Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных.

Самусенко, Алексей Владимирович

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Самусенко, Алексей Владимирович Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных.

10-2 2636

Самусенко Алексей Владимирович

Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных

Л4.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Научный руководитель

доктор медицинских наук А. А- Штиль

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.М. Бухман, доктор медицинских наук, профессор И. В. Высоцкая.

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет.

Защита диссертации состоится 2009 г. на заседании

специализированного Ученого Совета Д.0Ь1.017.01 при

РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Ученый секретарь специализиров. доктор медицинских наук

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Антибиотики-производные ауреоловой кислоты - оливомицин, хромомицин АЗ и митрамицин - соединения с высокой биологической активностью. Особую важность представляет оливомицин - соединение, структура которого впервые описана отечественными исследователями. Клинические испытания показали, что монохимиотерапия оливомицином приводит к значительному уменьшению объема опухолей лимфоидной ткани и саркомы матки. Побочное действие препарата - общерезорбтивная токсичность -обусловливает необходимость поиска структурных аналогов этого перспективного вещества с меньшей токсичностью и выяснения молекулярных механизмов гибели клеток при действии этого класса противоопухолевых соединений.

Выявлена внутриклеточная мишень оливомицина - двухцепочечная ДНК, с малой бороздкой которой оливомицин связывается в виде димера в присутствии преимущественно в ОС-богатые участки. Этот факт позволяет рассматривать оливомицин как агент, повреждающий структуру дуплекса. Ожидаемыми последствиями такого повреждения следует считать нарушение матричных процессов - транскрипции генов, синтеза ДНК.

Молекулярные механизмы клеточной гибели при действии производных ауреоловой кислоты не изучены. Например, клетки могут погибать по механизму апоптоза, сопровождающемуся активацией каскадов каспаз, митохондриальными событиями и фрагментацией геномной ДНК. Последнее означало бы, что гибель реализуется до необратимых этапов. Это существенно, т.к. в опухолевых клетках могут быть блокированы те или иные пути гибели в результате отбора при прогрессии опухоли и лечебных воздействий.

Цель исследования - получение новых знаний о молекулярных механизмах гибели опухолевых клеток человека при действии оливомицина и его новых производных.

Задачи:

1. Изучить цитотоксичность оливомицина для культивируемых клеток опухолей человека, в том числе сублиний с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости.

2. Установить влияние оливомицина на матричные процессы в бесклеточной системе и в культуре клеток: синтез ДНК и генную транскрипцию.

3. Выявить роль "ядрышкового стресса" в цитотоксичности оливомицина.

4. Исследовать новые производные оливомицина, выбрать менее токсичные и установить механизм снижения цитотоксичности для оптимизации препаратов этого химического класса, пригодных для предклинических испытаний.

Положения, выносимые на защиту.

1. Оливомицин - высокоактивное противоопухолевое соединение. В субмикромолярных концентрациях оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток благодаря связыванию с двухцепочечной ДНК и нарушению транскрипции и репликации ДНК.

2. Введение заместителя в боковую цепь оливомицина снижает связывание с ДНК и уменьшению цитотоксичности, что важно для создания клинических препаратов на основе ауреоловой кислоты.

Научная новизна

Новым являются систематическое исследование молекулярных механизмов гибели клеток при действии оливомицина и его производных. Впервые исследована токсичность новых соединений для культивируемых линий опухолей молочной железы, толстой кишки, меланомы, лейкоза - клеток дикого типа и сублиний, устойчивых к ряду лекарств.

Впервые определены типы клеточной гибели, вызываемой оливомидином. Установлено, что это соединение вызывает апоптоз в низких концентрациях (в наномолярном диапазоне) в течение 24 часов воздействия. Апоптоз сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК.

При исследовании механизма регуляции матричного синтеза оливомицином впервые установлен эффект оливомицина на транскрипционный аппарат: транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I, II и III. Впервые проведен детальный анализ нарушений экспрессии генов в ответ на действие оливомицина методом микрочип-анализа. Показано, что соединение ингибирует транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I и II, но не РНК-полимеразой III.

Впервые выявлена роль нарушений структуры ядрышка - сегрегации его компонентов - как фактора индукции клеточной гибели при действии оливомицина.

Новыми являются данные об активации оливомицином р53-зависимой транскрипции - промотор-репортерной конструкции с р53-зависимой регуляторной областью и генар21, экспрессия которого опосредована р53.

Впервые показано, что оливомицин непосредственно ингибирует синтез ДНК. Оливомицин вызывает торможение синтеза ДНК в первые часы воздействия.

Впервые изучена серия новых производных оливомицина с модификациями отдельных химических групп в молекуле. Новые производные проявляли меньшую цитотоксичность, чем оливомицин. При этом цитотоксичность новых производных оставалась достаточно высокой (в микромолярном диапазоне концентраций). Снижение цитотоксичности нового производного обусловлено более низкой константой связывания с двухцепочечной ДНК.

Научно-практическая значимость исследования

Изучение механизмов цитотоксического действия оливомицина и его новых производных позволит определить критерии для структурной оптимизации химических соединений и в перспективе создать эффективные препараты для лечения онкологических заболеваний на основе высокоактивного класса ДНК-связывающих производных ауреоловой кислоты.

Апробация работы.

Диссертация обсуждена 17 июня 2009 г. на совместной конференции лабораторий механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов регуляции иммунитета, биохимии опухолей, канцерогенных веществ, вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, биохимической фармакологии, медицинской химии, лаборатории электронной микроскопии отдела патологической анатомии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Основные материалы диссертации представлены на следующих конференциях: III международный симпозиум по мишень-направленной терапии опухолей ТАТ-2005, Амстердам, Нидерланды, 2005, "Фундаментальная онкология. 2-е Чтения им. проф. Н.Н.Петрова", Санкт-Петербург, 2006 и конференция "Cancer therapeutics: the road ahead", Капри, Италия, 2007.

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 4 журнальные статьи и тезисы 3 международных конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 100 страницах машинописи и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты исследования", обсуждения и выводов. Работа содержит 22

рисунка и 4 таблиц. Библиографический материал включает ссылки на 135 источников литературы.

Материалы и методы исследования

Клеточные линии.

Использованы линии трансформированных клеток человека: К562 (лейкоз) и вариант K562i/S9, несущий вектор, экспрессирующий Pgp; HepG2 (гепатома); А549 (рак легкого); MCF-7 (рак молочной железы) и сублиния MCF-7Dox, полученная при отборе на устойчивость к доксорубицину -противоопухолевому препарату, транспортируемому Pgp; ВЕ(2)С (нейробластома); А2780 (рак яичника) и резистентный к цисплатину вариант A2780/DDP4; НСТ116 (рак толстой кишки) и вариант НСТ116WafConALacZ с интегрированной в геном конструкцией, включающей участок промотора гена р21 с р53-зависимыми регуляторными элементами и ген-репортер ф-галактозидаза). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 или ее модификациях с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 5% СС>2. В экспериментах использовались клетки в логарифмической фазе роста. Реактивы приобретены в фирме "Sigma" (США) кроме особо оговоренных случаев. Оливомицин и его производные получены в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН (Tevyashova et al., 2009). Структура соединений подтверждена данными 'Н- и |3С-ЯМР спектроскопии. Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при 4°С.

Определение цитотоксичности соединений.

Диапазон цитотоксических концентраций различных веществ оценивали по способности клеток восстанавливать бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия в формазан (МТТ-тест). Клетки в 96-луночных планшетах (5x104 клеток на лунку) инкубировали с исследуемым препаратом в различных концентрациях 24-72 ч. при 37°С, 5%С02. После окончания

инкубации в лунки вносили 100 мкг МТТ на 2 ч., растворяли формазан в ДМСО и измеряли оптическую плотность при длине волны возбуждения 540 нм. Цитотоксичность выражали в процентах оптической плотности формазана, образованного клетками, инкубированными с исследуемым препаратом, к оптической плотности формазана в контрольных лунках (Shchekotikhin et al., 2007).

