Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия и активность белков множественной лекарственной устойчивости опухолей при воздействии ингибитора протеасом бортезомиба

На правах рукописи

Лалетина Лидия Александровна

ЭКПРЕССИЯ И АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ

ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОПУХОЛЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАСОМ БОРТЕЗОМИБА

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2012

005047921

005047921

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор

академик РАН и РАМН, профессор

Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители

доктор медицинских наук

Ставровская Алла Александровна

профессор

Официальные оппоненты

Красильников Михаил Александрович доктор биологических наук,

Ведущая организация

Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Защита диссертации состоится «_23_»_ноября_2012 г. в «_11_» часов на

заседании диссертационного совета Д.001.017.02 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24. Автореферат разослан « 22 » октября_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

профессор, НИИ Канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им. H.H. Блохина,

РАМН, заведующий лаборатории молекулярной эндокринологии

Онищенко Галина Евгеньевна

доктор биологических наук, профессор, биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова, заведующая кафедрой клеточной биологии и гистологии

д.м.н., профессор

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) является серьезным препятствием на пути терапии злокачественных новообразований. Показано, что МЛУ часто связана с повышенной экспрессией и активностью транспортных белков семейства ABC [Ставровская A.A., 2003]. К суперсемейству ABC (ATP Binding Cassette) сейчас относят около 300 белков, многие из которых являются транспортерами, переносящими самые разные соединения [Higgins C.F., 2007]. Белки этого семейства имеются у всех живых организмов. У человека найдено около 50-ти ABC белков, примерно столько же у мыши. Исследования ABC белков важны как для медицины, так и для биологии, поскольку речь идет о проблемах защиты всех живых клеток от повреждающих их воздействий.. К семейству ABC принадлежат транспортные белки, способные переносить множество разных веществ, в круг которых входят противоопухолевые препараты, антимикробные, противогрибковые средства и другие лекарства. Белки семейства ABC переносят химиотерапевтические препараты разных классов, включая антрациклиновые антибиотики, винка-алкалоиды, таксаны, подофиллотоксины и др. В последнее время показано, что резистентность малигнизированных клеток к таргетным препаратам нового поколения также может быть связана с активностью ABC транспортеров [Стромская Т.П. и др., 2008]. Это подчеркивает актуальность выбранного нами направления исследований для современной онкологии. Отметим, что основными ABC транспортерами, определяющими МЛУ, являются АВСВ1 (Р-гликопротейн или Pgp), АВСС1 (MRP1) и ABCG2 (BCRP).

В настоящее время, активно изучается новый класс противоопухолевых

агентов, действие которых направленно на ингибирование протеасом.

Протеасомная деградация белка в клетке, является одним из важнейших

процессов, связанных с её нормальным функционированием. Показано, что

ингибирование протеасом приводит к апоптозу. Одним из наиболее

известных и уже применяемых в клинике протеасомных ингибиторов для

лечения множественных миелом, лимфом и некоторых других опухолей,

является бортезомиб (PS-341, Velcade). Это водорастворимое соединение,

являющееся мощным селективным протеасомным ингибитором,

представляет из себя дипептид борониковой кислоты, который ковалентно

3

связываясь с активным сайтом каталитической субьединицы 05 20S коровой части протеасомы, способен её ингибировать. Важным свойством этого протеасомного ингибитора является то, что он влияет на опухолевые клетки в тех концентрациях, которые не оказывают воздействия на нормальные клетки. В сочетании с химиотерапевтическими агентами он может давать аддитивный или синергический эффект. Бортезомиб применяется в клинике и рассматривается как одно из многообещающих лекарственных средств для лечения множественных миелом и лимфом, а также рака молочной железы. В то же время имеются сведения о том, что бортезомиб может являться субстратом одного из наиболее изученных ABC транспортеров Р-гликопротеина (Pgp), однако, эти данные - противоречивы [Rumpold H., 2007;

H. Minderman, 2006]. Относительно взаимодействия бортезомиба и других ABC транспортеров конкретных данных пока нет. Таким образом, исследование связи МЛУ, опосредованной ABC белками, и воздействия бортезомиба на клетки - современно.

Основные цели и задачи исследования

Цели данной работы: Исследование роли транспортных белков семейства ABC в эволюции злокачественных новообразований под влиянием бортезомиба и изучение молекулярных механизмов регуляции ABC транспортеров ингибиторами протеасом. В соответствии с основными целями исследования были поставлены следующие задачи:

I. Получить ответ на вопрос, транспортируют ли ABC белки бортезомиб? Для этого сравнить чувствительность родительских клеток и клеток, гиперэкспрессирующих Pgp, к бортезомибу, оценить скорость выброса этими клетками флуоресцирующего вещества родамина 123 , а также применить метод ШС2-сдвига (UIC2 shift assay), который позволяет судить как об экспрессии, так и об активности Pgp, в присутствии бортезомиба.

2. Получить ответ на вопрос, изменяется ли экспрессия и активность ABC транспортеров (Pgp, MRP1, BCRP) при краткосрочном и длительном воздействии бортезомиба.

3. Получить ответ на вопрос, изменяется ли экспрессия маркеров опухолевых стволовых клеток при длительном воздействии бортезомиба.

4. Получить ответ на вопрос, участвуют ли сигнальный путь, контролируемый фосфоинозитол -3-киназой (PDK), и многофункциональный белок YB-1 в характере ответа популяций опухолевых клеток на бортезомиб.

Научная новизна и практическая значимость исследования

При выполнении данного исследования был получен ряд приоритетных данных. Впервые было проведено систематическое исследование, которое дало ответ на вопрос, является ли бортезомиб субстратом ABC транспортера - Pgp. Впервые была исследована эволюция экспрессии и активности ABC транспортеров при длительном воздействии бортезомиба на культуры малигнизированных клеток. Впервые было показано, что при продолжительном воздействии бортезомиба в популяции клеток, гиперэкспрессирующих ABC транспортер, накапливаются варианты с повышенной активностью киназы Akt, в то время как в популяции родительских клеток это не наблюдается. Впервые было проведено исследование корреляций изменений экспрессии ABC транспортеров под влиянием бортезомиба и маркеров стволовых клеток опухолей. Впервые были исследованы изменения многофункционального белка YB-1 при ответе опухолевых клеток на бортезомиб.

