимо не изменялся. Понятно, что такая перестройка процессов синтеза гемоглобина может иметь непосредственное отношение к снижению его общего уровня за счет изменения конформационной устойчивости молекул к окислению в период обострения герпес-вирусной инфекции. Доказательством явилось снижение уровня термостабильного гемоглобина при увеличении фракции термолабильного, что приводило к нарушению его оксигенации и снижению объема поступления из лакунарной крови кислорода в кровь плода. В венозной крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции установлено снижение степени насыщения гемоглобина

кислородом и концентрации оксигемоглобина. Достоверно высокими были показатели метгемоглобина.

Таблица 4

Показатели гемоглобинобразовательной и кислородтранспортной функций периферической крови рожениц при обострении герпес__вирусной инфекции__

Показатели Титр антител к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контроль ная группа

1:12800 1:3200

Общий НЬ, г/л 100±1,84;р<0,001 109±1,35;р<0,001 115±2,15

НЬА, % 88,20±0,71;р<0,05 89,69±0,42; р>0,05 90,83±0,93

НЬА2, % 6,80±0,75; р>0,05 6,60±0,81; р>0,05 5,93±0,54

НЬР, % 5,00±0,61;р<0,05 3,71±0,21; р>0,05 3,24±0,28

Термостабильный гемоглобин, % 74,14±0,96; р<0,001 84,54±2,19; р<0,05 87,21±0,42

Термолабильный гемоглобин, % 25,86±0,78; р<0,001 15,46±0,31; р<0,01 12,78±0,23

ОгБа^ % 30,20±0,90; р<0,001 37,1±1,00; р<0,001 57,10±1,10

НЬ02, % 90,20±0,47; р<0,001 93,30±0,44; р<0,05 95,20±0,51

меШЬ, % 1,05±0,03;р<0,001 0,98±0,02; р<0,001 0,81 ±0,03

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Необходимо отметить, что степень связывания кислорода с гемоглобином напрямую зависит от кислотно-щелочного баланса крови (табл. 5). В венозной крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции установлено снижение буферной емкости крови, что выражалось в росте показателей величины ВЕ. Появление ацидотических сдвигов подтверждалось и повышением показателей лактата, что приводило к увеличению кислотности венозной крови рожениц и снижению рН. К тому же, отмечалось уменьшение уровня стандартных и истинных бикарбонатов, которые сочетались с низкими показателями общих бикарбонатов.

Следовательно, в организме рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции формировались условия метаболической дисфункции эритрона, что указывало на дизадаптацию регуляторных систем, участвующих в компенсации кислородной недостаточности.

Таблица 5

Показатели кислотно-щелочного состояния венозной крови рожениц пр _обострении герпес-вирусной инфекции _

Показатели Титр антител к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контроль ная группа

1:12800 1:3200

РН 7,29±0,02; р<0,05 7,34±0,03; р>0,05 7,40±0,04

рС02, мм рт.ст. 33,00±0,47; р<0,01 39,00±1,10; р>0,05 40,00±0,90

ВЕ, ммоль/л -8,00±0,85;р<0,001 -4,40±0,23; р<0,001 -2,80±0,85

НСОз-ас^ ммоль/л 20,10±0,91; р<0,001 22,30±0,25; р<0,01 25,80±0,56

НСОз^с!, ммоль/л 19,70±0,35; р<0,01 21,40±0,51; р<0,05 23,00±0,87

ЮОг, ммоль/л 21,20±0,53; р<0,001 24,30±0,42; р<0,01 26,40±0,54

Лактат, ммоль/л 0,59±0,03; р<0,001 0,42±0,02; р>0,05 0,33±0,03

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Одной из таких является полифосфатная система, представленная в эритроците 2,3-ДФГ, который в физиологических условиях находится в эквимолярном соотношении с гемоглобином, обеспечивая, тем самым, адекватное присоединение и отдачу кислорода тканям (табл. 6).

Таблица 6

Содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции

2,3-ДФГ, мкмоль/мл Титр антител к триместре бе ВПГ-1 в третьем ременности Контроль ная группа

1:12800 1:3200

Общий 7,05±0,07; р<0,001 6,36±0,09; р<0,05 5,77±0,14

Связанный с НЬ 6,40±0,10; р<0,01 5,79±0,16; р>0,05 5,31±0,25

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Анализ содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции показал увеличение уровня, как общего, так и связанной с гемоглобином фракции. При этом повышение доли 2,3-ДФГ, связанного с гемоглобином, отражало тяжесть инфекционного процесса, при котором дополнительный его эффект на снижение сродства гемоглобина к кислороду и усиленную отдачу его тканям полностью нивелировался ацидотическим сдвигом. Результатом, такого воздействия, явилось вероятное увеличение мест связывания 2,320

ДФГ с глобиновыми цепями в полости деоксигемоглобина, что снижало его оксигенацию.

Помимо специфического регулятора кислородного обмена - 2,3-ДФГ, определялась метаболическая активность ферментных систем, регулирующих уровень восстановленного глутатиона, и представленных глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой и глутатионредуктазой (табл. 7). В эритроцитах периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции выявлено снижение уровня, как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, так и НАДФН-зависимой глутатионредуктазы, что приводило к вероятному уменьшению восстановительного потенциала тиолдисульфидной системы, представленной глутатионом.

Таблица 7

остояиие окислительно-восстановительных процессов в эритроцитах иферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции

Показатели Титр антител ^С к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контроль ная группа

1:12800 1:3200

Г-6-ФДГ, МЕ/л 109 эритроцитов 35,97±1,97; р<0,001 50,48±0,90; р<0,05 57,64±1,58

ГР, Ед/г НЬ 4,48±0,22; р<0,001 8,3б±0,14; р<0,05 10,82±0,18

ГП, Ед/г НЬ 5,82±0,14; р<0,001 8,62±0,12; р<0,001 15,68±0,16

СОД, Ед/г НЬ 230,37±2,51;р<0,001 289,51±3,12; р<0,001 402,73±5,87

Общий АТФ, мкмоль/мл 0,50±0,01;р<0,01 0,55±0,02; р>0,05 0,69±0,03

АТФ на 1 г НЬ, мкмоль/мл 4,43±0,074; р<0,01 5,04±0,05; р>0,05 5,56±0,11

Общий Р, мкмоль/мл 0,158±0,002; р<0,01 0,150±0,002; р>0,05 0,145±0,002

Неорганический Р, мкмоль/мл 0,109±0,006; р<0,01 0,097±0,003; р>0,05 0,089±0,005

а-токоферол, ммоль/л 1,63±0,П;р<0,01 1,72±0,10; р<0,05 1,96±0,09

МДА, мкмоль/мл 1,22±0,05;р<0,001 0,96±0,04; р<0,05 0,89±0,02

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Очевидно, что результатом такой метаболической дизадаптации эритроцитов периферической крови рожениц, инфицированных ВПГ-1, будет являться снижение их энергообеспеченности, обусловленное гидролизом значительной части, как общего, так и связанного с

21

гемоглобином АТФ, что изменяло состояние процессов окислительного фосфорилирования, способствуя, тем самым, нарушению баланса фосфатов. Доказательством явилось увеличение в периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции содержания общего и неорганического фосфора.

Наряду с этим, установлено, что обострение герпес-вирусной инфекции способствует нарушению антиокислительной активности эритроцитов периферической крови рожениц, а также усилению процессов липопероксидации, что во многом обуславливает их трансформацию и усиленное разрушение в кровеносном русле (табл. 7).

К причинам повышенного разрушения эритроцитов периферической крови рожениц можно отнести, обнаруженное в ходе исследования, подавление антиокислительной активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, что приводило, при недостаточной утилизации супероксидрадикалов и пероксида водорода, к вероятному окислению мембранных фосфолипидов. Подтверждением явилось накопление в периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции ТБК-активных продуктов - МДА. Одновременно выявлялось снижение уровня сывороточного а-токоферола. Разнонаправленный характер, обнаруженных в ходе исследования нарушений структурно-метаболического статуса и функциональных свойств эритроцитов периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции, позволяет рассматривать их, как неспецифические признаки вовлечения в сложный комплекс изменений, сопутствующих развитию инфекционного процесса. К тому же, нельзя не отметить, что степень выраженности выявленных различий по изученным показателям морфофункционального состояния эритроцитов периферической крови рожениц и их кислородтранспортных свойств закономерно зависит от агрессивности герпес-вирусной инфекции.

Следовательно, выявленный в периферической крови и клетках красной крови рожениц комплекс нарушений (гиперсекреция серотонина, типоспецифических антител к ВПГ-1, ТОТа) становится патогенетически обоснованным фактором, инициирующим повреждение фетоплацентарного барьера и его морфофункциональную перестройку.

Морфофункциональная характеристика плаценты при обострении герпес-вирусной инфекции

Доставка кислорода в кровь плода и освобождение от углекислого газа осуществляется через фетоплацентарный барьер. При этом эффективность кислородного обмена по обе стороны барьера будет определяться его морфофункциональным состоянием, обеспечивающим максимальное сближение материнского и плодового кровотоков, увеличение площади обмена, вследствие уменьшения толщины хориального эпителия и краевого расположения сосудов. Усиление периферической циркуляции, в том числе, и в зоне маточно-плацентарного кровообращения, патогенных факторов (антигены ВПГ-1, серотонин, иммуномодулирующие цитокины (TNFa, IL-1, INFy) при обострении герпес-вирусной инфекции вызывало, по-видимому, локальное повреждение фетоплацентарного барьера и изменение обменных процессов, способствующих его структурной перестройке и нарушению поверхностных свойств. К таким неспецифическим нарушениям, ограничивающим проницаемость фетоплацентарного барьера для кислорода, можно отнести дезорганизацию синтеза волокнистых соединительнотканных структур стромы, которая максимально проявлялась при титре антител IgG к ВПГ-1 1:12800 в третьем триместре беременности. В строме ворсин выявлялось увеличение количества коллагеновых волокон III типа, расположенных вокруг кровеносных сосудов и удаляющих их от соприкосновения с базальной мембраной синцитиотрофобласта. Наряду с этим, усиливалась реакция на кислые гликозаминогликаны, которые выявлялись между пучками коллагеновых волокон III типа. Кроме того, отмечалось уплотнение коллагеновых волокон IV-V типов, прилежащих непосредственно к базальной мембране капилляров ворсинок плацент, что также приводило к нарушению структурного гомеостаза стромы и ограничению ее проницаемости.