Межиуклеосолшая деградация ДНК.

Для изучения межнуклеосомной деградации ДНК клетки (2х10б), инкубированные с 100 нМ оливомицина 24-72 ч., осаждали при 1000xg, надосадочную жидкость центрифугировали при 12000xg в течение 15-20 минут, осадки объединяли и лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 0,35М NaCl, 0,5% NP-40, 2 мМ MgCl2, 1мМ дитиотрейтола. ДНК экстрагировали смесью фенола и хлороформа (1:1) и осаждали этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия при -20°С. Осадок обрабатывали РНК-азой А 20 мин. при и анализировали в электрофорезе в 1,5% агарозном геле.

Исследование клеточного цикла.

Клетки обрабатывали оливомицином или оставляли необработанными (контроль), после окончания инкубации осаждали центрифугированием. К осадку клеток добавляли 0,4 мл буфера, содержащего 0,1% цитрата натрия, 0,3% детергента NP-40, 100 мкг/мл РНКазы А и 50 мкг/мл пропидия иодида и перемешивали на vortex. Исследовали флуоресценцию на проточном цитофлуориметре по FL2, накапливая 10000 событий для каждого образца.

Изучениер53-зависимой активации транскрипции.

Клетки НСТ116WafConALacZ обрабатывали 24 ч. митоксантроном (0,5 мкМ) или 5-фторурацилом (3 мкМ). В опытах по ингибированию транскрипции одновременно с этими препаратами добавляли 100 нМ оливомицина или 5 мкМ оливина. После инкубации клетки лизировали в буфере, содержащем 1мМ MgCl2, 250 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 0,02% NP-40 ц 0,2% о-нитрофенил-P-D-

галактопиранозид (субстрат (3-галактозидазы) и инкубировали при 37°С 30 мин. Активность |3-галактозидазы (по оптической плотности лизатов, А,=414 нм) относили к общей концентрации белка в лизатах (удельная активность). Регуляцию транскрипции (индекс активации) выражали как отношение удельной активности fi-галактозидазы в клетках, обработанных противоопухолевыми препаратами, к удельной активности фермента в необработанных клетках. Для статистической обработки данных использовали t-критерий Стъюдента (Kaluzhny et al., 2009).

Электронная микроскопия.

Клетки НСТ116 рассевали на предметные стекла, обрабатывали оливомицином и фиксировали глутаровым альдегидом. Трансмиссивную электронную микроскопию выполняли в отделе патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (Н.А.Филиппова) на микроскопе JEM-1200 EX-II (Япония).

Исследование экспрессии генов. Клетки инкубировали с оливомицином в 6-луночных планшетах (105 на лунку в 3 мл). Тотальную РНК выделяли с помощью TRIzol. Обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию проводили по ранее разработанному протоколу (Walter et al., 1996). Праймеры для анализа экспрессии гена р21\ 5'-GGAAGACCATGTGGACCTGT-3' (прямой) и 5'-ATGCCCAGCACTCTTAGGAA-3' (обратный). Праймеры для амплификации кДНК бета-актина: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (прямой) и 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (обратный) (Шишкин и соавт., 2005). Продукты реакции анализировали в 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и анализировали с помощью Gel Documentation System.

Исследование репликации ДНК.

Клетки К562 в 96-луночных планшетах инкубировали с оливомицином или его производным JTXTA-1207 2 часа, добавляли 1 мкКи 3Н-тимидина и

инкубировали 2 часа. Затем клетки лизировали водой, переносили на целлюлозную мембрану, просушивали и переносили во флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость. Измеряли количество импульсов в минуту на счетчике фирмы Beckman.

Расчет константы связывания исследуемых веществ с ДНК.

Константу связывания с ДНК определяли по Скэтчарду как изменение интенсивности флуоресценции оливомицина или производного ЛХТА-1297при добавлении ДНК: в/ЩНК] = 1/Ка-9/Ка; [ДНК]сво6.=[ДНК]1-[ДНК]Ь=[БСА]1-[вещество]1:*(1-10)/(1тах-10); [вещество] сио6 =[ вещество t*(Imax-I)/(Imax-I0); [вещество] связ. =[вещество]1*(1-10)/(1тах-10); 0=[ вещество] связ./[вещество]г=[ДНК] связ/[вещество]1. В данных уравнениях Ка - константа связывания, lo , Imax , I -значения интенсивности флуоресценции, минимальной, максимальной и текущей соответственно, [вещество] и [DNA] - концентрации ииседуемого вещества и ДНК, индексы связ. и своб. - концентрации соединения, связанного с ДНК и свободного (Ol'shevskaya et al., 2008).

Результаты исследования

Структура оливомицина представлена на рис.1.

ОСНз

он он о

Рис.1. Структура оливомицина.

При исследовании цитотоксичности установлено, что оливомицин вызывает гибель клеток лейкоза человека (линия К562) в наномолярных концентрациях: доза, снижающая выживание на 50% (Ю50), составляет ~ 30 нМ. В этом же диапазоне концентраций (1С5о=20-50 нМ) оливомицин вызывал гибель клеток линий Нер02, А2780, А549, МСР-7, ВЕ(2)С и НСТ116. Цитотоксичность оливомицина была одинаковой для клеток НСТ116, экспрессирующих проапоптотический белок р53, и сублинии с делецией р53. Далее, оливомицин вызывал гибель клеток А2780 (линия дикого типа) и А2780ДШР4, причем цитотоксическое действие оливомицина было даже более выраженным в клетках, устойчивых к цисплатину: 1С5о оливомицина для клеток А2780 оказалась в интервале 25-50 нМ, тогда как для А2780ЯЛЗР4 - 12,5-25 нМ. Таким образом, развитие устойчивости клеток к цисплатину не сопровождается снижением чувствительности к оливомицину. Не выявлено различий в чувствительности к оливомицину клеток меланомы БЕМХ и изогенной сублинии, устойчивой к ростингибирующему действию дексаметазона. Эти результаты указывают на широту терапевтического диапазона оливомицина.

Изучение механизмов гибели клеток при действии оливомицина свидетельствует о том, что препарат индуцирует апоптоз. Уже в первые часы воздействия оливомицин вызывал изменения, характерные для апоптоза: краевую конденсацию хроматина и нарушение целостности ядра (рис.2 А,Б).

Рис. 2. Ультраструктура клеток НС1116 последействия

оливомицина (100 нМ, 4 ч).

А: краевая конденсация хроматина.

Первоначальное увеличение х4000; Б -распад ядерного материала на крупные фрагменты. Первоначальное увеличение

х20000.

Более продолжительная (24-48 час.)

обработка клеток приводила к

межнуклеосомной фрагментации

ДНК (рис. 3). К 48 час. воздействия наряду с низкомолекулярными фрагментами наблюдается и деградация высокомолекулярного пула молекул ДНК. Таким образом, гибель клеток при действии оливомицина сопровождается выраженным нарушением целостности ДНК.

О 24 48 час.

Рис. 3. Фрагментация ДНК при действии оливомицина.

Клетки линии НСТ116 инкубированы с 200 нМ оливомицина 24-48 час. Анализ целостности ДНК (электрофорез в 1% агарозном геле).

Деградация ДНК подтверждена в исследовании плоидности ДНК в клетках, обработанных оливомицином: суб-01 пик гистограммы (соответствующий фрагментированной ДНК) обнаруживали через 24-48 час. инкубации с 50-500 нМ оливомицина.