Результаты работы позволяют понять механизмы резистентности опухолевых клеток к бортезомибу и связи между множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и воздействием бортезомиба на клетки опухолей. Это позволяет оценить новые способы терапии опухолей и найти новые подходы к преодолению МЛУ.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 28 июня 2011 года на совместной научной конференции лаборатории генетики опухолевых клеток, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории механизмов канцерогенеза, лаборатории цитогенетики НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 6 таблицы, 1 схему, состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы». Список литературы включает 112 источников, в том числе 12 публикаций в отечественных рецензируемых изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает данные о механизмах множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолей, основных транспортёрах семейства ABC участвующих в формировании МЛУ, регуляции транскрипции генов этого семейства, а так же об основных путях сигнальной трансдукции, вовлеченные в регуляцию АВС-транспортеров. Вторая часть обзора посвящена современным представлениям об участии систем деградации белков в лекарственной устойчивости опухолей, о строении и роли протеасом в клетке, о противоопухолевых агентах, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом, и роли бортезомиба в регуляции транспортных белков семейства ABC.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы культуры малигнизированных клеток, чувствительных и резистентных к химиопрепаратам: линия клеток хронического миелолейкоза человека К562 и ее сублиния, гиперэкспрессирующую Pgp (K562/Í-S9), линия клеток острого миелобластного лейкоза KG1 человека, клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека КВ 3-1 и клетки сублинии КВ 8-5, птерэкспрессирующие Pgp, отобранные на резистентность к колхицину, клетки MCF-7 - линия клеток аденокарциномы молочной железы человека. Методы исследования: метод оценки чувствительности клеток к

химиопрепаратам - колориметрический метод (МТТ), выделение РНК и белков, ОТ-ПЦР, иммуноцитохимический анализ белков, проточная цитофлуориметрия, метод антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-ОАС), иммуноблоттинг, статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование цитотоксического действия бортезомиба на линии чувствительных и резистентных к лекарственным препаратам опухолевых клеток.

Для того чтобы выяснить, принадлежит ли бортезомиб к препаратам круга МЛУ, контролируемой ABC транспортерами, мы сравнили чувствительность к нему клеток, гиперэкспрессирующих Pgp, и соответствующих родительских клеток. Использовали две пары клеточных линий: ІС562 и K562/Í-S9, а также КВЗ-1 и КВ8-5. Мы также определили чувствительность к бортезомибу клеток KG-1, поскольку известно, что в клетках этой линии исходно высоко экспрессирован ген MDR1 [Stromskaya Т.Р. et al., 2005] и клеток MCF-7, так как известно, что бортезомиб применяют в терапии опухолей молочной железы [Yerlikaya A. et al., 2008]. В таблице 1 представлены результаты, полученные с помощью МТТ-теста.

Табл.1. Эффективные дозы бортезомиба для клеток линий КВЗ-1, КВ8-5, MCF-7,

К562, K562/Í-S9 и KG1.

линия клеток 1С20* 1С50**

КВ-3-1 1,25 +/. 0,2 х10"8М 2,5 +/. 0,2 х 10"8 М

КВ-8-5 2,5 +/. 0,2 х 10"8 М 5 +/. 0,2 х 10 8М

MCF-7 3,2х10"9М 2,5х10"8 М

К562 2,5 +/_ 1 х 10 8 М 5х10"8 М

K562ÍS9 1,25х10"8 М 2,5х10"8 М

KG1 3,125x10"' М 1,25x10"® М

* 1Сго - 20% клеток погибает при данной концентрации препарата. ** ГС50 - 50% клеток погибает при данной концентрации препарата.

Результаты опытов, приведенные в данном разделе работы, показывают, что культивируемые малигнизированные клетки разного гистогенеза различаются по чувствительности к бортезомибу. Данная серия опытов позволила определить концентрации бортезомиба (IC20 и 1С5о) для каждой линии клеток, которые можно использовать в дальнейшей работе. Сравнения чувствительных к лекарственным препаратам клеток и их производных, устойчивых к химиопрепаратам за счет гиперэкспрессии Pgp, показало, что резистентные клетки отличаются от родительских по чувствительности к бортезомибу. Эти отличия не превышают различий между клетками разных линий и могут иметь разную направленность.

2. Влияние бортезомиба на функциональную активность и экспрессию Р-гликопротеина (Pgp).

2.1. Оценка влияния бортезомиба на экспрессию и активность Pgp в клетках K562/i-S9 с помощью метода антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC).

Метод UIC2-OAC благодаря специфичности и высокой чувствительности позволяет отличать активность Pgp от активности других мембранных насосов, выбрасывающих лекарства. Повышение реактивности UIC2 в присутствии субстратов Pgp, которые изменяют его конформацию, тем самым "раскрывая" структуру этого белка, позволяет обнаруживать клетки с относительно низким количеством Pgp. Этот метод позволяет одновременно оценить количество Pgp в клетках и его функциональную активность [Park S.W., 2003; Мечетнер Е.Б., 2003], а также показывает, является ли препарат субстратом Pgp.