Перечисленные структурные изменения соединительнотканных волокнистых элементов стромы в значительной мере объясняют рост количества ворсин до 50%, а в некоторых случаях и до 70%, в которых расстояние от ближайших сосудов до базальной мембраны синцитиотрофобласта увеличивается в 4-5 раз, что, несомненно, снижало эффективность обменных процессов между кровью матери и плода.

Следует указать и на то, что при непосредственном контакте поверхности ворсин с материнской кровью, перегруженной патогенными

факторами, усиливается эндогенная фосфолипазная активность, инициирующая процессы пероксидации липидов и образование в синцитиотрофобласте перекисей жирных кислот. Параллельно с этим в синцитиотрофобласте активизируется NO-синтаза, что приводит к увеличению уровня не только N0, но и NO-продуктов - нитритов (N02"), высокий уровень которых определялся в гомогенатах плацент от женщин с обострением герпес-вирусной инфекции, что могло нарушать целостность тканевых структур плаценты, способствуя, тем самым, инвазии герпесных телец (табл. 8).

В этом отношении, становятся интересными данные, полученные при электронно-микроскопическом изучении препаратов плацент. Было обнаружено проникновение возбудителя в фетоплацентарный барьер в виде герпесных телец, которые в отдельных случаях внедрялись в виде мощного комплекса в цитозоль синцитиотрофобласта плаценты. Достигая ядер синцитиотрофобласта, возбудитель вступал с ними в контакт. В результате отмечалась реакция ядра на вирусное присутствие, которая выражалась в его деформации и конденсации хроматина. Более того, в наружном слое синцитиотрофобласта плацент от женщин при обострении герпес-вирусной инфекции отмечались грубые морфологические изменения, которые соотносились с данными общегистологических исследований, используемых при оценке фетоплацентарной недостаточности (Мельникова В.Ф., Цинзерлинг A.B., Михайлова JI.E. и соавт. 1984). Было отмечено укорочение микроворсинок, уменьшение их толщины, вплоть до разрушения. Безусловно, что в таких условиях обнаруживались признаки структурной дезорганизации цитозоля синцитиотрофобласта ворсин, которые выражались в его вакуолизации. Более того, установлены деструктивные изменения мембранного аппарата митохондрий. В большинстве случаев кристы митохондрий разрушались, что приводило к появлению опустошенных, иногда разорванных пузырьков. Среди причин, способствующих развитию дисфункции фетоплацентарного барьера при обострении герпес-вирусной инфекции, можно назвать появление дисбаланса между системой клеточных взаимодействий. Вероятно, это связано с повышением цитотоксических реакций клеток крови матери, а также снижением фагоцитирующей активности плацентарных макрофагов, что приводит к экспрессии повреждающих агентов и нарастанию апоптотических изменений в синцитиотрофобласте. Можно согласиться и с тем, что герпес-вирусная инфекция изменяет способность

пораженных клеток синтезировать цитокины, а клеток-мишеней -отвечать на действие последних. Событием, определяющим направленность течения пролиферативного ответа, служит секреция ТМ^а, избыточная концентрация которого была обнаружена в гомогенатах плацент от женщин с обострением герпес-вирусной инфекции (табл. 8). Установленное повышение цитотоксической активности ТОТа может свидетельствовать об изменении структурного гомеостаза фетоплацентарного барьера, а также иммунных взаимоотношений между матерью и плодом, усилении апоптоза иммунокомпетентных клеток и ядер синцитиотрофобласта. К тому же, нельзя исключить и прямого влияния молекулярных механизмов цитотоксического действия >}К-лимфоцитов на фетоплацентарный барьер, экспрессия которых отчетливо выявлялась не только в периферической крови рожениц при обострении герпес-вирусной инфекции, но и вдоль поверхности синцитиотрофобласта при люминесцентном его исследовании. Очевидно, что такое взаимодействие КК-лимфоцитов с поверхностью синцитиотрофобласта приводит к образованию контактов с мембраной и направленному выделению из азурофильных гранул гранзима В, высокий уровень которого выявлялся в гомогенатах плацент (табл. 8).

На усиление мембранодестабилизирующих процессов в синцитиотрофобласте при обострении герпес-вирусной инфекции указывало снижение общей АТФ-азной активности, что приводило к возможному нарушению транслокации фосфатидилсерина и его экстернализации на наружной поверхности с развитием аутоиммунной реакции и выработкой антител. Подтверждением явилось увеличение концентрации в гомогенатах плацент антител ^М к фосфатидилсерину (табл. 8). Одновременно, в тех же гомогенатах плацент, выявлялся высокий уровень аннексина V, имеющего большое сродство к фосфатидилсерину, что способствовало инактивации

противовоспалительной активности гибнущих клеточных элементов и индукции апоптоза. Безусловно, что в такой ситуации увеличивается сродство поверхности синцитиотрофобласта плаценты к цитотоксическим ЫК-лимфоцитам, особенно, в присутствии ЮТа, который вызывает инициацию энзиматического каспазного каскада и апоптоза ядер. Было установлено повышение уровня в гомогенатах плацент от женщин с обострением герпес-вирусной инфекции каспазы 3,

что свидетельствовало об усилении апоптотических изменений ядер синцитиотрофобласта (табл. 8).

Таблица 8

Содержание в гомогенатах плацент факторов апоптотического и

противоапоптотического действия при обострении _ герпес-вирусной инфекции__

Показатели Титр антител к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контроль ная группа

1:12800 1:3200

Тора, пг/мл 89,90±0,34; р<0,001 34,21±0,61;р<0,001 11,60±0,09

Гранзим В, пг/мл 1007,53±31,50;р<0,001 283,14±18,00;р<0,01 251,10±31,0

Антитела 1§М к фосфатидилсерину Ед/мл 5,60±0,06; р<0,001 3,10±0,05; р>0,05 2,50±0,07

Аннексии V, нг/мл 63,70±0,80; р<0,001 26,30±0,51; р>0,05 25,78±0,92

Каспаза 3, нг/мл 103,70±0,80; р<0,001 26,70±0,05; р<0,001 19,00±0,80

Вс1-2, пг/мл 28,14±0,79; р<0,001 34,24±1,00; р<0,001 5,80±0,02

Р53, Ед/мл 4,52±0,06; р<0,001 2,11±0,02; р<0,001 0,74±0,03

Нрз-70, нг/мл 22,30±0,90; р<0,001 30,40±0,40; р<0,001 56,10±0,60

Цитохром С, пг/мл 18,80±0,08; р<0,001 13,90±0,06; р<0,01 10,02±0,07

Н2О2, мкмоль/л 121,54±0,92; р<0,001 34,52±0,52; р<0,001 19,44±0,71

Ы02", мкмоль/л 105,70±1,52;р<0,001 64,41±1,12; р<0,001 20,31±0,09

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Действительно, исследование парафиновых срезов тех же плацент по ГБЕЬ-методу позволило выявить усиление реакции ядер синцитиотрофобласта на апоптоз. В большинстве наблюдений отмечалась конденсация хроматина в плотный, прилегающий к ядерной оболочке, полукруг. В некоторых случаях, конденсация хроматина была более выраженной, и, почти, все ядро становилось окрашенным продуктом гистохимической реакции. Параллельный подсчет таких, апоптотически измененных, ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плацент от общего их количества (2000 ядер) показал, что при титре антител к ВПГ-1 1:12800 в третьем триместре беременности их число увеличивалось в 4,5 раза, тогда как при титре антител к ВПГ-1 1:3200 - в 1,5 раза. Наряду с морфофункциональными изменениями в ядрах (апоптоз) при обострении герпес-вирусной инфекции отмечались глубокие нарушения и в цитозоле синцитиотрофобласта ворсин. Важным

доказательством таких нарушений явилось развитие дисбаланса между синтетическими процессами, связанными с секрецией белков р53 и Вс1-2, имеющих разнонаправленный характер действия при повреждении клеток вирусными агентами (табл. 8). Эта закономерность подтверждалась результатами исследования, при которых титр антител к ВПГ-1 1:3200 в третьем триместре беременности соотносился с однонаправленным повышением в гомогенатах плацент уровней белков р53 и Вс1-2, что явилось фактором относительно низкой выявляемое™ апоптотически измененных ядер синцитиотрофобласта. И, наоборот, при титре антител к ВПГ-1 1:12800 в третьем триместре беременности в гомогенатах плацент отмечалось снижение уровня белка Вс1-2 при одновременном нарастании содержания белка р53, что приводило к диерегуляции каскада энзиматических реакций, в том числе тех, которые обеспечивают конформационную стабильность и нативные свойства цитозольных и митохондриальных белков, а также ферментов дыхания и дыхательного фосфорилирования, ответственных за синтез АТФ.