Исследование взаимодействия оливомицина с внутриклеточной мишенью -

двухцепочечной ДНК! показало, что в присутствии ДНК увеличивается

интенсивность полос (А,=534 нм и А,=450 нм) в спектре флуоресценции

оливомицина,

свидетельствуя об

образовании

комплекса ДНК-

оливомицин (рис.4.)

Рис.4. Спектры флуоресценции оливомицина (8.35-10" 7 М) в 10 мМ Тпв-НС! буфере (рН 7,5), 50 мкМ М§С12.

Спектры флуоресценции оливомицина 254 при разных концентрациях ДНК

550

длина волны, нм

-[ОМА]=0 М

---[0МА]=1,82*10^-6 М

[□НЧ=3,64-10^6 М рМА]=7,28*10л-6 М

-[ОМА1=Ю,92*1СЛ6М

-[□МА]=18,2Ч0Д-6М

-[ОМА]=25,48*10^6 М

— РМА]=5,46*10^6 М

-[ОЫА]=9,1*10^5 М

РМА]=14,55*10^6 М Р №4=3,64*10^5 М [ОЫА]=7,28*1(^-5 М [□МА]=14,5В-1(А5М Р№4=21,84-10^5 М [□№Ч=1,82'10^4М [ОМА]=3,64*10М М

— Р МА]= 14,56* 10М М -[0№Ц=21.В4'10ММ

Константу комплексообразования определяли по методу Скэтчарда, измеряя интенсивность флуоресценции (при А.=534 нм) при добавлении возрастающих количеств ДНК в раствор оливомицина (рис. 5).

О 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

е/[ДНК]сво6.

Рис. 5. График Скэтчарда для комплексов оливомицина и ДНК.

Вычисленная константа связывания

Следствием образования комплексов оливомицин-ДНК, важным для установления механизма противоопухолевого действия этого соединения, может являться ингибирование матричных процессов - транскрипции и репликации ДНК. Изучены эффекты оливомицина на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I, II и III. При инкубации клеток MCF-7 в присутствии 12.5 нМ оливомицина на электронных микрофотографиях видна сегрегация ядрышек, проявляющаяся в перераспределении гранулярного и фибриллярного компонентов (рис.6). Этот феномен - признак ингибирования РНК-полимеразы I.

Рис. 6. Сегрегация ядрышек при действии оливомицииа.

Клетки рака молочной железы МСБ-7 обработаны 12,5 нМ оливомицина 3 часа и фиксированы для электронной микроскопии. Видно перераспределение компонентов ядрышек (сегрегация).

Для изучения влияния оливомицина на РНК-полимеразу II вначале исследовано действие соединения на р53-зависимую транскрипцию. Для индукции р53 использованы противоопухолевые препараты митоксантрон и 5-фторурацил (5-ФУ). Блокирующее действие оливомицина на р53-зависимую транскрипцию возрастало с увеличением его концентрации и проявлялось уже при 25 нМ. Оливомицин (100 нМ) полностью отменял активируемую 5-ФУ (колонки 3 и 4; р<0.05) или митоксантроном (колонки 5 и 6; р<0.05) транскрипцию |3-галактозидазы (рис.7). Важно, что оливомицин предотвращал не только индуцибельную (вызванную воздействием индукторов р53) транскрипцию, но и базальную активность промотора (колонки 1 и 2; р<0.05).

Рис. 7. Изменение р53-зависимой транскрипции под действием оливомицина.

1 - необработанные клетки НСТ116\Уа1СопАЬас2, 2 - оливомицин, 3 -5-ФУ, 4 - 5-ФУ+оливомицин, 5 -митоксантрон,

6 - митоксантрон + оливомицин. Данные 5 независимых экспериментов.

16 со 3 § 4 * э га о 5,: т 5,1 Г

* 2 0) 5 1 5 д ^ 0,23 0,25 0,26

1 2 3 4 5 6

В соответствии с результатами экспериментов в модельной системе - линии клеток со стабильно трансфецированной промотор-репортерной конструкцией, оливомицин подавлял базальную и активированную противоопухолевыми препаратами экспрессию эндогенного гена р21, регулируемого посредством р53 (рис. 8).

р21 $2т

- '

к+ H2o Этоп. Митокс К-

+ + +

Оливомицин

Рис. 8. Оливомицин ингибирует экспрессию генар21.

Клетки линии НСТ116 обработаны согласно указанным подписям. Выделена РНК, проведена обратная транскрипция и ПЦР. Представлен электрофорез продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Для изучения активированной транскрипции клетки обрабатывали 0,5 мкМ митоксантрона (митокс.) и 10 мкМ этопозида (этоп.). Концентрация оливомицина 0,5 мкМ. Бета-2-микроглобулин использован в качестве внутреннего контроля ПЦР.

Для выяснения способности оливомицина препятствовать синтезу второй цепи ДНК в бесклеточной системе, мы применили собственный вариант polymerase stop assay. Оливомицин вносили в реакционные смеси в увеличивающихся количествах и проводили ПЦР с праймерами, амплифицирующими кДНК бета-актина. Контролем служили образцы ПЦР в отсутствие оливомицина. Обнаружена зависимость количества продукта амплификации от концентрации антибиотика в реакционной смеси (рис. 9).

"¡■у.''Г:

0.1 1 10 юо н2о - к-

Оливомицин, р.М ~~ ДМСО

Рис. 9. Влияние оливомицина на синтез второй цепи ДНК.

В реакционную смесь добавляли оливомицин в конечных концентрациях 0,1, 1, 10, 100 цМ. В контрольные пробы добавляли эквивалентное количество ДМСО. Проводили ПЦР, используя кДНК бета-актина в качестве матрицы. Представлена фотография электрофореза продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. К- ПЦР в отсутствие матрицы.

Для детализации механизмов влияния оливомицина на функции клеток, важные для выживания, проведен микрочип-анализ транскрипции 18 000 генов человека. Для анализа использовалась тотальная РНК клеток линии рака толстой кишки НСТ116, инкубированных с 0,5 нМ оливомицина 4-24 час. Оливомицин оказывал значительное ингибирующее действие на -30% исследованных генов (диапазон ингибирования 2-60 раз). В то же время оливомицин активировал транскрипцию ~40% генов, например, гена каспазы-1 (63-кратная активация) и цитохрома с (27-кратная активация). Таким образом, оливомицин вызывает выраженное влияние на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой II. Это влияние не сводится к ингибированию; антибиотик вызывает дисбаланс в транскрипционной активности клетки.

При изучении действия оливомицина на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой III (в ПЦР с праймерами, амплифицирующими гены 75Ь, 1РНК-Туг и 58-РНК, транскрибируемые этой полимеразой II), мы не получили значимых изменений транскрипции этих продуктов. Таким образом, влияние оливомицина на генную транскрипцию разнонаправленно. Если оливомицин блокирует транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой I в наномолярных

концентрациях в первые минуты воздействия, то действие соединения на транскрипцию, опосредованную РНК-лолимеразой II, разнонаправленно и заключается в подавлении экспрессии одних генов и активации других. На транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой III, оливомицин действия не оказывает.

Комплексообразование с ДНК позволяет предположить, что оливомицин препятствует репликации ДНК. Действительно, эксперименты по включению радиоактивного тимидина в клетки линии НСТ116 свидетельствуют о способности оливомицина подавлять синтез ДНК в логарифмически растущей культуре (рис.10). В качестве положительного контроля ингибирования включения 3Н-тимидина использован афидиколин - блокатор ДЬЖ-полимеразы. Оливомицин (500 нМ, 2 часа) резко снижал синтез ДНК, и этот эффект сохраняется на протяжении последующих часов. Совпадение диапазона концентраций, при которых оливомицин ингибирует синтез ДНК, и концентраций, вызывающих гибель клеток, позволяет утверждать, что одним из механизмов цитотоксичности оливомицина является ингибирование репликации.