Мы проанализировали степень связывания антител UIC2, меченных

фикоэритрином, с Pgp в клетках K562/i-S9 в присутствии винбластина в

концентрации 2x10 М или бортезомиба в концетрации 2x10"7 М

(инкубация в течение 30 мин). Нами было обнаружено, что в присутствии

винбластина количество клеток с Pgp, увеличивается по сравнению с

контролем (клетки без добавления препарата) более чем в 2 раза и составляет

95,9%. При инкубации этих же клеток с бортезомибом в тех же молярных

концентрациях, количество клеток с Pgp также увеличивалось почти в 2

раза по сравнению с контролем и составило 71,8% от исследованной

популяции (Таблица 2). По сравнению с контролем под влиянием

винбластина возросла и средняя светимость клеток K562/i-S9 в 5 раз 8

(средняя светимость 212), в то время как под влиянием бортезомиба — в 2 раза (средняя светимость 81,2) (Таблица 2). Эти данные показывают, что в клетках K562/i-S9 бортезомиб влияет на конформацию Pgp, возникает активная конформация этого белка. Следовательно, бортезомиб является субстратом Pgp. Однако, очевидно, что бортезомиб принадлежит к более слабым субстратам Pgp, чем винбластин, который является его известным субстратом.

Таблица 2. Результаты определения экспрессии и активности Р-гликопротеина в клетках линии K562/i-S9 с использованием метода антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC).

Группа опыта контроль (РЕ)* + AT UIC2

UIC2 VBL +UIC2 ** VLC+UIC2 ***

% клеток, связавших АТ 2% 40,7% 95,9% Р < 0,0001 71,8% Р < 0,0001

Средняя светимость на клетку 35,9 60,9 212 Р< 0,0001 81,2 Р< 0,0019

* К клеткам добавлен фикоэритрин, которым помечены AT UIC2 ** винбластин (VBL) в дозе - 2х10"7М *** бортезомиб (VLC) в дозе - 2х10"7М

2.2. Влияние бортезомиба на выброс родамина 123 клетками K562/Î-S9.

Функциональную активность Pgp в клетках резистнентного варианта K562/i-S9 оценивали общепринятым методом по интенсивности выброса флюоресцентного красителя родамина (Rhl23) [Egudina S.V. et al, 1993, Егудина C.B. и др., 1995]. Клетки K562/i-S9 достаточно интенсивно выбрасывают Rh 123. В качестве модуляторов использовали винбластин и бортезомиб. Винбластин, который является известным субстатом Pgp, блокировал выброс Rh 123 из клеток, что привело к значительному увеличению количества светящихся клеток в популяции и возрастанию значения средней светимости - 728. Воздействие бортезомиба не привело

9

к блокированию выброса ЛЬ 123: показатели средней интенсивности флюоресценции клеток, обработанных ЯЬ 123, и клеток, обработанных 1111123 и бортезомибом, практически не отличаются (Таблица 3). Таким образом, бортезомиб, в отличие от винбластина, не конкурирует с ЯЬ 123 за связьшание с Pgp.

Таблица 3. Результаты оценки изменений выброса Родамина 123 (ЯЫ23) клетками К562/Ь59 под воздействием бортезомиба.

Группа опыта + Rh 123 (5 мкг/мл)

кулыуральная среда* +VBL** +VLC***

Средняя светимость на клетку 397 728 Р< 0,0007 398 Р = 0,96

* К клеткам добавлен Rh 123 ** винбластин (VBL) в дозе - 2х10"7М *** бортезомиб (VLC) в дозе - 2х10"7М

3. Влияние бортезомиба на степень чувствительности родительских и резистентных опухолевых клеток к препаратам круга МЛУ.

Поскольку чувствительность опухолевых клеток к большим группам химиопрепаратов хотя бы отчасти может быть связана с активностью ABC транспортеров, а выше мы показали, что бортезомиб является субстратом одного из транспортёров семейства ABC (Pgp), следующей задачей было исследовать влияние бортезомиба на чувствительность опухолевых клеток к препаратам круга МЛУ. Известно, что при лечении злокачественных новообразований бортезомиб нередко используется в комплексе с другими химиопрепаратами. В качестве препарата круга МЛУ мы использовали доксорубицин (Dox). Он принадлежит к группе антрациклиновых антибиотиков, механизм его действия заключается в интеркаляции между цепями ДНК и в подавлении синтеза нуклеиновых кислот. Также известно, что Dox является субстратом Pgp [Mechetaer Е.В. et al, 1992]. В качестве модели, мы выбрали клетки линии

применяли соответствующую пятидесятипроцентную эффективную дозу (1С50) бортезомиба (см. Таблицу 1) и Бох. К Бох клетки КВ8-5 были более, чем на порядок устойчивее, по сравнению с клетками КВЗ-1. 1С50 Бох для КВЗ-1 составила 3,9х10"9 М, для КВ8-5 - 1x107 М). На рис. 1 А., Б. представлены гистограммы, отражающие полученные результаты. Как видно на рис. 1А бортезомиб не оказывает влияния на чувствительность клеток линии КВЗ-1 к Бох, при совместном добавлении этих препаратов, процент выживаемости клеток равен проценту выживаемости клеток при добавлении только бортезомиба. Однако, как видно на рис. 1 Б., при сочетанном воздействии бортезомиба и доксорубицина в популяции КВ8-5 погибло значительно больше клеток, чем в группе опыта с обработкой этих клеток только Бох. Таким образом, наше исследование свидетельствует в пользу того, что бортезомиб способствовал увеличению чувствительности к доксорубицину клеток резистентной линии, однако не оказывал подобного влияния на клетки дикого типа.

А.

120 100 80 60 40 20 о

Контроль Do* IC50 Vfc IC50 DoxlC50 + Vic IC50

дозы препарата

120 100 80 60 • 40 20 0

ш

Контроль Dox IC50 Vic ICS0

дозы препарата

Dox IC50 -» Vic ЇС50

Рис.1. Гистограммы, позволяющие сравнить чувствительность клеток КВЗ-1(А) и КВ8-5 (Б) к доксорубицину (Dox) и бортезомибу (Vic), а также к сочетанному воздействию этих препаратов. МТТ тест. К клеткам добавляли препараты через 24ч после засева и инкубировали в течении 72ч. Контроль - вариант клеток без добавления препаратов.