Одним из таких, является белок теплового шока Шр-70 (табл. 8). В гомогенатах плацент от женщин при обострении герпес-вирусной инфекции установлено снижение его уровня, что могло свидетельствовать об инициации протеолитических процессов, повышающих вероятность появления конгломератов денатурированных белков цитозоля с белками НБр-70, уменьшающих концентрацию его свободной формы. Проведенное электронно-микроскопическое исследование препаратов тех же плацент показало, что в большинстве случаев на фоне функциональной недостаточности белков Нзр-70 отмечалась дезинтеграция цитозоля синцитиотрофобласта. Цитозоль, в зоне контакта с ядрами синцитиотрофобласта, терял свою компактность. В большинстве случаев цитозоль, в зоне контакта с ядром синцитиотрофобласта, исчезал, способствуя появлению крупных светлых вакуолей, которые сдавливали ядро и уплотняли хроматин, что можно рассматривать, как начальные признаки апоптоза. Наряду с этим, в ходе исследования гомогенатов плацент от женщин при обострении герпес-вирусной инфекции выявлялись признаки, отражающие тяжесть повреждений мембранных структур синцитиотрофобласта. В гомогенатах плацент было отмечено повышение уровня пероксида водорода, что, при наблюдаемом нарушении структуры мембранного аппарата митохондрий, приводило к выходу содержимого межмембранного пространства (цитохром С, апоптогенные белки) в цитозоль, активации каспазы 3 и

индукции апоптоза. Установлено увеличение уровня цитохрома С в гомогенатах тех же плацент.

Безусловно, рассмотренные механизмы реализации апоптоза имеют решающее значение в понимании компенсаторно-приспособительных, либо дизадаптационно-направленных структурно-функциональных перестроек фетоплацентарного барьера при обострении герпес-вирусной инфекции и инфицировании плаценты ВПГ-1. При этом наблюдаемые повреждения мембранных структур и дезинтеграция цитозоля синцитиотрофобласта плаценты могут усиливать проникновение повреждающих факторов в пуповинную кровь плода, вызывая, тем самым, структурно-метаболические изменения эритроцитов, их кислородтранспортные свойства, что является признаком кислородной недостаточности.

Структурно-метаболический статус эритроцитов крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции

Оценивая характер кислородного обмена между матерью и плодом необходимо указать, что его эффективность будет определяться не только степенью оксигенации материнской крови, омывающей межворсинчатое пространство, но и морфофункциональным состоянием фетоплацентарного барьера. Отмечаемые при обострении герпес-вирусной инфекции снижение кислородтранспортной функции крови матери и диффузионных свойств фетоплацентарного барьера способствовали уменьшению кислородного обеспечения крови плода, что проявлялось в снижении показателей рОг в венозной крови пуповины (табл. 9).

Можно полагать, что компенсацией гипоксии должно явиться повышение эффективности фетального эритропоэза, обеспечивающее увеличение объема функционально зрелой эритроцитарной массы. Однако, этого не происходило и в венозной крови пуповины выявлялось снижение уровня эритропоэтина. Возникал порочный круг - низкая эритропоэтическая активность приводила к уменьшению числа зрелых эритроидных клеток в крови сосудов пуповины и их предшественников -ретикулоцитов, что, в свою очередь, стимулировало выброс морфофункционально незрелых эритроидных форм и усугубляло гипоксию, что соотносилось со степенью агрессивности герпес-вирусной инфекции во время беременности. В крови пуповины выявлено увеличение количества полносетчатых и неполносетчатых форм

ретикулоцитов. Доля пылевидных ретикулоцитов, наоборот, уменьшалась.

Таблица 9

Показатели эритропоэтической функции крови пуповины _при обострении герпес-вирусной инфекции

Показатели

Титр антител к ВПГ-1 в третьем триместре беременности

1:12800

1:3200

Контроль ная группа

ьр;, ММ рт. СТ.

21,00±0,30; р<0,001

30,00±0,21; р<0,001

36,20±0,10

Эритропоэтин, МЕ/мл

13,23±0,21; р<0,001

23,67±0,18; р<0,001

42,53±0,32

Эритроциты,10 /л

5,20±0,15; р<0,001

5,53±0,12; р<0,05

6,00±0,20

Ретикулоциты, %

1,30±0,11; р<0,001

2,00±0,07; р<0,05

2,30±0,09

Полносетчатые ретикулоциты, %

31,24±0,27; р<0,001

17,69±0,33; р>0,05

16,66±0,12

Неполносетчатые . етикулоциты, %

56,25±0,71; р<0,001

43,85±0,65; р<0,001

31,25±0,21

Пылевидные . етикулоциты, %

12,51±0,23; р<0,001

38,46±0,65; р<0,001

52,09±0,34

Дискоциты,%

66,00± 1,20; р<0,001

77,10±0,80; р<0,001

84,00±0,90

Эхиноциты,%

7,80±0,09; р<0,001

5,50±0,23; р<0,001

3,80±0,05

Каплевидные эритроциты, %

1,60±0,04; р>0,05

1,40±0,09; р>0,05

1,20±0,09

Мишеневидные эритроциты, %

9,80±0,70; р<0,001

6,50±0,12; р<0,001

3,65±0,06;

Дегенеративные ормы, %_

14,80±0,40; р<0,001

9,50±0,51; р<0,001

7,35±0,12

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой

Таким образом, к моменту рождения у детей от матерей при обострении герпес-вирусной инфекции в условиях сниженной кислородной обеспеченности крови пуповины, формируются признаки неэффективного эритропоэза, которые проявляются в диспропорции между скоростью продукции морфофункционально зрелых эритроидных клеток и их разрушением в кровеносном русле.

В результате в крови пуповины, совместно с неонатальными эритроцитами, которые сохраняют черты фетальных эритроидных клеток, характеризующихся физиологическим макроцитозом, сокращенной продолжительностью жизни, повышенной нестойкостью и сниженной

деформированностью, появляется большое число функционально незрелых эритроидных клеток. Последнее, по-видимому, определяло морфологическую изменчивость эритроцитов, которая обнаруживалась при цитофотометрическом исследовании мазков крови пуповины. Было установлено статистически достоверное снижение доли морфологически зрелых дискоцитов. При этом число трансформированных форм в крови пуповины (эхиноциты, мишеневидные эритроциты, дегенеративные формы) повышалось. Количество каплевидных форм эритроцитов в крови пуповины статистически достоверно не изменялось.

Установленное повышение трансформируемое™ эритроцитов крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции приводило к возможному нарушению гемодинамики в микроциркуляции, которое обеспечивалось уменьшением площади обмена между видоизмененной поверхностью клеток красной крови и сосудистой стенкой капилляров в ворсинке плаценты, что вызывало ограничение поступления кислорода в кровь плода, усиливая, тем самым, проявления гипоксии и повреждение жизненно важных органов.

Вместе с тем, определяемая в ходе исследования, гетерогенность морфологических форм в популяции эритроцитов крови пуповины явилась следствием снижения их деформируемости, обусловленным непосредственным воздействием мембранодестабилизирующих факторов, поступающих экзогенно в плодовый кровоток из материнской крови (ВПГ-1), либо эндогенно продуцируемого ТОТа, что приводит к инициации пероксидации липидов и протеолиза, нарушающих конформационную структуру фосфолипидных и белковых компонентов мембран. Более того, повышенная окисляемость липидных и белковых структур мембран таких эритроцитов может быть обусловлена специфичностью их соотношения, которое определяется условиями функционирования эритроцитов в пониженном кислородном режиме, а также незрелостью компенсаторных механизмов противорадикальной защиты.

Анализ состава белков цитоскелета мембран эритроцитов крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции показал перераспределение соотношения белковых фракций, которое проявлялось в снижении относительного содержания а-спектрина, Р-спектрина, анкирина и белка полосы 4.1 (табл. 10). Вместе с тем, статистически значимых изменений в показателях белков полос 4.2, 4.5 и 4.9, а также белка полосы 6 и актина выявлено не было. При этом увеличивалась доля белка полосы 7. Одновременно установлено снижение в мембранах

эритроцитов крови пуповины уровня белка полосы 3 при значительном увеличении фракции гликофорина.

Полученные результаты позволяют заключить, что для эритроцитов крови пуповины, функционирующих в условиях повышенной антигенной нагрузки ВПГ-1 и сниженном кислородном режиме, характерно изменение свойств мембран, обусловленное нарушением возможной взаимосвязи между белками а, р-спектрином, анкирином, белком полосы 4.1, образующими периферическую цитоскелетную сеть; снижением активности белка полосы 3 и, как следствие, нарушением течения газообменных и энергетических процессов в клетке; появлением высокой антигенной специфичности мембраны, которая определяется ростом содержания гликофорина, что также способствует изменению барьерных свойств и усилению гемолитических процессов, сокращающих объем эритроцитарной массы.

В связи с этим, возможно предположить, что в эритроцитах крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции, усиливались процессы диссоциации и перестройки белковых компонентов мембран, что приводило к снижению площади белок-липидных контактов, повышению окисляемости фосфолипидных молекул, нарушающей их состав и ассиметрию в липидном бислое.

Данный факт подтверждался снижением в мембранах крови пуповины уровня фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина при увеличении фракции лизофосфатидилхолина, соответственно степени выраженности герпес-вирусной инфекции (табл. 10). Кроме того, определялось увеличение доли фосфатидилсерина, что соотносилось с высоким уровнем гликофорина и повышало вероятность участия эритроцитов в иммунных реакциях в период высокой антигенной нагрузки с последующим их разрушением. Наряду с этим, в мембранах эритроцитов крови пуповины отмечалось снижение уровня фосфатидилинозитола. Статистически значимых изменений в показателях сфингомиелина установлено не было. Одновременно выявлялось снижение параметров флюоресценции липотропного зонда пирен, а также гидрофобного объема зоны белок-липидных контактов, о чем свидетельствовали низкие показатели его флюоресценции.