14000 5

12000 ; -г

10000 ^^

8000 ■ ■ =I1_jüLJL

контроль афид- опив- олив- олив-50мкм 5мкм 500нМ ЮОнМ

Рис. 10. Влияние оливомицина на репликацию (по включению Н3-тимидина).

Клетки НСТ116 обрабатывали указанными концентрациями оливомицина 2 часа, затем вносили 1 мкКи Н3-тимидина и продолжали инкубацию 2 часа. О репликации судили по включению радиоактивной метки. Афид, афидиколин, олив. - оливомицин. Представлены данные 3-х экспериментов.

Таким образом, оливомицин обладает важными свойствами: 1) вызывает апоптоз опухолевых клеток человека различной тканевой принадлежности, 2) токсичен для клеток, экспрессирующих механизмы устойчивости к ряду ксенобиотиков, 3) подавляет генную транскрипцию 4) подавляет репликацию ДНК. О высокой противоопухолевой активности препарата свидетельствует то, что оливомицин вызывает указанные эффекты в наномолярных концентрациях в течение относительно кратковременной обработки. Поскольку цитотоксичность, антитранскрипционное и антирепликативное действие оливомицина проявляются в одном и том же диапазоне концентраций, гибель клеток при действии препарата связана с его способностью ингибировать транскрипцию и синтез ДНК.

Для подавления генной транскрипции и репликации, приводящей к индукции клеточной гибели, требуется высокая аффинность взаимодействия оливомицина с ДНК. Следовательно, производные оливомицина с меньшей константой комплексообразования с дуплексом будут менее токсичны. При этом необходимо выбрать производные с приемлемой противоопухолевой активностью для культивируемых опухолевых клеток. В НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе РАМН синтезирован ряд производных оливомицина. На культуре клеток НСТ116 изучена способность новых производных вызывать гибель клеток в течение 72 час. воздействия (МТТ-тест). Оказалось, что все новые производные менее токсичны, чем оливомицин. Для детального исследования выбрано соединение JIXTA-1297 (рис. 11) -производное с объемным адамантильным заместителем в боковой цепи агликона. Опираясь на методы определения противоопухолевых свойств, использованные в экспериментах с оливомицин ом, мы исследовали способность ЛХТА-1297 связываться с двухцепочечной ДНК, влиять на синтез второй цепи ДНК in vitro и репликацию в логарифмически растущей культуре.

Рис. 11. Структура ЛХТА-1297.

Цитотоксичность (1С5о) ЛХТА-1297 для клеток НСТ116 составила в среднем 110 нМ, что приемлемо для противоопухолевого препарата, поскольку соединение активно в субмикромолярных концентрациях. Константу связывания ЛХТА-1297 с ДНК определяли по изменению интенсивности флуоресценции (>.=520 нм) при добавлении ДНК (рис. 12).

Рис. 12. График Скэтчарда для взаимодействия ЛХТА-1297 и ДНК.

Ка,=2.94х103М"'; Ка2=1.32х104 М"1.

Из рис.12 следует, что константы связывания

ЛХТА-1297 с ДНК меньше, константа связывания

оливомицина. Это позволило предположить, что влияние ЛХТА-1297 на матричные процессы менее выражено, чем у оливомицина. При проведении ПЦР с праймерами, фланкирующими кДНК бета-актина, в присутствии ЛХТА-1297 видно, что данное производное не препятствует реакции даже в высоких концентрациях (рис. 13). ЛХТА-1297 не влиял на включение клетками 3Н-тимидина в концентрациях до 2,4 мкМ, тогда как оливомицин подавлял репликацию уже в субмикромолярных концентрациях

В/ИНК]еа0б.

(рис.14). Таким образом, JIXTA-1297 оказался менее активным, чем оливомицин,

и как цитотоксический агент, и как ингибитор синтеза ДНК in vitro и в живых

клетках. Ослабление этих свойств у JIXTA-1297 можно объяснить меньшей

константой связывания с ДНК в сравнении с оливомицином.

Рис. 13. Сравнение Map. 1 2 3 4 5 _ 6 7 8 9_ влияния JIXTA-1297 и

оливомицина на синтез второй цепи ДНК.

Jr.zf "w"L' 1 " В реакционную смесь

добавляли JIXTA-1297 или ¡Ssgi оливомицин. Проводили

ПЦР, используя кДНК бета-актина в качестве матрицы. Представлен электрофорез продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Дорожки: 1-маркер молекулярных масс ДНК; 2-ДМСО; 3,4,5,6-оливомицин 1, 10, 50, 100 мМ соответственно; 7,8,9,10 - JIXTA-1297 в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мМ соответственно.

Ькоктроль 2- 400 оливо. 3-оливо. 800 4-оливо. 1600 5-оливо. 6-1297 400 7-1297 800 В-12Э71600 8-1297 2400 нМ нМ нМ 2400 нМ нМ кМ нМ нМ

__Доза-вещество

Рис. 14. Сравнение влияния JIXTA-1297 и оливомицина на репликацию ДНК

(по включению Н-тимидина).

Клетки НСТ116 обрабатывали оливомицином или ЛХТА-1297 2 часа, затем вносили 1 мкКи 3Н-тимидина и продолжали инкубацию 2 часа. Представлены данные 3-х экспериментов.

Выводы

1. Оливомицин - высокоактивный противоопухолевый антибиотик: гибель культивируемых клеток опухолей человека наступает при действии субмикромолярных концентраций соединения. Оливомицин одинаково токсичен для клеток дикого типа и сублиний, устойчивых к действию дексаметазона и цисплатина. Оливомицин не преодолевает множественную лекарственную устойчивость, опосредованную Р-гликопротеином, тогда как делеция р53 не защищает клетки от токсичности оливомицина.

2. Молекулярный механизм гибели клеток при действии оливомицина - апоптоз, сопровождающийся межнуклеосомной деградацией ДНК.

3. Апоптоз при действии оливомицина вызывается образованием высокоаффинных комплексов соединения с двухцепочечной ДНК, трансактивацией р53-зависимых генов, ингибированием синтеза ДНК и нарушениями транскрипции, опосредованной РНК-полимеразами I и II.

4. Антитранскрипционное действие оливомицина выражается в индукции сегрегации ядрышка и подавлении экспрессии десятков генов.

5. Новые производные оливомицина являются менее аффинными ДНК-лигандами, менее токсичны и значительно слабее ингибируют матричные синтезы в бесклеточной системе и в культуре клеток. Достаточна высокая цитотоксичность новых производных - в микромолярных концентрациях -позволяет утверждать, что модификации химической структуры оливомицина позволят оптимизировать соединения и получить производные, обладающие противоопухолевой активностью при меньшей общерезорбтивной токсичности.

Публикации по теме диссертации 1. Симонова B.C., Самусенко A.B., Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю., Штиль A.A. Внутриклеточная концентрация ксенобиотика как ключевой фактор цитотоксичности: роль Р-гликопротеина. // Доклады Российской Академии наук. -2004.-Т. 394.-С. 90-93.

2. Tevyashova A.N., Shtil A.A., Olsufyeva E.N., Simonova V.S., Samusenko A.V., Preobrazhenskaya M.N. Carminomycin, 14-hydroxycarminomycin and its novel carbohydrate derivatives potently kill human tumor cells and their multidrug resistant variants. //Journal of Antibiotics. - 2004. - Vol. 57. - P. 143-150.

3. Симонова B.C., Самусенко А.В., Филиппова Ii.A., Тевяшова A.H., Лынив Л.С., Кулик Г.И., Чехун В.Ф., Штиль А.А. Оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток и подавляет р53-индуцированную транскрипцию. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - Т. 139. - С. 455-459.

4. Самусенко А.С. Нарушения клеточного цикла и старение клеток в ответ на повреждение ДНК. //Вопросы онкологии. - 2009. - Т. 5.- в печати.