4. Влияние бортезомиба на экспрессию гена МО/?7 и других генов круга

МЛУ в опухолевых клетках разного гистогенеза.

С помощью полуколичественного метода ОТ-ПЦР было исследовано

влияние бортезомиба на экспрессию некоторых генов круга МЛУ. Нами

были получены РНК клеток (К562, К562/І-Б9, Кв-І, КВЗ-1, КВ8-5 и МСР-7) после обработки их бортезомибом в нескольких эффективных дозах в течение 72ч. Мы получили образцы кДНК и провели серию ПЦР с праймерами к исследуемым нами генам (МБЯ! он же АВСВ1, МЯР1-АВСС1, ВСІІР-АВСС1, ЬЛР/МУР).

4.1. Базальный уровень экспрессии мРНК генов МЛУ в исследованных клетках.

Результаты этой части работы показывают, что единственным геном, экспрессию которого мы обнаружили во всех исследованных нами линиях опухолевых клеток, является ген MRP1 (АВСС1) (Рис. 2).

4. 2. Влияние бортезомиба на содержание мРНК генов МЛУ в исследованных линиях.

Бортезомиб не оказывал влияния на экспрессию мРНК таких генов как BCRP и LRP/MVP во всех использованных линиях клеток. Бортезомиб также не оказал влияния на количество мРНК всех исследуемых нами генов в клетках линий KG-1, К562, K562/Î-S9 и КВЗ-1. Однако как видно на рисунке 2, под воздействием бортезомиба в дозах, равных IC20 и IC50, происходит заметное снижение количества мРНК генов MDR1 и MRP1 в клетках КВ8-5. Бортезомиб снижал также содержание мРНК гена MRP1 в популяции MCF-7 (рис.2). В этих клетках ген MDR1 не экспрессирован или экспрессирован весьма слабо, поэтому о влиянии бортезомиба на мРНК этого гена в данных клетках судить трудно. Наши данные позволяют лишь заключить, что воздействие бортезомиба не привело к повышению количества мРНК этого гена в клетках MCF-7. Эти опыты показывают, что в некоторых клетках бортезомиб может влиять на содержание мРНК генов MDR1 и MRP1, снижая его. Очевидно, это не обязательно происходит в клетках, отбиравшихся на гиперэкспрессию Pgp, но может наблюдаться и в опухолевых клетках разного гистогенеза.

К562 K562/I-S9 KGI КВЗ-1 KB8-5 MÎT? к Ю20 IC50 к IC;o 1С50 к Юг, Ю50 к Ю20 Ю50 к 1Сго Ю50 к 1С20 Ю»

а.ти i51îsSS5!# ILOC3 12X5351 CI3XÏI Cî'^WLI ï*JC3G3

MDRl Е. ■■■■ MRP!

BCRP WÊÊÊÊÊÊÈ 1 ИВВИ—1 —1ЯЖ

IÄJP ■■«n/i Li .«JÜU..b.,-l,tÄ

Рис.2. Влияние бортезомиба на количество мРНК генов круга МЛУ в клетках К562, K562/Î-S9, KG1, КВЗ-1, КВ8-5 и MCF-7. Результаты ОТ-ПЦР. Бортезомиб добавляли на 72 часа к клеткам в дозах равных IC20 и IC50 определенных ранее для каждой культуры клеток, к - контрольный вариант без добавления бортезомиба. VLC - обозначение бортезомиба. IC20, ICso - эффективные дозы бортезомиба для данных клеток, (см. Таблицу 3). Ставили не менее Зх опытов.

5. Влияние бортезомиба на количество белков множественной

лекарственной устойчивости в опухолевых клетках.

Поскольку мы показали, что бортезомиб способен оказывать влияние на экспрессию мРНК некоторых генов круга МЛУ, следующей нашей задачей являлось выяснить, может ли этот протеасомный ингибитор влиять на количество белков круга МЛУ. Для этого мы оценили связывание антител к белкам Pgp и MRP1 в двух парах клеток: КВЗ-1 и КВ8-5, а также К.562 и K562/i-S9, клетки которых перед этим инкубировали с бортезомибом в эффективных дозах IC20 и IC50 в течение 72ч. Нами было обнаружено, что в клетках КВ8-5 количество белка MRP1 под воздействием бортезомиба, увеличивается (с 52,2% до 85,2%). В клетках КВЗ-1 бортезомиб не влияет на белковые продукты этих генов (Табл.4).

Так же бортезомиб способствовал увеличению количества клеток с Pgp, в популяции клеток К562 и K562/i-S9 (Табл.4).

Таблица 4. Влияние бортезомиба на количество белков МЛУ. Иммуноцитохимический анализ.

% клеток, связавших антитела

Антитела КВЗ-1 КВЗ-1 КВ8-5 КВ8-5 К562 К562 K562/i-S9 K562/i-S9

к белкам + + + +

VLC VLC VLC VLC

PgP (АВСВ1) 4,3% 4,6% 93,9% 95,9% 10,6% 40,6% 74,9% 86,9%

Проточная цитофлуриметрия. Результаты одного репрезентативного опыта. Клетки инкубировали с бортезомибом в эффективных дозах 1С2о и ІС50 в течении 72ч. УЬС -бортезомиб.

Результаты этих опытов показывают, что в некоторых (но не во всех) исследованных нами клеточных линиях, бортезомиб способствовал повышению количества белков круга МЛУ.

6. Исследование активности киназ Akt и ERK1/2 под влиянием бортезомиба в лекарственно-устойчивых и родительских клетках.