Таблица 10

Состав и свойства мембран эритроцитов крови пуповины при _обострении герпес-вирусной инфекции _

Показатели Титр антител к триместре бе ВПГ-1 в третьем эеменности Контрольная группа

1:12800 1:3200

а-спектрин 5,37±0,11;р<0,01 7,42±0,23; р>0,05 7,46±0,51

р-спектрин 6,21±0,22; р<0,01 8,07±0,21; р>0,05 8,11±0,40

Анкирин 1,81±0,09; р<0,001 2,40±0,30; р>0,05 2,59±0,10

Полоса 3 12,58±0,39; р<0,001 14,35±0,44; р<0,05 15,80±0,51

Полоса 4.1 2,93±0,22; р<0,001 4,81±0,13; р>0,05 5,20±0,30

Полоса 4.2 5,95±0,31; р>0,05 7,74±0,34; р>0,05 7,54±0,54

Полоса 4.5 11,65±0,23; р>0,05 10,16±0,12; р>0,05 10,60±0,42

Полоса 4.9 10,50±0,24; р>0,05 9,17±0,17; р>0,05 9,80±0,60

Актин 9,22±0,17; р>0,05 8,41 ±0,11; р>0,05 8,80±0,14

Полоса 6 8,78±0,21; р>0,05 8,13±0,12; р>0,05 8,20±0,20

Полоса 7 10,60±0,13; р<0,01 7,64±0,09; р>0,05 7,90±0,24

Гликофорин 14,40±0,25; р<0,01 10,91±0,18; р<0,01 7,70±0,12

Фосфатидилэтанол амин 19,10±0,12; р<0,001 20,17±0,15; р<0,01 22,41±0,14

Фосфатидилхолин 22,29±0,11; р<0,001 25,66±0,20; р>0,05 26,10±0,22

Сфингомиелин 20,16±0,24; р>0,05 19,53±0,13; р>0,05 19,41±0,09

Фосфатидилинозитол 11,30±0,09; р<0,001 13,15±0,11; р>0,05 14,01±0,12

Фосфатидилсерин 14,15±0,12; р<0,001 12,02±0,10; р<0,05 11,37±0,11

Лизофосфатидил холин 13,00±0,П;р<0,001 9,47±0,10; р<0,001 6,70±0,10

Рэ/Рм липидного бислоя 0,54±0,02; р<0,001 0,69±0,03; р<0,05 0,76±0,04

Рэ/Рм зоны липид-белковых контактов 0,80±0,02; р<0,001 0,87±0,03; р<0,05 1,13±0,03

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Следует указать и на то, что при обострении герпес-вирусной инфекции изменялся характер оксигенации эритроцитов крови пуповины (табл. 11).

Таблица 11

Показатели гемоглобинобразовательной и кислородтрапспортной функций крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции

Показатели Титр антител ^С к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контрольная фуппа

1:12800 1:3200

Общий НЬ, г/л 145±2,21;р<0,001 156±1,30; р<0,001 167±3,00

НЬА, % 16,81±0,82; р<0,001 29,98±0,72; р<0,001 32,37±0,35

НЬА2, % 13,06±0,54;р<0,05 11,85±0,29; р>0,05 10,72±0,54

НЬР, % 70,13±0,95;р<0,001 58,17±0,41; р<0,05 56,71±0,64

Термостабильный гемоглобин, % 64,94±1,41; р<0,001 75,15±0,74; р<0,05 78,52±0,66

Термолабильный гемоглобин, % 35,06±0,84; р<0,001 26,85±0,51; р<0,01 21,48±0,34

0^, % 27,30±0,70; р<0,001 34,00±1,10; р<0,001 42,70±1,21

НЬ02, % 88,50±0,34;р<0,001 91,00±0,20; р<0,05 93,00±0,51

меЩЬ, % 1,11±0,05; р<0,001 0,98±0,03; р<0,05 0,90±0,04

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Было установлено снижение уровня общего гемоглобина крови пуповины. Одной из причин, явилась задержка смены типов гемоглобина (фетальный гемопоэз), при которой синтез более нестойкого фетального гемоглобина преобладал над гемоглобином А, что соответствовало степени агрессивности герпес-вирусной инфекции. Наряду с этим, выявлялось увеличение уровня гемоглобина А2. Можно полагать, что у новорожденных от матерей при обострении герпес-вирусной инфекции сохраняется фетальный тип эритропоэза, который адаптирован к низкому р02 и является свидетельством внутриутробной гипоксии плода. Более того, фетальный эритропоэз и гиперпродукция фетального гемоглобина может усиливать неустойчивость гемоглобина по отношению к окисляющим агентам, что приводит к нарушению его структуры и кислородтранспортных свойств. Данный факт подтверждался низкими

показателями термостабильного гемоглобина в эритроцитах крови пуповины. При этом уровень термолабильного увеличивался. Нарушение конформационной устойчивости гемоглобина в эритроцитах крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции приводило к нарушению способности присоединять кислород, что проявлялось в снижении степени сатурации гемоглобина кислородом и его оксигенированной формы. Показатели метгемоглобина в эритроцитах крови пуповины, наоборот, увеличивались.

Наряду с нарушением кислородной обеспеченности крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции отмечалось развитие метаболической дизадаптации, что выражалось в нарушении ее кислотно-щелочного баланса с развитием смешанного респираторно-метаболического ацидоза (табл. 12).

Таблица 12

Показатели кислотно-щелочного равновесия крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции_

Показатели Титр антител к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контрольная группа

1:12800 1:3200

рН 7,20±0,01; р<0,01 7,30±0,02; р>0,05 7,36±0,01

рС02, мм рт.ст. 50,20±1,00; р<0,01 45,30±0,70; р>0,05 44,53±0,60

ВЕ, ммоль/л -11,00±0,50; р<0,001 -7,70±0,31; р<0,05 -6,30±0,24

НСОз-ай, моль/л 20,00±0,11; р<0,01 21,20±0,33; р<0,05 23,10±0,46

НС03-51с1, моль/л 19,00±0,44; р<0,01 20,30±0,31; р>0,05 22,00±0,87

КЗОг, ммоль/л 22,40±0,33; р<0,01 23,00±0,12; р>0,05 24,00±0,71

Лактат, ммоль/л 0,67±0,02; р<0,01 0,51 ±0,03; р>0,05 0,41±0,01

Примечания: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Было установлено прогрессирующее увеличение дефицита оснований в венозной крови пуповины, которое проявлялось в снижении рН крови и развитии метаболического ацидоза. На формирование ацидотического сдвига указывало накопление в крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции лактата. Наблюдаемое при этом уменьшение буферной емкости венозной крови пуповины

сопровождалось снижением уровня общих, истинных (НС03-ас1) и стандартных (НС03-ас1) бикарбонатов. Наряду с этим, выявлялись признаки гиперкапнии, которые выражались в повышении рС02 в венозной крови пуповины. Вместе с тем, следует отметить, что эритроциты крови пуповины, в отличие от материнских, обладают неодинаковыми возможностями для выполнения кислородтранспортной функции. Это обеспечивается различными функциональными свойствами фетального гемоглобина и гемоглобина А, а также их отношением к действию рН и 2,3-ДФГ, регулирующих сродство к кислороду. При этом считается доказанным низкая способность фетального гемоглобина взаимодействовать с 2,3-ДФГ до 40%, что повышает его сродство к кислороду, обеспечивая оксигенацию тканей плода при сниженном кислородном режиме.

Следовательно, эффективность кислородтранспортной функции крови пуповины будет определяться не количеством синтезируемого 2,3-ДФГ, а функциональными свойствами фетального гемоглобина и состоянием внутриклеточной среды.

Подтверждением может служить, установленный в ходе исследования, рост показателей внутриэритроцитарного общего 2,3-ДФГ (табл. 13). Тогда, как фракция, связанного с гемоглобином 2,3-ДФГ снижалась, что соотносилось с высоким уровнем фетального гемоглобина и соответствовало степени выраженности герпес-вирусной инфекции. Не исключено, что, в такой ситуации, сохранялось повышенное сродство фетального гемоглобина к кислороду, которое в условиях сниженного кислородного режима приводило к развитию гипоксии.

Таблица 13

Содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах крови пуповины

при обострении герпес-вирусной инфекции

2,3-ДФГ, м км оль/мл Титр антител [«в к ВПГ-1 в третьем триместре беременности Контрольная группа

1:12800 1:3200

Общий 6,43±0,19; р<0,001 5,26±0,12; р>0,05 5,10±0,11

Связанный с НЬ 2,88±0,03; р<0,05 2,80±0,04; р<0,05 3,83±0,12

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

Безусловно, что, такого рода, изменения кислородной обеспеченности крови пуповины при обострении герпес-вирусной

инфекции сопровождались нарушениями внутриклеточного метаболизма, которые проявлялись в дисрегуляции процессов гликолиза и, связанных с ним, пентозофосфатного и глутатионредуктазного циклов. В эритроцитах крови пуповины выявлено подавление не только глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной, но и глутатионредуктазной активности (табл. 14).

Таблица 14

Состояние окислительно-восстановительных процессов в эритроцит _крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции

Показатели

Титр антител к ВПГ-1 в третьем _триместре беременности_

1:12800

Контроль ная группа

1:3200

Г-6-ФДГ, МЕ/л 10у эритроцитов_

31,97±2,1; р<0,001

51,96±1,12; р<0,01

68,30±5,06

ГР, Ед/г НЬ

4,03±0,03; р<0,001

8,05±0,05; р>0,05

8,74±0,07

ГП, Ед/г НЬ

4,90±0,23;р<0,001

7,93±0,18; р<0,001

13,89±0,51

СОД, Ед/г НЬ

193,51±1,56;р<0,001

245,69±2,03 ;р<0,001

348,66±3,21

Общий мкмоль/мл

АТФ,

0,46±0,02; р<0,001

0,51±0,01;р<0,05

0,64±0,02

АТФ на 1 г НЬ, мкмоль/мл

4,31±0,05;р<0,001

4,5б±0,03; р<0,05

5,18±0,09

Общий мкмоль/мл

Р,

0,164±0,002; р<0,01

0,156±0,003; р<0,05

0,146±0,002

Неорганический Р, мкмоль/мл

0,105±0,006; р<0,01

0,098±0,002; р>0,05

0,091±0,003

а-токоферол, ммоль/л

1,59±0,03; р<0,01

1,68±0,07; р<0,05

1,84±0,03

МДА, мкмоль/мл

1,40±0,06; р<0,001

1,01 ±0,03; р<0,01

0,92±0,04

Примечание: р - достоверность по сравнению с контрольной группой.