5. Shtil А.А. , Zatsepina O.V., Grigorian I.A., Komarov P.G., Samusenko A.V., Simonova V.S., Shishkin A.A., Strom E.N., Azare J., Filippova N.A.' Olivomycin, a DNA binding anticancer agent, is a potent genome-wide transcriptional inhibitor. In: Abstracts of 3d International symposium of targeted anticancer therapies TAT-2005, Amsterdam, the Netherlands. - 2005. - P. 84.

6. Самусенко A.B., Штиль А.А. ДНК-связывающий антибиотик оливомицин ингибирует транскрипцию и вызывает апоптоз опухолевых клеток. Материалы конференции "Фундаментальная онкология. 2-е Чтения им.проф. Н.Н.Петрова". Санкт-Петербург, 2006. Вопросы онкологии. - 2006. - Т. 52. - С. 30-31.

7. Shtil А.А., Dezhenkova L.G., Samusenko A.V. , Filippova N.A., Tevyashova A.N., Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. Olivomycin A induces multiple mechanisms of tumor cell death. In: Abstracts of International meeting 'Cancer therapeutics: the road ahead'. Capri. Italy. - 2007. - P. 27.

Подписано в печать 02.09.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Заказ № 659 Тираж 100 экз. __

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

2008175764

Оглавление диссертации Самусенко, Алексей Владимирович :: 2009 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.:.

Глава 5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Онкология", Самусенко, Алексей Владимирович, автореферат

Актуальность проблемы.

Антибиотики-производные ауреоловой кислоты - оливомицин, хромомицин A3 и митрамицин - открыты как высоко активные соединения, вызывающие гибель бактерий. Правомерно предположить, что соединения этого химического класса окажутся активными для клеток эукариот, в частности, для опухолевых клеток человека. Это свойство данной группы антибиотиков может найти применение в терапии злокачественных опухолей. Особую важность представляет оливомицин — соединение, структура которого впервые описана отечественными исследователями [11]. Первоначальные клинические испытания показали, что монохимиотерапия с применением оливомицина приводит к значительному уменьшению объема солидных опухолей — неходжкинских лимфом н саркомы матки. Побочное действие препарата - общерезорбтивная токсичность — обусловливает необходимость поиска структурных аналогов этого перспективного вещества с меньшей токсичностью и выяснения молекулярных механизмов гибели клеток при действии этого класса противоопухолевых соединений.

Выявлена внутриклеточная мишень оливомицина - двухцепочечная ДНК, с малой бороздкой которой оливомицин связывается в виде димера в присутствии Mg2+, преимущественно в GC-богатые участки [1]. Этот факт позволяет рассматривать оливомицин как агент, повреждающий структуру дуплекса. Ожидаемыми последствиями такого повреждения следует считать нарушение матричных процессов - транскрипции генов, синтеза ДНК. Исследования механизмов гибели опухолевых клеток при действии ингибиторов генной транскрипции — одна из актуальных тем в современной медицинской химии, молекулярной биологии и онкологии [20].

Молекулярные механизмы клеточной гибели при действии производных ауреоловой кислоты не изучены. Многообразие путей инициации и реализации гибели позволяет предполагать, что конкретный механизм будет определяться особенностями экспериментальной системы — тканевой принадлежностью клеток, экспрессией факторов лекарственной устойчивости. Клетки могут погибать по механизму апоптоза, сопровождающемуся активацией каскадов каспаз, митохондриальными событиями и фрагментацией геномной ДНК. Последнее означало бы, что гибель реализуется до необратимых этапов. Это существенно, т.к. в опухолевых клетках могут быть блокированы те или иные пути гибели - в результате отбора в течение прогрессии опухоли и лечебных воздействий. Не исключены и неапоптотические пути реализации гибели, в частности, программированный некроз.

Установление механизмов гибели опухолевых клеток при действии оливомицина необходимо для направленного поиска производных этого соединения, обладающих приемлемыми противоопухолевыми свойствами и меньшей общерезорбтивной токсичностью. Требуется создание моделей гибели клеток при действии оливомицина и сравнение механизмов смерти в ответ на оливомицин и его производные. Таким образом, при содружестве онкологов-экспериментаторов и химиков может быть достигнут прогресс в решении актуальной проблемы — установления механизмов гибели опухолевых клеток и выбора новых соединений для предклинических исследований.

Цель исследования:

Целью работы является получение новых знаний о молекулярных механизмах гибели опухолевых клеток человека при действии оливомицина и его новых производных.

Задачи исследования:

I. Изучить цитотоксичность оливомицина для культивируемых клеток опухолей человека, в том числе сублиний с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости.

II. Установить влияние оливомицина на матричные процессы в бесклеточной системе и в культуре клеток: синтез ДНК и генную транскрипцию.

III. Выявить роль "ядрышкового стресса" в цитотоксичности оливомицина.

IV. Исследовать новые производные оливомицина, выбрать менее токсичные и установить механизм снижения цитотоксичности для оптимизации препаратов этого химического класса, пригодных для предклинических испытаний.

Положения, выносимые на защиту.

Новизна исследования

Новым являются систематические исследования молекулярных механизмов гибели клеток при действии оливомицина и его производных.

Впервые исследована токсичность новых соединений для культивируемых линий опухолей молочной железы, толстой кишки, меланомы, лейкоза - клеток дикого типа и их изогенных сублиний, устойчивых к ряду лекарств, в частности, к препаратам, транспортируемым Р-гликопротеином и в клетках с генетической инактивацией р53.

Впервые определены типы клеточной гибели, вызываемой оливомицином. Установлено, что это соединение вызывает апоптоз в низких концентрациях (в наномолярном диапазоне) в течение 24 часов воздействия. Апоптоз сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК.

Новыми являются данные об активации оливомицином р53-зависимой транскрипции — промотор-репортерной конструкции с р53-зависимой регуляторной областью и генар21, экспрессия которого опосредована р53.

Впервые показано в бесклеточных системах - синтез ДНК на матрице РНК и синтез второй цепи ДНК (в полимеразной цепной реакции) в присутствии возрастающих концентраций препарата, что оливомицин непосредственно ингибирует синтез ДНК. Оливомицин вызывает торможение синтеза ДНК в первые часы воздействия. В более высоких концентрациях наблюдается гибель клеток без нарушения S-фазы.

Впервые получена и изучена серия новых производных оливомицина с модификациями отдельных химических групп в молекуле. Новые производные проявляли меньшую цитотоксичность, чем исходный оливомицин. При этом цитотоксичность новых производных оставалась достаточно высокой (в микромолярном диапазоне концентраций). Установлено, что снижение цитотоксичности нового производного обусловлено более низкой константой связывания лиганда с двухцепочечной ДНК.

Научно-практическая значимость исследования

Заключение диссертационного исследования на тему "Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных."

Выводы

3.Апоптоз при действии оливомицина вызывается образованием высокоаффинных комплексов соединения с двухцепочечной ДНК, трансактивацией р53-зависимых генов, ингибированием синтеза ДНК и нарушениями транскрипции, опосредованной РНК-полимеразами I и II.

5. Новые производные оливомицина являются менее аффинными ДНК-лигандами, менее токсичны и значительно слабее ингибируют матричные синтезы в бесклеточной системе и в культуре клеток. Достаточна высокая цитотоксичность новых производных - в микромолярных концентрациях - позволяет утверждать, что модификации химической структуры оливомицина позволят оптимизировать соединения и получить производные, обладающие противоопухолевой активностью при меньшей общерезорбтивной токсичности.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Самусенко, Алексей Владимирович

1. Брикенштейн В.Х., Патина JI.P., Баренбойм Г.М. Стереохимия и кинетика взаимодействие с ДНК противоопухолевого антибоотика оливомицина. // Молекулярная биология. 1984. - Том. 186 - С. 1606-1616.