С целью понять, что может определять различия между клетками КВЗ-1 и КВ8-5, в ответ на воздействие бортезомиба, мы исследовали его действие на активность Akt и ERK1/2 - киназ в этих клеточных линиях (рисунок 3 А, Б). Клетки КВ8-5 и КВЗ-1 инкубировали с бортезомибом в течение 6ч, 12ч и 24ч, в эффективной дозе 1С50. Оказалось, что в популяции КВ8-5, бортезомиб увеличивает количество фосфорилированной формы киназы Akt, в то время как в клетках КВЗ-1 этот препарат снижает фосфорилирование Akt. Так же бортезомиб значительно снижает количество фосфорилированной формы ERKl/2-киназы в клетках КВ8-5 при инкубации с этим препаратом в течение 12ч и 24ч, а в клетках КВЗ-1 не оказывает влияния на эту мишень. Таким образом, резистентные и родительские клетки отличались по характеру изменений активности Akt-киназы и ERKl/2-киназы в ответ на обработку бортезомибом.

А.

KB 3 -1

KB 8-5

р-АКТ Tubulin

Бортезомиб 6ч 12ч 24ч

Бортезомиб 6ч 12ч 24ч

Б.

ERK1/2 Tubulin

KB 3-1

Бортезомиб бч 12ч 24ч

...

ЩЯЯ

Рис.3. Влияние бортезомиба на степень фосфорилирования киназ Akt и Erkl/2 в клетках КВ 3-1 и КВ 8-5. А. Влияние бортезомиба на количество фосфорилированной формы Akt-киназы в клетках КВ 3-1 (1С50 = 2,5х10'8М) и КВ 8-1 (1С50 = 5х10"*М). Б. Влияние бортезомиба на количество фосфорилированной формы ERK1/2 в клетках КВ 31 (1С5о= 2,5х10~8М.) и КВ 8-1 (1С50 = 5х10"8М) (Вестерн-блоттинг).

7. Анализ уровня экспрессии генов MDR1 и MRP1 в опухолевых клетках при воздействии на них бортезомиба и Ly 294002 (специфического ингибитора фосфорилированной формы киназы Akt).

С целью выяснить, влияют ли изменения активности Akt на количество мРНК генов ABC транспортеров, мы исследовали, как влияет Ly 294002 (специфический ингибитор активации Akt-киназы) на количество мРНК генов MDR1 и MRP1 в клетках КВ8-5. Методом ОТ-ПЦР проводили сравнение уровня экспрессии мРНК гена MDR1 и MRP] в клетках КВ8-5 обработанных бортезомибом, Ly 294002 и бортезомибом совместно с Ly 294002 в течении 6ч,12ч и 24ч. Как видно из рисунке 4, Ly 294002 повысил количество мРНК MRP1. Его влияние на количество мРНК MDR1 в этих опытах выявлено не было. Нельзя исключить, что высокое содержание мРНК

15

MDR1 в резистентных клетках не позволяет обнаружить небольшие отклонения в содержании этой мРНК. Сочетанная обработка клеток бортезомибом и Ly 294002 несколько снизила количество мРНК обоих генов, но оно осталось более высоким, чем в группе с обработкой только бортезомибом. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что активная Akt-киназа оказывает выраженное влияние на количество мРНК по крайней мере одного ABC транспортера на фоне воздействия бортезомиба.

Бортезомнб Ly 294002 Бортезомяб + Ly 294002 6ч 12ч 6ч 12ч 6ч 12ч

GAPDH MRP1

Рис.4. Экспрессия генов МВЯ1 и МКР1 в клетках КВ-8-5 при воздействии на них бортезомиба (1С5о = 5х10"8М) и Ьу 294002 (специфический ингибитор фосфорилированной формы А1й-киназы; в дозе 1хЮ"2М). Препараты добавляли к клеткам через 24 часа после засева. Метод ОТ-ПЦР.

8. Влияние бортезомиба на фенотип МЛУ при длительном воздействии препарата на популяции опухолевых клеток.

Следующей задачей было исследовать влияние бортезомиба на механизмы МЛУ при длительном воздействии этого препарата на популяции опухолевых клеток, поскольку терапия бортезомибом - длительный процесс. Использовали клетки линий К562 и К562Л-89, которые культивировали в присутствии бортезомиба, исходя из ранее определенной чувствительности клеток (в краткосрочный период воздействия препарата - 72 часа) к этому препарату для каждой линии клеток (Таблица 1). Клетки пересевали в течение 9-ти недель. Количество добавляемого препарата увеличивали в процессе культивирования.

Мы показали, что даже при относительно небольших концентрациях бортезомиба (5x10"9 М, 1x10"8 М) происходит торможение размножения клеток, тем не менее клетки размножаются. По-видимому, происходит адаптация клеток к бортезомибу (рисунок 5). Клетки, которые изначально культивировали с бортезомибом в более высокой концентрации, равной 1С50 (2x10"8 М), также перенесли эту дозу препарата (выжило примерно 50% от

контроля) (рисунок 6). Таким образом, адаптация к этой дозе препарата наблюдается при длительном культивировании (примерно 6 недель). В процентном выражении выживает то же количество клеток, которое выживает при краткосрочном воздействии бортезомиба (72 часа). Через 39 дней концентрацию бортезомиба увеличили в 2 раза (4x10"8 М), при этом клетки выжили, и процент их выживаемости увеличился до 70%. Это свидетельствует в пользу того, что произошла адаптация не единичных вариантов, а достаточно большого количества клеток (рисунок 6).

Клетки линии К562 погибали при культивировании их в среде со средней или высокой концентрацией бортезомиба, и выживали лишь при малых дозах препарата. Концентрацию, при которой клетки не погибали, удалось повысить с 4хЮ"10 М до 1,25х10"8 М.

2С о

h- QJ 100%

5

£ 80%

ь

О 60%

S

ш 8 40%

£

i 20%

ъ

m

äS

12 15 21 24

I период ведения -доза VLC- 5x10 » М

II период ведения -доза VLC - lxlO"8 М

количество дней культивирования клеток с бортезомибом

Рис.5. Выживаемость клеток K562/i-S9 при длительном культивировании с бортезомибом. Клетки засевали по 2x106 клеток на 7 мл среды + fcs. Процент выживания клеток вычислялся от контроля - клеток, которые культивировали в тех же условиях, но без бортезомиба. В первый период (15 дней) клетки культивировали в присутствии бортезомиба (VLC) в дозе 5x10 М, во втором периоде (с 15 по 39 день) клетки культивировали в присутствии бортезомиба (VLC) в дозе 1х10"8М.