В результате возникал дефицит энергопродукции, который проявлялся в снижении уровня в эритроцитах крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции, как общего, так и связанного с гемоглобином АТФ. Наряду с этим, в крови пуповины определялось нарушение баланса фосфатов, выражающееся в однонаправленном увеличении уровней общего и неорганического фосфора. Одной из основных причин метаболической дисфункции эритроцитов крови

пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции можно считать онтогенетически более низкий уровень адаптивных возможностей противорадикальной защиты, которые, при усилении действия повреждающих факторов на мембрану, способствовали инициации процессов липопероксидации. Образующийся при этом высокий уровень МДА в крови пуповины, связываясь с белками и липидами мембран эритроидных клеток, повышал вязкостные свойства мембран, снижал активность мембраносвязанных гликолитических ферментов, деформируемость клеток, способствуя их разрушению. Доказательством явилось снижение показателей супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, а также уровня а-токоферола в крови пуповины.

Следовательно, в патогенезе развития внутриутробной гипоксии плода при обострении герпес-вирусной инфекции лежит структурная перестройка клеточных мембран, которая подчиняется общим патогенетическим законам цепной реакции и определяется начальным воздействием повреждающих факторов (ВПГ-1, серотонин, иммуномодулирующие цитокины (ТЫРа, 1Ь-1, 1№у)) на эритроциты матери, включая механизмы эритропоэтической компенсации (рис.).

Результатом такого взаимообусловленного влияния будет являться структурно-метаболическая и функциональная недостаточность эритрона матери, которая при несостоятельности механизмов компенсации приводит к развитию гипоксии. Безусловно, что в условиях низкой кислородной обеспеченности лакунарной крови нарушаются обменные процессы в тканях плаценты, следствием которых является гиперэкспрессия в синцитиотрофобласте ворсин свободнорадикальных продуктов (гидроперекиси жирных кислот, пероксид водорода, нитриты), изменяющих проницаемость гидрофобного барьера и способствующих проникновению в толщу фетоплацентарного комплекса антигенов ВПГ-1. Такого рода воздействия приводят к деструкции не только поверхности ворсин синцитиотрофобласта (высокий уровень антител к фосфатидилсерину, аннексину V), но и его цитозоля (уменьшение свободной формы Нрз-70), вызывая нарушение метаболизма и появление дисбаланса между провоспалительными (гиперсекреция ТЖа) и противовоспалительными, а также проапоптотическими (Вс1-2) и апоптотическими (каспаза 3, р53, цитохром С) факторами с последующим апоптотическим изменением ядер, что является критерием морфофункциональной несостоятельности, ограничивающей кислородобменную функцию плаценты в целом.

МАТЬ

•гипопродукция эритропоэтина; ■дисбаланс между продукцией и разрушением эритроцитов; ■поступление в кровь

морфофункционально незрелых эритроидных форм; ■необратимая деформация

эритроцитов (эхиноцитоз); ■нарушение белкового и фосфолипидного состава мембран ££ эритроцитов и их микровязкости; ■метаболический ацидоз; ■угнетение активности Г-6-ФДГ, ГР;

■дефицит энергопродукции (АТФ); ■усиление ПОЛ (МДА) и подавление противорадикальной защиты эритроцитов (СОД, ГП);

■снижение р02._

кислородная недостаточность периферической крови матери

вшч

МНСС ГНДЖЫ'Ы И пни (icpoiomni) ЧК-.шмфоцщм (грапшм В. ТМ~<Л

ПЛАЦЕНТА

■усиление свободнорадикальных

процессов (накопление гидроперекисей жирных кислот, Н2О2, N0); •деструктивные изменения поверхности и цитозоля синцитиотрофобласта; ■перераспределение синтеза

соединительнотканных волокнистых элементов стромы ворсин (коллагена III, IV и V типов);

■дисбаланс между

противовоспалительными и

провоспалительными (TNFa, IL-1, INFy); противоапоптическими (Bcl-2, Hps 70) и проапоптотическими факторами (гранзим В, фосфатидилсерин/аннексин V, цитохром С, каспаза 3, р53); ■усиление апоптотических изменений в ядрах синцитиотрофобласта.

нарушение транспорта кислорода в кровь плода

ПЛОД

■незрелость механизмов компенсации недостаточности 02 (низкий уровень эритропоэтина); •неэффективный эритропоэз; ■фетальный тип гемопоэза; ■необратимая деформация

эритроцитов крови пуповины (эхиноцитоз);

■нарушение белкового и

фосфолипидного состава мембран эритроцитов крови пуповины и их микровязкости;

■респираторно-метаболический ацидоз;

■угнетение активности Г-6-ФДГ, ГР; ■дефицит энергопродукции (АТФ); ■усиление ПОЛ (МДА) и подавление противорадикальной защиты

эритроцитов (СОД, ГП).

гипоксия плода

Рис. Концептуальная схема развития внутриутробной гипоксии плода при герпес-вирусной инфекции.

При этом не исключается возможность поступления в кровь плода патогенных факторов (антигены ВПГ-1, серотонин, ЮТа), инициирующих подавление выработки эритропоэтина в ответ на снижение поступления кислорода, что приводит к выработке морфофункционально незрелых эритроцитов, среди которых преобладают формы, содержащие значительные количества фетального гемоглобина. В дальнейшем, в условиях длительного воздействия патогенных факторов на эритроциты крови пуповины нарушаются механизмы саморегуляции, происходит срыв механизмов метаболической компенсации, что приводит к дезинтеграции систем, отвечающих за оксигенацию гемоглобина и развитию кислородной недостаточности. Следует указать, что изменение морфофункционального состояния эритроцитов крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции свидетельствуют о дизадаптационной реакции кроветворной системы плода.

Таким образом, на основании выше изложенного можно утверждать, что обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности приводит к формированию внутриутробной гипоксии плода, в которой первостепенная роль принадлежит структурной перестройке биоструктур, включающих периферическое звено эритрона и ткани плаценты.

ВЫВОДЫ

1. При обострении герпес-вирусной инфекции увеличивается синтез иммуномодулирующих факторов (специфические антитела к ВПГ-1, серотонин), усиливающих провоспалительный ответ и гиперпродукцию макрофагами цитотоксического ТОТа, что ведет к нарушению механизмов регуляции эритропоэтической функции периферической крови рожениц и крови пуповины (подавлению выработки эритропоэтина), неэффективности процессов гемопоэза (фетализация крови), выработке морфофункционально незрелых эритроидных клеточных форм с измененными кислородтранспортными свойствами.

2. Обострение герпес-вирусной инфекции ослабляет антиокислительные свойства супероксидцисмутазы, глутатионредуктазы в эритроцитах периферической крови рожениц и крови пуповины, что приводит к накоплению продуктов липопероксидации (МДА), а также лизоформ, усиливающих окислительную денатурацию основных мембранных белков цитоскелета (спектрина, анкирина, белка полосы 3,

белка полосы 4.1) и энзимов пентозофосфатного (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа) и глутатионредуктазного (глутатионредуктаза) циклов, антиокислительных ферментов (супероксиддисмутаза, глутатионперокидаза), дефициту АТФ, увеличению микровязкости мембран, снижению деформируемости мембран, эхиноцитарной трансформации клеток, нарушению микроциркуляции, ограничивающей поступление кислорода в ткани.

3. При обострении герпес-вирусной инфекции и повреждении плаценты ВПГ-1 отмечается нарушение морфофункционального состояния фетоплацентарного барьера (дезорганизация поверхности ворсин и цитозоля синцитиотрофобласта (вакуолизация, деградация белков за счет снижения уровня свободной формы белка теплового шока Hps 70)).

4. Обострение герпес-вирусной инфекции приводит к нарушению синтеза волокнистых соединительнотканных элементов стромы (преобладание коллагенов III, IV, V типов), что вызывает увеличение расстояния от кровеносных сосудов до поверхности синцитиотрофобласта, уменьшение проницаемости плаценты, ограничивающей диффузию кислорода в кровь плода.

5. Повреждение фетоплацентарного барьера ВПГ-1 приводит к деструктивным изменениям его поверхности, усиливающим экспонирование фосфатидилсерина на наружном монослое и его связь с аннексином V, что увеличивает адгезию NK-лимфоцитов, экспрессирующих гранзим В и TNFa, к поверхности; повышает проокислительное действие свободнорадикальных продуктов на митохондрии (гидроперекиси жирных кислот, N0, пероксид водорода), способствуя нарушению целостности их мембран, выбросу цитохрома С в цитозоль, инициации каспазы 3, гиперпродукции белка р53, подавлению противоапоптотического действия Вс1-2, росту числа ядер синцитиотрофобласта в состоянии апоптоза.

6. Обострение герпес-вирусной инфекции приводит к нарушению кислородного обмена, осуществляемого между кровью матери и плода, что проявляется в снижении кислородтранспортной функции эритроцитов крови пуповины.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Луценко М.Т., Шмыков И.О., Андриевская И.А. Влияние герпес вирусной инфекции на развитие плода и состояние здоровья родившихся детей // Комплексная оценка состояния здоровья детей и подростков в

Дальневосточном регионе: материалы междунар. науч.-практ. конф. (Хабаровск, 1 дек. 2004 г.). - Хабаровск, 2004. - С. 94-95.

2. Иммуно-биохимическая оценка эффективности лечения хронической герпес-вирусной инфекции у беременных / Квиткина И.Г., И.Н. Гориков, И.А. Андриевская [и др.] // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всерос. науч.-практ. конф. (Красноярск, 7-9 сент. 2005 г.). -Красноярск, 2005 - С. 111-112.

3. Клиника фетоплацентарной недостаточности у беременных с хронической герпес-вирусной инфекцией / Квиткина И.Г., И.Н. Гориков, И.А. Андриевская [и др.] // Аллергология и иммунология. - Москва, 2005. -Т. 6,№2,-С. 263.