2. Гаузе Г.Ф. Противоопухолевые антибиотики. // Медицина. — 1971. С. 4070.

3. Гаузе Г.Ф., Дудник Ю.В. Противоопухолевые антибиотики. // Медицина. -1987.-С. 13-14.

4. Кучкарев Р.Н Опыт клинического изучения новых противоопухолевых антибиотиков хризомалина и оливомицина. Автореферат дисс. канд. М. 1966.

5. Харкевич Д.А. Фармакология // ГЭОТАР-Мед. 2006. - С. 643-665.

6. Akao Y., Yamada Н., Nakagawa Y. Arsenic-induced apoptosis in malignant cells in vitro. // Leuk Lymphoma. 2000. - Vol. 37. - P. 53-63.

7. Arima Y., Nitta M., Kuninaka S. Transcriptional blockade induces p53-dependent apoptosis associated with translocation of p53 to mitochondria. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. - 280(19). - P. 19166-19176.

8. Arur S., Uche U.E., Rezaul K. Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment. // Dev. Cell. 2003. - Vol. 4. - P. 587-598.

9. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation. // J. Hepatol. 2003. - Vol. 39. -P. 883-885.

10. Bakkenist C.J., Kastan M.B., Initiating cellular stress responses. // Cell. -2004.-Vol. 9.-P. 9-17.

11. Berlin Y.U., Kiseleva O.A., Kolosov M.N. Aureolic acid group of anti-tumour antibiotics. //Nature.- 1968.- Vol. 13.-P. 193-194.

12. Borner С., Olivier R., Martinou I. Dissection of functional domains in Bcl-2 alpha by site-directed mutagenesis. // Biochem. Cell Biol. 1994. -Vol. 72(11-12). - P. 463-469.

13. Bortner C.D., Oldenburg N.B., Cidlowski J.A. The role of DNA fragmentation in apoptosis. // Trends Cell Biol. 1995. - Vol. 5. - P. 21-26.

14. Bortner CD, Oldenburg NB, Cidlowski JA. The role of DNA fragmentation in apoptosis. // Trends Cell Biol. 1995. - Vol. 5 - P. 21-26.

15. Brown J., Attardi L.D. The role of apoplosis in cancer and treatment response. //Nat. Rev. Cancer. 2005. - Vol. 5. - P. 231-237.

16. Сапера E.T., Scassa M.E., Ceruti J.M. INK4 proteins, a family of mammalian CDK inhibitors with novel biological functions. // IUBMB Life. 2007. - Jul. 59. - P. 419-426.

17. Cliby W.A., Lewis K.A., Lilly K.K. et al. S phase and G2 arrests induced by topoisomerase I poisons are dependent on ATR kinase function. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277(2). - P. 1599-1606.

18. Crompton M., Viiji S., Doyle V. The mitochondrial permeability transition pore. // Biochem. Soc. Symp. 1999. - Vol. 66. - P. 167-179.

19. Denecker G., Vercammen D., Declercq W., Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. // Cell. Mol. Life Sci. 2001. - Vol. 58(3) - P. 356370.

20. Derheimer F.A., Chang C.W., Ljungman M. Transcription inhibition: a potential strategy for cancer therapeutics. // Eur. J. Cancer. — 2005. Vol. 41(16). — P. 2569-2576.

21. Desagher S., Martinou J.C. Mitochondria as the central control point of apoptosis. // Trends Cell Biol. 2000. - Vol. 10(9). - P. 369-377.

22. Diez-Roux G., Lang R.A. Macrophages induce apoptosis in normal cells in vivo. // Development. 1997. - Vol.124. - P. 3633-3638.

23. Eastham J.A. In vivo gene therapy with p53 or p21 adenovirus for prostate cancer.//Cancer Res. 1995.-Vol. 55.-P. 5151-5155.

24. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. // Nature. 1998. - Vol. 391(6662).-P. 43-50.

25. Fadok V.A., Chimini G. The phagocytosis of apoptotic cells. // Semin. Immunol. 2001. - Vol. 13. - P. 365-372.

26. Falck J., Mailand N., Syljuasen R.G. et al. The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. // Nature. 2001. -Vol. 410(6830). - P. 842-847.

27. Ferraro-Peyret C., Quemeneur L., Flacher M. Caspase-independent phosphatidylserine exposure during apoptosis of primary T lymphocytes. // J Immunol. -2002.-Vol. 169(9).- P. 4805-4810.

28. Festjens N., van Gurp M., van Loo G. Bcl-2 family members as sentinels of cellular integrity and role of mitochondrial intermembrane space proteins in apoptotic cell death. // Acta Haematol. 2004. - Vol. 111. - P. 7-27.

29. Fesus L., Madi A., Balajthy Z. Transglutaminase induction by various cell death and apoptosis pathways. // Experientia. 1996. - Vol. 31. - P. 942-949.

30. Flatten K., Dai N.T., Vroman B.T. et al. The role of checkpoint kinase 1 in sensitivity to topoisomerase I poisons. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280(14). - P. 14349-14355.

31. Foo S.Y., Nolan G.P. NF-kappaB to the rescue: RELs, apoptosis and cellular transformation. // Trends Genet. 1999. - Vol. 15(6). - P. 229-235.

32. Freebern W.J., Smith J.L., Chaudhry S.S. Novel cell-specific and dominant negative anti-apoptotic roles of p73 in transformed leukemia cells. // J. Biol. Chem. -2003. Vol. 24. - P. 2249-2255.

33. Frizelle, S.P. Re-expression of pl6INK4a in mesothelioma cells results in cell cycle arrest, cell death, tumor suppression and tumor regression. // Oncogene. 1998. -Vol. 16.-P. 3087-3095.

34. Fukuoka, K. pl6INK4 expression is associated with increased sensitivity of human non-small cell lung cancer cells to DNA topoisomerase I inhibitors. // Jpn. J. Cancer Res. 1997.-Vol. 88.-P. 1009-1016.

35. Furnari В., Blasina A., Boddy M.N. et al. Cdc25 inhibited in vivo and in vitro by checkpoint kinases Cdsl and Chkl. // Mol. Biol. Cell. 1999. - Vol.10. - P. 833-845.

36. Gardai S.J., McPhillips K.A., Frasch S.C. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. // Cell. 2005. - Vol. 21. - P. 321-334.

37. Gupta M., Fan S.J., Zhan Q.M. et al. Inactivation of p53 increases the cytotoxicity of camptothecin in human colon HCT116 and breast MCF-7 cancer cells. // Clin. Cancer Res. 1997. - Vol. 3. - P. 1653-1660.

38. Harbour J.W., Luo, R.X., DeiSanti A. et al. Cdk phosphorylation triggers sequential intramolecular interactions that progressively block Rb functions as cells move through Gl. // Cell. 1999. - Vol.98. - P. 859-869.

39. Hershko Т., Ginsberg D. Up-regulation of Bcl-2 homology 3 (BH3)-only proteins by E2F1 mediates apoptosis. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279(10). P. 86278634.

40. Hill M.M., Adrain C., Martin S.J. Portrait of a killer: the mitochondrial apoptosome emerges from the shadows. // Mol. Interv. 2003. -Vol. 3(1) - P. 19-26.

41. Hirota Т., Kunitoku N., Sasayama T. et al. Aurora-A and an interacting activator, the LIM protein Ajuba, are required for mitotic commitment in human cells. // Cell. 2003. - Vol. 114. - P. 585-598.

42. Hitoshi Y., Lorens J., Kitada S.I. Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells. // Immunity. 1998. - Vol. 8(4). - P. 461-71.

43. Hockenbery D.M., Oltvai Z.N., Yin X.M. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. // Cell. 1993. - Vol. 75(2). - P. 241-251.