X

80%

(и

70%

£ 60%

К 50%

(П

40%

£

л 30%

гк 20%

10%

0%

И I период ведения -доза М1С - 2х103 М

II период ведения -доза УЮ - 4х10"8 М

3 6 9 12 15 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 количество дней культивирования клеток с бортезомибом

Рис.6. Выживаемость клеток К562Л-89 при длительном культивировании с бортезомибом. Клетки засевали в соотношении 2x106 клеток на 7 мл среды Процент выживания клеток вычислялся от контроля - количества клеток, которые культивировали в тех же условиях, но без бортезомиба. В первый период (39 дней) клетки культивировали в присутствии бортезомиба (УЬС) в дозе 2х10"8М, во втором периоде (с 39 по 54 день) клетки культивировали в присутствии бортезомиба (УЬС) в дозе 4х10"8М

8.1. Сравнение чувствительности к бортезомибу клеток до и после длительного культивирования в присутствии этого препарата.

Через 9 недель культивирования клеток в среде с бортезомибом с помощью МТТ теста мы определили уровень их чувствительности к этому препарату. Клетки, которые культивировали с бортезомибом мы обозначили К562„|0 и К562Л-89У|С. Их чувствительность к бортезомибу сравнили с чувствительностью к этому препарату исходных линий К562 и К562Л-89. Оказалось, что устойчивость клеток сублинии К562Л-89у|с к бортезомибу по сравнению с исходной линией К562Л-89 возросла в 10 раз. В то же время, чувствительность клеток К562У|С к бортезомибу почти не изменилась по' сравнению с клетками К562 (рисунок 7). Таким образом, видно, что за тот срок воздействия препарата, который позволил получить из линии с гиперэкспрессией Pgp резистентную к бортезомибу популяцию, из популяции клеток с низким уровнем Рцр резистентную сублинию получить не удалось.

250 HM

□ К562 BK562vlc Я □ K562/Í-S9 В K562/i-S9vlc ■

Рис.7. Сравнение 1С5о (концентрации, вызывающей гибель 50% клеток) для клеток К562 и их производного K562/Í-S9 с гиперэкспрессией Р-гликопротеина (Pgp) до и после культивирования в присутствии бортезомиба в течение 9-ти недель. Клетки, культивировавшиеся в присутствии бортезомиба, обозначены как K562vic и K562/i-S9vic. Концентрация бортезомиба, при которой происходит гибель 50% клеток в нМ, для К562 -50 нМ, K562vlc - 62,5 нМ, K562/Í-S9 - 25 нМ, K562/i-S9vlc - 250 нМ. МТТ тест.

8.2. Сравнение конститутивной экспрессии фосфорилированной формы киназы Akt в клетках до и после длительного культивирования в присутствии бортезомиба.

Следующая серия опытов была посвящена выяснению вопроса, будет ли изменяться активность Akt киназы при долгосрочном воздействии бортезомиба, так как ранее мы показали, что в клетках с гиперэкспрессией Pgp бортезомиб способствует возрастанию количества фосфорилированной формы этого белка. Сравнение сублинии K562/i-S9 и K562/i-S9vlc показало, что в клетках K562/i-S9vic (после культивирования с бортезомибом) обнаружено большее количество фосфорилированной формы Akt-киназы (рисунок 8), однако в клетках линии К562 и её сублинии K562vic подобных различий не обнаружено. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что гиперэкспресия Pgp опухолевыми клетками может являться клеточным контекстом, в условиях которого под воздействием бортезомиба активируется киназа Akt.

К 562 К 562vic

К 562'i-S9 К 562/i-Sä.te

Рис.8. Сравнение экспрессии фосфорилированной формы киназы Akt (Вестерн-блотшнг) в клетках К562 и их их сублинии K562/i-S9 с гиперэкспрессией Р-гликопротеина (Pgp) до и после культивирования в присутствии бортезомиба в течение 9-ти недель. Клетки, культивировавшиеся в присутствии бортезомиба, обозначены как K562vic и K562/i-S9 vic-

8.3. Исследование экспрессии белка Pgp и маркеров стволовых кроветворных клеток СБ34 и СБ38 в клетках до и после длительного культивирования в присутствии бортезомиба.

Исследование экспрессии белка Pgp и белков-маркеров стволовых кроветворных клеток СБ34 и СЭ38 в популяциях К562Л-Б9 и К562/]-89У1С показало, что в популяции К562/1-89У1С количество Рер повышено в 2 раза по сравнению с клетками К562Л-Б9 (Таблица 5). Из приведенных данных, следует, что возрастало не количество клеток, экспрессирующих Pgp, а количество Pgp на клетку. В популяции клеток К562Л-89У1С также возросло количество клеток, экспрессирующих СБ34 (Таблица 5). Экспрессия СБ38 осталась на том же низком уровне, что и в исходной линии К562/ь89. Процент клеток связавших антитела к этому белку очень мал, на грани достоверности, тем не менее важно, что он не возрастает, поэтому мы приводим эти данные (для К562Д-89 - 1,9%, и 1,7% для К562Л-89У1С соответственно). Такая низкая экспрессия СБ38 является характерным для стволовых клеток крови [Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2005]. Эти данные показывают, что при воздействии бортезомиба на клетки К562/ь59 произошел отбор вариантов с повышенной экспрессией Pgp и маркера стволовых кроветворных клеток СБ34, т.е. вариантов с фенотипом стволовых кроветворных клеток.

При сравнении линии К562 и её сублинии К562у1с различий в экспрессии Р§р, СБ34 и СЭ38 не наблюдалось, экспрессия этих белков оставалась низкой в клетках обеих линий.