4. Лечение фетоплацентарной недостаточности у беременных с хронической герпес-вирусной инфекцией и состояние здоровья их потомства / Б.А. Рабинович, И.Н. Гориков, И.А. Андриевская [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - № 4 (42). - С.70.

5. Андриевская И.А. Особенности белкового обмена у беременных с герпесной патологией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. -

2006.-Вып. 23.-С. 13-16.

6. Изменение микровязкости мембран эритроцитов крови у беременных, инфицированных вирусом герпеса / Н.А.Ишутина, Н.Н.Дорофиенко, И.А. Андриевская [и др.] // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2006. - Вып. 23. - С. 16-18.

7. Андриевская И.А. Особенности обмена глюкозы по пентозофосфатному пути в эритроцитах матерей и новорожденных с герпесной патологией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. -

2007.-Вып. 24.-С. 57-61.

8. Андриевская И.А. Оценка дыхательной активности крови у матерей и новорожденных в условиях герпес-вирусной инфекции // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2007. - Вып. 24. - С. 6366.

9. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Оценка фетоплацентарного барьера при герпес-вирусной инфекции по состоянию ядерного аппарата симпласта ворсинок плаценты // Клинические и фундаментальные аспекты состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном федеральном округе: материалы междунар. науч.-практ. конф. (Хабаровск, 26-27 сентября 2007 г.) - Хабаровск, 2007. - С. 140.

10. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Приходько В.Б. Метод диагностики фетоплацентарной недостаточности у беременных с герпес-

вирусной инфекцией: пособие для врачей. - Благовещенск: ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН, Департамент здравоохранения Амурской области, 2007. - 37 с.

11. Луценко М.Т., Соловьева A.C., Андриевская И.А. Метод оценки иммунных реакций местных лимфоидных органов у беременных при герпес-вирусной инфекции: пособие для врачей. - Благовещенск: ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН, Департамент здравоохранения Амурской области, 2007.- Юс.

12. Луценко М.Т., Соловьева A.C., Андриевская И.А. Механизмы изменений иммунной системы у беременных с герпес-вирусной инфекцией. - Благовещенск-Новосибирск, 2007. - 173 с.

13. Андриевская И.А. Состояние свободнорадикальных процессов у беременных с различной степенью выраженности герпес-вирусной инфекции // Сибирский консилиум медико-фармацевтический журнал: Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: материалы третьей Всерос. межд. науч.-практ. конф.: (Новосибирск, 7-9 ноября 2007 г.). - Новосибирск, 2007. - № 7 (62). - С. 23.

14. Андриевская И.А., Ишутина H.A. Основные аспекты формирования железодефицитного эритропоэза у новорожденных с герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2008. - Вып. 28. - С. 22-24.

15. Андриевская И.А. Характер окислительно-восстановительных процессов в эритроне рожениц и новорожденных при герпес-вирусной инфекции // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2008. - Вып. 28.-С. 33-35.

16. Андриевская И.А. Характер дыхательной активности крови у беременных с герпес-вирусной инфекцией / Фундаментальные аспекты оценки фетоплацентарной недостаточности при вирусных заболеваниях во время беременности. - Благовещенск: изд-во АМГУ, 2008. - С. 54-72.

17. Андриевская И.А. Дыхательная функция крови у беременных с герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень СО РАМН. -2008. -№. 3 (131). -С. 53-62.

18. Андриевская И.А. Состояние процессов гемоглобинообразования в фетальной крови новорожденных при герпес-вирусной инфекции // VI Сибирский физиологический съезд. Тезисы докладов (Барнаул, 25-27 июня 2008 г.). - Барнаул: Принтэкспресс, 2008. -Т. I.-C.110.

19. Андриевская И.А., Ишутина H.A. Диагностика степени

повреждаемости мембран эритроцитов у женщин, перенесших во время беременности обострение герпес-вирусной инфекции // Информатика и системы управления. - 2008. -№ 2 (16). - С.111-112.

20. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Состояние фетоплацентарного барьера при герпес-вирусной инфекции у беременных // Бюллетень СО РАМН. - 2008. - №. 5 (133). - С. 142-147.

21. Андриевская И.А. Кислотоустойчивость мембран эритроцитов у рожениц с тяжелым течением герпес-вирусной инфекции во время беременности // Бюл. физиол. и патол. дыхания. - 2009. - Вып. 31. - С. 58-60.

22. Андриевская И.А., Болелова С.М. Особенности кислородного метаболизма у рожениц, перенесших во время беременности герпес-вирусную инфекцию // Бюл. физиол. и патол. дыхания. - 2009. - Вып. 31. - С. 62-64.

23. Значение газотранспортной функции эритроцитов в патогенезе хронической плацентарной недостаточности / И.Г.Квиткина, Е.В.Веревкина, Т.С.Быстрицкая, И.А.Андриевская // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2009. - Вып. 31. - С. 50-53.

24. Андриевская И.А., Луценко М.Т. Диагностика резистентности мембран эритроцитов к окислительному стрессу у беременных с герпесной патологией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. -2009.-Вып. 33.-С. 21-24.

25. Андриевская И.А. Каспаза-3 в гомогенате плацент рожениц, перенесших в третьем триместре беременности обострение герпес-вирусной инфекции // Якутский медицинский журнал. - 2009. - № 4. - С. 122-123.

26. Андриевская И.А. Показатели эритропоэтической функции у рожениц при поражении вирусом герпеса // Якутский медицинский журнал. -2009. -№3 (27). -С. 15-16.

27. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Степень выраженности апоптоза в ядрах синцитиотрофобласта ворсин плаценты при герпес-вирусной инфекции // Морфология. - 2009. - Т. 135, № 1. - С. 46-48.

28. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ прогнозирования устойчивости мембран эритроцитов при обострении герпес-вирусной инфекции у беременных // Информатика и системы управления. - 2009. -№. 1 (19).-С. 27-30.

29. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Ишутина H.A. Содержание стабильных метаболитов N0 в плаценте беременных, перенесших в

третьем триместре обострение герпес-вирусной инфекции // Бюллетень СО РАМН. - 2009. -№ 5 (139). - С. 128-132.

30. Механизм формирования плацентарной недостаточности при герпес-вирусной инфекции / И.Г.Квиткина, Е.В.Веревкина, Т.С.Быстрицкая, И.А.Андриевская // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия «Медицина. Акушерство и гинекология». - 2009. - № 6. - С. 170-173.

31. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Регуляция апоптоза в синцитиотрофобласте при поражении вирусом герпеса // Успехи современного естествознания. - 2009. - №. 4 - С. 25-26.

32. Lytsenko М.Т., Andrievskaya I.A. Regulation apoptosis in sincutiotrofoblaste at a lesion a virus of herpes // European Journal of natural history. - 2009. - № 3. - C.58-59.

33. Луценко M.T., Андриевская И.А. Способ диагностики резистентности мембран эритроцитов к окислительному стрессу у беременных с герпесной патологией: пособие для врачей - Благовещенск: ДНЦ ФПД СО РАМН, Департамент Здравоохранения администрации Амурской области, 2009. - 12 с.

34. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Дифференциальная диагностика устойчивости мембран эритроцитов периферической крови у беременных с герпес-вирусной инфекцией // Информатика и системы управления. - 2009. - №. 4. - С.71 -74.

35. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в нейтрофилах периферической крови беременных, перенесших в третьем триместре герпес-вирусную инфекцию // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2010. - Вып. 36.-С. 15-17.

36. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Содержание цитохрома С и количество ядер в состоянии апоптоза в плаценте беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции // Фундаментальные исследования. - 2010. -№ 2. - С.75-79.

37. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Ишутина H.A. Изменение микровязкости мембран эритроцитов периферической крови при обострении герпес-вирусной инфекции у беременных // Информатика и системы управления. - 2010. - № 2 (24). - С. 98-100.

38. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Реализация апоптоза в ядрах синцитиотрофобласта ворсинок плаценты у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции в зависимости от содержания в гомогенате плаценты аннексина V // Экспериментальные и клинические

исследования. - 2010. - № 1. - С. 45-48.

39. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Морфофункциональная характеристика фетоплацентарного барьера ворсинок плаценты при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2010. -№. 2-С. 106-108.

40. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Морфологические исследования фетоплацентарного барьера ворсинок плаценты при герпесной и цитомегаловирусной инфекциях // Бюллетень СО РАМН. -2010. -№ 3. -С.137-140.

41. Луценко М.Т., Дорофиенко Н.Н., Андриевская И.А. Морфофункциональная характеристика синцитиотрофобласта и содержание в нем белка теплового шока-70 при обострении во время беременности герпесвирусной инфекции // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2010. -№. 3. - С.165-169.

42. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Морфофункциональная характеристика фетоплацентарного барьера при герпес-вирусной инфекции // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - № 3. - С.82-85.

43. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Довжикова И.В. Морфофункциональная характеристика фетоплацентарного барьера у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции, и патоморфологические изменения в органах плода // Архив патологии. -2010.-№ 4.-С. 47-49.

44. Андриевская И.А., Луценко М.Т. Влияние иммунного статуса на эритропоэтическую функцию крови рожениц при герпес-вирусной инфекции во время беременности // Бюллетень физиологии и патологии

ыхания. -2010. - Вып. 38. - С. 54-57.

45. Фетоплацентарная система при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности / Луценко М.Т., Андриевская И.А.,

овжикова И.В., Соловьева А.С. - Новосибирск-Благовещенск, 2010. -245 с.

46. Lutsenko М.Т., Andrievskaja I.A. Morphofunctional characteristics of fetoplacental barrier of placental villi during pregnancy complicated by herpes-virus infection // Bull, of experim. biology and medicine. - 2010. - Vol. 149,№4.-P. 537-539.