44. Hoeppner D.J., Hengartner M.O., Schnabel R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. // Nature. 2001. - Vol. 12. -P. 133-135.

45. Hofmann K., Bucher P., Kajava A.V. et al. A model ofCdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain. // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 282. - P. 195-208.

46. Igney F.H., Krammer PH. Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis. // Nat. Rev. Cancer. 2002. - Vol. 2(4). - P. 277-288.

47. Igney FH, Krammer PH. Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis. // Nat. Rev. Cancer. 2002. - Vol. 2. - P. 277-288.

48. Innocente SA, Abrahamson JL, Cogswell JP et al., p53 regulates a G2 checkpoint through cyclin В17/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 2147-2152.

49. Jacks, T. Tumor suppressor gene mutations in mice. // Ann. Rev. Genet. — 1996.-Vol. 30.-P. 603-636.

50. Jacotot E., Costantini P., Decaudin D., et al. Mitochondrion as a novel target of anticancer chemotherapy. // J. Natl. Cancer Inst. 2000. - Vol. 13. - P.1042-1053.

51. Jacotot E., Costantini P., Laboureau E. Mitochondrial membrane permeabilization during the apoptotic process. // Ann. N Y Acad. Sci. 1999. - Vol. 887. -P. 18-30.

52. Jiang H., Chou H.S., Zhu, L. Requirement of cyclinE-cdk2 inhibition inp 16INK4a-mediated growth suppression. // Mol. Cell. Biol. 1998. - Vol. 18. - P. 52845290.

53. Jimenez В., Volpert O.V., Crawford S.E. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. // Nat. Med. 2000. -Vol. 6-P. 41-48.

54. Jin X., Nguyen D., Zhang W. Cell cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation the pl6INK4 gene mediated by an adenovirus vector. // Cancer Res. 1995. -Vol. 55.-P. 3250-3253.

55. JozaN., Susin S.A., Daugas E. Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death. // Nature. 2001. - Vol. 29. - P. 549-554.

56. Kang B.H., Ко E., Kwon O.K. The structure of procaspase 6 is similar to that of active mature caspase 6. // Biochem. J. 2002. - Vol. 15. - P. 629-634.

57. Katayose, Y. Promoting apoptosis: a novel activity associated with the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. // Cancer Res. 1997. - Vol. 57. - P. 5441-5445.

58. Kaufmann S.H., Earnshaw W.C. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. // Exp. Cell. Res. 2000. - Vol. 256. - P. 42-49.

59. Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. // EMBO J. 1995. - Vol. 15. - P. 5579-5588.

60. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. // Science. 1997. - Vol. 275(5303). P. - 1132-1136.

61. Korsmeyer S.J., Wei M.C., Saito M. Pro-apoptotic cascade activates BID, which oligomerizes ВАК or BAX into pores that result in the release of cytochrome c. // Cell Death Differ. 2000. - Vol. 7(12). P. 1166-1173.

62. Koumenis C., Giaccia A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoplosis. // Moll. Cell. Biol. -1997.- Vol. -17(12).-P. 7306-7316.

63. Krajewski S., Krajewska M., Turner B.C. Prognostic significance of apoptosis regulators in breast cancer. // Endocr. Relat. Cancer. 1999. - Vol. 6(1). - P. 29-40.

64. Lammer C., Wagerer S., Saffrich. et al. The cdc25B phosphatase is essential for the G2/M phase transition in human cells. // J. Cell Sci. 1998. - Voll. 11. -P. 24452453.

65. Lang R.A., Bishop J.M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. // Cell. 1993. - Vol. 13. - P. 453-462.

66. Liu F., Stanton J., Wu, Z. et al. The human Mytl kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. // Mol. Cell Biol. 1997. - Vol. 17. - P. 571-583.

67. Liu Q., Guntuku S., Cui S. et al. Chkl is an essential kinase that is regulated by Atr and required for the G(2)/M DNA damage checkpoint. // Genes Dev. 2000. -Vol. 14.-P. 1448-1459.

68. Ljungman M. Lane DP Opinion: transcription guarding the genome by sensing DNA damage. // Nat. Rev. Cancer. - 2004. - Vol. 4(9). - P. 727-737.

69. Ljungman M., Zhang Fl-', Chen H., e' al Inhibition of RXA polymerase 11 as a trigger for the p53 response. // Oncogene. 1999. - Vol. 18(3). - P. 583 - 592.

70. Locksley R.M., Killeen N., Lenardo M.J. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. // Cell. 2001. - Vol. 23. - P. 487-501.

71. Locksley R.M., Reiner S.L., Hatam F., et al. Helper T cells without CD4: control of leishmaniasis in CD4-deficient mice. // Science. 1993. - Vol. 10. - P. 14481451.

72. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. // Am. J. Pathol. 1995. - Vol. 146. - P. 3-15.

73. Martinvalet D., Zhu P., Lieberman J. Granzyme A induces caspase-independent mitochondrial damage, a required first step for apoptosis. // Immunity. -2005. Vol. 22. - P. 355-370.

74. Marumoto Т., Hirota Т., Morisaki T. et al. Roles of aurora-A kinase in mitotic entry and G2 checkpoint in mammalian cells. // Genes Cells. — 2002. Vol. 7. - P. 11731182.

75. Melino G., Bernassola F., Ranalli M. p73 Induces apoptosis via PUMA transactivation and Bax mitochondrial translocation. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279(9).-P. 8076-8083.

76. Mellon I., Spivak G., Hanawalt P.C. Selective removal of transcription-blocking DNA damage from the transcribed strand of the mammalian DHFR gene. // Cell. 1997.-Vol. 51.-P. 241-249.

77. Metzstein M.M., Stanfield G.M., Horvitz H.R. Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future. // Trends Genet. 1998. - Vol. 14(10). - P. 410-416.

78. Mueller P.R., Coleman T.R., Dunphy W.G. Mytl: a membrane-associated inhibitory kinase that phosphorylates Cdc2 on both threonine-14 and tyrosine- 15. // Science. 1995. - Vol.270. - P. 86-90.

79. Newmeyer D.D., Bossy-Wetzel E., Kluck R.M. Bcl-xL does not inhibit the function of Apaf-1. // Cell Death Differ. 2000. - Vol. 7(4). - P. 402-407.

80. Nicotera P., Leist M., Ferrando-May E. Apoptosis and necrosis: different execution of the same death. // Biochem. Soc. Symp. 1999. - Vol. 66. - P. 69-73.

81. Nigg, E.A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. - Vol. 2. - P. 21-32.

82. Nunez G., Benedict M.A., Hu Y. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. // Oncogene. 1998. - Vol. 24. - P. 3237-3245.

83. O'Connell, M.J., Raleigh, J.M., Verkade, H.M. et al. Chk 1 is a weeJ kinase in the G2 DNA damage checkpoint inhibiting cdc2 by Y15 phosphorylation. // EMBO J. 1997. - Vol. 16. - P. 545-554.

84. Ohki R., Murasawa H., Nemoto J. Noxa, a ВНЗ-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. // Science. 2000. - Vol. 12. -P. 1053-1058.

85. Passalaris T.M., Benanti, J.A., Galloway D.A. et al. The G(2) checkpoint is maintained by redundant pathways. // Mol. Cell Biol. 1999. - Vol. 19. - P. 5872-5881.

86. Puduvalli V.K., Saito Y., Xu R. Fenretinide activates caspases and induces apoptosis in gliomas. // Clin. Cancer Res. 1999. - Vol. 5(8). - P. 2230-2235.

87. Puthalakath H., Huang D.C., O'Reilly L.A. The proapoptotie activity of the Bcl-2 family member Bim is regulated by interaction with the dynein motor complex. // Mol. Cell. 1999. - Vol. 3(3). - P. 287-296.