Таблица 5. Экспрессия Р-глнкопротеина (Pgp) и белка стволовых клеток СЭ34 клетками К562/1-89 с гиперэкспрессией Pgp до и после культивирования в присутствии бортезомиба в течение 9-ти недель.

Антитела к белкам K562/i-S9 K562/i-S9vlc*

% клеток, связавших антитела Средняя светимость % клеток, связавших антитела Средняя светимость

PgP (АВСВ1) 98% 325 98,4% 736

CD34 10,2% 58,3 17,4% 54

* Клетки K562/i-S9, культивировавшиеся в присутствии бортезомиба в течение 9-ти недель.

9. Роль белка YB-1 в характере ответа опухолевых клеток на бортезомиб.

С целью дальнейшего изучения молекулярных механизмов, определяющих

влияние бортезомиба на гены и белки МЛУ, мы решили выяснить, влияет ли этот протеасомный ингибитор на количество мРНК и локализацию белка YB-1 в опухолевых клетках, поскольку известно, что белок YB-1 активируется Akt-киназой. Ранее в нашей лаборатории было показано, что в лекарственно-устойчивых клеточных популяциях повышено число клеток с ядерной локализацией YB-1 [Вайман A.B. и др., 2006].

9.1. Определение влияния бортезомиба на экспрессию мРНК гена YB-1 в опухолевых клетках.

С помощью полуколичественного метода ОТ-ПЦР было исследовано влияние бортезомиба на экспрессию гена YB-1 в 5 различных линиях опухолевых клеток: MCF-7, КВЗ-1, КВ8-5, К562, K562/i-S9. Клетки обрабатывали бортезомибом в нескольких эффективных дозах (IC20 и 1С50) в течение 72ч. В данной серии опытов не было выявлено изменений под влиянием бортезомиба в количестве мРНК гена YB-1 во всех исследованных нами клеточных линиях (рисунок 9). Таким образом, мы нашли, что бортезомиб не оказывает влияния на экспрессию гена YB-1 как в родительских клетках, так и в клетках гиперэкспрессирующих Pgp (с фенотипом МЛУ).

УВ-1 в АРОН

Рис.9. Влияние бортезомиба на экспрессию гена УВ-1 в клетках МСР-7, КВ 3-1, КВ 8-5, К562 и К562Л-59. Результаты ОТ-ПЦР. Бортезомиб добавляли на 72 часа к клеткам в дозах равных 1Сго и 1С5о определенных ранее для каждой культуры клеток, к -контрольный вариант без добавления бортезомиба. 1Сго, 1С50 - эффективные дозы бортезомиба для данных клеток, (см. Таблицу 3). Ставили не менее Зх опытов которые дали сходные результаты.

9.2. Исследование влияние бортезомиба на локализацию белка УВ-1 в опухолевых клетках.

В качестве модели использовали клетки линии аденокарциномы молочной железы МСР-7 хорошо распластанные на субстрате, что позволило наблюдать изменения внутриклеточной локализации УВ-1. Клетки инкубировали в присутствии бортезомиба в течении Зч и 6ч, далее методом иммунноцитохимического окрашивания клеток, определяли внутриклеточную локализацию белкаУВ-1. В клетках МСР-7 белок УВ-1 в основном располагается в цитоплазме (рисунок 10). При действии бортезомиба в дозе 1С50 в течение Зх часов, УВ-1 располагается в перинуклеарном пространстве, а после 6-ти часов инкубации, перемещался в ядро (рисунок. 10). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что под влиянием бортезомиба в популяции опухолевых клеток активность УВ-1 в качестве фактора транскрипции может повышаться.

Контроль

1С50 6 ч

Рис.10. Влияние бортезомиба на внутриклеточную локализацию УВ-1 в клетках МСР-7 (иммуногистохимическое окрашивание клеток антителами к УВ-1). Бортезомиб добавляли к клеткам через 24ч после засева. 1С5о - эффективная доза бортезомиба для этой линии клеток. 22

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленном исследовании проведено изучение роли транспортеров семейства ABC в эволюции новообразований, подвергнутых действию перспективного препарата специфического ингибитора активности протеасом бортезомиба. Исследования проводились на 6 клеточных линиях: линии клеток хронического миелолейкоза человека К562 и ее сублинии, гиперэкспрессирующей Pgp (K562/Í-S9), линии клеток острого миелобластиого лейкоза KG1 человека, линии эпидермоидной карциномы полоста рта человека КВ 3-1 и ее сублинии КВ 8-5, гиперэкспрессирующей а так же линии MCF-7 -клетки аденокарциномы молочной железы человека.

В результате проведенных исследований были получены некоторые принципиально новые результаты, детализировавшие и углубившие представления об участии механизмов множественной лекарственной устойчивости в опухолевой прогрессии. Мы показали, что бортезомиб является субстратом Р-гликопротеина (Pgp или АВСВ1), и что его свойства в качестве субстрата Pgp отличаются от свойств классических субстратов Pgp. Мы нашли, что гиперэкспрессия Pgp не обязательно определяет резистентность опухолевых клеток к бортезомибу и что в некоторых клетках бортезомиб может выступать как ингибитор активности Pgp.

Мы показали, что бортезомиб может снижать количество мРНК генов MDR1 (АВСВ1) и MRP1 (АВСС1), являющихся транспортными белками семейства ABC, в исследованных нами клеточных линиях. Также мы показали, что под влиянием бортезомиба изменения сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию пролиферации, можгут происходить в первую очередь в лекарственно-устойчивых клетках с гипрэкспрессией ABC транспортера.