47. Lutsenko M.T., Dorofienko N.N., Andrievskaja I.A. Morphofunctional characteristics of syncytiotrophoblast and content of heat shock protein 70 in during exacerbation of herpesvirus infection in pregnant women // Bull, of experim. biology and medicine. - 2010. - Vol. 150, № 1. -P. 149-152.

48. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Дорофиенко H.H. Оценка роли белка HPS 70 в синцитиотрофобласте плаценты при обострении герпес-вирусной инфекции в период гестации // Бюллетень физиологии и патологии дыхания.-2011.-Вып. 39.-С. 13-16.

49. Андриевская И.А., Луценко М.Т. Структурно-функциональное состояние гемоглобина у рожениц при герпесной инфекции во время беременности // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2011. Вып. 39.-С. 17-19.

50. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ прогнозирования устойчивости мембран эритроцитов периферической крови при обострении герпесвирусной инфекции у беременных // Патент РФ № 2344423,20.01.2009.

51. Луценко М.Т., Соловьева A.C., Андриевская И.А. Способ оценки степени тяжести повреждающего действия герпес-вирусной инфекции на иммунный статус беременных // Патент РФ № 2346278, 10.02.2009.

52. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ диагностики устойчивости мембран эритроцитов в периферической крови беременны при герпес-вирусной инфекции // Патент РФ № 2367953, 20.09.2009.

53. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ диагностики устойчивости мембран эритроцитов в периферической крови при обострении герпес-вирусной инфекции у беременных // Патент РФ № 2370770,20.11.2009.

54. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценки повреждающего действия герпес-вирусной инфекции на развита апоптоза в ядрах симпласта ворсинок плаценты у беременных // Патен РФ №2370772, 20.11.2009.

55. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ диагностик вступления ядер симпласта плаценты ворсинок в апоптоз путем определения в гомогенате плаценты содержания цитохрома С беременных, перенесших в третьем триместре герпес-вирусну: инфекцию // Патент РФ № 2370768, 20.11.2009.

56. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Ишутина H.A. Спосо оценки структурно-функционального состояния мембран эритроците периферической крови у беременных при обострении герпес-вирусно" инфекции//Патент РФ №2389021, 10.05.2010.

57. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ определения уплотненных белково-липидных участков в мембранах эритроцитов

азличной степени зрелости с помощью компьютерной программы Bio ision // Патент РФ № 2390020, 20.05.2010.

58. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценки содержания в лаценте белка р53 при беременности, осложненной обострением герпес-ирусной инфекции // Патент РФ № 2390781, 27.05.2010.

59. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценки влияния нтител IgG и IgM к фосфатидилсерину в плаценте беременных на азвитие апоптоза в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при бострении во время беременности герпес-вирусной инфекции // Решение выдаче патента по заявке № 2009124860/14(034413), 02.06.2010.

60. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценки активности аспазы-3 при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // 1атент РФ №2391668, 10.06.2010.

61. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценки ндуцирующего действия гранзима В на апоптоз ядер инцитиотрофобласта плаценты, вызванного обострением герпес-ирусной инфекции во время беременности // Решение о выдаче патента о заявке № 2009138791/14(054918), 17.06.2010.

62. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ прогнозирования пектрин-актинового комплекса мембран эритроцитов периферической рови беременных в зависимости от агрессивности герпес-вирусной нфекции // Решение о выдаче патента по заявке № 009108782/15(011781), 09.07.2010.

63. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценки содержания елка теплового шока Hps 70 в плаценте беременной при обострении ерпес-вирусной инфекции // Решение о выдаче патента по заявке № 009108785/15(011786), 12.08.2010.

64. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ прогнозирования стойчивости мембран эритроцитов периферической крови при бострении герпес-вирусной инфекции у беременных // Решение о ыдаче патента по заявке № 2009108783/14(011783), 19.08.2010.

65. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ определения ксигенации гемоглобина эритроцитов пуповинной крови оворожденных, родившихся от матерей, перенесших в третьем

иместре герпес-вирусную инфекцию // Решение о выдаче патента по аявке № 2009131246/15(043686), 30.08.2010.

66. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Болелова С.М. Способ фогнозирования угрозы снижения насыщения эритроцитов кислородом

у беременной с бронхиальной астмой // Решение о выдаче патента п заявке № 2009131248/15(043688), 06.10.2010.

67. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ прогнозировани развития гипоксии у беременных в третьем триместре гестаци перенесших вспышку герпес-вирусной инфекции // Решение о выдач патента по заявке № 2009131247/15(043687), 11.10.2010.

68. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценк антиокислительной функции липидов мембран эритроцитов периферической крови беременных при обострении герпес-вирусно инфекции // Решение о выдаче патента по заявке 2009124858/15(034411), 13.10.2010.

69. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ прогнозировани насыщения периферической крови беременных кислородом зависимости от показателей глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитах при различной степени агрессивности герпес-вирусно инфекции и содержания ЮТа в периферической крови // Патент РФ 2402780, 27.10.2010.

70. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ диагностик дыхательной функции эритроцитов беременных путем определени активности глютатион-редуктазы в эритроцитах периферической кров при обострении герпес-вирусной инфекции // Патент РФ № 240227 27.10. 2010.

71. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ оценки содержани нитросоединений в плаценте беременной при обострении герпе вирусной инфекции // Патент РФ №2405156, 27.11.2010.

72. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ определени изменений активности глютатион-пероксидазы в эритроцита периферической крови беременных при вспышке герпес-вирусно инфекции // Патент РФ № 2405149,27.11.2010.

73. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ прогнозировани активности гликофорина мембран эритроцитов в периферической кров беременных при обострении герпес-вирусной инфекции и содержани перекисей жирных кислот в периферической крови // Патент РФ 2405154,27.11.2010.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ТФ - аденозинтрифосфорная кислота ПГ-1 - вирус простого герпеса 1 типа Р — глутатионредуктаза П - глутатионпероксидаза -6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа ,3-ДФГ - 2,3-дифосфоглицериновая кислота ДА - малоновый диальдегид ОД - супероксиддисмутаза с1-2- антиапоптозные факторы семейства Вс1-2 Е - буферные основания крови Ь - гемоглобин ЬОг - оксигемоглобин СОз-ас1 - истинные бикарбонаты крови СОз^с! - стандартные бикарбонаты крови рз-70 - белок теплового шока 70 Ь-1, 2, 4, 8 - интерлейкины 1, 2,4, 8 ТБу - интерферон у

- иммуноглобулины класса в К - натуральные киллеры О - оксид азота еШЬ - метгемоглобин

- сатурация гемоглобина кислородом - фосфор

Ог - парциальное напряжение кислорода СО2 - парциальное напряжение углекислого газа СО2 - общий бикарбонат крови ЧБа - фактор некроза опухоли а

Отпечатано в ЦОП «RISO-PRINT» ИП Кубышкиной Г.М. г.Благовещенск ул. Ломоносова, 225, тел.53-40-44, свидетельство 20431РП, ИНН 28010024933, ОГРНИП 304280134400018. Заказ № 000724 от 25.04.2011 г.. Тираж 100 шт.

Актуальность исследования. К числу важнейших патологических проявлений герпес-вирусной инфекции во время беременности можно отнести формирование ранних форм внутриутробной гипоксии плода, патогенез которой, несмотря на нарастающий интерес исследователей к данной проблеме, до настоящего времени остается не ясным. Так, по данным авторов, внутриутробная гипоксия плода, вызванная тяжелыми инфекционными патологиями у матери в период беременности, сопровождается увеличением частоты летальных исходов в антенатальном периоде по отношению к общему числу перинатальной смертности в среднем до 40% [37, 38, 64, 188, 189].

Значимость проблемы определяется и тем, что генерализация герпес-вирусной инфекции во время беременности приводит к нейроэндокринным и иммунным сдвигам в организме женщины [100, 157, 158], которые сопровождаются формированием новых порочных кругов в цепи причинно-следственных отношений, усугубляющих течение, как основного заболевания, так и предопределяющих скрытое неблагополучие развивающегося плода в виде гипоксического поражения центральной нервной системы. Итогом может явиться снижение адаптации новорожденных в неонатальном периоде, их высокая заболеваемость, нарушение физического и интеллектуального развития детей [10, 23, бб, 189, 249].

В связи с этим, решение вопросов, связанных с изучением механизмов и закономерностей развития внутриутробной гипоксии плода, особенно при герпес-вирусной инфекции во время беременности, актуально и имеет важное социальное значение.

Гипоксия плода - состояние, обусловленное морфофункциональными изменениями и представляющее собой результат сложной реакции эритрона и тканей плаценты на различные патологические изменения со стороны материнского организма [18]. В ее основе лежит дизадаптация компенсаторно-приспособительных механизмов фетоплацентарного комплекса, которая проявляется на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях, и способствует нарушению газотранспортной, эндокринной, метаболической и антиокислительной функций плаценты [36,41,44, 78].

Вполне очевидно, что определяющее значение в механизмах вовлечения плаценты в процесс формирования состояния» внутриутробной1 гипоксии? плода,, при- вирусных инфекциях у матери: в период беременности, имеет морфофункциональное изменение мембранного и, как следствие, ядерного аппарата фетоплацентарного барьера. Нарушение метаболизма ядер, вызванное патогенными факторами (вирусы, цитокины, биогенные амины, глюкокортикоиды), экспонирующихся на поверхности синцитиотрофобласта, либо проникающих в его толщу, при обострении инфекционного процесса во время беременности, изменяет характер течения биосинтетических и обменных процессов, способствует нарушению перфузии ворсин, проницаемости фетоплацентарного барьера и метаболической его дисфункции. Формирующийся при этом недостаток кислородного метаболизма в зоне маточно-плацентарных контактов усиливает выраженность апоптотических изменений ядер синцитиотрофобласта [244, 247], вызывая дезорганизацию его основных функций с развитием необратимых деструктивных процессов в плацентарной ткани, после чего возникают микроциркуляторные расстройства. Возможно, что такие расстройства являются причиной нарушений гемодинамики и реологических свойств крови плода [120].