88. Rai N.K., Suryabhan, Ansari M. et al. Effect of glycaemic control on apoptosis in diabetic wounds. // J. Wound Care. 2005. - Vol.14. - P. 277-281.

89. Rai N.K., Tripathi K. Apoptosis: a basic physiologic process in wound healing. // Int. J. Low Extrern. Wounds. 2005. - Vol. 4. - P. 138-144.

90. Reddien P.W., Cameron S., Horvitz H.R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. // Nature. 2001. - Vol. 12. - P. 198-202.

91. Reed J.C., Zha H., Aime-Sempe C, Takayama S, Structure-function analysis of Bcl-2 family proteins. Regulators of programmed cell death. // Adv. Exp. Med. Biol. — 1996.-Vol. 406. P. 99-112.

92. RPA and ATR link transcriptional stress to p53. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2007.-Vol. 104(31).-P. 12778-12783.

93. Rubio-Moscardo F., Blesa D., Mestre C. Characterization of 8p21.3 chromosomal deletions in B-cell lymphoma: TRAIL-R1 and TRAIL-R2 as candidate dosage-dependent tumor suppressor genes. // Blood. 2005. - Vol. 106. - P. 3214-3222.

94. Ryan K.M., Ernst M.K., Rice N.R. Role of NF-kappaB in p53-mediated programmed cell death. // Nature. 2000. - Vol. 404. - P. 892-897.

95. Sandig V. Adenovirally transferred pl6INK4/CDKN2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. // Nat. Med. 1997. — Vol. 3. — P. 313— 319.

96. Savill J., Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. // Nature. 2000. - Vol. 12(6805). - P. 784-788.

97. Scaffidi С, Kirchhoff S, Krammer PH. Apoptosis signaling in lymphocytes. // Curr. Opin. Immunol. 1999. - Vol. 11. - P. 277-285.

98. Schimmer A.D. Inhibitor of apoptosis proteins: translating basic knowledge into clinical practice. // Cancer Res. 2004. - Vol. 15. - P. 7183-7190.

99. Schmitt, E., Boutros, R., Froment, C. et al. CHK1 phosphorylates CDC25B during the cell cycle in the absence of DNA damage. // J. Cell Sci. 2006. - Vol.119. - P. 4269-4275.

100. Schuler M., Green D.R. Mechanisms of p53-dependent apoptosis. // Biochem Soc Trans. 2001. - Vol. 29. - P. 684-688.

101. Schuler M., Green D.R. Transcription, apoptosis and p53: catch-22. // Trends Genet.-2005.-Vol. 21.-P. 182-187.

102. Sherr C.J., Roberts J.M. CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression. // Genes Dev. 1999. - Vol. 13. - P. 1501-1512.

103. Sherr, C.J., Roberts, J.M. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases. // Genes. 1995. - Vol. 9. - P. 1149-1163.

104. Shiloh S., Illness representations, self-regulation, and genetic counseling: a theoretical review. // J. Genet. Couns. 2006. 15(5). P. 325-337.

105. Shiloh Y. ATM and ATR: networking cellular responses to DNA damage. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. - Vol. 11. - P. 71-77.

106. Shimizu S., Eguchi Y., Kamiike W. Bcl-2 prevents apoptotic mitochondrial dysfunction by regulating proton flux. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - Vol. 95(4).-P. 1455-1519.

107. Shimizu S., Yamabe K., Kamiike W. et al. Prevention of hypoxic liver cell necrosis by in vivo human bcl-2 gene transfection. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998.-Vol. 4.-P. 217-223.

108. Slee E.A., Adrain C., Martin S.J. Executioner caspase-3, -6, and -7 perform distinct, non-redundant roles during the demolition phase of apoptosis. // J. Biol. Chem. -2001. Vol. - 276. - P. 7320-7326.

109. Smits V.A., Klompmaker R., Arnaud L. et al. Polo-like kinase-1 is a target of the DNA damage checkpoint. // Nat. Cell Biol. 2000. - Vol. 2. - P. 672-676.

110. Stiewe Т., Putzer B.M. Role of the p53-homologue p73 in E2Fl-induced apoptosis. // Nat. Genet. 2000. - Vol. 26. - P. 464-469.

111. Suliman I.A., Lindgren J.U., Elhassan A.M. Effects of short- and long-term rat hind limb immobilization on spinal cord insulin-like growth factor-I and its receptor. // Brain Res. 2001. - Vol. 31. - P. 17-23.

112. Susin S.A., Zamzami N., Castedo M. Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease. // J. Exp. Med. 1996. - Vol. 184(4). - P. 1331-1341.

113. Svejstrup JQ. Mechanisms of transcription-coupled DNA repair. // Nat. Revv Mol. Cell Bio. 2002. - Vol. 3(1). - P. 21-29.

114. Tamatani M., Che Y.H., Matsuzaki H. Tumor necrosis factor induces Bcl-2 and Bcl-x expression through NFkappaB activation in primary hippocampal neurons. // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274(13).-P. 8531-8538.

115. Tanaka N., Ishihara M., Lamphier M.S. et al. Cooperation of the tumour suppressors Irf-1 and p53 in response to DNA damage. // Nature. 1996. - Vol. 382. - P. 816-818.

116. Transcriptional blockade induces p53-dependent apoptosis associated with translocation of p53 to mitochondria. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280(19). - P. 19166-19176.

117. Vaux D.L., Silke J. IAPs, RINGs and ubiquitylation. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. - Vol. 6(4). - P. 287-297.

118. Verhagen A.M., Ekert P.G., Pakusch M. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. // Cell. 2000. - Vol. 102(1). - P. 43-53.

119. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) and its receptors in tumor surveillance and cancer therapy. // Apoptosis. -2002.-7(5).-P. 449-459.

120. Wang C.Y., Guttridge D.C., Mayo M.W. et al. NF-kappaB induces expression of the Bcl-2 homologue Al/Bfl-1 to preferentially suppress chemotherapy-induced apoptosis. // Mol. Cell Biol. 1999. - Vol. 35. - P. 123-130.

121. Xie S., Wu H., Wang Q. et al. Plk3 functionally links DNA damage to cell cycle arrest and apoptosis at least in part via the p53 pathway. // J. Biol. Chem. 2001. -Vol. 276.-P. 43305-43312.

122. Yamaizumi M. Sugano T. IJV-mduced nuclear accumulation of p53 is evoked through DNA damage of actively transcribed genes independent of the cell cycle. // Oncogene. 1994. - Vol. 9(10). - P. 2775-2784.

123. Zamzami N., Kroemer G. The mitochondrion in apoptosis: how Pandora's box opens. //Nat. Rev. Mo.l Cell Biol. -2001. Vol. 2(1). - P. 67-71.

124. Zamzami N., Marchetti P., Castedo M. Sequential reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death. // J. Exp. Med. 1995. Vol. 182(2). - P. 367-377.

125. Zeiss C.J. The apoptosis-necrosis continuum: insights from genetically altered mice. // Vet. Pathol. 2003. - Vol. 40(5). - P. 481-495.

126. Zhan, Q., Antinore, M.J., Wang, X.W. Association with Cdc2 and inhibition of Cdc2/Cyclin B1 kinase activity by the p53-regulated protein Gadd45. // Oncogene. -1999. Vol. 18.-P. 2892-2900.

127. Zoratti M., Szabo I. The mitochondrial permeability transition. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - Vol. 1241(2). - P. 139-176.

128. Zoratti M., De Marchi U., Gulbins E., et al. Novel channels of the inner mitochondrial membrane. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. - Vol. 1787. - P. 351-363.

129. Zoratti M., De Marchi U., Basso E., et al. Electrophysiological characterization of the Cyclophilin D-deleted mitochondrial permeability transition pore. // Mol. Membr. Biol. -2006.-Vol. 23.-P. 521-530.