В экспериментах на культурах клеток линии K562/Í-S9 (клетки с повышенной экспрессий Pgp) нами было впервые показано, что при продолжительном воздействии бортезомиба в популяции накапливаются варианты с конститутивно активированной киназой Akt. В этих вариантах наблюдается также повышенная экспрессия Р-гликопротеина и маркера стволовых кроветворных клеток CD34, т.е. накапливаются варианты с фенотипом стволовых кроветворных клеток. Таким образом, наши исследования свидетельствуют о том, что бортезомиб может способствовать накоплению в малигнизированной лекарствнно-устойчивой популяции вариантов, за счет которых опухоль может прогрессировать.

ВЫВОДЫ:

Бортезомиб является субстратом с Р-гликопротеина (Pgp или АВСВ1). Его свойства в качестве субстрата Pgp отличаются от свойств классического субстрата Pgp винбластина: в отличие от винбластина, бортезомиб является менее специфичным субстратом для этого транспортёра, кроме того бортезомиб не конкурирует с родамином (Rh 123) за связывание с Pgp.

Клетки с повышенной экспрессией Р-глигопротеина (Pgp), могут быть как резистентнее (клетки линии КВ 8-5) так и чувствительнее (клетки линии K562/Í-S9) к бортезомибу, чем соответствующие родительские клетки. Таким образом, гиперэкспрессия Pgp не обязательно определяет резистентность опухолевых клеток к бортезомибу.

В клетках линии КВ 8-5 (клетки с повышенной экспрессий Pgp) бортезомиб повышает чувствительность к доксорубицину -субстрату Pgp. Таким образом, в некоторых клетках бортезомиб может выступать как ингибитор активности Pgp.

Обработка бортезомибом приводит к снижению количества мРНК гена MDR1 (.АВСВ1) и MRP1 (.АВСС1) в клетках линий КВ 8-5 и гена MRP1 в клетках линии MCF-7. Таким образом, бортезомиб может снижать количество мРНК генов некоторых транспортных белков семейства ABC.

Воздействие бортезомиба на клетки способствует повышению количества белков (Pgp и MRP1) в некоторых, но не во всех клеточных линиях. Это, по-видимому, связано с подавлением активности протеасом.

В клетках КВ 8-5 (резистентных за счет повышенной экспрессии Р-глигопротеина) бортезомиб увеличивает количество фосфорилированной формы киназы Akt и снижает количество фосфоршшрованной ERK1/2 киназы. Снижение количества мРНК

гена MRP1 под влиянием бортезомиба связано с активацией киназы Akt. При сравнении резистентных (КВ 8-5) и чувствительных (КВ 31) клеток этот эффект обнаружен только в резистентном варианте. Это свидетельствует о том, что под влиянием бортезомиба изменения сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию пролиферации, может происходить в первую очередь в лекарственно-устойчивых клетках с гипрэкспрессией ABC транспортера.

7. При продолжительном воздействии бортезомиба на популяцию клеток линии K562/Í-S9 (клетки с повышенной экспрессий Pgp), в популяции накапливаются варианты с активированной киназой Akt. Так же в этих вариантах наблюдается повышенная экспрессия Р-гликопротеина и маркера стволовых кроветворных клеток CD34, т.е. накапливаются варианты с фенотипом стволовых кроветворных клеток. Это не наблюдалось в популяции не резистентных клеток К 562. Таким образом, бортезомиб может способствовать накоплению в малигнизированной лекарствнно-устойчивой популяции вариантов, за счет которых опухоль может прогрессировать.

8. Обработка бортезомибом клеток MCF-7 приводит к перемещению белка YB-1, регулирующего лекарственную устойчивость, из цитоплазмы в ядра клеток, что может способствовать повышению активности белка YB-1 в качестве фактора транскрипции. Бортезомиб не оказывает влияния на количество мРНК гена YB-1 в клетках.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Паншцева, Л.А. Влияние ингибитора протеасом бортезомиба на экспрессию и активность ABC-транспортёров в опухолевых клетках. / JI.A. Паншцева, Е.С. Какпакова, Е.Ю. Рыбалкина, A.A. Ставровская // Биологические мембраны. - 2010 - Т. 27, №2. - С. 1-7.

2. Паншцева, JI.A. Влияние протеасомного ингибитора бортезомиба на экспрессию генов множественной лекарственной устойчивости и активность киназы Akt. / JI.A. Паншцева, Е.С. Какпакова, Е.Ю. Рыбалкина, A.A. Ставровская // Биохимия. - 2011. - Т. 76, №9. - С. 12381247.

3. Батенёва, Е.И. Частота одиннадцати мутаций генов BRCA1 и BRCA2 в неотобранной выборке больных раком молочной железы россиянок. / Е.И. Батенёва, A.A. Мещеряков, JI.H. Любченко, В.В. Кадочникова, Л.А. Паншцева, Д.Ю. Трофимов, Д.В. Ребриков // Уральский Медицинский журнал.-2011.-Т. 81,№3.-С. 69-73.

4. Паншцева, Л.А. Влияние ингибитора протеасом бортезомиба на экспрессию и активность белков множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток / Л.А. Паншцева, Е.С. Какпакова, Е.Ю. Рыбалкина, A.A. Ставровская // VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». - 2009. 22-25 Октября -С. 32.

5. Panischeva, L.A., Kakpakova, E.S., Rybalkina, E.Y., Stavrovskaya, A.A. New anticancer drugs and multidrug resistance of tumors: influence of bortezomib on ABC transporters. / L.A. Panischeva, E.S. Kakpakova, E.Y. Rybalkina, A.A. Stavrovskaya // Internation Symposium «Control of gene expression and cancer». - 2010. 21-25 June - № 24. - C. 81-82.

6. Паншцева, Л.А. Молекулярные механизмы резистентности популяции опухолевых клеток к протеасомному ингибитору, противоопухолевому препарату бортезомибу. / Л.А. Паншцева, Е.С. Какпакова, Е.Ю. Рыбалкина, A.A. Ставровская // VIII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». - 2011. 6-9 Декабря -С. 44-45.

Подписано в печать 05.10.12. Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 962. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24