Между тем, несмотря на освещенность проблемы патогенеза внутриутробной гипоксии плода при осложненном течении беременности, остаются не выясненными вопросы воздействия персистирующих вирусных инфекций, в том числе, герпес-вирусной, на морфофункциональное состояние плаценты и кислородтранспортную функцию периферической крови рожениц и крови пуповины. Не установлена роль ВПГ-1 в механизмах вовлечения; эритроцитов периферической крови в патологический процесс. Остаются не изученными аспекты патогенетического влияния дестабилизирующих и деструктивных процессов, индуцируемых ВГТГ-1, на конформационную устойчивость белкового цитоскелета и липидного матрикса мембран эритроцитов периферической крови, играющих основную роль в реакциях кислородного обмена. Не установлены причинно-следственные связи между активностью герпес-вирусной, инфекции и состоянием механизмов, компенсации гипоксии в периферической крови рожениц и крови пуповины.

Вместе с тем, недостаточно четко было определено влияние-ВПГ-1 на состояние апоптоза ядер синцитиотрофобласта плаценты и характер обменных процессов [84]. Недостаточно исследований и в области изучения закономерностей функционирования плаценты, как органа, обеспечивающего поддержание кислородобменной функции у плода на период беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией. Поэтому оценка характера взаимоотношений активности ВПГ-1 во время беременности, морфофункционального состояния фетоплацентарного барьера и кислородтранспортной функции крови матери в патогенезе внутриутробной гипоксии плода представляет одну из актуальных проблем патологической физиологии.

Цель исследования

Установить механизмы и закономерности развития нарушений морфофункционального состояния плаценты и кислородтранспортной функции периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции.

Задачи исследования

1. Выявить механизмы и закономерности формирования нарушений эритропоэтической функции периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции.

2. Определить особенности морфофункционального состояния эритроцитов периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции: строение эритроцитов; состояние липидно-белкового комплекса мембран; активность ферментов, определяющих оксигенацию гемоглобина и антиокислительные свойства мембран:,

3. Оценить морфофункциональное состояние* фетоплацентарного барьера при- обострении; герпес-вирусной инфекции: строение поверхности и цитозоля фетоплацентарного барьера; апоптотическую активность ядер синцитиотрофобласта плаценты.

4. Раскрыть закономерности развития нарушений кислородного обмена между кровью матери и плода при обострении герпест-вирусной инфекции и участие в нем фетоплацентарного барьера.

Новизна исследования

Впервые установлены наиболее значимые причины, лимитирующие эритропоэз и кислородтранспортную функцию эритроцитов при обострении герпес-вирусной инфекции, как в периферической крови рожениц, так и в крови пуповины.

Доказано, что повышение концентрации ТМ^а при обострении герпес-вирусной инфекции приводит к снижению эритропоэтической функции периферической крови рожениц и крови пуповины.

Определены механизмы патогенного действия ВИГ-1 на морфофункциональное состояние эритроцитов (структура белкового цитоскелета мембран, вязкостные свойства и деформируемость мембран, активность ферментов пентозофосфатного (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа) и глутатионредуктазного (глутатионредуктаза) циклов, антиокислительных ферментов (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза)), как в периферической крови рожениц, так и в крови пуповины.

Выявлены причинно-следственные связи между формой эритроидных клеток и содержанием основных белков цитоскелета (спектрина, анкирина, белка полосы 4.1, белка полосы 3, гликофорина); между структурой гемоглобина, уровнем 2,3-ДФГ и скоростью кислородного обмена в эритроцитах периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции.

Новыми являются данные об особенностях морфофункционального состояния фетоплацентарного барьера при обострении герпес-вирусной инфекции, механизмы повреждений его наружной поверхности, структуры цитозоля и ядерного аппарата, приводящие к нарушению трансплацентарного кислородного обмена.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в том, что получены теоретические знания о закономерностях развития эритропоэтической дисфункции периферической крови рожениц и крови пуповины, нарушений эритропоэза, морфофункционального состояния эритроцитов и их кислородтранспортных свойств при обострении герпес-вирусной инфекции. Разработаны оригинальные способы диагностики эритропоэтической функции периферической крови рожениц, крови пуповины, а также морфофункционального состояния эритроцитов крови при обострении герпес-вирусной инфекции (структура белкового цитоскелета, вязкостно-эластические свойства мембран, состав и конформационная стабильность гемоглобина), состояние ферментов (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза), участвующих в сохранении нативных свойств гемоглобина, его оксигенации и фетоплацентарного барьера (структура и свойства наружной поверхности синцитиотрофобласта, цитозоля, мембранного аппарата митохондрий, активность проапоптотических и апоптотических факторов).

Внедрение в практику

Разработанные способы диагностики нарушений морфофункционального состояния эритроцитов периферической крови рожениц и фетоплацентарного барьера, а также океигенации крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции внедрены в научно-исследовательскую и клиническую практику акушерского отделения патологии беременности при клинике «Учреждение Российской академии медицинских наук Дальневосточный центр физиологии и патологии Сибирского отделения РАМН» (г. Благовещенск).

Материалы исследования рекомендуется внедрять в практическую работу научно-исследовательских лабораторий, использовать в учебно-методических материалах для обучения студентов медицинских институтов профильных кафедр.

Положения, выносимые на защиту

1. При обострении герпес-вирусной инфекции нарушаются-механизмы цитокинопосредованной регуляции эритропоэтической функции периферической крови рожениц и крови пуповины.

2. Обострение герпес-вирусной инфекции усиливает морфофункциональную перестройку эритроцитов, нарушает состояние липидно-белкового комплекса мембран, изменяет ферментативную активность, определяющую оксигенацию гемоглобина и антиокислительные свойства мембран, как в периферической крови рожениц, так и в крови пуповины.

3. Повреждение плаценты ВПГ-1 приводит к нарушению морфофункционального состояния фетоплацентарного барьера: строения поверхности и цитозоля фетоплацентарного барьера, апоптотической активности ядер синцитиотрофобласта плаценты.

4. При обострении герпес-вирусной инфекции нарушаются механизмы регуляции трансплацентарного кислородного обмена между кровью матери и плода.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета «Учреждение Российской Академии медицинских наук Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН» (2007, 2010); на научно-практической конференции с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном федеральном округе» (Хабаровск, 26-27 сентября 2007 г.); II съезд врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего востока (Благовещенск, 2425 октября 2007 г.); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 7-9 ноября 2007 г.); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 25-27 июня 2008 г.); научно-практической конференции с международным участием «Современные факторы формирования, методы оценки и прогнозирования общественного здоровья на территории Дальневосточного региона» (Хабаровск, 10-11 июня 2008 г.); международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд (Паттайа), 18-28 февраля 2009 г.); IV международной научной конференции «Системный анализ в медицине» (Благовещенск, 25-26 мая 2010 г.).

Публикации

По теме диссертации всего опубликовано 73 научных работы, из них 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, 24 патента РФ на изобретения.

13

ВЫВОДЫ

1. При обострении герпес-вирусной инфекции увеличивается синтез иммуномодулирующих факторов (специфические антитела к ВПГ-1, серотонин), усиливающих провоспалительный ответ и гиперпродукцию макрофагами цитотоксического Т№а, что ведет к нарушению механизмов регуляции эритропоэтической функции периферической крови рожениц и крови пуповины (подавлению выработки эритропоэтина), неэффективности процессов гемопоэза (фетализация крови), выработке морфофункционально незрелых эритроидных клеточных форм с измененными кислородтранспортными свойствами.

2. Обострение герпес-вирусной инфекции ослабляет антиокислительные свойства супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы в эритроцитах периферической крови рожениц и крови пуповины, что приводит к накоплению продуктов липопероксидации (МДА), а также лизоформ, усиливающих окислительную денатурацию основных мембранных белков цитоскелета (спектрина, анкирина, белка полосы 3, белка полосы 4.1) и энзимов пентозофосфатного (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа) и глутатионредуктазного (глутатионредуктаза) циклов, антиокислительных ферментов (супероксиддисмутаза, глутатионперокидаза), дефициту АТФ, увеличению микровязкости мембран, снижению деформируемости мембран, эхиноцитарной трансформации клеток, нарушению микроциркуляции, ограничивающей поступление кислорода в ткани.

3. При обострении герпес-вирусной инфекции и повреждении плаценты ВПГ-1 отмечается нарушение морфофункционального состояния* фетоплацентарного барьера (дезорганизация поверхности ворсин и цитозоля синцитиотрофобласта (вакуолизация, деградация белков, за счет снижения уровня свободной формы белка теплового шока Hps 70)).

4. Обострение герпес-вирусной инфекции приводит к нарушению синтеза волокнистых соединительнотканных элементов стромы (преобладание коллагенов III, IV, V типов), что вызывает увеличение расстояния от кровеносных сосудов до поверхности синцитиотрофобласта, уменьшение проницаемости плаценты, ограничивающей диффузию кислорода в кровь плода.

5. Повреждение фетоплацентарного барьера ВПГ-1 приводит к деструктивным изменениям его поверхности, усиливающим экспонирование фосфатидилсерина на наружном монослое и его связь с аннексином V, что увеличивает адгезию NK-лимфоцитов, экспрессирующих гранзим В и TNFa, к поверхности; повышает проокислительное действие свободнорадикальных продуктов на митохондрии (гидроперекиси жирных кислот, N0, пероксид водорода), способствуя нарушению целостности их мембран, выбросу цитохрома С в цитозоль, инициации каспазы 3, гиперпродукции белка р53, подавлению противоапоптотического действия Bcl-2, росту числа ядер синцитиотрофобласта в состоянии апоптоза.

6. Обострение герпес-вирусной инфекции приводит к нарушению кислородного обмена, осуществляемого между кровью матери и плода, что проявляется в снижении оксигенации эритроцитов крови пуповины.